JP2009132705A - 標的核酸配列に基づく目的分子の放出方法 - Google Patents

標的核酸配列に基づく目的分子の放出方法 Download PDF

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Abstract

【課題】本発明の目的は、生体内分解酵素の影響を抑え、かつ高い選択性で所望の部位に薬剤などの目的分子を放出させることを可能とする、目的分子を放出させる方法を提供することである。
【解決手段】本発明によれば、標的核酸配列の一部に対して相補的な塩基配列を有する第１の核酸プローブに電子供与体構造を結合させた電子供与体−第１核酸プローブ分子と、上記標的核酸配列の一部の配列に対して相補的な塩基配列で、かつ上記第１の核酸プローブと異なる塩基配列を有する第２の核酸プローブに、目的分子とアジド基とを有する電子受容体構造を結合させた目的分子−電子受容体−第２核酸プローブ分子とを、上記標的核酸配列にハイブリダイズさせ、かつ上記電子供与体−第１核酸プローブ分子が上記目的分子−電子受容体−第２核酸プローブ分子に作用して上記目的分子を放出させる工程を含む、目的分子を放出させる方法が提供される。
【選択図】なし

Description

本発明は、薬剤などの目的分子の放出を標的核酸配列に依存して行う、目的分子を選択的に放出させる方法に関する。より詳細には、電子供与体構造が標的核酸配列の一部に結合した第１の核酸プローブと、目的分子およびアジド基を有する電子受容体構造が結合した第２の核酸プローブとを、第１の核酸プローブの近傍にハイブリダイズさせ、かつ電子供与体から電子受容体に電子が受け渡されることにより目的分子が放出されることを特徴とする標的核酸配列の近傍で目的分子を放出させる方法に関する。さらに本発明は、目的分子を消光剤とし、かつ電子受容体構造に加えて蛍光剤を結合させた上記第２の核酸プローブを用いることにより、上記の通りに第１の核酸プローブと第２の核酸プローブを標的核酸配列にハイブリダイズさせ、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）効果を利用して標的核酸配列を検出する方法に関する。さらに本発明は、目的分子をIPTG(イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド)とし、かつ上記第２の核酸プローブを用いることにより、上記の通りに第１の核酸プローブと第２の核酸プローブを標的核酸配列にハイブリダイズさせ、大腸菌内でのAcGFP蛍光タンパク質の発現を誘導する方法に関する。さらに本発明は、上記の目的分子を放出させる方法および標的核酸配列を検出する方法で使用する新規の電子供与体、新規の電子受容体及び目的分子、並びにそれらと上記核酸プローブがそれぞれ結合した化学構造に関する。
生体内の特定部位で薬剤を放出させる方法としては、高分子ミセルおよび無機化合物などのキャリアに薬剤を包含して、体内での薬剤の徐放性や吸収性を制御する方法、いわゆるドラッグデリバリーシステムが広く利用されている。しかし、これらのキャリアを用いる場合、薬剤の作用部位の認識はキャリアのサイズにのみに依存することとなり、作用部位の認識の選択性が高くないという問題が生じていた。
上記問題を解決する方法として、細胞内の核酸配列を認識して薬剤を放出させる方法がテイラー（Ｔａｙｌｏｒ）らによって報告されている（例えば、米国公開特許公報第２００３／００６０４４１号公報、及びTaylor, J.ら, (2000) Proc. Natl. Acad. Sci., 97, 11159-11163を参照）。しかし、テイラーらの方法は、薬剤の放出メカニズムとして種々の生体内酵素の影響を受けやすいエステルの加水分解を利用した化学メカニズムを採用しているために、十分な選択性を得ることができなかった。
一方、特定の標的核酸配列を検出するための方法としては、その標的核酸配列に相補的な塩基配列を有し、かつフルオレセイン、テトラメチルローダミン、Ｃｙ３、Ｃｙ５などの蛍光物質で標識した核酸プローブを用いるハイブリダイゼーション法が広く利用されている。しかし、これらの蛍光物質で標識した蛍光核酸プローブは、バックグラウンド蛍光シグナルが高く、高感度測定が困難であった。
米国公開特許公報第２００３／００６０４４１号公報 Taylor, J.ら, (2000) Proc. Natl. Acad. Sci., 97, 11159-11163
本発明は、上記した従来技術の問題点を解消することを解決すべき課題とした。すなわち、本発明は、生体内分解酵素の影響を抑え、かつ高い選択性で所望の部位、さらにはその部位を構成するin vivo, in vitro系での細胞内で薬剤などの目的分子を放出させることを可能とする方法を提供することを解決すべき課題とした。また、本発明は、安定性および選択性が高く、かつ高感度であり、微量の標的核酸配列を検出することを可能とする、ＦＲＥＴ効果を利用した標的核酸配列の検出方法を提供することを解決すべき課題とした。さらに、上記の目的分子を放出させる方法および標的核酸配列を検出する方法の提供を達成することを可能とする、新規な電子供与体と核酸プローブを併せ持つ分子および新規な電子受容体と目的分子と核酸プローブを併せ持つ分子を提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、生体内の分解酵素で分解されず、かつ結合した目的分子を非選択的に放出させることのないアジド基を有する電子受容体構造を合成することに成功した。さらに、標的核酸配列の一部にハイブリダイズさせることができる第１の核酸プローブと電子供与体構造が結合した分子と第１の核酸プローブと所定の間隔でハイブリダイズできる第二の核酸プローブ、アジド基を有する電子受容体構造、および上記の目的分子が結合した分子を創作し、これらを標的核酸配列でハイブリダイズさせることにより、上記電子受容体構造からアジドメチルとともに目的分子を放出させることができることを見出した。また、目的分子を消光剤とし、電子受容体構造と結合させた核酸プローブにフルオレセイン等の蛍光剤を結合させておくことにより、単体では蛍光を発色しないが、電子供与体構造が結合した核酸プローブとともに標的核酸配列にハイブリダイズすることにより消光剤が遊離して核酸プローブの蛍光剤が蛍光を発することになり、この蛍光を検出することによって標的核酸配列を検出できることを見出し本発明を完成した。
すなわち、本発明によれば、標的核酸配列の一部に対して相補的な塩基配列を有する第１の核酸プローブに電子供与体構造を結合させた電子供与体−第１核酸プローブ分子と、
上記標的核酸配列の一部から所定の間隔で隔てられた近傍の核酸配列に対して相補的で、かつ上記第１の核酸プローブと異なる塩基配列を有する第２の核酸プローブに、目的分子とアジド基とを有する電子受容体構造を結合させた目的分子−電子受容体−第２核酸プローブ分子とを
それぞれ上記標的核酸配列にハイブリダイズさせ、かつ上記電子供与体構造が上記目的分子−電子受容体構造に作用して上記目的分子を放出させる工程を含む、目的分子を放出させる方法が提供される。
好ましくは、本発明の目的分子を放出させる化学構造は、上記標的核酸配列において、上記第２の核酸プローブの塩基配列に相補的な塩基配列が上記第１の核酸プローブの塩基配列に相補的な塩基配列よりも３’側にあり；
上記電子供与体−第１核酸プローブ分子において、上記電子供与体構造が上記第１の核酸プローブの５’末端部分に結合し；および
上記目的分子−電子受容体−第２核酸プローブ分子において、上記電子受容体構造が上記第２の核酸プローブの３’末端部分に結合している。
好ましくは、本発明の目的分子を放出させる化学構造は、上記標的核酸配列において、第２の核酸プローブの塩基配列に相補的な塩基配列が上記第１の核酸プローブの塩基配列に相補的な塩基配列よりも５’側にあり；
上記電子供与体−第１核酸プローブ分子において上記電子供与体構造が上記第１の核酸プローブの３’末端部分に結合し；および、
上記目的分子−電子受容体−第２核酸プローブ分子において上記電子受容体構造が上記第２の核酸プローブの５’末端部分に結合している。
好ましくは、本発明の目的分子を放出させる化学構造は、上記標的核酸配列において、上記第２の核酸プローブの塩基配列に相補的な塩基配列が上記第１の核酸プローブの塩基配列に相補的な塩基配列と直接または１〜２０個の塩基を介して位置する。
好ましくは、本発明の目的分子を放出させる化学構造は、上記電子供与体構造が還元剤を含む構造であり、より好ましくはジフェニルフォスフィン基を含む構造である。
さらに好ましくは、本発明の目的分子を放出させる化学構造は、上記電子受容体構造が下記式（１）で表される。
（上記式（１）中、Ｙ1およびＹ2はそれぞれ独立に、水素原子、炭素数１から６のアルキル基、炭素数１から６のアルコキシ基、炭素数６から１０のアリール基、またはシアノ基を表し、Ｒ1は目的分子の残基を表し、Ｒ2は核酸と結合するための反応基を表す。）
