CN105733564B - 一种线粒体靶向的pH敏感的比率型荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

一种线粒体靶向的pH敏感的比率型荧光探针及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种线粒体靶向的pH敏感的比率型荧光探针及其制备方法和应用，比率型荧光探针的化学结构式如(1)所示；本发明提供的线粒体靶向的pH比率荧光探针，具有快速响应、高选择性、高灵敏性检测pH值的微小变化的优点，并且该荧光探针通过比率荧光可以避免荧光探针浓度、微环境以及成像参数等因素的影响；细胞暗毒性试验表明这一荧光探针具有细胞低毒性、温度影响小的优点。

Description

一种线粒体靶向的pH敏感的比率型荧光探针及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种线粒体靶向的pH敏感的比率型荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
荧光探针是一种极好的生物分子传感器，具备灵敏度高、反应时间迅速等特点，特别是在检测小分子等方面，近年来在细胞学检测中应用十分广泛，如细胞凋亡的检测、细胞表面特征的检测以及细胞pH的检测等；细胞和细胞器的许多重要生理过程都与pH值密切相关，pH是衡量生物生理的重要参数，细胞内外的pH值的准确实时监测可为研究细胞的生理病理过程的分析和诊断提供重要的信息，如细胞的偏酸性环境可能与炎症或肿瘤相关等。
与酸性的细胞器不同，线粒体的pH值显示微碱性，是细胞呼吸和细胞能量产生的主要场所，在细胞的生命周期中的活性氧的产生、钙离子的平衡以及细胞死亡的触发等起着重要的作用；与线粒体相关的生理功能取决于pH，pH值的微小变化对认识线粒体的生理过程有着重要的意义。
荧光光谱法检测pH值是一种基于光学信号建立的检测方法，具有高灵敏性、高选择性等特点；但荧光探针的荧光强度可能会受到多种因素的影响，如光程长度、激发光的强度以及用于检测生物体系微小pH值偏差的关-开型荧光探针的荧光信号会受到荧光探针浓度、微环境以及成像参数等因素的影响；因此研发通过测量两个不同波长荧光的强度比值变化的比率型荧光探针具有重要的意义、应用价值和广阔的前景。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足，而提供一种线粒体靶向的pH敏感的比率型荧光探针及其制备方法和应用，具有快速响应、高选择性、高灵敏性检测pH值的微小变化、可通过比率荧光避免荧光探针浓度、微环境以及成像参数等因素的影响、细胞低毒性的特点。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种线粒体靶向的pH敏感的比率型荧光探针，所述的比率型荧光探针的结构式为如(1)所示：
一种线粒体靶向的pH敏感的比率型荧光探针的制备方法，所述的比率型荧光探针的制备方法包括以下步骤：
步骤1，合成2，3，3-三甲基-3H-吲哚-5-羧酸
a.将4-羧基苯肼盐酸盐和氢氧化钠混合溶于无水乙醇，室温下，超声震荡搅拌至溶解；
b.将步骤a中的溶解液旋干，除去无水乙醇，再将剩余的固体溶于冰乙酸中，加入醋酸钠，超声震荡搅拌至溶解；
c.向步骤b中的溶解液中加入3-甲基-2-丁酮，加热至100℃，回流12h；
d.待步骤c中的反应液冷却至室温，减压蒸馏，除去冰乙酸；将蒸馏后剩余的溶液冷却至0℃，加入饱和碳酸钠溶液使之溶解，滴加盐酸调节pH＝4，用二氯甲烷萃取，收集油相；将油相用无水硫酸钠干燥，抽滤，旋干二氯甲烷，得红色油状物，为2，3，3-三甲基-3H-吲哚-5-羧酸。
步骤2，合成5-羧基-1，2，3，3-四甲基-3H-碘化吲哚盐
①将步骤1中合成的2，3，3-三甲基-3H-吲哚-5-羧酸溶于乙腈，加入碘甲烷，加热至45℃，反应12h；
②待步骤①中反应液冷却至室温，加入乙醚，直至无沉淀产生止，抽滤，乙醚洗，真空干燥，得米色固体5-羧基-1，2，3，3-四甲基-3H-碘化吲哚盐，其结构如(2)所示：
