CN103937490B - 一种检测线粒体中硫离子的荧光探针及其应用 - Google Patents

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本发明涉及一种检测线粒体中硫离子的荧光探针。所述的荧光探针为RhS荧光探针，RhS荧光探针的结构通式如(Ⅰ)所示。本发明的荧光探针能够快速的定位于线粒体中，并能够对其中的硫离子、硫氢根离子进行在线实时的检测，另外，该探针还具有较好的化学、光稳定性，较好的溶解性和生物兼容性，较高的硫离子选择性，不受其他活性氧和活性氮等物种的干扰。激光共聚焦成像实验表明这类探针具有较好的细胞通透性，对细胞和生物体无毒副作用。

Description

一种检测线粒体中硫离子的荧光探针及其应用
技术领域
本发明涉及一类可定位于活细胞线粒体，并检测线粒体中硫离子的荧光探针。
背景技术
硫化氢在生命科学中扮演重要角色，是仅次于一氧化氮和一氧化碳的第三个重要的气体信使分子。自20世纪90年代发现内源性硫化氢(hydrogen sulfide，HS)在体内发挥生理病理作用后，人们开始了对HS新的认识和探索。近些年的研究表明，机体有内源性HS的生成，它同一氧化氮(nitricoxide，NO)有类似的作用:能够舒张血管和消化道平滑肌，抑制血管平滑肌细胞增殖等，并且在神经系统中参与重要的调节作用。此外，HS是一种相对分子质量较小的气体分子，可以自由通过细胞膜，其在溶液中主要存在形式为H2S、HS-和S2-。对S2-进行实时、原位、定量的检测，将有助于我们进一步了解硫化氢的生理功能，有助于增进对HS生理作用的了解，为新型心血管药物的研发提供可视化的检测工具。
生命体中的内源性硫化氢的生成与多种酶相关，比如胱硫醚-B-合成酶(cystathionine-B-synthase，CBS)，胱硫醚裂解酶(cystathionine-lyase，CSE)和半胱氨酸转移酶，其产生的场所是在线粒体中。来源于线粒体中的硫化氢对于心脑血管系统、免疫系统以及神经系统具有非常重要的调节作用。目前对硫离子进行检测的荧光探针种类很多，但是绝大多数都不具有线粒体定位功能，更无法实现对线粒体中所产生的硫离子进行检测。为了实现对线粒体中产生的硫离子进行实时在线的检测，急需开发具有线粒体定位功能的硫离子荧光探针。
发明内容
为了解决以上问题，本发明提供一类可以检测线粒体中硫离子的高灵敏度荧光探针。
本发明采用的技术方案是：一种检测线粒体中硫离子的荧光探针，所述的荧光探针为RhS荧光探针，RhS荧光探针的结构通式如(Ⅰ)所示：
其中，
R1＝R2＝R3＝R4＝H；
或R1＝R4＝H，R2＝-CH2CH3，R3＝-CH3；
或R1＝R2＝-CH3，R3＝R4＝H；
或R1＝R2＝-CH2CH3，R3＝R4＝H；
或R1＝-CH3，R2＝R3＝-CMe2CH＝C(Me)-，R4＝H；
或R1＝R4＝-CMe2CH＝C(Me)-，R2＝R3＝-CMe2CH＝C(Me)-；
或R1＝R4＝-(CH2)3-，R2＝R3＝-(CH2)3-。
上述的RhS荧光探针的制备方法包括如下步骤：将罗丹明类化合物与三氯氧磷加入到干燥的1，2-二氯乙烷中，加热回流反应3-5小时，除去溶剂，加入丙酮和叠氮化钠水溶液，0℃下反应20-26小时，反应液用二氯甲烷萃取、取下层液，无水硫酸镁干燥，经硅胶柱层析提纯得到目标产物RhS荧光探针。优选的，罗丹明类化合物与三氯氧磷的摩尔比为1:2.5-3.5。
本发明的检测线粒体中硫离子的荧光探针的制备反应式如下：
本发明的检测线粒体中硫离子的荧光探针可用于生理体系中硫离子的检测。主要用于检测活细胞线粒体中的硫离子。所述的活细胞为Hela细胞株、MCF-7细胞株或RAW264.7细胞株。
本发明的有益效果是：本发明的荧光探针分子能够快速的定位于线粒体中，并能够对其中的硫离子进行在线实时的检测，另外，该探针还具有较好的化学稳定性，较好的溶解性和生物兼容性，较高的硫离子选择性，不受其他活性氧和活性氮等物种的干扰。激光共聚焦成像实验表明这类探针具有较好的细胞通透性，对细胞和生物体无毒副作用。
附图说明
图1是实施例3制备的RhS-3对Na2S水溶液的吸收光谱响应。
图2是实施例3制备的RhS-3对Na2S水溶液的荧光光谱响应。
图3是实施例3制备的RhS-3对线粒体中硫离子的荧光显微成像。
具体实施方式
实施例1RhS-1荧光探针
将300mmol罗丹明123与900mmol的三氯氧磷POCl3加入到120mL干燥的1，2-二氯乙烷中，加热回流反应4小时，减压除去溶剂。加入50mL干燥的丙酮和300mmol的叠氮化钠水溶液(质量浓度为5％)，0℃下反应24小时。反应液用二氯甲烷萃取、取下层，无水硫酸镁干燥，经硅胶柱层析(200-300目)提纯得到亮黑色产物RhS-1，产率33％，MS:355.1022。