好ましくは、本発明の目的分子を放出させる化学構造は、上記Ｒ2が下記式（２）で表される反応基であるが、これに限定されるものではない。
本発明の目的分子を放出させる方法において、上記標的核酸はＤＮＡまたはＲＮＡである。
本発明の目的分子を放出させる方法において、上記目的分子は毒物、医療用医薬または種々の目的からなる試薬であり、試薬の例としては消光剤が挙げられるが、より好ましくはIPTG(イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド)、又はダブシルが例示される。
さらに本発明の別の側面によれば、標的核酸配列の一部に対して相補的な塩基配列を有する第１の核酸プローブに電子供与体構造を結合させた電子供与体−第１核酸プローブ分子と、
上記標的核酸配列の一部から所定の間隔で隔てられた近傍の核酸配列に対して相補的かつ上記第１の核酸プローブと異なる塩基配列および蛍光剤を有する第２の核酸プローブに、消光剤とアジド基とを有する電子受容体構造を結合させた消光剤−電子受容体−蛍光剤結合第２核酸プローブ分子（以後、消光剤−電子受容体−蛍光剤プローブともいう）とを、
上記標的核酸配列にハイブリダイズさせ、かつ上記電子供与体構造が上記消光剤−電子受容体−蛍光剤構造に作用して上記消光剤を放出させる工程、および
上記ハイブリダイズさせた複合体の蛍光を測定する工程
を含む、標的核酸を検出する方法が提供される。
好ましくは、本発明の標的核酸配列を検出する化学構造は、上記標的核酸配列において、上記第２の核酸プローブの塩基配列に相補的な塩基配列が上記第１の核酸プローブの塩基配列に相補的な塩基配列よりも３’側にあり；
上記電子供与体−第１核酸プローブ分子において、上記電子供与体構造が上記第１の核酸プローブの５’末端部分に結合し；および、
上記消光剤−電子受容体−蛍光剤プローブにおいて、上記電子受容体構造が上記第２の核酸プローブの３’末端部分に結合している。
好ましくは、本発明の標的核酸配列を検出する化学構造は、上記標的核酸配列において、上記第２の核酸プローブの塩基配列に相補的な塩基配列が上記第１の核酸プローブの塩基配列に相補的な塩基配列よりも５’側にあり；
上記電子供与体−第１核酸プローブ分子において上記電子供与体構造が上記第１の核酸プローブの３’末端部分に結合し；および、
上記消光剤−電子受容体−蛍光剤プローブにおいて上記電子受容体構造が上記第２の核酸プローブの５’末端部分に結合している。
好ましくは、本発明の標的核酸配列を検出する化学構造は、上記標的核酸配列において、上記第２の核酸プローブの塩基配列に相補的な塩基配列が上記第１の核酸プローブの塩基配列に相補的な塩基配列と直接または１〜２０個の塩基を介して位置する。
好ましくは、本発明の標的核酸配列を検出する化学構造は、上記電子供与体構造が還元剤を含む構造であり、より好ましくはジフェニルフォスフィン基を含む構造である。
好ましくは、本発明の標的核酸配列を検出する方法は、上記電子受容体構造が下記式（２）で表される化合物である。
（上記式（３）中、Ｙ1およびＹ2はそれぞれ独立に、水素原子、炭素数１から６のアルキル基、炭素数１から６のアルコキシ基、炭素数６から１０のアリール基、またはシアノ基を表し、Ｒ1は消光剤の残基を表し、Ｒ2は核酸と結合するための反応基を表す。）
好ましくは、本発明の標的核酸配列を検出する方法は、上記Ｒ2が下記式（４）で表される反応基である。
好ましくは、本発明の標的核酸配列を検出する方法においては、上記標的核酸がＤＮＡまたはＲＮＡである。
好ましくは、本発明の標的核酸配列を検出する方法においては、上記消光剤がダブシルである。
好ましくは、本発明の標的核酸配列を検出する方法においては、上記蛍光剤がフルオレセインである。
さらに本発明の別の側面によれば、下記式（５）で表される化合物が提供される。
（上記式（５）中、Ｙ1およびＹ2はそれぞれ独立に、水素原子、炭素数１から６のアルキル基、炭素数１から６のアルコキシ基、炭素数６から１０のアリール基、またはシアノ基を表し、Ｒ1は目的分子の残基を表し、Ｒ2は水素原子、ハロゲン原子または核酸と結合するための反応基を表す。）
好ましくは、本発明の上記式（５）で表される化合物は、上記Ｒ1が消光剤であり、より好ましくは下記式（６）で表される。
さらに本発明の別の側面によれば、下記式（７）で表される化合物が提供される。
さらに本発明の別の側面によれば、本発明の目的分子を放出させる方法または本発明の標的核酸配列を検出する方法に使用するための本発明の化合物が提供される。
本発明によれば、電子供与体−第１核酸プローブ分子及び目的分子−電子受容体−第２核酸プローブ分子を用いて、標的核酸配列を感知して目的分子を放出させる方法が提供される。本発明の目的分子を放出させる方法は、生体内の分解酵素の影響を受けずに、遺伝子情報に基づき特定の部位に高い選択性で目的分子を放出させることができる。したがって、本発明の目的分子を放出させる方法を応用すれば、細胞内で発現している種々の疾患遺伝子を標的とした核酸プローブと、目的分子として異常細胞を局所的に破壊する毒剤や、正常化させる薬剤等を用いることにより、種々の疾患を改善せしめる治療薬を創製することができる。すなわち本発明は、疾患により異常化した細胞に直接作用し、かつ副作用の少ない治療薬の創製の基盤となる非常に有用な技術である。さらに本発明によれば、目的分子を消光剤とし、消光剤とアジド基とを有する電子受容体構造が結合する核酸プローブに蛍光剤を結合させることにより、標的核酸配列を検出する方法が提供される。本発明の標的核酸配列を検出する方法は、生体内で分解を受けず、高いシグナル・バックグラウンド比を持つため、高感度遺伝子検出が可能になるとともに、細胞内、生体内での遺伝子検出イメージングが可能となる。さらに、本発明の標的核酸配列を検出する方法は、標的核酸配列を特定の疾患遺伝子とすることにより、特定の疾患を誤りなく診断する診断薬として期待できる。さらに本発明は、他の試薬や酵素を用いる必要がないため、簡便・安価であり、試験管内のみではなく、細胞内あるいは生体内での遺伝子検出が可能となる。さらに、本発明の標的遺伝子を放出させる方法は、安定性が高く（長期間活性）かつ高感度であり、微量の遺伝子シグナルを増幅し、観察することが可能である。これらの本発明の効果は、具体的に本発明の化合物によりもたらされうる。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本発明の目的分子を放出させる方法は、標的核酸配列の一部に対して相補的な塩基配列を有する第１の核酸プローブに電子供与体構造を結合させた電子供与体−第１核酸プローブ分子と、
上記標的核酸配列の一部から所定の間隔で隔てられた近傍の核酸配列に対して相補的で、かつ上記第１の核酸プローブと異なる塩基配列を有する第２の核酸プローブに、目的分子とアジド基とを有する電子受容体構造を結合させた目的分子−電子受容体−第２核酸プローブ分子とを
それぞれ上記標的核酸配列の一部および所定の間隔で隔てられた近傍の核酸配列にハイブリダイズさせ、かつ上記電子供与体構造が上記目的分子−電子受容体構造に作用して上記目的分子を放出させる工程を含む、目的分子を放出させる方法である。本発明の目的分子を放出させる方法の概略を図１に示す。
本明細書にいう「目的分子」とは、生体内の特定の部位で放出させることを目的とした分子を意味する。目的分子の種類は特に制限されないが、例えば、医療用医薬、毒物、抗体、ワクチン、消光剤を含む各種試薬などが好ましい。薬剤としては、例えば、抗癌剤、抗アレルギー剤、抗感染症剤、抗リウマチ剤、抗神経性疾患剤、抗血液疾患剤、抗代謝異常剤、抗骨髄疾患剤などの薬剤が好ましい。毒物としては、例えば、核酸、タンパク質または細胞に作用して局所的に異常細胞を破壊することにより、上記体内異常を正常化させる毒剤が好ましい。
目的分子の分子量は、例えば、１００〜１０００００であり、好ましくは１００〜５００００であり、さらに好ましくは１００〜２５０００であり、なおさらに好ましくは１００〜１００００であり、最適に好ましくは１００〜１０００である。
本明細書にいう「電子供与体構造」とは、電子を放出しやすい性質を有する構造を意味する。電子供与体構造は、電子を放出しやすい性質を有していれば特に制限されないが、例えば、硫黄化合物や三価のリン化合物などの還元剤、好ましくはジフェニルフォスフィン、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）、トリフェニルフォスフィン、アルキルフォスフィンなどを含む構造が挙げられる。ジフェニルフォスフィン基などの電子供与体構造の入手方法は特に制限されないが、市場から入手するか、または公知の合成法により入手し得る。