步骤3，合成比率型荧光探针
I.将步骤2中合成的5-羧基-1，2，3，3-四甲基-3H-碘化吲哚盐和4-羟基苯甲醛混合溶于无水乙醇，超声至混合均匀，升温至80℃回流4h；
II.待步骤I中反应液冷却后，抽滤，用冷冻的无水乙醇洗涤，真空干燥，得橙红色固体，即线粒体靶向的pH敏感的比率型荧光探针。
一种线粒体靶向的pH敏感的比率型荧光探针的应用，所述的比率型荧光分子探针在细胞的线粒体内靶向的pH敏感的比率荧光成像的应用。
所述的步骤a中4-羧基苯肼盐酸盐和氢氧化钠的摩尔比为1∶4。
所述的步骤c中4-羧基苯肼盐酸盐和3-甲基-2-丁酮的摩尔比为：1∶1。
所述的步骤①中2，3，3-三甲基-3H-吲哚-5-羧酸与碘甲烷的摩尔比为：1∶4。
所述的步骤b中醋酸钠与4-羧基苯肼盐酸盐的摩尔比为4∶1。
所述的步骤I中5-羧基-1，2，3，3-四甲基-3H-碘化吲哚盐和4-羟基苯甲醛的摩尔比为：1∶1。
所述的细胞为HeLa细胞。
本发明的有益效果：本发明的比率型荧光探针可以在细胞内定位线粒体实现pH值荧光成像，实现5.0-9.6pH值的比率型荧光成像，且对金属离子、阴离子以及细胞内生物相关分子抗干扰性强，具有荧光可逆性、快速响应、高选择性、高灵敏性检测pH值的微小变化的优点；pH敏感的比率型荧光探针可通过比率荧光避免荧光探针浓度、微环境以及成像参数等因素的影响，具有准确性高的优点；在生物体常见的温度下从28℃至48℃范围内，具有化学性质稳定、光稳定性好和毒性小等优点。
附图说明
图1是实施例1制备的比率型荧光探针(a)不同pH值的探针的吸收光谱；(b)吸收光谱与不同pH之间的线性关系；(c)不同pH环境下探针图片。
图2是实施例1制备的比率型荧光探针(a)在pH值为5.0-9.6范围的荧光光谱；(b)I564/I526比值与pH的关系图。
图3是实施例1制备的比率型荧光探针(a)荧光探针I564/I525比值随pH变化图；(b)荧光探针I564/I525比值随时间变化图。
图4是实施例1制备的比率型荧光探针加入不同目标化合物的荧光强度图。
图5是实施例1制备的比率型荧光探针在A549细胞的暗毒性图。
图6是实施例1制备的比率型荧光探针不同浓度下、pH7.4的HeLa细胞的共聚焦图像。
图7是实施例1制备的比率型荧光探针在pH5-10范围内荧光探针(1.25μM)HeLa细胞的激光共聚焦显微镜图像。
图8是实施例1制备的比率型荧光探针载不同pH值下的荧光探针吸收光谱的比率响应关系图。
图9是实施例1制备的比率型荧光探针在不同pH值下的发射光谱的比率响应关系图。
图10是实施例1制备的比率型荧光探针在不同温度下的I564/I525发射比率光谱图。
图11是实施例1制备的比率型荧光探针荧光探针加入不同金属离子的发射光谱图。
图12是实施例1制备的比率型荧光探针加入不同阴离子的发射光谱图。
图13是实施例1制备的比率型荧光探针在pH5-10范围内荧光探针(0.625μM)HeLa细胞的激光共聚焦显微镜图像。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的说明。
本发明化合物的合成方案如下式所示：
实施例1
a.将500mg(2.46mmol)4-羧基苯肼盐酸盐和98.5mg(2.46mmol)氢氧化钠混合于100mL的茄形瓶中，加入无水乙醇，室温下，超声震荡搅拌至溶解；
b.将步骤a中的溶解液旋干，除去无水乙醇，再将剩余的固体移至100mL三口瓶中，加入16mL冰乙酸，再加入405mg(4.94mmol)醋酸钠，超声震荡搅拌至溶解；
c.向步骤b中的溶解液中加入397μL(3.7mmol)3-甲基-2-丁酮，加热至100℃，回流12h；
d.待步骤c中的反应液冷却至室温，减压蒸馏，除去冰乙酸；将蒸馏后剩余的溶液用冰水冷却至0℃，慢慢加入饱和碳酸钠溶液使之溶解，滴加盐酸调节pH＝4，用二氯甲烷萃取三次，收集油相；将油相用无水硫酸钠干燥，抽滤，旋干二氯甲烷，得红色油状物，为2，3，3-三甲基-3H-吲哚-5-羧酸。
