JP2013183736A - 生体分子標識用の新規蛍光物質 - Google Patents

Abstract

【課題】エキシトンプライマー等の合成工程の短縮化に寄与する新規蛍光色素を提供する。
【解決手段】下式（１）で示される蛍光色素が２つ結合した構造を有する化合物。

ここでＡは、ＣＲ、Ｎ、Ｐ、ＰＯ、ＢもしくはＳｉＲ（Ｒは、水素原子、アルキル基または任意の置換基）である。Ｂ^１、Ｂ^２およびＢ^３は、リンカー、Ｃ^１およびＣ^２は、エキシトン効果を示す蛍光性原子団。
【選択図】図１

Description

本発明は、生体分子標識用の新規蛍光物質、それを用いて製造された標識物質およびそれらを用いた検出方法に関する。

細胞レベルでの生命現象の解析や、病気の分子レベルでの診断には特定のたんぱく質や核酸配列を検出する必要があり、その検出には、蛍光が広く利用されている。具体的には、ターゲットたんぱく質への結合、および標的核酸配列の増加に共役して、蛍光強度が増大するような蛍光物質を用いる方法が知られている。前記蛍光物質としては、例えば、フォレスター共鳴エネルギー・トランスファー（ＦＲＥＴ）を利用する方法や二重らせん構造にインターカレーションし、励起光の照射により蛍光を発する物質が代表的である。

しかしながら、従来の蛍光物質は、例えば、ターゲットの物質に結合していない場合でも、蛍光を発するおそれがある。また、蛍光物質を標識した抗体や核酸配列のみの蛍光を消光する目的では、ＦＲＥＴを利用する方法が有効であるが（非特許文献１〜４等）、ＦＲＥＴを与えるために、例えば、２種類の蛍光色素やユニークな配列の導入、さらには蛍光色素を結合させる位置の精密なデザインが必要となり、配列の制約や製造コスト等の問題がある。

そこで、前記課題の解決のために１種類の色素のみでの蛍光検出系が提案されており、その一つが、２つ以上の色素分子が並行に集合するために生じるエキシトン効果によって蛍光発光を示さないが、それらの分子が核酸にインターカレーションまたはグルーブバインディング（溝結合）するときには、前記集合状態が解けることにより蛍光発光が生じる２つ以上の色素分子の化学構造を同一分子内に有することを特徴的化学構造とする複合体標識物質である（特許文献３）。この標識物質をオリゴヌクレオチドに導入したプライマーまたはプローブ（エキシトンオリゴマー等）として標的核酸の増幅や検出に使用することが開示されている（特許文献４）。このエキシトンオリゴマー等は、ハイブリダイゼーション前後の蛍光のスイッチングを一種類の色素で可能にするものであり、また、増幅反応のリアルタイムモニタリングに利用する場合、配列特有の蛍光シグナルを与えることができるので、従来のＳＹＢＲグリーンＩを用いたときに非特異的増幅も検出されてしまうという問題を克服することができる。さらに、蛍光団をｄＴまたはｄＣに導入できるので、配列の制約をほとんど無視することができる。

しかし、このようなエキシトンオリゴマー等を合成する際には、２つの蛍光色素を導入するために用いる特殊なアミダイト（ＤＮＡ合成試薬）を自ら合成して利用する必要があり、色素自体にも、ＤＮＡオリゴマーに結合させるための特殊な修飾が必要であった。しかしこれらはいずれも人手を必要とする作業であるため、コスト改善を図る上ではこの作業の短縮化が求められていた。また、色素とＤＮＡオリゴマーとをＤＮＡ合成機中で反応させることができないため、合成したＤＮＡオリゴマーを精製した後に色素と結合させ、さらに精製工程が必要となるなど、作業が煩雑であった（特許文献４、非特許文献１）。

さらに色素を導入する塩基に応じて特定のＤＮＡ合成試薬を準備する必要があるが、いずれも市販されていない。Ｔ（チミン）、Ｃ（シトシン）は合成法が知られているが、Ａ（アデニン）、Ｇ（グアニン）は合成法すら未だ知られていない。したがってエキシトンオリゴマー等の開発にあたっては、ＴまたはＣにしか修飾できないという制限があった（特許文献３、特許文献４、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３）。さらに現状ではＤＮＡに限定されており、ＲＮＡやペプチドと２つの蛍光色素を結合させるモノマーは合成法すら知られていない。