本明細書にいう「電子受容体構造」とは、電子を受け取りやすい性質を有する構造を意味する。さらに本明細書にいう「目的分子とアジド基とを有する電子受容体構造」とは、目的分子を結合した上記性質を供す官能基がアジド基である電子受容体構造であって、電子供与体構造からアジド基が電子を受け取ると構造変化が起こり、目的分子を遊離させる性質を有する構造を意味する。このような目的分子の結合とアジド基とを有する電子受容体構造は、目的分子が結合し、かつ上記の電子を受け取りやすい性質がアジド基により達成される電子受容体構造であれば特に制限されないが、例えば、下記式（８）で示される構造が好ましい。
（上記式（８）中、Ｙ1およびＹ2はそれぞれ独立に、水素原子、炭素数１から６のアルキル基、炭素数１から６のアルコキシ基、炭素数６から１０のアリール基、またはシアノ基を表し、Ｒ1は目的分子の残基を表し、Ｒ2は核酸と結合するための反応基を表す。）
本明細書でいうＲ2が有する「核酸と結合するための反応基」としては、保護されたアミド基、アミノ基、カルボン酸基、エチニル基、ハロゲン、アジド基、チオール基、アルデヒド基などを挙げることができる。これらは連結基を有していてもよい。なお、アミド基の保護基として、ｔ−ブトキシカルボニル基などのウレタン系保護基、ベンゾイル基などのアシル系保護基、トリチル基などのアルキル系保護基、ジメチルアセタールなどのイミン系保護基などがあげられる。置換基としては、核酸と反応して結合できる反応性基が好ましく、例えば、ハロゲン原子などを挙げることができる。Ｒ2が有する核酸と結合するための反応基の具体例としては、下記式（９）で示される反応基、−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ2−ＮＨＣＯ−ＣＨ2Ｂｒ、−Ｎ3、−Ｃ≡ＣＨ、−ＳＨ、−ＮＨ2、−ＣＯ2Ｈ、−ＣＨＯ、並びに以下に示す基などを挙げることができる。
ＤＮＡ結合には、ブロモアセチル(BrCH2CO‐)が重要であり、電子受容体とブロモアセチルの間のリンカーとしては上記以外にも任意のリンカーを用いることができる。ブロモアセチル基と電子受容体とのリンカーとしては、例えば、主鎖炭素数1〜２０の飽和もしくは不飽和非環式炭化水素又は炭素数3〜10の脂肪族もしくは芳香族環式炭化水素もしくはこれらが複合したものが好ましく、鎖又は環に、置換基を有してもよい。また、鎖又は環に、ヘテロ原子（例えば、酸素原子又は窒素原子など）を含んでいてもよい。また、２種以上の異なるリンカーを組み合わせて用いてもよい。
上記置換基としては、例えば、アルキル基（炭素数が1〜４の低級アルキル基であって分枝していてもよい）、アシル基、アリール基、アルコキシヒドロキシ基（炭素数が1〜４の低級アルキル基であって分枝していてもよい）、ケト基、アミノ基（炭素数が１〜２の低級アルキル基で置換されていてもよい）、オキソ基、アセチル基、ホルミ基が挙げられる。
本明細書でいう「アルキル基」としては、例えば、炭素数１から６のアルキル基を挙げることができ、直鎖又は分岐鎖の何れでもよく、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、又はヘキシル基を挙げることができる。
本明細書でいう「アシル基」としては、例えば、炭素数１から６のアシル基を挙げることができ、具体的にはアセチル基、プロピオニル基などを挙げることができる。
本明細書でいう「アリール基」としては、例えば、炭素数６から１０のアリール基を上げることができ、具体的にはフェニル基、ナフチル基などを挙げることができる。
本明細書でいう「アルコキシ基」としては、例えば、炭素数１から６のアルコキシ基を挙げることができ、直鎖又は分岐鎖の何れでもよく、具体的にはメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基、ペンチルオキシ基、又はヘキシルオキシ基などを挙げることができる。
目的分子とアジド基とを有する電子受容体構造の入手方法は特に制限されないが、例えば、実施例で示す方法により合成して入手し得る。
本明細書にいう「電子供与体−第１核酸プローブ分子」とは、標的核酸配列の一部に対して相補的な塩基配列を有する第１の核酸プローブであって、３’末端部分または５’末端部分に電子供与体構造を結合させた核酸プローブを意味する。さらに、本明細書にいう「３’末端部分」とは３’末端に位置する１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個程度の塩基配列を、「５’末端部分」とは５’末端に位置する１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個程度の塩基配列をそれぞれ意味する。
電子供与体−第１核酸プローブ分子は、市場で入手しても構わないし、合成により得ても構わない。電子供与体−第１核酸プローブ分子を合成により得る場合は、標的核酸配列の一部に対して相補的な塩基配列を決定し、公知のオリゴヌクレオチド合成法、例えば、ホスホロアミダイト法に基づいて第１の核酸プローブを合成した後、合成または市場から入手して得た電子供与体構造、例えば、トリフェニルフォスフィンを該核酸プローブの３’末端部分または５’末端部分に結合させる。上記した電子供与体構造を核酸プローブの末端に結合させる方法は、特に制限されないが、例えば、５’アミノ修飾オリゴと反応させることにより結合させる。
本明細書にいう「目的分子−電子受容体−第２核酸プローブ分子」とは、上記標的核酸配列の一部から所定の間隔で隔てられた近傍の核酸配列に対して相補的で、かつ上記第１の核酸プローブと異なる塩基配列を有する第２の核酸プローブと、５’末端部分または３’末端部分に目的分子とアジド基とを有する電子受容体構造を結合させた分子である。目的分子と電子受容体は直接結合させてもよいし、リンカーを介して結合させてもよい。電子受容体構造とリンカー、又は電子受容体構造と目的分子との結合部位は、Ｏ、Ｎ、Ｓのいずれかであることが好ましいが、特に限定されるものではない。
「リンカー」とは、目的分子と電子受容体構造とを架橋可能なものであれば特に限定されない。
リンカーとしては、目的分子と電子受容体構造との結合部位となる官能基を有する主鎖炭素数1〜１０の飽和もしくは不飽和非環式炭化水素又は炭素数3〜10の脂肪族もしくは芳香族環式炭化水素もしくはこれらが複合したものが好ましく、鎖又は環に、置換基を有してもよい。また、鎖又は環に、ヘテロ原子（例えば、酸素原子又は窒素原子など）を含んでいてもよい。また、２種以上の異なるリンカーを組み合わせて用いてもよい。
上記置換基としては、例えば、アルキル基（炭素数が1〜４の低級アルキル基であって分枝していてもよい）、アシル基、アリール基、アルコキシヒドロキシ基（炭素数が1〜４の低級アルキル基であって分枝していてもよい）、ケト基、アミノ基（炭素数が１〜２の低級アルキル基で置換されていてもよい）、オキソ基、アセチル基、アルデヒド基が挙げられる。
目的分子−電子受容体−第２核酸プローブ分子は、市場で入手しても構わないし、合成により得ても構わない。電子受容体プローブを合成により得る場合は、標的核酸の所望の配列に対して相補的な塩基配列であり、かつ上記第１の核酸プローブと異なる塩基配列を決定し、公知のオリゴヌクレオチド合成法、例えば、ホスホロアミダイト法に基づいて第２の核酸プローブを合成した後、合成または市場から入手して得た目的分子とアジド基とを有する電子供与体構造、例えば、消光剤が結合した化合物１９を該核酸プローブの３’末端部分または５’末端部分に結合させる。上記した目的分子とアジド基とを有する電子受容体構造を核酸プローブの末端に結合させる方法は特に制限されないが、例えば、３’ホスホロチオエートオリゴと反応させることにより結合させうる。詳細については、実施例で示す。
上記した第１および第２の核酸プローブの長さは、例えば、５〜１０００であり、好ましくは５〜１００であり、さらに好ましくは５〜５０であり、なおさらに好ましくは５〜２５であり、最も好ましくは８〜１５塩基である。
電子供与体−第１核酸プローブ分子における第１の核酸プローブと電子供与体構造の結合部位および目的分子−電子受容体−第２核酸プローブ分子における第２の核酸プローブと目的分子とアジド基とを有する電子受容体構造の結合部位は、電子供与体−第１核酸プローブ分子と目的分子−電子受容体−第２核酸プローブ分子が標的核酸配列にハイブリダイズする位置により決定される。
すなわち、標的核酸配列において、第２の核酸プローブの塩基配列に相補的な塩基配列が第１の核酸プローブの塩基配列に相補的な塩基配列よりも３’側にある場合は、電子供与体−第１核酸プローブ分子において、電子供与体構造が第１の核酸プローブの５’末端に結合し、かつ目的分子−電子受容体−第２核酸プローブ分子において、電子受容体構造が第２の核酸プローブの３’末端に結合する。
一方、標的核酸配列において、第２の核酸プローブの塩基配列に相補的な塩基配列が第１の核酸プローブの塩基配列に相補的な塩基配列よりも５’側にある場合は、電子供与体−第１核酸プローブ分子において、電子供与体構造が第１の核酸プローブの３’末端部分に結合し、かつ目的分子−電子受容体−第２核酸プローブ分子において、電子受容体構造が第２の核酸プローブの５’末端部分に結合する。