实施例2RhS-2荧光探针
将300mmol的罗丹明6G与900mmol的三氯氧磷POCl3加入到120mL干燥的1，2-二氯乙烷中，加热回流反应4小时，减压除去溶剂。加入50mL干燥的丙酮和300mmol的叠氮化钠水溶液(质量浓度为5％)，0℃下反应24小时。反应液用二氯甲烷萃取、取下层，无水硫酸镁干燥，经硅胶(200-300目)柱层析分离提纯，得到亮黑色的RhS-2，产率34％，MS:439.1789。
实施例3RhS-3荧光探针
将300mmol的四甲基罗丹明与900mmol的三氯氧磷POCl3加入到120mL干燥的1，2-二氯乙烷中，加热回流反应4小时，减压除去溶剂。加入50mL干燥的丙酮和300mmol的叠氮化钠水溶液(质量浓度为5％)，0℃下反应24小时。反应液用二氯甲烷萃取、取下层，无水硫酸镁干燥，经硅胶(200-300目)柱层析分离提纯，得到亮黑色的RhS-3，产率51％，MS:412.1543。
实施例4RhS-4荧光探针
将300mmol的罗丹明B与900mmol的三氯氧磷POCl3加入到120mL干燥的1，2-二氯乙烷中，加热回流反应4小时，减压除去溶剂。加入50mL干燥的丙酮和300mmol的叠氮化钠水溶液(质量浓度为5％)，0℃下反应24小时。反应液用二氯甲烷萃取、取下层，无水硫酸镁干燥，经硅胶(200-300目)柱层析分离提纯，得到亮黑色的RhS-4，产率54％，MS:468.2342。
实施例5RhS-5荧光探针
将300mmol的Alexa Fluor(Pyrano[3,2-g:5,6-g']diquinolin-13-ium,6-(2-carboxyphenyl)-1,2,10,11-tetrahydro-1,2,2,4,8,10,10,11-octamethyl-,inner salt)与900mmol的三氯氧磷POCl3加入到120mL干燥的1，2-二氯乙烷中，加热回流反应4小时，减压除去溶剂。加入50mL干燥的丙酮和300mmol的叠氮化钠水溶液(质量浓度为5％)，0℃下反应24小时。反应液用二氯甲烷萃取、取下层，无水硫酸镁干燥，经硅胶(200-300目)柱层析分离提纯，得到亮黑色的RhS-5，产率34％，MS:544.2766。
实施例6RhS-6荧光探针
将300mmol的罗丹明2(1H,5H,11H,15H-Xantheno[2,3,4-ij:5,6,7-I’j’]diquinolizin-18-ium,9-(2-carboxyphenyl)-2,3,6,7,12,13,16,17-octahydro-,innersalt)与900mmol的三氯氧磷POCl3加入到120mL干燥的1，2-二氯乙烷中，加热回流反应4小时，减压除去溶剂。加入50mL干燥的丙酮和300mmol的叠氮化钠水溶液(质量浓度为5％)，0℃下反应24小时。反应液用二氯甲烷萃取、取下层，无水硫酸镁干燥，经硅胶(200-300目)柱层析分离提纯，得到亮黑色的RhS-6，产率23％，MS:516.2326。
实施例7应用试验
本应用试验采用实施例3制备的RhS-3荧光探针进行。
1、RhS-3对Na2S水溶液的吸收、荧光光谱响应(图1、图2):
配制浓度为10uM的RhS-3溶液(乙醇/NaH2PO4缓冲溶液,体积比1:4,pH＝7.4),加入不同摩尔当量的Na2S(1uM、5uM、10uM、15uM、20uM、30uM、40uM)，分别进行紫外分光光度法和荧光分光光度法测试，并绘制RhS-3对不同浓度的Na2S水溶液响应的吸收光谱和荧光光谱(图1、图2)。
RhS-3表现出对Na2S快速的光谱响应，随着Na2S浓度的增加，当加入40uM的Na2S后，溶液颜色由红色变为无色，荧光由橙红色变为无色。结果表明RhS-3能够用于对Na2S实时在线的监测。
2、RhS-3对线粒体中硫离子的荧光显微成像(图3)：
向含有Hela细胞株的培养皿中，加入浓度为0.05-0.1M的RhS-3的二甲基亚砜溶液，与细胞培养液混合均匀后，使RhS-3在培养液中的终浓度达到10uM。染色5min后，用pH＝7.2的磷酸盐缓冲溶液进行清洗三次，最后将该培养皿置于共聚焦显微镜下进行观察。
实验结果发现，染有RhS-3的细胞线粒体中呈现出较强的荧光，实验结果表明RhS-3具有较好的细胞膜透过性，能够定位于细胞的线粒体中。当加入终浓度为100uM的Na2S后，线粒体中的荧光强度明显减弱，表明RhS-3能够用于线粒体中Na2S的检测，并且在测试过程中细胞保持较高的活性。

