CN105018074B - 一种线粒体靶向型pH荧光探针及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种线粒体靶向型pH荧光探针，所述荧光探针为FDI荧光探针，FDI荧光探针的结构通式如(I)所示。本发明的荧光探针分子能够快速的定位于线粒体中，有较好的化学稳定性，较好的溶解性和生物兼容性。激光共聚焦成像实验表明这类探针具有较好的细胞通透性，对细胞和生物体无毒副作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于荧光素的线粒体靶向型pH荧光探针。
背景技术
近年来,随着生物成像技术的不断发展,荧光探针越来越多地应用于细胞标记及成像、蛋白质分析、医学诊断、生物传感等研究领域。荧光探针具有荧光量子产率高，光稳定性好，生物兼容性好等优点，成为显微成像的理想工具。
pH值是人体内一个重要的生理参数,参与了许多生理过程,比如接受调控信号转换、酶活性、细胞生长、离子运输、离子调控、细胞粘附等。它的变化会影响机体的健康,例如酸性pH与炎症和肿瘤疾病相关。
线粒体控制着细胞凋亡的激活系统，是细胞呼吸的主要场所，在细胞的生命周期中扮演重要角色，三羧酸循环和氧化磷酸化都是在线粒体中进行的。线粒体不仅是细胞内能量产生的主要场所,还是氧自由基产生的重要部位。线粒体的数量与形状不但与细胞的种类有关，也与代谢活动和相关疾病密切相关。因此，实现线粒体的可视化观测对于了解细胞生命活动及疾病的预防和治疗具有重要意义。线粒体存在于大多数的真核细胞中，一般呈短棒状或圆球状，也有环状、线状、哑铃状、分杈状、扁盘状等，大小不一，在光学显微镜下需要经过特殊染色才能看见。一般来说，用于生命科学研究的理想染料需要符合以下要求:较高的焚光量子产率,有良好的生物相容性,稳定性和低毒性。目前,用于活细胞内线粒体靶向成像的荧光探针种类还不是很多。因此开发线粒体靶向型荧光探针具有广阔的前景。
发明内容
本发明目的是提供一种线粒体靶向型pH荧光探针，该荧光探针分子能够快速的定位于线粒体中用于活细胞的荧光显微成像。
本发明采用的技术方案为：
一种线粒体靶向型pH荧光探针，所述荧光探针为FDI荧光探针，FDI荧光探针的结构通式如(I)所示：
所述一种线粒体靶向型pH荧光探针，所述FDI荧光探针的合成方法包括如下步骤：
将荧光素烯醛与2,3,3-三甲基-吲哚，分别加入到无水乙醇中，在氮气保护下加热回流反应7-10小时，反应液冷却后旋干，经硅胶柱层析提纯得到目标产物FDI。其中荧光素烯醛与2,3,3-三甲基-吲哚的比为1:1，硅胶柱层析提纯中的洗脱剂为甲醇：二氯甲烷＝1:10，硅胶柱为300-400目。
所述荧光素烯醛的制备方法为：
(1)将荧光素溶于甲醇中，再加入15-冠醚-5和三氯甲烷，恒压滴加质量分数为33％NaOH溶液，再升温至55℃回流反应10h。在0℃将反应液用浓盐酸酸化，pH调至1-2，出现絮状沉淀，过滤得黄色固体，经硅胶柱层析干法上样提纯得到荧光素单醛，洗脱剂为乙酸乙酯：二氯甲烷＝1：10，硅胶柱为300-400目；
(2)将荧光素单醛，甲酰基亚甲基三苯基磷烷，溶于氯仿，氮气保护，加热50℃，冷凝回流24h，反应液冷却后，旋干去溶剂，经硅胶柱层析提纯得到荧光素烯醛，洗脱剂为甲醇：二氯甲烷＝1:9，硅胶柱为300-400目。
上述这种荧光探针的制备反应式如下：