電子供与体−第１核酸プローブ分子と目的分子−電子受容体−第２核酸プローブ分子がそれぞれ認識する標的核酸配列の領域は、上記両プローブが標的核酸配列にハイブリダイズした際に、目的分子−電子受容体−第２核酸プローブ分子中の電子受容体構造におけるアジド基が、電子供与体−第１核酸プローブ分子中の電子供与体構造の作用により還元されるという条件を満たす限りは、任意に設定することができる。電子供与体−第１核酸プローブ分子と目的分子−電子受容体−第２核酸プローブ分子がそれぞれ認識する標的核酸配列の領域は、上記条件を満たすためには、隣接または近接していることが一般的に好ましい。電子供与体−第１核酸プローブ分子と目的分子−電子受容体−第２核酸プローブ分子がそれぞれ認識する標的核酸配列の領域は、上記条件を満たすためには、例えば、１〜２０塩基、好ましくは１〜１０塩基、より好ましくは１〜５塩基、なおさらに好ましくは１〜３塩基程度のスペースを介して近接していることが好ましい。
本明細書にいう「電子供与体−第１核酸プローブ分子が目的分子−電子受容体−第２核酸プローブ分子に作用して目的分子を放出させる」ことは、電子供与体−第１核酸プローブ分子の電子供与体構造が還元剤として機能して、近接する目的分子−電子受容体−第２核酸プローブ分子の電子受容体構造におけるアジド基に電子を受け渡すことにより、電子受容体構造が構造変化を起こし、目的分子が遊離することを意味する。
本明細書にいう「標的核酸配列」とは、目的分子を放出させる部位を決定付ける標的となる核酸分子の塩基配列であって、例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡであり、好ましくはＲＮＡである。ＲＮＡの場合は、直鎖状であって二次構造をとらない配列であることが好ましい。
本発明の標的核酸配列を検出する方法とは、標的核酸配列に対して相補的な塩基配列を有する第１の核酸プローブに電子供与体構造を結合させた電子供与体−第１核酸プローブ分子と、上記標的核酸配列に対して相補的な塩基配列で、かつ上記第１の核酸プローブと異なる塩基配列および蛍光剤を有する第２の核酸プローブに、消光剤とアジド基とを有する電子受容体構造を結合させた消光剤−電子受容体−蛍光剤プローブとを、上記標的核酸配列にハイブリダイズさせ、かつ上記電子供与体−第１核酸プローブ分子が上記消光剤−電子受容体−蛍光剤プローブに作用して上記消光剤を放出させる工程、ならびに上記ハイブリダイズさせた複合体の蛍光を測定する工程を含む、標的核酸配列を検出する方法である。本発明の標的核酸配列を検出する方法の具体例を図３に示す。
本明細書にいう「蛍光剤を有する第２の核酸プローブ」とは、上記した塩基配列を有する第２の核酸プローブに蛍光剤を結合させた核酸プローブを意味する。蛍光剤を有する第２の核酸プローブの入手方法は特に制限されるものではないが、市場から入手するか、または公知の方法で合成することにより入手し得る。さらに、第２の核酸プローブにおいて蛍光剤が結合する位置は、消光剤による消光作用が働く限りにおいて制限されない。
本明細書にいう「消光剤とアジド基とを有する電子受容体構造」とは、上記した目的分子とアジド基とを有する電子受容体構造の目的分子が消光剤である構造を意味する。消光剤とアジド基を有する電子受容体構造の具体例は、例えば、下記式（１０）で表される。
（上記式（１０）中、Ｙ1およびＹ2はそれぞれ独立に、水素原子、炭素数１から６のアルキル基、炭素数１から６のアルコキシ基、炭素数６から１０のアリール基、またはシアノ基を表し、Ｒ2は核酸と結合するための反応基を表す。）
さらに、本明細書にいう「消光剤−電子受容体−蛍光剤プローブ」とは、上記した目的分子−電子受容体−第２核酸プローブ分子において、目的分子を消光剤とし、かつ第２の核酸プローブに蛍光剤が結合した核酸プローブを意味する。
消光剤−電子受容体−蛍光剤プローブにおける消光剤および蛍光剤の種類は特に制限されないが、消光剤によって蛍光剤の蛍光発色に対して消光作用が働く組み合わせを要する。例えば、そのような組み合わせは、消光剤がダブシルであり、蛍光剤がフルオレセインである組み合わせが望ましい。
本明細書にいう「ハイブリダイズさせた複合体の蛍光を測定する工程」とは、消光剤が放出することにより第２の核酸プローブに結合した蛍光剤の蛍光を測定する工程を意味する。蛍光を測定する方法は特に制限されないが、例えば、蛍光分光光度計を利用して蛍光を測定し得る。この場合、励起波長を４９０ｎｍとして、蛍光波長を４５０ｎｍとすることにより試料中の蛍光を測定し得る。
本発明の化合物とは、下記式（１１）で示される化合物である。
（上記式（１１）中、Ｙ1およびＹ2はそれぞれ独立に、水素原子、炭素数１から６のアルキル基、炭素数１から６のアルコキシ基、炭素数６から１０のアリール基、またはシアノ基を表し、Ｒ1は目的分子の残基を表し、Ｒ2は水素原子、ハロゲン原子または核酸と結合するための反応基を表す。）
本明細書にいう「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子を挙げることができる。
目的分子の一例として、消光剤を挙げることができ、より具体的には下記式（１２）で表される化合物を挙げることができる。
本発明の化合物の好ましい態様として、下記式（１３）で表される化合物を挙げることができる。化合物１９とした下記式（１３）で表される化合物の合成方法を図２に示した。
本発明の化合物は、本発明の目的分子を放出させる方法または本発明の標的核酸配列を検出する方法に使用することができる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
実施例
［実施例１］本発明の化合物（図２の化合物１９）の有機合成
（１）化合物３の合成（図２の化合物３）
アレクソポウロスらの文献(K. Alexopoulos et al., (2001), J. Med. Chem., 44, 328-338) に記載の方法により、化合物１（図２の化合物１）をＢｏｃ保護して化合物２（図２の化合物２）を得た後に、化合物２（２．２７９０ｇ，９．９ ｍｍｏｌ）と４−Ｉｏｄｏａｎｉｌｉｎｅ（２．４１５６ｇ，１１．０ｍｍｏｌ，１．１ｅｑ）をＤＭＦ（５０ｍｌ）に溶解し、ＷＳＣ（２．３１３０ｇ，１２．１ ｍｍｏｌ，１．２ｅｑ）を加え一晩撹拌した。化合物２の消失を確認した後、反応液をＥｔＯＡｃで希釈した。２Ｎ ＨＣｌ（２回）分液した後、ＮａＣｌ飽和水溶液で洗浄した。有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥した後、残渣をシリカゲルカラムで精製し、化合物３（４．１７０８ｇ，９．７ ｍｍｏｌ，９８％）を得た。
1H-NMR ( 400MHz, CDCl3 ) :δ 7.62-7.60, 7.31-7.29 ( each 2H, d, J= 8.8, 8.6 Hz ), 7.35 ( 1H, s ), 4.17 ( 2H, m ), 2.77 ( 2H, m ), 2.37 ( 1H, m ), 1.89 ( 2H, m ), 1.75 ( 2H, m ), 1.46 ( 9H, s )。
13C-NMR ( 99.5MHz, CDCl3 ) :δ 172.46, 154.49, 137.79, 137.42, 121.58, 87.47, 79.81, 44.39, 28.62, 28.51。
QSTAR (Applied Biosystems/MDS SCIEX)(ESI): [ MNa+ ] C17H23IN2NaO3 : 453.0651, found: 453.0654。
（２）化合物４（図２の化合物４）の合成
化合物３（２．９２３８ｇ，６．８ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2（１０ｍｌ）に溶解させた。ＴＦＡ（３０ｍｌ）を氷浴中で滴下した後、反応液を室温に戻し２時間撹拌した。原料の消失を確認し、トルエンを加えた後、溶媒を留去した。ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘａｎｅで化合物４（２．５６９２ｇ，５．８ｍｍｏｌ，８５％）を結晶化させた。
1H-NMR ( 400MHz, DMSO-d6 ) :δ 10.17 ( 1H, s ), 8.75, 8.46 ( each 1H, br ), 3.35 ( 2H, m ), 2.95-2.89 ( 2H, t, J= 12.0 Hz ), 2.63 ( 1H, m ), 1.97-1.93 ( 2H, d, J= 12.7 Hz ), 1.80 ( 2H, m )。
13C-NMR ( 99.5MHz, DMSO-d6 ) :δ 171.94, 138.67, 137.11, 121.24, 86.56, 42.41, 25.05.