步骤2，合成5-羧基-1，2，3，3-四甲基-3H-碘化吲哚盐
①将步骤1中合成的2，3，3-三甲基-3H-吲哚-5-羧酸溶于20mL乙腈，并移至50mL三口瓶中，加入500μL碘甲烷，加热至45℃，反应12h；
②待步骤①中反应液冷却至室温，加入乙醚，直至无沉淀产生止，抽滤，乙醚洗三次，真空干燥，得米色固体5-羧基-1，2，3，3-四甲基-3H-碘化吲哚盐，产率为60％，其结构如下所示，核磁共振氢谱测定如下：
1HNMR(400MHz，DMSO-d6，TMS)：δH13.73(s，1H)，10.10(s，1H)，8.88(d，2H)，8.60(d，2H)，8.54(d，2H)，8.14(d，2H)，7.77(t，2H)，7.67(t，2H).13CNMR(100MHz，DMSO-d6)：δC193.03，172.48，148.16，136.54，135.89，130.69，127.75，126.92，126.16，124.48，and122.53。
步骤3，合成比率型荧光探针
I.将步骤2中合成的5-羧基-1，2，3，3-四甲基-3H-碘化吲哚盐称取229mg(0.66mmol)和81mg(0.66mmol)4-羟基苯甲醛混合溶于15mL无水乙醇，超声至混合均匀，升温至80℃，回流4h；
II.待步骤I中反应液冷却后，抽滤，用冷冻的无水乙醇洗涤，真空干燥，得橙红色固体，即线粒体靶向的pH敏感的比率型荧光探针，产率85％，核磁共振氢谱测定如下：
HRMS(EI)m/z：calcdforC20H20NO3[M-I]，322.1443；found，322.1442.1HNMR(600MHz，DMSO-d6，TMS)：δH10.97(s，1H)，8.47(d，1H)，8.39(s，1H)，8.17(m，3H)，7.93(d，1H)，7.49(d，1H)，6.98(d，2H)，4.10(s，3H)，1.82(s，6H).13CNMR(150MHz，DMSO-d6)：δC183.80，167.08，164.30，155.91.，145.69，143.86，134.60，131.16，130.87，126.53，124.20，117.03，115.13.109.76，52.26，34.69，and26.06。
上述制备的比率型荧光探针对pH相应实验如下：
如图1所示，由实施例1制得的探针，随着pH的变化，探针酚式结构逐渐转变为酚盐式，由于分子内电荷转移的缘故(ICT)，探针位于430nm处的吸收峰逐渐降低，红移至535nm处的吸收峰逐渐增强，可以从pH＝5.0至pH＝9.6溶液颜色明显的变化可体现紫外比率效果，从黄色渐变为橙黄色进而变为肉粉色最后变为紫红色，A535/A430比值与pH呈现出了良好的线性关系。
图2(a)pH从5.00至9.60(间隔为0.2)，探针的荧光光谱(激发波长为470nm，1.0×10-5M，VHEPES∶Vethanol＝100∶1)；(b)I564/I526比值与pH的关系。
当pH＝5.00时，该探针的荧光发射为双峰，分别位于564nm和526nm处，且526nm处的荧光强度略大于564nm处的荧光强度；随着pH值的增加，位于526nm处的荧光强度逐渐降低，而位于564nm处的荧光强度逐渐增强，与随着pH值的增加，探针分子逐渐由酚式结构变为酚盐式，分子内产生了电荷转移的缘故(ICT)相对应；随着从pH＝5.0增至pH＝9.6，探针的I564/I526强度比值增加了将近20倍。
图3a显示了探针检测pH的荧光可逆性强度变化。