Ｔｙａｇｉ，Ｓ．，Ｋｒａｍｅｒ，Ｆ．Ｒ．（１９９６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４，３０３−３０８． Ｎａｚａｒｅｎｋｏ，Ｉ．Ａ．，Ｂｈａｔｎａｇａｒ，Ｓ．Ｋ．，Ｈｏｈｍａｎ，Ｒ．Ｊ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５，２５１６−２５２１． Ｇｅｌｍｉｎｉ，Ｓ．，Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｃ．，Ｓｅｓｔｉｎｉ，Ｒ．，Ｖｏｎａ，Ｇ．，Ｐｉｎｚａｎｉ，Ｐ．，Ｒｕｏｃｃｏ，Ｌ．，Ｐａｚｚａｇｌｉ，Ｍ．（１９９７）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３，７５２−７５８． Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ，Ｄ．，Ｔｈｅａｋｅｒ，Ｊ．，Ｇｕｙ，Ｓ．Ｐ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｔ．，Ｌｉｔｔｌｅ，Ｓ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７，８０４−８０７． Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ １９９８，４６，３９−５１． Ａｎａｌｙｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ２００２，４７０，５７−７０． Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ａ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ２００６，１２，２２７０−２２８１． Ｍｉｔａｎｉ Ｙ．，Ｌｅｚｈａｖａ Ａ．，Ｋａｗａｉ Ｙ．，Ｋｉｋｕｃｈｉ Ｔ．，Ｏｇｕｃｈｉ−Ｋａｔａｙａｍａ Ａ．，Ｋｏｇｏ Ｙ．，Ｉｔｏｈ Ｍ．，Ｍｉｙａｇｉ Ｔ．ｅｔ ａｌ．２００７．"Ｒａｐｉｄ ＳＮＰ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓｕｓｉｎｇ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ａ ｎｅｗ ｍｉｓｍａｔｃｈ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．"Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ４（３）：２５７−２６２． Ｉｋｅｄａ Ｓ，Ｋｕｂｏｔａ Ｔ，Ｋｉｎｏ Ｋ，Ｏｋａｍｏｔｏ Ａ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｏｆ ｄｏｕｂｌｙ ｔｈｉａｚｏｌｅ ｏｒａｎｇｅ ｌａｂｅｌｅｄ ＤＮＡ：ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｐｒｏｂｅ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．２００８．１９．１７１９−１７２５ Ｉｋｅｄａ Ｓ，Ｋｕｂｏｔａ Ｔ，Ｙｕｋｉ Ｍ，Ｏｋａｍｏｔｏ Ａ．Ｅｘｃｉｔｏｎ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅｓ：ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ．Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．２００９．４８．６４８０−６４８４ Ｉｋｅｄａ Ｓ，Ｙｕｋｉ Ｍ，Ｙａｎａｇｉｓａｗａ Ｈ，Ｏｋａｍｏｔｏ Ａ．Ｄｏｕｂｌｙ ｔｈｉａｚｏｌｅ ｏｒａｎｇｅ−ｌａｂｅｌｅｄ ｃｙｔｉｄｉｎｅ ｆｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｐｒｏｂｅ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２００９，５１，７１９１−７１９５ Ｒａｔｎａｋａｒ Ｂ，Ｍｕｊｕｍｄａｒ，Ｌａｕｒｅｎ Ａ．Ｅｒｎｓｔ，Ｓｗａｔｉ Ｒ．Ｍｕｊｕｍｄａｒ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ Ｊ．Ｌｅｗｉｓ，Ａｌａｎ Ｓ．Ｗａｇｇｏｎｅｒ，Ｃｙａｎｉｎｅ ｄｙｅ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔｓ：Ｓｕｌｆｏｉｎｄｏｃｙａｎｉｎｅ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，１９９３，４，１０５−１１１ Ｈ．Ｗａｎｇ，Ｅ．Ｎａｋａｔａ ａｎｄ Ｉ．Ｈａｍａｃｈｉ，Ｒｅｃｅｎｔ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｒｅａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｂａｓｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ．ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，２００９，１０，２５６０−２５７７ 特許第３８９７８０５号公報 特許第３９４２６２７号公報 特許第４７６１０８６号公報 特許第４３７０３８５号公報

本発明は、１種類２個の蛍光色素で標識された核酸配列やペプチド配列の合成工程の短縮化に寄与する新規蛍光色素の提供を目的とする。また、本発明による蛍光色素は、結合する活性部位の種類によってさまざまな用途に利用することができる。

エキシトンオリゴマーは２個の蛍光色素（チアゾールオレンジやその類似物）が導入されたＤＮＡオリゴマーであり、１本鎖の場合は蛍光をほとんど発しない。しかしターゲットＤＮＡとハイブリダイズさせるとエキシトン制御によって大きく蛍光を発する。エキシトンオリゴマーを合成するにあたっては、色素を導入するために市販されていない特殊なＤＮＡ合成試薬を利用しており、この試薬の合成が必須となる。また色素もＤＮＡオリゴマーに結合させるために特殊な誘導体として合成する必要がある。

本発明者は、エキシトンオリゴマー合成の改良法について種々検討を重ねた結果、市販のＤＮＡ合成試薬を利用してもエキシトンオリゴマーの合成が可能な新規蛍光色素を開発した。この色素を用いることによって、ＤＮＡ合成機の中で色素を結合させることが可能となり、精製工程の大幅な短縮化を達成することができた。また、本発明による蛍光色素は、結合する活性部位の種類によって、ＤＮＡ合成試薬のみならずＲＮＡ合成試薬として利用でき、合成オリゴペプチドやたんぱく質へラベル化することもできる。

前記課題を解決するために、本発明者は活性エステルが導入された部位への結合できる、かつエキシトン制御機構をもつ新規蛍光色素を設計し合成した。すなわち、本発明による蛍光色素は、下式（１）で表されるように蛍光色素が２つ結合した構造を有する化合物、その互変異性体もしくは立体異性体、またはそれらの塩であることを特徴とする。