QSTAR (Applied Biosystems/MDS SCIEX)(ESI): [ MH+ ] C12H16IN2O : 331.0307, found: 331.0308。
（３）化合物７（図２の化合物７）の合成
コマツらの文献(T. Komatsu et al., (2006), J. Am. Chem. Soc., 128, 15946-15947) に記載の方法により、化合物５（図２の化合物５）をＢｏｃ保護して化合物６（図２の化合物６）を得た。化合物６（０．１６６ｇ，０．７８ｍｍｏｌ，１．２ｅｑ）をＣＨ2Ｃｌ2 （３０ｍｌ）に溶解した。ｐ−Ｍｅｔｈｙｌ Ｒｅｄ（０．１７７ｇ，０．６６ｍｍｏｌ）、ＷＳＣ（０．２５３ｇ，１．３２ｍｍｏｌ，２ｅｑ）、ＴＥＡ（２滴）を加え、Ａｒ雰囲気下で一晩撹拌した。ＴＬＣ（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝２０：１）で化合物６の消失を確認した後、残渣をＣＨ2Ｃｌ2に溶解して２Ｎ ＨＣｌおよびＨ2Ｏで各々１度ずつ分液した。有機層を無水ＮａＳＯ4で乾燥した後、残渣をシリカゲルカラムで精製して化合物７（８０．９ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ，２６％）を得た。
1H-NMR ( 400MHz, CDCl3 ) :δ 7.91-7.83 ( 6H, m ), 6.77 ( 2H, d, J= 9.0 Hz ), 6.12-5.98 ( 1H, m ), 4.60-4.44 ( 1H, m ), 4.12-3.98, 3.69-3.48 ( each 1H, m ), 3.11 ( 6H, s ), 2.13-1.25 ( 8H, m ), 1.46 ( 9H, s )。
13C-NMR ( 99.5 MHz, CDCl3 ) :δ166.13, 154.87, 152.65, 143.49, 134.66, 127.60, 125.29, 122.16, 111.37, 48.29, 46.56, 40.35, 32.16, 31.94, 28.94, 28.52。
QSTAR (Applied Biosystems/MDS SCIEX)(ESI): [ MH+ ] C26H36N5O4 : 466.2818, found: 466.2805。
（４）化合物８の合成
化合物７（８０ｍｇ，０．１７ｍｍｏｌ）をＴＦＡ（６ｍｌ）に溶解し撹拌した。２時間後、ＴＬＣ（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝２０：１）で原料の消失を確認した。トルエンを加えた後、溶媒を留去して化合物８（１３２．６ｍｇ，０．３５ｍｍｏｌ，ｑｕａｎｔ）を得た。
1H-NMR ( 400MHz, CD3OD ) :δ 7.93-7.83 ( 6H, m ), 6.84-6.82 ( 2H, d, J= 9.0 Hz ), 3.90, 3.11 ( each 1H, m ), 2.11, 1.54 ( each 4H, m )。
13C-NMR ( 99.5 MHz, CD3OD ) :δ167.08, 153.07, 142.69, 133.98, 127.85, 125.96, 121.34, 111.91, 77.44, 77.19, 47.53, 40.31, 29.98, 29.28。
QSTAR (Applied Biosystems/MDS SCIEX)(ESI): [ MH+ ] C21H28N5O2 : 366.2294, found: 366.2289。
（５）化合物１１（図２の化合物１１）の合成
コマツらの文献(T. Komatsu et al., (2006), J. Am. Chem. Soc., 128, 15946-15947) に記載の方法により、化合物９（図２の化合物９）をアセチル化して化合物１０（図２の化合物１０）を得た。化合物１０（１．００３９ｇ，４．０ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１６ｍｌ）に溶解し、Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（０．７２００ｇ，６．３ｍｍｏｌ， １．６ｅｑ）、ＤＣＣ（１．０３１４ｇ，５．０ｍｍｏｌ，１．３ｅｑ）を加え一晩撹拌した。原料の消失を確認した後、反応液を濾過してジシクロヘキシル尿素を除去した。溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムで精製することにより化合物１１（１．２２８２ｇ，３．５ｍｍｏｌ，８８％）を得た。
1H-NMR ( 400MHz, CDCl3 ) :δ 7.57-7.55, 7.19-7.16 ( each 2H, d, J= 8.8, 8.8 Hz ), 6.34 ( 1H, s ), 2.81 ( 4H, s ), 2.30, 2.19 ( each 3H, s )。
13C-NMR ( 99.5MHz, CDCl3 ) :δ 169.37, 168.83, 167.36, 151.66, 129.50, 129.37, 122.16, 71.73, 33.88, 25.62, 24.97, 21.22, 20.56。
QSTAR (Applied Biosystems/MDS SCIEX)(ESI): [ MK+ ] C16H15KNO8 : 388.0435, found: 388.0418。
（６）化合物１２（図２の化合物１２）の合成
化合物４（０．７９０９ｇ，１．７８ｍｍｏｌ）と化合物１１（０．８０８３ｇ，２．３１ｍｍｏｌ，１．３ｅｑ）をＴＨＦ（１８ｍｌ）に溶解し、ＴＥＡ（２５０μｌ）を加え撹拌した。３時間後、化合物１１の消失を確認し、反応液をＥｔＯＡｃで希釈した。２Ｎ ＨＣｌで２度分液した後、ＮａＣｌ飽和水溶液で洗浄した。有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥させた。溶媒を留去後、残渣をシリカゲルカラムで精製することにより、化合物１２（０．９０９０ｇ，１．６１ｍｍｏｌ，９０％）を得た。
1H-NMR ( 400MHz, DMSO-d6 ) :δ 10.02-9.95 ( 1H, d, J= 28.3 Hz ), 7.63-7.53 ( 4H, m ), 7.45-7.43, 7.38-7.36 ( each 1H, d, J= 8.56, 8.56 Hz ) 7.21-7.16 ( 2H, m ), 6.42-6.36 ( 1H, d, J= 21.5 Hz ), 4.38-4.35, 4.11-3.94, 3.10, 2.85, 2.71-2.61, 1.56-1.48, 1.26-0.711 ( each 1H, m ), 2.27, 2.08 ( each 3H, s ), 1.81-1.73 ( 2H, m )。
13C-NMR ( 99.5MHz, DMSO-d6 ) :δ 172.61, 169.47, 168.86, 165.66, 165.22, 150.62, 137.07, 131.80, 129.29, 121.99, 121.12, 86.30, 72.09, 71.67, 44.16, 42.57, 41.11, 28.11, 27.81, 20.85, 20.54。
QSTAR (Applied Biosystems/MDS SCIEX)(ESI): [ MK+ ] C24H25IKN2O6 : 603.0394, found: 603.0382。
（７）化合物１３（図２の化合物１３）の合成
化合物１２（０．５９３９ｇ，１．０５ｍｍｏｌ）を１，４−ｄｉｏｘａｎｅ（１５ｍｌ）に溶解し、氷浴中で２Ｎ ＮａＯＨ（２５ｍｌ）を加え撹拌した。５分後、原料の消失を確認し、反応液にＨＣｌを滴下しｐＨ ２．０にした。反応液をＥｔＯＡｃで２度抽出した後、ＮａＣｌ飽和水溶液で洗浄した。有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥させた。溶媒を留去した後、残渣をシリカゲルカラムにて精製することにより、化合物１３（０．２７９５ｇ， ０．５８ｍｍｏｌ，５５％）を得た。
1H-NMR ( 400MHz, CD3OD ) :δ7.59-7.57, 7.35-7.28, 7.22-7.18, 6.80-6.76( each 2H, m ), 5.36-5.30 ( 1H, d, J= 23.7 Hz ) 4.62-4.59, 3.92-3.89, 2.99, 2.79-2.76, 2.51, 1.84-1.82, 1.66-1.64, 1.53-1.49, 0.94-0.92 ( each 1H, m )。
13C-NMR ( 99.5 MHz, CD3OD ) :δ174.98, 158.65, 139.55, 138.67, 131.41, 129.67, 122.90, 116.59, 87.62, 72.63, 61.50, 45.56, 44.56, 43.14, 20.91, 14.53。
QSTAR (Applied Biosystems/MDS SCIEX)(ESI): [ MNa+ ] C20H21IN2NaO4 : 503.0444, found: 503.0436。
（８）化合物１４（図２の化合物１４）の合成
化合物１３（０．２７９５ｇ，０．５８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１．３ｍｌ）に溶解し、ＮａＩ（１５．９ｍｇ，０．１１ｍｍｏｌ，０．１８ｅｑ）を加え撹拌した。反応液を氷冷した後、ＴＨＦ（１．５ｍｌ）に溶解させたＫＯｔ−Ｂｕ（９７．２ｍｇ，０．８６ｍｍｏｌ，１．５ｅｑ）を滴化した。その後、ＣＨ3ＳＣＨ2Ｃｌ（７３μｌ，０．８７ｍｍｏｌ，１．５ｅｑ）を加え室温で撹拌した。４．５時間後、ＴＬＣで原料の消失を確認した。反応液をＥｔＯＡｃで希釈し、Ｈ2Ｏ（２回）で分液後、ＮａＣｌ飽和水溶液で洗浄した。有機層を無水ＮａＳＯ4で乾燥後、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムで精製することにより、化合物１４（０．２４６７ｇ，０．４６ｍｍｏｌ，７８％）を得た。
1H-NMR ( 400MHz, DMSO-d6 ) :δ 9.99-9.96 ( 1H, d, J= 13.9 Hz ), 7.60, 7.43-7.35, 7.29-7.23, 6.98 ( each 2H, m ), 5.43-5.27 ( 1H, m ), 5.43-5.27 ( 1H, m ), 5.25 ( 2H, s ), 2.15 ( 3H, s ), 4.43-4.40, 3.97-3.92, 2.92, 2.76-2.65, 1.79, 1.63, 1.52-1.46, 1.34, 0.93 ( each 1H, m )。