配制浓度为0.01mol/L，pH＝6.0的HEPES溶液，然后取6mL配制好的上述溶液于10mL的小烧杯中，取60μL浓度为1×10-3mol/L探针的色谱乙醇溶液于上述小烧杯溶液中，此时探针的浓度为1×10-5mol/L，VHEPES∶Vethanol＝100∶1，混合均匀后，取出3mL于荧光比色皿中，以470nm为激发波长，测其发射光谱，并计算出I564/I526的强度比值；紧接着将荧光比色皿中3mLpH＝6.0的HEPES溶液倒回取处，用3mol/LNaOH溶液调至pH＝9.0，取出3mL于荧光比色皿中，以470nm为激发波长，测其发射光谱，并计算出I564/I526的强度比值；紧接着将荧光比色皿中3mLpH＝9.0的HEPES溶液倒回取处，用3mol/LHCl溶液调至pH＝6.0，取出3mL于荧光比色皿中，以470nm为激发波长，测其发射光谱，并计算出I564/I526的强度比值；以上过程即为一个可逆循环。
图3b研究了温度对探针在溶液中检测pH的影响。
分别取3mL浓度为0.01mol/L，pH＝7.40的HEPES溶液于闪烁瓶中，然后分别取30μL浓度为1×10-3mol/L探针的色谱乙醇溶液于上述闪烁瓶中，此时探针的浓度为1×10-5mol/L，VHEPES∶Vethanol＝100∶1，最后再分别加入10倍当量各种生物小分子包括半胱氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、甘氨酸、高半胱氨酸、谷氨酸、谷胱甘肽、精氨酸、赖氨酸、酪氨酸、亮氨酸、色氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、葡萄糖、过氧化氢，图4表明生物小分子的加入未改变探针选择性，检测pH＝7.4的荧光光谱I564/I526强度比值，表明该发明的探针有很强的抗生物小分子干扰性。
图5显示了探针的A535/A430强度比值与pH(从5.00至9.60)的曲线关系图，pH值从7.00至8.80，紫外吸收的强度比值增加大于15倍。
图6显示了不同pH值的荧光探针(HEPES缓冲溶液，1.0×10-5M)发射光谱的比率响应关系；当pH＝5.00时，该探针的荧光发射为双峰，分别位于564nm和526nm处，且526nm处的荧光强度略大于564nm处的荧光强度；随着pH值的增加，位于526nm处的荧光强度逐渐降低，而位于564nm处的荧光强度逐渐增强，这与随着pH值的增加，探针分子逐渐由酚式结构变为酚盐式，分子内产生了电荷转移的缘故(ICT)相对应。
图7显示了从28℃增加至48℃荧光探针(HEPES缓冲溶液，1.0×10-5M)的I564/I525发射比率光谱几乎没有变化。
图8显示了荧光探针(HEPES缓冲溶液，1.0×10-5M)加入10当量的不同金属干扰离子(无，Al3+，Ca2+，Cd2+，Co2+，Cr3+，Cu2+，Hg2+，K1+，Mg2+，Mn2+，Na1+，Ni2+，pb2+和Zn2+)对发射光谱无影响。
图9显示了不同阴离子(无，F-，Cl-，Br-，I-，S2-，N3-，HS-，Ac-，CO3 2-，NO3 -，SO3 2-，SO4 2-，SiO3 2-，PO4 3-，ClO3-，ClO4-，C2O4 2-，S2O3 2-，P2O7 4-，HCO3 -，HSO3 -，HSO4 -，HPO4 2-和H2PO4 -)，10当量的干扰阴离子对发射光谱无影响。
实施例1制备的比率型荧光探针的细胞暗毒性及细胞荧光成像试验如下：
图10显示了荧光探针A549细胞的暗毒性实验结果。
将处于对数期生长的HeLa细胞铺于96孔培养板，过夜培养；吸取40μL，100μM探针于60μLHeLa细胞培养液，使探针的工作浓度为40μM；吸取20μL，100um探针于80μLHeLa细胞培养液，使探针的工作浓度为20μM；吸取10μL，100μM探针于90μLHeLa细胞培养液，使探针的工作浓度为10μM；吸取5μL，100μM探针于95μLHeLa细胞培养液，使探针的工作浓度为5μM；吸取2.5μL，100μM探针于97.5μLHeLa细胞培养液，使探针的工作浓度为2.5μM；吸取62.5μL，2μM探针于37.5μLHeLa细胞培养液，使探针的工作浓度为1.25μM；不同浓度的染料与细胞孵育24h；向各细胞孔中加入10μL5.0mg/mLMTT，孵育5h；吸弃MTT黄色上清液，留蓝紫色沉淀；向各孔中加入150mLDMSO，溶解沉淀，于培养箱中孵育8min；用酶标仪检测570nm下的吸光值，计算细胞的存活率，取的是六次测试结果的平均值，由暗毒性实验结果可知染料与HeLa细胞孵育浓度低于20μM时，细胞的存活率在80％以上。