式（１）中、
Ａは、ＣＲ、Ｎ、Ｐ、ＰＯ、ＢもしくはＳｉＲであり、Ｒは、水素原子、アルキル基または任意の置換基である。
Ｂ^１、Ｂ^２およびＢ^３は、リンカー（架橋原子または原子団）であり、主鎖長は任意である。主鎖中にＣ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｂ、Ｓｉ、Ｓを含んでいてもいなくても良く、単結合、二重結合、三重結合、アミド結合、エステル結合、ジスルフィド結合、イミノ基、エーテル結合、チオエーテル結合、およびチオエステル結合をそれぞれ含んでいてもいなくても良い。Ｂ^１、Ｂ^２およびＢ^３はそれぞれ同一でも異なっていても良い。
Ｃ^１およびＣ^２は、エキシトン効果を示す蛍光性原子団であり、それぞれ同一でも異なっていてもよい、下式（２）または下式（３）で表される原子団である。Ｅは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅであり、ｎは、０または正の整数である。Ｒ^１およびＲ^２のうち一方は、式（１）中のＢ^１またはＢ^２に結合する連結基であり、他方は、水素原子または低級アルキル基である。Ｒ^３〜Ｒ^１２は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基、ニトロ基、シアノ基、カルボニル基、カルボキシル基、アミノ基、シリル基、ボリル基である。ＡＲは、任意の芳香環であり、あってもなくても良い。式（２）または（３）中においてＲ^３が複数存在する場合は、同一でも異なっていてもよく、式（２）または（３）中においてＲ^４が複数存在する場合は、同一でも異なっていてもよい。
Ｃ^１中のＥ、ＡＲ、ｎおよびＲ^１〜Ｒ^１２と、Ｃ^２中のＥ、ＡＲ、ｎおよびＲ^１〜Ｒ^１２とは、互いに同一でも異なっていてもよい。

Ｄは、ＤＮＡオリゴマー、ＲＮＡオリゴマー、たんぱく質、オリゴペプチド、抗体または糖類に結合する部位であり、アミノ基、活性エステル基、チオール基またはビオチン誘導体である。結合させる物質は生体由来のもの、または化学合成品である。

本発明の標識物質は、上記の化合物、その互変異性体もしくは立体異性体、またはそれらの塩を用いて製造された標識物質であり、具体的には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）やＬＮＡ（ロックト核酸）のような人工核酸、たんぱく質、ペプチド、抗体または糖類などであるが、より具体的には、標識モノヌクレオチド、標識オリゴヌクレオチド、標識核酸または標識核酸誘導体が例示できる。

本発明の検出方法は、上記の標識物質、すなわちエキシトン制御機構を有する標識物質を用いた方法であり、例えば、標識物質が標識核酸である場合、核酸プローブや核酸プライマーの形態で核酸検出や増幅確認に好適に用いることができる。遺伝子の増幅方法を用いて目的物質を検出する場合、従来公知の種々の核酸増幅方法が適用でき、その反応形式は何ら制限されない。前記核酸増幅方法としては、例えば、等温増幅方法やポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法等があげられる。前記等温増幅法とは、一般に、等温で核酸増幅反応を行う方法である。このような方法としては、例えば、特公平７−１１４７１８号公報等に開示される鎖置換型増幅（ＳＤＡ；ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、米国特許第５８２４５１７号明細書、国際公開第９９／０９２１１号パンフレットまたは国際公開第９５／２５１８０号パンフレット等に開示されている改良ＳＤＡ法、日本国特許第２６５０１５９号公報等に開示されている核酸配列増幅（ＮＡＳＢＡ；ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、日本国特許第３３１３３５８号およびＮｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．１２，ｅ６３に開示されているランプ（ＬＡＭＰ；Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、国際公開第０２／１６６３９号パンフレット等に開示されているＩＣＡＮ法（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）、自立複製（３ＳＲ；ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、日本国特許第２７１０１５９号公報に開示されているＱベータレプリカーゼ法、日本国特許第３８９７８０５号およびＮＡＴＵＲＥ ＭＥＴＨＯＤＳ，Ｖｏｌ．４，Ｎｏ．３，Ｍａｒｃｈ ２００７，ｐｐ．２５７−２６２に開示されているＳｍａｒｔＡｍｐ法、Ｉｎｖａｄｅｒ法、ＲＣＡ（ｒｏｌｌｉｎｇ ｃｙｃｌｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法等があげられる。

この蛍光色素はターゲットとのハイブリダイゼーションに依存した蛍光のスイッチングが可能である。これをＤＮＡオリゴマーの合成時に、市販されているＤＮＡ合成試薬（ＮＨＳ−Ｃａｒｂｏｘｙ−ｄＴ）を導入した位置にＤＮＡ合成機中で結合させることが可能である。これによって従来必要であった特殊なＤＮＡ合成試薬の合成、および蛍光色素によるラベル化の前の精製が必要なくなり工程の大幅な短縮が可能となった。また、この新規蛍光色素には容易に他の種類の結合部位の導入が可能である。これによってアミノ基やチオール基をもつ合成ＤＮＡやＲＮＡ、抗体やたんぱく質、合成オリゴペプチドへの導入へ発展できる。さらにエキシトン制御による蛍光スイッチングを行うことにより生体物質間の相互作用のリアルタイム検出も可能になると期待される。さらに、生体物質間の相互作用の検出には、それぞれの物質に異なる色素を２つ導入する必要があるなど調製が難しいが、この色素は１つ導入するだけで相互作用の検出が可能である。また相互作用した場合のみ発色することが期待されることから、過剰の色素の洗浄工程も不必要になる。

図１は、本発明の蛍光色素の例としてＴＯ_２−ｄｉａｍｉｄｅの合成スキームを示す図である。 図２は、本発明の蛍光色素の使用例として、エキシトンプライマーの合成スキームを示す図である。