本发明另一目的是一种线粒体靶向型pH荧光探针在细胞内线粒体的荧光显微成像中的应用。所述细胞为Hela细胞株、MCF-7细胞株或RAW264.7细胞株。
本发明具有以下有益效果：
本发明的荧光探针分子能够快速的定位于线粒体中，具有较好的化学稳定性，较好的溶解性和生物兼容性。激光共聚焦成像实验表明这类探针具有较好的细胞通透性，对细胞和生物体无毒副作用。
附图说明
图1是实施例1制备的FDI荧光探针对不同pH值的吸收光谱响应。
图2是实施例1制备的FDI荧光探针在pH值为1.99-10.36范围的吸收光谱变化。
图3是实施例1制备的FDI荧光探针在pH值为10.36-13.69范围的吸收光谱变化。
图4是实施例1制备的FDI荧光探针对不同pH值的荧光光谱响应。
图5是实施例1制备的FDI荧光探针在pH值为1.99-5.34范围的荧光光谱变化。
图6是实施例1制备的FDI荧光探针在pH值为5.77-13.17范围的荧光光谱变化。
图7是实施例1制备的FDI荧光探针在线粒体中的荧光共聚焦显微成像。
具体实施方式
实施例一 一种线粒体靶向型pH荧光探针
制备方法如：
(1)荧光素单醛的制备：荧光素(1g 3.16mmol)溶于7ml甲醇，再加入0.2ml的15-冠-5和4ml的三氯甲烷，恒压滴加质量分数为33％的NaOH溶液，再升温至55℃回流反应10h，在0℃将反应液用浓盐酸酸化，pH调至1-2，出现絮状沉淀，过滤得黄色固体，经硅胶柱层析干法上样提纯(洗脱剂乙酸乙酯：二氯甲烷＝1：10Rf＝0.33；SiO2300-400目)，得到0.2183g的目标产品，产率19％。MS：360.0634。
(2)荧光素烯醛的制备：荧光素单醛(0.1059g,0.2941mmol)，甲酰基亚甲基三苯基磷烷(0.1105g,0.3634mmol)，溶于氯仿(25ml)，氮气保护，加热50℃，冷凝回流24h，反应液冷却后，旋干去溶剂，经硅胶柱层析提纯(洗脱剂甲醇：二氯甲烷＝1:9Rf＝0.42；SiO2300-400目)，得到0.0721g的目标产品，产率63％。MS：386.0790。
(3)FDI的制备：荧光素烯醛(0.0721g,0.18mmol),N-R-2,3,3-三甲基-3H-吲哚(0.0566g,0.18mmol)，加入到无水乙醇中，氮气保护下加热回流反应7-10小时，反应液冷却后，旋干去溶剂，经硅胶柱层析提纯(洗脱剂二氯甲烷：甲醇＝10:1Rf＝0.28；SiO2300-400目)，得到40.97mg的目标产品，产率42％。MS：669.1012。
实施例二 一种线粒体靶向型pH荧光探针对pH响应检测
将实施例1中制备的FDI荧光探针溶于乙醇水溶液中，配制浓度为2×10-5M的FDI乙醇溶液，其中乙醇与水的体积比5:5。逐次调节FDI乙醇溶液pH，可见溶液的颜色随着pH值增加由黄色变为墨绿色最后变为红色。
各次溶液进行紫外分光光度法测试，将所得数据汇总绘制出FDI荧光探针对不同pH值响应的吸收光谱，如图1所示。调节FDI乙醇溶液pH由1.99,2.66…逐渐升高至10.36,可见溶液吸收光谱454nm处的波峰由454nm红移至489nm，且峰值随pH值的增加由0.46升高至0.97，624nm处随pH值的增加由无波峰至逐渐出现波峰，峰值升高至0.38，如图2所示。调节FDI乙醇溶液pH由10.36逐渐升高至13.69,可见溶液吸收光谱在489nm处的波峰继续红移，且峰值随pH值的增加而降低至0.75，624nm处的波峰峰值随pH值的增加而降低至0.08，如图3所示。由图2、图3可知FDI荧光探针对于pH在吸收上有响应，pH值的改变可使FDI颜色发生改变。