13C-NMR ( 99.5MHz, DMSO-d6 ) :δ 172.65, 170.04, 163.56, 138.20, 137.05, 133.25, 127.70, 121.11, 115.64, 86.31, 70.87, 59.69, 43.75, 43.46, 41.29, 27.64, 20.78, 14.12。
QSTAR (Applied Biosystems/MDS SCIEX)(ESI): [ MNa+ ] C22H25IN2NaO4S : 563.04777 , found: 563.0469。
（９）化合物１５（図２の化合物１５）の合成
化合物１４（０．２６８５ｇ，０．５０ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2（１０ｍｌ）に溶解し、ＮＣＳ（８５．５ｍｇ，０．６４ｍｍｏｌ，１．３ｅｑ）を加え、撹拌した。５分後、ＴＭＳＣｌ（７６μｌ，０．５９ｍｍｏｌ，１．２ｅｑ）を加えた。１時間後、反応液をＣＨＣｌ3で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ3（２回）で分液後、ＮａＣｌ飽和水溶液で洗浄した。有機層を無水ＮａＳＯ4で乾燥後、溶媒を留去した。残渣をＤＭＦ（９ｍｌ）に溶解し、ＮａＮ3（４９．８ｍｇ，０．７７ｍｍｏｌ，１．５ｅｑ）をＨ2Ｏ（５ｍｌ）に溶解させたものを加えて撹拌した。１．５時間後、反応液に飽和ＮａＨＣＯ3を加えた後、ＥｔＯＡｃで２度抽出した後、ＮａＣｌ飽和水溶液で洗浄した。有機層をＮａ2ＳＯ4で乾燥させた。溶媒を留去した後、残渣をシリカゲルカラムにて精製することにより化合物１５（８５．６ｍｇ，０．１６ｍｍｏｌ，３２％）を得た。
1H-NMR ( 400MHz, DMSO-d6 ) :δ 9.98-9.95 ( 1H, d, J= 13.9 Hz ), 7.60, 7.43-7.38, 7.33-7.31, 7.04-7.02 ( each 2H, m ), 5.49-5.47 ( 1H, m ), 5.38 ( 2H, s ), 4.43-4.39, 4.06-3.93, 3.65, 2.92-2.89, 2.78-2.66, 1.63, 1.53-1.46, 1.35-1.32 ( each 1H, m )。
13C-NMR ( 99.5MHz, DMSO-d6 ) :δ 172.64, 170.12, 155.24, 138.81, 137.04, 134.30, 128.80, 127.94, 121.13, 115.54, 86.30, 78.78, 70.58, 70.18, 59.69, 43.82, 42.44, 41.29, 33.27, 28.42, 28.06, 27.92, 22.63, 20.78, 15.00, 14.78, 14.11。
QSTAR (Applied Biosystems/MDS SCIEX)(ESI): [ MK+ ] C21H22IKN5O4 : 574.0354 , found: 574.0335。
（１０）化合物１７の合成
化合物１５（８４．９ｍｇ，０．１６ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2（８ｍｌ）に溶解し、４−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｃｈｌｏｒｏｆａｒｍａｔｅ（１２９ｍｇ，０．６４ｍｍｏｌ，４ｅｑ）、ＴＥＡ（２２０μｌ，１．５８ｍｍｏｌ，９．９ｅｑ）を加えた。３時間後、ＴＬＣにより原料の消失を確認した。反応液をＣＨＣｌ3で希釈し、Ｈ2Ｏ（２回）で分液した後、ＮａＣｌ飽和水溶液で洗浄した。有機層を無水ＮａＳＯ4で乾燥後、溶媒を留去した。残渣をシリカゲルカラムにて精製し、化合物１６（図２の化合物１６）を得た。
化合物１６をＣＨ2Ｃｌ2（８ｍｌ）に溶解し、化合物８（４４．２ｍｇ，０．０９２ｍｍｏｌ，０．５ｅｑ）、ＴＥＡ（１００μｌ，０．７１７ｍｍｏｌ，４．５ｅｑ）を加え一晩撹拌した。反応液を３５℃で２．５時間加熱し、ＴＬＣにより化合物１６の消失を確認した。反応液をＣＨＣｌ3で希釈し、Ｈ2Ｏ（２回）で分液した後、ＮａＣｌ飽和溶液で洗浄した。有機層を無水ＮａＳＯ4で乾燥後、溶媒を留去した。残渣をカラムにて精製することにより、化合物１７（５２．８ｍｇ，０．０５７ｍｍｏｌ，３６％（２ｓｔｅｐｓ））を得た。
1H-NMR ( 400MHz, CDCl3 ) :δ7.89-7.85 ( 6H, t, J= 8.2 Hz ), 7.59-7.57, 7.40-7.29, 7.04-7.02, 6.79-6.77 ( each 2H, m ), 6.25-6.22 ( 1H, d ), 6.11 ( 1H, m ), 5.19 ( 2H, s ), 4.55 ( 1H, m ), 3.94 ( 2H, m ), 3.45-3.37 ( 4H, m ), 3.12 ( 6H, s ), 2.85-2.78 ( 2H, m ), 2.47 ( 1H, m ), 2.09 ( 4H, m ), 1.91-1.62 ( 4H, m ), 1.40 ( 6H, m ).
13C-NMR ( 99.5MHz, CDCl3 ) :δ 172.76, 167.50, 166.93, 154.62, 152.62, 143.18, 137.84, 137.41, 134.38, 129.42, 127.67, 125.11, 121.76, 121.40, 116.13, 111.25, 86.97, 79.32, 72.17, 44.40, 42.83, 42.09, 40.09, 31.21, 29.58, 28.01.
QSTAR (Applied Biosystems/MDS SCIEX)(ESI): [ MH+ ] C43H48IN10O6 : 927.2803 , found: 927.2801.
（１１）化合物１９（図２の化合物１９）の合成
化合物１７（５２．８ｍｇ，０．０５７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１．１ｍｌ）に溶解し、ブロモアセチルリンカーである化合物１８（図２の化合物１８；５２．８ｍｇ，０．３０２ｍｍｏｌ，５．３ｅｑ）、テトラキス（トリフェニルフォスフィン）Ｐｄ（６．６ｍｇ，０．００６ｍｍｏｌ，０．１ｅｑ）、ＣｕＩ（２．０ｍｇ，０．０１１ｍｍｏｌ，０．２ｅｑ）、およびＴＥＡ（４０μｌ，０．２８７ｍｍｏｌ，５．０ｅｑ）を加えた。３０分後、ＴＬＣにより原料の消失を確認した。溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムにて精製することにより、化合物１９（４８．１ｍｇ，０．０４９ｍｍｏｌ，８７％）を得た。
1H-NMR ( 400MHz, DMSO-d6 ) :δ10.09-10.02 ( 1H, d, J= 26.1 Hz ), 8.80, 8.33 ( each 1H, m ), 7.83-7.79 ( 6H, t, J= 7.9 Hz ), 7.63-7.61, 7.47-7.45, 7.33,7.07 ( each 2H, m ), 6.86-6.84 ( 2H, d, J= 9.0 Hz ), 6.24-6.20 ( 1H, d, J= 15.4 Hz ), 5.41 ( 2H, s ), 4.37 ( 1H, m ), 4.14-4.03 ( 4H, m ), 3.89 ( 2H, s ), 3.73-3.67 ( 1H, m ), 3.32 ( 4H, br ), 3.11 ( 6H, s ), 2.89-2.68 ( 1H, m ), 1.86-1.57 ( 6H, m ), 1.42-1.23 ( 6H, m )。
13C-NMR ( 99.5MHz, DMSO-d6 ) :δ 165.49, 164.58, 153.60, 152.56, 142.39, 134.74, 131.79, 129.64, 128.18, 124.85, 121.20, 118.76, 115.66, 111.40, 78.68, 31.36, 30.91, 29.26, 29.09, 25.51, 0.15。
QSTAR (Applied Biosystems/MDS SCIEX)(ESI): [ MH+ ] C48H53BrN11O7 : 974.3313 , found: 974.3301。
［実施例２］オリゴヌクレオチドの合成
全てのオリゴヌクレオチドは、０．２ μＭスケールのカラムを用いて、一般的なホスホロアミダイト法に基づいて、ＤＮＡ自動合成機（Ｈ−８−ＳＥ； Ｇｅｎｅ Ｗｏｒｌｄ）で合成した。塩基の脱保護およびＣＰＧ担体からの切り出しは、アンモニア水中で、５５℃、４時間インキュベートすることにより行った。オリゴヌクレオチドの精製は、逆相カラム（ＭｉｃｒｏＰｕｒｅ ＩＩ； Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にて行い、ＵＶ ａｂｓｏｒｂａｎｃｅを測定することにより濃度を決定した。
［実施例３］本発明の化合物（図２の化合物１９）が結合したＤＮＡプローブの作成
化合物１９の付加は、３’ホスホロチオエートオリゴと反応させることにより行った。３’ホスホロチオエートオリゴの合成は３’−リン酸ＣＰＧにはじめのモノマーをカップリングしたのち、ｓｕｌｆｒｉｚｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ （ Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ ）でＴｈｉｏ化することにより行った。反応は、３ ｍＭの化合物１９（ ｉｎ ＤＭＦ ）、３０ ｍＭ ＮａＢ ｂｕｆｆｅｒ、３００ μＭの３’ ホスホロチオエートオリゴ溶液を含む混合液を、室温で５時間激しく撹拌することにより行った（反応液中のＤＭＦ濃度は６０％）。反応液をＭｉｌｌｉ Ｑで希釈したのち、逆相ＨＰＬＣ（グラジエント条件：０−１００％ アセトニトリル／５０ ｍＭ 酢酸トリエチルアンモニウム）にて精製を行った。また、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ マススペクトロメトリーにより目的産物が得られていることを確認した。5'-AAGFluTGCTT化合物19-3': calculated mass, C155H177N42O63P8S 3915.2; found 3929.0.