次に、本発明の実施形態についてさらに具体的に説明する。

本発明の蛍光色素は、前述のように、下式（１）で表されるように蛍光色素が２つ結合した構造を有する化合物であることを特徴とする。また、これらの互変異性体若しくは立体異性体、またはそれらの塩も、本発明における蛍光色素に含まれる。

式（１）中、
Ａは、ＣＲ、Ｎ、Ｐ、ＰＯ、ＢもしくはＳｉＲであり、Ｒは、水素原子、アルキル基または任意の置換基である。
Ｂ^１、Ｂ^２およびＢ^３は、リンカー（架橋原子または原子団）であり、主鎖長は任意である。主鎖中にＣ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｂ、Ｓｉ、Ｓを含んでいてもいなくても良く、単結合、二重結合、三重結合、アミド結合、エステル結合、ジスルフィド結合、イミノ基、エーテル結合、チオエーテル結合、およびチオエステル結合をそれぞれ含んでいてもいなくても良い。Ｂ^１、Ｂ^２およびＢ^３はそれぞれの同一でも異なっていても良い。
Ｃ^１およびＣ^２は、エキシトン効果を示す蛍光性原子団であり、それぞれ同一でも異なっていてもよい、下式（２）または下式（３）で表される原子団である。Ｅは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅであり、ｎは、０または正の整数である。Ｒ^１およびＲ^２のうち一方は、式（１）中のＢ^１またはＢ^２に結合する連結基であり、他方は、水素原子または低級アルキル基である。Ｒ^３〜Ｒ^１２は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基、ニトロ基、シアノ基、カルボニル基、カルボキシル基、アミノ基、シリル基、ボリル基である。ＡＲは、任意の芳香環であり、あってもなくても良い。式（２）または（３）中においてＲ^３が複数存在する場合は、同一でも異なっていてもよく、式（２）または（３）中においてＲ^４が複数存在する場合は、同一でも異なっていてもよい。
Ｃ^１中のＥ、ＡＲ、ｎおよびＲ^１〜Ｒ^１２と、Ｃ^２中のＥ、ＡＲ、ｎおよびＲ^１〜Ｒ^１２とは、互いに同一でも異なっていてもよい。

Ｄは、ＤＮＡオリゴマー、ＲＮＡオリゴマー、たんぱく質、オリゴペプチド、抗体または糖類に結合する部位であり、アミノ基、活性エステル基、チオール基またはビオチン誘導体である。結合させる物質は生体由来のもの、または化学合成品である。

前記式（１）中、Ｂ^１、Ｂ^２およびＢ^３の主鎖長（主鎖原子数）は、それぞれ２以上の整数であることが好ましく、上限は特に制限されないが、例えば１００以下であり、より好ましくは３０以下であり、特に好ましくは１０以下である。

Ｃ^１およびＣ^２は、エキシトン効果を示す蛍光性原子団であることが好ましい。これにより、ターゲット分子と結合したときの環境変化における蛍光の増大が大きく、例えばＤＮＡの二重らせん構造をいっそう効果的に検出することができる。Ｃ^１およびＣ^２は、蛍光性を有する原子団であればよく、前記蛍光性を有する原子団は、特に制限されない。Ｃ^１およびＣ^２は、例えば、それぞれ独立に、チアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー、シアニン、ヘミシアニン、その他のシアニン色素、メチルレッド、アゾ色素またはそれらの誘導体から誘導される基であることがより好ましい。また、その他の公知の色素から誘導される基も、適宜用いることができる。核酸やペプチドに結合することによって蛍光強度を変化させる蛍光色素は、数多く報告されている。典型的な例では、エチジウムブロミドがＤＮＡの二重らせん構造にインターカレーションして強い蛍光を示すことが知られており、ＤＮＡ検出に多用されている。また、ピレンカルボキシアミドやプロダンのような微視的極性に応じて蛍光強度を制御できる蛍光色素も知られている。また、前記チアゾールオレンジは、ベンゾチアゾール環とキノリン環をメチン基で連結した蛍光色素であり、通常微弱な蛍光を示すが、二重らせん構造をもつＤＮＡにインターカレーションすることによって強い蛍光発光を与えるようになる。その他、例えば、フルオレセインやＣｙ３等の色素も挙げられる。

Ｃ^１およびＣ^２は、それぞれ独立に、下式（４）または（５）で表される原子団であることがより好ましい。

式（４）または（５）中、
Ｅは、ＳまたはＯであり、ｎは、０または正の整数である。
Ｒ^１およびＲ^２のうち一方は、式（１）中のＢ^１またはＢ^２に結合する連結基であり、他方は、水素原子または低級アルキル基である。Ｒ^３〜Ｒ^１２は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基、ニトロ基、シアノ基、カルボニル基、カルボキシル基、アミノ基、シリル基、ボリル基である。ＡＲは、任意の芳香環であり、あってもなくても良い。式（４）または（５）中においてＲ^３が複数存在する場合は、同一でも異なっていてもよく、式（４）または（５）中においてＲ^４が複数存在する場合は、同一でも異なっていてもよい。
Ｃ^１中のＥ、ＡＲ、ｎおよびＲ^１〜Ｒ^１２と、Ｃ^２中のＥ、ＡＲ、ｎおよびＲ^１〜Ｒ^１２とは、互いに同一でも異なっていてもよい。

前記式（４）または（５）中、Ｒ^１〜Ｒ^１２において、前記低級アルキル基が、炭素数１〜６の直鎖または分枝アルキル基であり、前記低級アルコキシ基が、炭素数１〜６の直鎖または分枝アルコキシ基であることがさらに好ましい。