各次溶液进行荧光分光光度法测试，将所有数据汇总绘制出FDI荧光探针对不同pH响应的荧光光谱，如图4所示。调节FDI乙醇溶液pH由1.99逐渐升高至5.34,可见溶液荧光光谱在672nm处的波峰的荧光强度随pH值的增加由158升高至686，如图5所示。调节FDI乙醇溶液pH由5.34…逐渐升高至13.17,可见溶液荧光光谱在672nm处的波峰荧光强度随pH值的增加降低至35，如图5所示。由图4、图5可知FDI荧光探针对于pH在荧光上有响应，pH值的改变可使FDI荧光强度发生改变。
实施例三 一种线粒体靶向型pH荧光探针用于活细胞的荧光显微成像
向含有MCF-7或RAW264.7(Hela)细胞株的培养皿中，加入浓度为加入实施例2中浓度为2×10-5M的FDI乙醇溶液，与细胞培养液混合均匀后，使FDI在培养液中的终浓度达到10uM。染色5min后，用pH＝7.2的磷酸盐缓冲溶液进行清洗三次，然后将该培养皿置于37℃恒温培养箱中进行孵育24小时，最后将该培养皿置于共聚焦显微镜下进行观察。实验结果发现，染有FDI的Hela细胞线粒体中呈现出明显的荧光，如图7所示。实验结果表明，FDI能进入细胞，具有较好的细胞膜透过性，且FDI可以定位于线粒体，能够检测细胞线粒体中的pH。
Claims (7)
1.一种线粒体靶向型pH荧光探针，所述荧光探针为FDI荧光探针，所述FDI荧光探针的结构式如(I)所示，其特征在于，所述FDI荧光探针的合成方法包括如下步骤：
将荧光素烯醛与2,3,3-三甲基-吲哚，分别加入到无水乙醇中，在氮气保护下加热回流反应7-10小时，反应液冷却后旋干，经硅胶柱层析提纯得到目标产物FDI；所述荧光素烯醛与2,3,3-三甲基-吲哚的摩尔比为1:1；
2.如权利要求1所述一种线粒体靶向型pH荧光探针，其特征在于，硅胶柱层析提纯中的洗脱剂为甲醇：二氯甲烷＝1:10，硅胶柱为300-400目。
3.如权利要求1所述一种线粒体靶向型pH荧光探针，其特征在于，所述荧光素烯醛的制备方法为：
(1)将荧光素溶于甲醇中，再加入15-冠醚-5和三氯甲烷，恒压滴加质量分数为33％NaOH溶液，再升温至55℃回流反应10h，在0℃将反应液用浓盐酸酸化，pH调至1-2，出现絮状沉淀，过滤得黄色固体，经硅胶柱层析干法上样提纯得到荧光素单醛；
(2)将荧光素单醛、甲酰基亚甲基三苯基磷烷，溶于氯仿，氮气保护，加热50℃，冷凝回流24h得反应液，反应液冷却后，旋干去溶剂，经硅胶柱层析提纯得到荧光素烯醛。
4.如权利要求3所述一种线粒体靶向型pH荧光探针，其特征在于，所述步骤(1)中硅胶柱层析干法上样提纯中的洗脱剂为乙酸乙酯：二氯甲烷＝1：10，硅胶柱为300-400目。
5.如权利要求3所述一种线粒体靶向型pH荧光探针，其特征在于，所述步骤(2)中硅胶柱层析提纯中的洗脱剂为甲醇：二氯甲烷＝1:9，硅胶柱为300-400目。
6.如权利要求1所述一种线粒体靶向型pH荧光探针在细胞内线粒体的非疾病诊断或治疗目的的荧光显微成像中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述细胞为Hela细胞株、MCF-7细胞株或RAW264.7细胞株。
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