Claims (6)

1.一种检测线粒体中硫离子的荧光探针，其特征在于所述的荧光探针为RhS荧光探针,RhS荧光探针的结构通式如(Ⅰ)所示:
其中，
R1＝R2＝R3＝R4＝H；
或R1＝R4＝H，R2＝-CH2CH3，R3＝-CH3；
或R1＝R2＝-CH3，R3＝R4＝H；
或R1＝R2＝-CH2CH3，R3＝R4＝H；
或R1＝-CH3，R2至R3为-CMe2CH＝C(Me)-，R4＝H；
或R1＝R4＝-(CH2)3-，R2＝R3＝-(CH2)3-。
2.如权利要求1所述的检测线粒体中硫离子的荧光探针，其特征在于所述的RhS荧光探针的制备方法包括如下步骤：将罗丹明类化合物与三氯氧磷加入到1，2-二氯乙烷中，加热回流反应3-5小时，除去溶剂，加入丙酮和叠氮化钠水溶液，0℃下反应20-26小时，反应液用二氯甲烷萃取、取下层液，无水硫酸镁干燥，经硅胶柱层析提纯得到目标产物RhS荧光探针。
3.如权利要求2所述的检测线粒体中硫离子的荧光探针，其特征在于罗丹明类化合物与三氯氧磷的摩尔比为1:2.5-3.5。
4.如权利要求1所述的检测线粒体中硫离子的荧光探针在检测生理体系中硫离子的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，荧光探针在检测活细胞线粒体中硫离子的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的活细胞为Hela细胞株、MCF-7细胞株或RAW264.7细胞株。
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