前記式（４）または（５）中、Ｒ^１およびＲ^２において、前記連結基が、炭素数２以上のポリメチレンカルボニル基であり、カルボニル基部分で前記式（１）中のＢ^１もしくはＢ^２に結合することがさらに好ましい。前記ポリメチレンカルボニル基の炭素数は、その上限は特に制限されないが、例えば１００以下、好ましくは５０以下、より好ましくは３０以下、特に好ましくは１０以下である。

Ｃ^１およびＣ^２は、前記式（４）または（５）で表される場合は、例えば、それぞれ独立に、前記式（４）で示される基であることがさらにより好ましい。

本発明の蛍光色素は、蛍光性を有する原子団（色素）を１分子当たり１個のみ有していても良いが、２個以上有することが好ましい。これにより、例えば、前記蛍光性を有する原子団（色素）がエキシトン効果を有することになる。エキシトン効果によれば、例えば、本発明の蛍光色素を核酸に結合させた場合、一本鎖状態での蛍光強度を抑え、二重らせん構造を一層効果的に検出可能である。なお、エキシトン効果（ｅｘｃｉｔｏｎ ｃｏｕｐｌｉｎｇ）とは、例えば、複数の色素が並行に集合し、Ｈ会合体（Ｈ−ａｇｇｒｅｇａｔｅ）を形成することにより、ほとんど蛍光発光を示さなくなる効果である。この効果は、色素の励起状態が、Ｄａｖｙｄｏｖ ｓｐｌｉｔｔｉｎｇにより２つのエネルギーレベルに分裂し、上位エネルギーレベルへの励起→下位エネルギーレベルへの内部変換（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）→発光が熱的に禁制、という理由で生じると考えられる。ただし、これらの説明は、本発明を何ら制限しない。エキシトン効果が起こりうることは、Ｈ会合体を形成した色素の吸収バンドが単一の色素の吸収バンドより短い波長に現れることで確認できる。このような効果を示す色素としては、例えば、前述したチアゾールオレンジとその誘導体、オキサゾールイエローとその誘導体、シアニンとその誘導体、ヘミシアニンとその誘導体、メチルレッドとその誘導体、ほか一般的にシアニン色素、アゾ色素と呼ばれる色素群が挙げられる。

［蛍光性原子団の調製］
本発明化合物における蛍光性原子団は、活性エステルなどの容易に結合をつくる置換基が導入されていればよい。例えばＧＥヘルスケア社などからアミンと反応する活性エステルが導入されたＣｙ３−ＮＨＳやＣｙ５−ＮＨＳなど蛍光原子団が入手可能である。

また、前記式（４）において、Ｃ^１およびＣ^２が蛍光性を示す原子団である化合物は、２分子の蛍光性分子、例えば、チアゾールオレンジ誘導体又はオキサゾールイエロー誘導体で修飾した化合物である。例えば一本鎖核酸にこの色素が導入されると、エキシトンカップリングによる消光が引き起こされることにより、一本鎖核酸のみの状態では蛍光は極めて弱いが、ＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズすることにより強い蛍光発光を示す。すなわち、例えば、チアゾールオレンジ誘導体又はオキサゾールイエロー誘導体の蛍光は、そのひずんだ構造により強く抑制されているが、チアゾールオレンジ誘導体又はオキサゾールイエロー誘導体は、ＤＮＡに結合することにより、構造のひずみが解消・固定化され、強い蛍光を示すようになる。蛍光は、例えば、４８８ｎｍ、５１４ｎｍのＡｒレーザーを使用して励起することにより検出できる。

なお、本発明の化合物に互変異性体または立体異性体（例：幾何異性体、配座異性体および光学異性体）等の異性体が存在する場合は、いずれの異性体も本発明に用いることができる。また、前記化合物または核酸の塩は、酸付加塩でも良いが、塩基付加塩でも良い。さらに、前記酸付加塩を形成する酸は無機酸でも有機酸でも良く、前記塩基付加塩を形成する塩基は無機塩基でも有機塩基でも良い。前記無機酸としては、特に限定されないが、例えば、硫酸、リン酸、フッ化水素酸、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、次亜フッ素酸、次亜塩素酸、次亜臭素酸、次亜ヨウ素酸、亜フッ素酸、亜塩素酸、亜臭素酸、亜ヨウ素酸、フッ素酸、塩素酸、臭素酸、ヨウ素酸、過フッ素酸、過塩素酸、過臭素酸、および過ヨウ素酸等があげられる。前記有機酸も特に限定されないが、例えば、ｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、ｐ−ブロモベンゼンスルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸および酢酸等があげられる。前記無機塩基としては、特に限定されないが、例えば、水酸化アンモニウム、アルカリ金属水酸化物、アルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩および炭酸水素塩等があげられ、より具体的には、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、水酸化カルシウムおよび炭酸カルシウム等があげられる。前記有機塩基も特に限定されないが、例えば、エタノールアミン、トリエチルアミンおよびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン等があげられる。これらの塩の製造方法も特に限定されず、例えば、前記電子供与体・受容体連結分子に、前記のような酸や塩基を公知の方法により適宜付加させる等の方法で製造することができる。また、置換基等に異性体が存在する場合はどの異性体でも良く、例えば、「ナフチル基」という場合は、１−ナフチル基でも２−ナフチル基でも良い。