［実施例４］ＤＮＡテンプレート上での反応および蛍光測定
実施例３で作製したダブシルとアジド基を有する化合物１９と蛍光剤を結合させたＤＮＡプローブ５’−ＡＡＧFluＴＧＣＴＴ化合物19−３’、５’側にトリフェニルフォスフィン基を結合させたＤＮＡプローブ５’−TPPＴＴＧ ＡＡＣ ＴＣ−３’および配列表に記載の配列番号１のＤＮＡテンプレートを反応させ（図４Ａ）、その後蛍光測定した。反応は、それぞれ５０ ｎＭのＤＮＡテンプレート、５’ トリッフェニルフォスフィン結合プローブ、化合物１９結合プローブをＬｉｇａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ中（ ２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， １００ ｍＭ ＭｇＣｌ２， ０．０１ ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ； ｐＨ ７．２ ）において、３７℃で反応させることにより行った。ＤＮＡテンプレートに特異的なシグナル発生を確認するため、ＤＮＡテンプレートが存在しない条件でも蛍光シグナルの経時変化を測定し比較した（図４Ｂ）。
蛍光シグナルは、蛍光分光光度計（ ＦＰ−６５００； ＪＡＳＣＯ ）を用いて解析した。３０、９０、１８０分後に蛍光を測定し、励起波長は４９０ｎｍ、蛍光波長は４５０ｎｍとした。
その結果、ＤＮＡテンプレートが存在すると蛍光シグナルが増大した。一方、ＤＮＡテンプレートが存在しない場合では、蛍光シグナルの増加はほとんど観察されなかった（図４Ｂ）。したがって、ＤＮＡプローブセットが目的分子である消光剤をリリースし標的核酸配列特異的に蛍光シグナルを発生することが明らかとなった。すなわち、本実施例により標的核酸配列特異的に第２の核酸プローブに結合させた目的分子を放出することができることが明らかとなった。
[実施例５]
細胞内での遺伝情報に基く薬剤放出の実施を試みた。放出分子としてIPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)を用いた。その放出により、タンパク質の発現が誘導される。本実験では、大腸菌内でのAcGFP蛍光タンパク質の発現量によりその効果を観測した（図５）。
[実験方法]
（１）化合物20の合成
化合物15(0.2060 g, 0.38 mmol) をCH2Cl2 (20 ml)に溶解し、 4-ニトロフェニルクロロホルメート (0.3893 g, 1.93 mmol, 5.0 eq )及びTEA(490μl, 3.52 mmol, 9.1 eq) を添加した。反応液を2.5時間攪拌した。反応液をCHCl3で希釈し、水と分液後、食塩水で洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥し、溶媒を留去した。残渣をフラッシュクロマトグラフィーで精製して化合物16を得た。化合物16をピリジン(4 ml)に溶解し、IPTG(0.0953 g, 0.40 mmol, 1.0 eq) 及びDMAP(7.1 mg, 0.06 mmol, 0.2 eq)を添加した。反応液を18時間攪拌した。反応液を酢酸エチルで希釈し、水と分液後、食塩水で洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥し、溶媒を留去した。残渣をフラッシュクロマトグラフィーで精製して化合物20 (78.2 mg, 0.10 mmol, 25% (2steps))を得た。
QSTAR (Applied Biosystems/MDS SCIEX)(ESI-Q-TOF): [ MNa+ ] C31H36BrN5NaO10S : 822.1276 , found: 822.1299.
（２）化合物21の合成
化合物20(27.7 mg, 0.053 mmol)及び2-ブロモ-N-(プロパルギル)アセトアミド(31.6 mg, 0.18 mmol, 5.2 eq)をDMF (0.7 ml)に溶解し、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム(5.4 mg, 0.005 mmol, 0.1 eq), ヨウ化銅(I)(2.1 mg, 0.01 mmol, 0.3 eq)及びTEA (24μl, 0.17 mmol, 5.0 eq)を添加した。反応液を1時間攪拌した。溶液を濃縮し、残渣をフラッシュクロマトグラフィーで精製して化合物21(19.3 mg, 0.02 mmol, 66%)を得た。
QSTAR (Applied Biosystems/MDS SCIEX)(ESI-Q-TOF): [ MNa+ ] C36H43BrN6NaO11S : 869.1786 , found: 869.1767.
（３）化合物21が結合したDNAプローブの作成
23srRNAを標的核酸配列とし（Bernhard M. Fuchs et al, Applied and Environmental Microbiology, Feb. 2001, p.961-968）、化合物21付加DNAプローブおよび電子供与プローブとしてマッチ配列(Seq01)およびミスマッチ配列(Seq02)の2種類のプローブを合成した（配列番号２から４）。
化合物21の付加は、3' phoshorothioateオリゴと反応させることにより行った。3' phoshorothioateオリゴの合成は3'-phoshate CPGにはじめのモノマーをカップリングしたのち、sulfrizing reagentでThio化することにより行った。反応は、3 mMの化合物21( in DMF )、80 mM TEAA buffer、200 μMの3' phoshorothioateオリゴ溶液を含む混合液を、室温で5時間激しく撹拌することにより行った(反応液中のDMF濃度は80％)。反応液をMilli Qで希釈したのち、逆相HPLC(グラジエント条件:0-100％ acetonitrile/50 mM TEAA buffer )にて精製を行った。また、MALDI-TOF mass spectrometryにより目的産物が得られていることを確認した。
5'-GCTGGCGGTCTGGGT-IPTG-3': calculated mass, C183H227N63O105P15S2 5514.99; found 5519.36.
（４）大腸菌内へのプローブの導入
pAcGFP1 vectorを形質転換した大腸菌JM109をLB/Amp培地中で37℃、１晩、前培養した。OD600=0.6になるように菌体を回収し菌体をbuffer (0 or 50 μM プローブ, 20 mM Tris-HCl(pH7.2), 0.9 M NaCl, 0.1% SDS) 50μlに懸濁した。37℃で30分間インキュベートした後にSOC培地950 μlを加えさらに1時間インキュベートした。1時間後、菌体を100 μlにまで濃縮し、900 μl LB/Amp培地を加えた。37℃で振とう撹拌し、36時間後に菌体を回収し、FACSにて測定した。
[結果]
FACSによる測定結果を図６に示す。ランダム配列であるSeq02を用いた場合にはGFPタンパクの発現量がIPTGを加えていないもの(cell only)と同程度にとどまっていることから、IPTGの放出が起こっていないことが示された。それに対しマッチ配列であるSeq01を用いた場合cell onlyと比較して明らかな蛍光の増加が見られ、IPTGが配列特異的に放出されていることが確認できた。以上のことから、開発したプローブは、細胞内においても遺伝子配列特異的に薬剤の放出を行うことができることが示された。
図１は、電子供与体構造（図中の「ｔｒｉｇｇｅｒ」）を有する第１の核酸プローブ（図中の「ｐｒｏｂｅ １」）と、目的分子（図中の「ｄｒｕｇ」）とアジド基とを有する電子受容体構造を有する第２の核酸プローブ（図中の「ｐｒｏｂｅ ２」）とが標的核酸配列（図中の「ｍＲＮＡ」）にハイブリダイズし、かつｐｒｏｂｅ １がｐｒｏｂｅ ２に作用して、電子受容体構造の構造変化が起こり目的分子を放出させる、本発明の目的分子を放出させる方法の概略を示す。 図２は、化合物１９の有機合成スキームを示す。 図３は、電子供与体構造を有する第１の核酸プローブ（図中の「ｐｒｏｂｅ １」）と、消光剤が結合し、かつアジド基を有する電子受容体構造（図中の「ｄｒｕｇ」）および蛍光剤を有する第２の核酸プローブ（図中の「ｐｒｏｂｅ ２」）とが標的核酸配列（図中の「ｍＲＮＡ」）にハイブリダイズし、かつｐｒｏｂｅ １がｐｒｏｂｅ ２に作用して、電子受容体構造の構造変化が起こり目的分子を放出させる、本発明の標的核酸配列を検出する方法の概略を示す。 図４Ａはダブシルとアジド基を有する化合物１９（図中「Ｄ」）と蛍光剤（図中「Ｆ」）を結合させたＤＮＡプローブ、５’側にトリフェニルフォスフィン基（図中「ＰＰＨ2」）を結合させたＤＮＡプローブ、および配列表に記載の配列番号１のＤＮＡテンプレートを示し、図４Ｂは上記ＤＮＡプローブセットおよびＤＮＡテンプレートを反応させた後の蛍光光度測定結果を示す。 図５は、大腸菌内での遺伝子情報に基く薬剤放出を示す。 図６は、FACSによる測定結果を示す。

Claims (25)

  1. 標的核酸配列に対して相補的な塩基配列を有する第１の核酸プローブに電子供与体構造を結合させた電子供与体−第１核酸プローブ分子と、
    上記標的核酸配列に対して相補的な塩基配列で、かつ上記第１の核酸プローブと異なる塩基配列を有する第２の核酸プローブに、目的分子とアジド基とを有する電子受容体構造を結合させた目的分子−電子受容体−第２核酸プローブ分子とを、
    上記標的核酸配列にハイブリダイズさせ、かつ上記電子供与体−第１核酸プローブ分子が上記目的分子−電子受容体−第２核酸プローブ分子に作用して上記目的分子を放出させる工程を含む、目的分子を放出させる方法。
  2. 上記標的核酸配列において、上記第２の核酸プローブの塩基配列に相補的な塩基配列が上記第１の核酸プローブの塩基配列に相補的な塩基配列よりも３’側にあり；
    上記電子供与体−第１核酸プローブ分子において、上記電子供与体構造が上記第１の核酸プローブの５’末端部分に結合し；および
    上記目的分子−電子受容体−第２核酸プローブ分子において、上記電子受容体構造が上記第２の核酸プローブの３’末端部分に結合している、
    請求項１に記載の目的分子を放出させる方法。
  3. 上記標的核酸配列において、第２の核酸プローブの塩基配列に相補的な塩基配列が上記第１の核酸プローブの塩基配列に相補的な塩基配列よりも５’側にあり；
    上記電子供与体−第１核酸プローブ分子において上記電子供与体構造が上記第１の核酸プローブの３’末端部分に結合し；および、
    上記目的分子−電子受容体−第２核酸プローブ分子において上記電子受容体構造が上記第２の核酸プローブの５’末端部分に結合している、
    請求項１または２に記載の目的分子を放出させる方法。
  4. 上記標的核酸配列において、上記第２の核酸プローブの塩基配列に相補的な塩基配列が上記第１の核酸プローブの塩基配列に相補的な塩基配列と直接または１〜２０個の塩基を介して位置する請求項１〜３のいずれか１項に記載の目的分子を放出させる方法。
  5. 上記電子供与体構造が還元剤を含む構造である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の目的分子を放出させる方法。
  6. 上記還元剤がジフェニルフォスフィン基を含む還元剤である、請求項５に記載の目的分子を放出させる方法。
  7. 上記電子受容体構造が下記式（１）で表される構造である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の目的分子を放出させる方法。
    （上記式（１）中、Ｙ1およびＹ2はそれぞれ独立に、水素原子、炭素数１から６のアルキル基、炭素数１から６のアルコキシ基、炭素数６から１０のアリール基、またはシアノ基を表し、Ｒ1は目的分子の残基を表し、Ｒ2は核酸と結合するための反応基を表す。）
  8. 上記Ｒ2が下記式（２）で表される反応基である、請求項７に記載の目的分子を放出させる方法。
  9. 上記目的分子が毒剤、薬剤または消光剤である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の目的分子を放出させる方法。
  10. 上記薬剤がIPTG(イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド)であり、上記消光剤がダブシルである、請求項９に記載の目的分子を放出させる方法。
  11. 標的核酸配列に対して相補的な塩基配列を有する第１の核酸プローブに電子供与体構造を結合させた電子供与体−第１核酸プローブ分子と、
    上記標的核酸配列に対して相補的な塩基配列で、かつ上記第１の核酸プローブと異なる塩基配列および蛍光剤を有する第２の核酸プローブに、消光剤とアジド基とを有する電子受容体構造を結合させた消光剤−電子受容体−蛍光剤プローブとを、
    上記標的核酸配列にハイブリダイズさせ、かつ上記電子供与体−第１核酸プローブ分子が上記消光剤−電子受容体−蛍光剤プローブに作用して上記消光剤を放出させる工程、および
    上記ハイブリダイズさせた複合体の蛍光を測定する工程
    を含む、標的核酸配列を検出する方法。
  12. 上記標的核酸配列において、上記第２の核酸プローブの塩基配列に相補的な塩基配列が上記第１の核酸プローブの塩基配列に相補的な塩基配列よりも３’側にあり；
    上記電子供与体−第１核酸プローブ分子において、上記電子供与体構造が上記第１の核酸プローブの５’末端部分に結合し；および、
    上記消光剤−電子受容体−蛍光剤プローブにおいて、上記電子受容体構造が上記第２の核酸プローブの３’末端部分に結合している、
    請求項１１に記載の標的核酸配列を検出する方法。
  13. 上記標的核酸配列において、上記第２の核酸プローブの塩基配列に相補的な塩基配列が上記第１の核酸プローブの塩基配列に相補的な塩基配列よりも５’側にあり；
    上記電子供与体−第１核酸プローブ分子において上記電子供与体構造が上記第１の核酸プローブの３’末端部分に結合し；および、
    上記消光剤−電子受容体−蛍光剤プローブにおいて上記電子受容体構造が上記第２の核酸プローブの５’末端部分に結合している、
    請求項１１または１２に記載の標的核酸配列を検出する方法。
  14. 上記標的核酸配列において、上記第２の核酸プローブの塩基配列に相補的な塩基配列が上記第１の核酸プローブの塩基配列に相補的な塩基配列と直接または１〜２０個の塩基を介して位置する、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の標的核酸配列を検出する方法。
  15. 上記電子供与体構造が還元剤を含む構造である、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の標的核酸配列を検出する方法。
  16. 上記還元剤がジフェニルフォスフィン基を含む還元剤である、請求項１５に記載の標的核酸配列を検出する方法。
  17. 上記電子受容体構造が下記式（３）で表される化合物である、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の標的核酸配列を検出する方法。
    （上記式（３）中、Ｙ1およびＹ2はそれぞれ独立に、水素原子、炭素数１から６のアルキル基、炭素数１から６のアルコキシ基、炭素数６から１０のアリール基、またはシアノ基を表し、Ｒ1は消光剤の残基を表し、Ｒ2は核酸と結合するための反応基を表す。）
  18. 上記Ｒ2が下記式（４）で表される反応基である、請求項１７に記載の標的核酸配列を検出する方法。
  19. 上記消光剤がダブシルである、請求項１１〜１８のいずれか１項に記載の標的核酸配列を検出する方法。
  20. 上記蛍光剤がフルオレセインである、請求項１１〜１９のいずれか１項に記載の標的核酸配列を検出する方法。
  21. 下記式（５）で表される化合物。
    （上記式（５）中、Ｙ1およびＹ2はそれぞれ独立に、水素原子、炭素数１から６のアルキル基、炭素数１から６のアルコキシ基、炭素数６から１０のアリール基、またはシアノ基を表し、Ｒ1は目的分子の残基を表し、Ｒ2は水素原子、ハロゲン原子または核酸と結合するための反応基を表す。）
  22. 上記Ｒ1が消光剤である、請求項２１に記載の化合物。
  23. 上記消光剤が下記式（６）で表される消光剤である、請求項２２に記載の化合物。
  24. 下記式（７）で表される化合物。
  25. 請求項１〜１０に記載の目的分子を放出させる方法または請求項１１〜２０に記載の標的核酸配列を検出する方法に使用するための請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の化合物。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012121396A1 (ja) * 2011-03-10 2012-09-13 独立行政法人理化学研究所 蛍光プローブ及びその利用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE19945398A1 (de) * 1999-09-22 2001-04-05 Friz Biochem Gmbh Elektrochemische Detektion von sequenzspezifischen Nukleinsäure-Oligomer-Hybridisierungsereignissen
US7445891B2 (en) * 2001-07-23 2008-11-04 John-Stephen Taylor Nucleic acid triggered catalytic drug and probe release
US7172865B2 (en) * 2001-08-13 2007-02-06 Saint Louis University Rapid and sensitive assay for the detection and quantification of coregulators of nucleic acid binding factors
US20050147963A1 (en) * 2003-12-29 2005-07-07 Intel Corporation Composite organic-inorganic nanoparticles and methods for use thereof
US20060147963A1 (en) * 2004-12-30 2006-07-06 Affymetrix, Inc. Detection of polynucleotides on nucleic acid arrays using azido-modified triphosphate nucleotide analogs
EP1937849B1 (en) * 2005-10-27 2019-05-29 The President and Fellows of Harvard College Methods and compositions for labeling nucleic acids

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012121396A1 (ja) * 2011-03-10 2012-09-13 独立行政法人理化学研究所 蛍光プローブ及びその利用

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