また、本発明において、アルキル基としては、特に限定されないが、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基およびｔｅｒｔ−ブチル基等が挙げられ、アルキル基を構造中に含む基（アルキルアミノ基、アルコキシ基等）においても同様である。また、ペルフルオロアルキル基としては、特に限定されないが、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基およびｔｅｒｔ−ブチル基等から誘導されるペルフルオロアルキル基が挙げられ、ペルフルオロアルキル基を構造中に含む基（ペルフルオロアルキルスルホニル基、ペルフルオロアシル基等）においても同様である。本発明において、アシル基としては、特に限定されないが、例えば、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基、シクロヘキサノイル基、ベンゾイル基、エトキシカルボニル基、等が挙げられ、アシル基を構造中に含む基（アシルオキシ基、アルカノイルオキシ基等）においても同様である。また、本発明において、アシル基の炭素数にはカルボニル炭素を含み、例えば、炭素数１のアルカノイル基（アシル基）とはホルミル基を指すものとする。さらに、本発明において、「ハロゲン」とは、任意のハロゲン元素を指すが、例えば、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素が挙げられる。また、本発明において、アミノ基の保護基としては、特に制限されないが、例えば、トリフルオロアセチル基、ホルミル基、Ｃ１−６アルキル−カルボニル基（例えばアセチル、エチルカルボニル等）、Ｃ１−６アルキル−スルホニル基、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基（以下、Ｂｏｃとも称する）、ベンジルオキシカルボニル基、アリルオキシカルボニル基、フルオレニルメチルオキシカルボニル基、アリールカルボニル基（例えばフェニルカルボニル、ナフチルカルボニル等）、アリールスルホニル基（例えばフェニルスルホニル、ナフチルスルホニル等）、Ｃ１−６アルキルオキシ−カルボニル基（例えば、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル等）、Ｃ７−１０アラルキル−カルボニル基（例えばベンジルカルボニル等）、メチル基、アラルキル基（例えばベンジル、ジフェニルメチル、トリチル基等）、等が用いられる。これらの基は１ないし３個のハロゲン原子（例えばフッ素、塩素、臭素等）、ニトロ基等で置換されていてもよく、その具体例としては、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル基、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル基、ｍ−クロロベンジルオキシカルボニル基、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル基などが挙げられる。また、本発明において、水酸基の保護基（酸で脱保護することが可能なものを含む）としては、特に制限されないが、例えば、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基、ピクシル基などが挙げられる。

次に、本発明化合物が有する蛍光性原子団について説明する。
すなわち、前記蛍光性原子団は、
（ｉ）一つの分子内の二つの平面化学構造が同一平面内ではなく、ある一定の角度をもって存在するが、その分子が核酸にインターカレーションまたはグルーヴバインディング（溝結合）するときには二つの平面化学構造が同一平面内に並ぶように配置することによって蛍光発光が生じるものであるか、
（ｉｉ）２つ以上の色素分子が並行に集合するために生じるエキシトン効果によって蛍光発光を示さないが、それらの分子がターゲット分子、たとえば核酸にインターカレーションまたはグルーヴバインディング（溝結合）するときには、前記集合状態が解けることにより蛍光発光が生じる２つ以上の色素分子群からなるものであるか、または、
（ｉｉｉ）２つ以上の色素分子が並行に集合するために生じるエキシトン効果によって蛍光発光を示さないが、それらの分子がターゲット分子、たとえば核酸にインターカレーションまたはグルーヴバインディング（溝結合）するときには、前記集合状態が解けることにより蛍光発光が生じる２つ以上の色素分子の化学構造を同一分子内に有することを特徴とするものである。
前記（ｉｉ）または（ｉｉｉ）の場合において、前記色素分子が、前記（ｉ）記載の分子であることが好ましい。

本発明の化合物において、Ｃ^１およびＣ^２が、エキシトン効果を示す原子団であることにより、ターゲット分子と結合したときの蛍光色素周りの環境変化、例えばＤＮＡがの２本鎖形成となったときの蛍光の増大が大きくなり、いっそう効果的に検出することができる。ただし、本発明の化合物においては、Ｃ^１およびＣ^２が、エキシトン効果を示す原子団でなくても、また、蛍光性を示す原子団（色素）が１分子中に１個のみ導入されていても、核酸やペプチド等の標識物質として使用可能であり、二重らせん構造を効果的に検出することもできる。

［化合物の製造方法］
本発明の化合物の製造方法は、特に制限されず、公知の合成方法（製造方法）を適宜用いることができる。

本発明の化合物を核酸に結合させる方法としては、例えば、以下の方法がある。すなわち、まず、ＤＮＡの簡便なラベル化法として、ＤＮＡ中の活性なアミノ基とラベル化剤中の活性化されたカルボキシル基とを緩衝溶液中で反応させる方法が広く用いられている。この方法は、本発明の化合物または核酸のいずれの製造にも応用可能であり、特に、リンカーまたは色素の導入に応用できる。アミノ基の導入法としては、ＧＬＥＮ ＲＥＳＥＡＲＣＨ社が販売しているＡｍｉｎｏ ｍｏｄｉｆｉｅｒホスホロアミダイトを利用する方法などがある。

前記原子団Ｃ^１およびＣ^２は、例えば、保護基から水素原子に変換し（保護基を外し）、さらに、水素原子から、蛍光性を有する原子団（色素）で置換することができる。保護基を外す方法は特に制限されず、公知の方法を適宜用いることができる。蛍光性を有する原子団（色素）で置換する方法も特に制限されず、例えば、Ｃ^１およびＣ^２の部分が水素原子である化合物と、蛍光性分子（色素）とを適宜反応させればよい。例えば、Ｃ^１およびＣ^２の部分の少なくとも一方が活性アミノ基であると、蛍光性分子（色素）と反応しやすいため好ましく、Ｃ^１およびＣ^２の部分の両方が活性アミノ基であることがより好ましい。蛍光性分子（色素）も特に制限されないが、例えば、前記式（２）、（３）のいずれかで表される化合物（ただし、Ｒ^１１およびＲ^１２のいずれもが、水素原子もしくは低級アルキル基、またはカルボキシポリメチレン基である）であっても良い。

色素としては、前述の通り、特に制限されず、あらゆる色素が使用可能であるが、例えば、シアニン色素が好ましく、チアゾールオレンジが特に好ましい。シアニン色素は、例えば、ヘテロ原子を有する２つの複素環がメチンリンカーで結ばれた化学構造をしている。複素環の種類やメチンリンカーの長さを変えること、または複素環への置換基導入などにより、さまざまな励起・発光波長の蛍光色素を合成することが可能である。また、ＤＮＡ導入のためのリンカー導入も比較的容易である。なお、チアゾールオレンジは水中でほとんど蛍光を出さないが、ＤＮＡまたはＲＮＡと相互作用することにより強い蛍光を発する。核酸との相互作用により、色素分子間の相互作用が抑制されること、そして色素分子の２つの複素環の間のメチンリンカー周りの回転が抑制されることが蛍光強度の増加につながると考えられている。なお、チアゾールオレンジ色素の使用方法については、良く知られているが、例えば、Ｈ．Ｓ．Ｒｙｅ，Ｍ．Ａ．Ｑｕｅｓａｄａ，Ｋ．Ｐｅｃｋ，Ｒ．Ａ．Ｍａｔｈｉｅｓ ａｎｄ Ａ．Ｎ．Ｇｌａｚｅｒ，Ｈｉｇｈ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ａ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｇｅｌ ｓｃａｎｎｅｒ ｕｓｉｎｇ ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ ａｎｄ ｔｈｉａｚｏｌｅ ｏｒａｎｇｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９１，１９，３２７−３３；及びＬ．Ｇ．Ｌｅｅ，Ｃ．Ｈ．Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｌ．Ａ．Ｃｈｉｕ，Ｔｈｉａｚｏｌｅ ｏｒａｎｇｅ：ａ ｎｅｗ ｄｙｅ ｆｏｒ ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，１９８６，７，５０８−１７を参照して用いることができる。

以下の実施例では、本発明の蛍光色素の合成例を示し、参考例として、本発明の稽古色素のエキシトンオリゴマーへの利用例を示す。ただし、本発明は、以下の実施例により、なんら制限および限定されない。

原料となるＭｏｎｏ−Ｎ−Ｂｏｃ−ＤｉａｍｉｎｅとＴＯは既に報告されているため、これらを参照して合成を行った。ＤＮＡ合成機はＨ−８ ＤＮＡ合成機（日本テクノサービス）、ＨＰＬＣはＬＣ−２０シリーズ（島津製作所）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＡＳＳはｍｉｃｒｏｆｌｅｘ（ブルカーダルトニクス）を用いた。

Ｍｏｎｏ−Ｎ−Ｂｏｃ−ＴＯ_２−ｄｉａｍｉｄｅの合成
５０ｍｌナスフラスコにＴＯ（０．７６３ｇ，１．６２ｍｍｏｌ）、ＤＭＦを７．０ｍｌ、ＨＯＢｔ（０．２４３ｇ，１．８０ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（０．５２１ｇ，１．６２ｍｍｏｌ）を入れ窒素置換をしたのち２５分間室温で撹拌した。この溶液にＭｏｎｏ−Ｎ−Ｂｏｃ−Ｄｉａｍｉｎｅ（０．１８６ｇ，０．７５５ｍｍｏｌ）の３ｍｌのＤＭＦ溶液を加え９５分間室温で撹拌した。この溶液を１００ｍｌのエーテルに滴下し、生じた沈殿を遠心分離により回収した。この沈殿を逆相（ＲＰ−１８）のフラッシュクロマトグラフィー（溶出液、ＭｅＯＨ：０．１％ＴＦＡ＝５０：５０−６０：４０、グラジエント）で精製し、溶媒を減圧留去することにより赤橙色の固体を得た（０．５８４ｇ、収率６７％）。
^１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）ｄ８．６７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），８．５６（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），８．２−７．９１（ｍ，１０Ｈ），７．７４−７．６５（ｍ，４Ｈ），７．５５（ｔ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），７．３７（ｔ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），７．３１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），６．８４（ｓ，２Ｈ），４．６１−４．５１（ｍ，４Ｈ），４．１４（ｓ，６Ｈ），３．２３−３．１３（ｍ，４Ｈ），２．３５−２．２４（ｍ，４Ｈ），１．８５−１．６４（ｍ，８Ｈ），１．３３（ｓ，９Ｈ）；
ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ４９６（Ｍ^２＋），４４６（Ｍ^２＋−Ｂｏｃ）

ＴＯ_２−ｄｉａｍｉｄｅの合成
３０ｍｌナスフラスコにＭｏｎｏ−Ｎ−Ｂｏｃ−ＴＯ_２−ｄｉａｍｉｄｅ（０．２２０ｇ，１９１μｍｏｌ）、アセトニトリルを３．０ｍｌ、トリフルオロ酢酸を３．０ｍｌを入れ３０分間室温で撹拌した。溶媒を減圧留去した後、トリエチルアミン２ｍｌを加え、さらにこれを減圧留去した。残渣を逆相（ＲＰ−１８）のフラッシュクロマトグラフィー（溶出液、ＭｅＯＨ：０．１％ ＴＦＡ＝４０：６０−６０：４０、グラジエント）で精製し、溶媒を減圧留去することにより赤橙色の固体を得た（０．１３９ｇ、収率６９％）。
^１Ｈ ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）ｄ８．６７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），８．５３（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），８．０−７．８０（ｍ，１０Ｈ），７．７２−７．６３（ｍ，４Ｈ），７．５３（ｔ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），７．３６（ｔ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），７．２７（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，２Ｈ），６．８１（ｓ，２Ｈ），４．５５−４．４８（ｍ，４Ｈ），４．１２（ｓ，６Ｈ），３．１０−２．９５（ｍ，４Ｈ），２．３５−２．２４（ｍ，４Ｈ），２．２３−２．１５（ｂｒ，２Ｈ）１．８３−１．６６（ｍ，８Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ４４６（Ｍ^２＋）

Ｅｘｃｉｔｏｎ Ｏｌｉｇｏｍｅｒの合成
ＴＯ_２−ｄｉａｍｉｄｅが導入されたＥｘｃｉｔｏｎ Ｏｌｉｇｏｍｅｒの合成は従来通りのアミダイト法により合成を行った。ＴＯ_２−ｄｉａｍｉｄｅの導入は、目的の位置にＮＨＳ−Ｃａｒｂｏｘｙ−ｄＴを導入した直後にＴＯ_２−ｄｉａｍｉｄｅを反応させ、その後の配列は従来通りの方法で合成を行った。ＣＰＧからの切り出しおよび脱保護は２８％アンモニア水中、５５℃で４時間かけて行った。精製は逆相（ＲＰ−１８）カラムを装備したＨＰＬＣで行った。目的配列の確認はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＡＳＳで行った。測定結果は以下の通りである。
５’−ＧＡＧＴＧＣＣＴＺＧＡＣＧＡＴＡＣ−３’，Ｃａｌｃｄ．６１３９．３，Ｏｂｓ．６１４４．６

Claims (8)

1. 下式で表されることを特徴とする化合物、その互変異性体もしくは立体異性体、またはそれらの塩。
   

   

   式（１）中、
   Ａは、ＣＲ、Ｎ、Ｐ、ＰＯ、ＢもしくはＳｉＲであり、Ｒは、水素原子、アルキル基または任意の置換基である。
   Ｂ^１、Ｂ^２およびＢ^３は、リンカー（架橋原子または原子団）であり、主鎖長は任意である。主鎖中にＣ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｂ、Ｓｉ、Ｓを含んでいてもいなくても良く、単結合、二重結合、三重結合、アミド結合、エステル結合、ジスルフィド結合、イミノ基、エーテル結合、チオエーテル結合、およびチオエステル結合をそれぞれ含んでいてもいなくても良い。Ｂ^１、Ｂ^２およびＢ^３はそれぞれ同一でも異なっていても良い。
   Ｃ^１およびＣ^２は、エキシトン効果を示す蛍光性原子団であり、それぞれ同一でも異なっていてもよい、下式（２）または下式（３）で表される原子団である。Ｅは、Ｏ、Ｓ、Ｓｅであり、ｎは、０または正の整数である。Ｒ^１およびＲ^２のうち一方は、式（１）中のＢ^１またはＢ^２に結合する連結基であり、他方は、水素原子または低級アルキル基である。Ｒ^３〜Ｒ^１２は、それぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基、ニトロ基、シアノ基、カルボニル基、カルボキシル基、アミノ基、シリル基、ボリル基である。ＡＲは、任意の芳香環であり、あってもなくても良い。式（２）または（３）中においてＲ^３が複数存在する場合は、同一でも異なっていてもよく、式（２）または（３）中においてＲ^４が複数存在する場合は、同一でも異なっていてもよい。
   Ｃ^１中のＥ、ＡＲ、ｎおよびＲ^１〜Ｒ^１２と、Ｃ^２中のＥ、ＡＲ、ｎおよびＲ^１〜Ｒ^１２とは、互いに同一でも異なっていてもよい。
   

   

   Ｄは、ＤＮＡオリゴマー、ＲＮＡオリゴマー、たんぱく質、オリゴペプチド、抗体または糖類に結合する部位であり、アミノ基、活性エステル基、チオール基またはビオチン誘導体である。
2. 請求項１に記載の化合物、その互変異性体もしくは立体異性体、またはそれらの塩を用いて製造された標識物質。
3. 標識物質が標識モノヌクレオチド、標識オリゴヌクレオチド、標識核酸または標識核酸誘導体である請求項２に記載の標識物質。
4. 請求項１から３のいずれか１項に記載の標識物質を用いる目的物質の検出方法。
5. 遺伝子の増幅方法を用いた検出方法であり、前記増幅方法のプライマーが、請求項１に記載の物質により標識されている検出方法。
6. 遺伝子の増幅方法を用いた検出方法であり、前記検出が、プローブを用いた検出であり、前記プローブが、請求項１に記載の物質により標識されている検出方法。
7. 前記遺伝子の増幅方法が、ＰＣＲ法である請求項５または６に記載の検出方法。
8. 前記遺伝子の増幅方法が、等温増幅方法である請求項５または６に記載の方法。

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