图11显示当染料与细胞的孵育浓度在0.001μM～1.25μM之间时，λ564nm和λ526nm强度随着浓度增加而增强，I564/I526比值基本没有变化；当染料与细胞的孵育浓度在5.00μM～10.0μM之间时，可能是由于高浓度淬灭效应引起λ564nm和λ526nm强度随着浓度增加而降低，但I564/I526比值基本没有变化。
图12显示了当探针的工作浓度为1.25μM时，以488nm为激发波长，随着pH由5.0变化至10.0，绿光逐渐减弱，而红光逐渐增强。
图13是荧光探针(0.625μM)HeLa细胞的pH5-10激光共聚焦显微镜图像，随着pH由5.0变化至10.0，比率荧光逐渐增强，比率效果明显；因此该比率荧光探针可以实现细胞内pH的检测，具有很强的应用价值。
实施例2
步骤1，合成2，3，3-三甲基-3H-吲哚-5-羧酸
a.将1000mg(4.92mmol)4-羧基苯肼盐酸盐和197.0mg(4.92mmol)氢氧化钠混合于100mL的茄形瓶中，加入无水乙醇，室温下，超声震荡搅拌至溶解；
b.将步骤a中的溶解液旋干，除去无水乙醇，再将剩余的固体移至100mL三口瓶中，加入28mL冰乙酸，再加入810mg(9.88mmol)醋酸钠，超声震荡搅拌至溶解；
c.向步骤b中的溶解液中加入794μL(7.4mmol)3-甲基-2-丁酮，加热至100℃，回流12h；
d.待步骤c中的反应液冷却至室温，减压蒸馏，除去冰乙酸；将蒸馏后剩余的溶液用冰水冷却至0℃，慢慢加入饱和碳酸钠溶液使之溶解，滴加盐酸调节pH＝4，用二氯甲烷萃取三次，收集油相；将油相用无水硫酸钠干燥，抽滤，旋干二氯甲烷，得红色油状物，为2，3，3-三甲基-3H-吲哚-5-羧酸。
步骤2，合成5-羧基-1，2，3，3-四甲基-3H-碘化吲哚盐
①将步骤1中合成的2，3，3-三甲基-3H-吲哚-5-羧酸溶于36mL乙腈，并移至50mL三口瓶中，加入1000μL碘甲烷，加热至45℃，反应12h；
②待步骤①中反应液冷却至室温，加入乙醚，直至无沉淀产生止，抽滤，乙醚洗三次，真空干燥，得米色固体5-羧基-1，2，3，3-四甲基-3H-碘化吲哚盐，产率为61.2％。
步骤3，合成比率型荧光探针
I.将步骤2中合成的5-羧基-1，2，3，3-四甲基-3H-碘化吲哚盐称取458mg(1.32mmol)和162mg(1.32mmol)4-羟基苯甲醛混合溶于26mL无水乙醇，超声至混合均匀，升温至80℃，回流4h；
II.待步骤I中反应液冷却后，抽滤，用冷冻的无水乙醇洗涤，真空干燥，得橙红色固体，即线粒体靶向的pH敏感的比率型荧光探针，产率为84.3％。
产物的测定都同实施例1。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims (7)

1.一种线粒体靶向的pH敏感的比率型荧光探针，其特征在于，所述的比率型荧光探针的结构式为如(1)所示：
2.一种线粒体靶向的pH敏感的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，所述的比率型荧光探针的制备方法包括以下步骤：
步骤1，合成2，3，3-三甲基-3H-吲哚-5-羧酸
a.将4-羧基苯肼盐酸盐和氢氧化钠混合溶于无水乙醇，室温下，超声震荡搅拌至溶解；
b.将步骤a中的溶解液旋干，除去无水乙醇，再将剩余的固体溶于冰乙酸中，加入醋酸钠，超声震荡搅拌至溶解；
c.向步骤b中的溶解液中加入3-甲基-2-丁酮，加热至100℃，回流12h；
d.待步骤c中的反应液冷却至室温，减压蒸馏，除去冰乙酸；将蒸馏后剩余的溶液冷却至0℃，加入饱和碳酸钠溶液使之溶解，滴加盐酸调节pH＝4，用二氯甲烷萃取，收集油相；将油相用无水硫酸钠干燥，抽滤，旋干二氯甲烷，得红色油状物，为2，3，3-三甲基-3H-吲哚-5-羧酸；
步骤2，合成5-羧基-1，2，3，3-四甲基-3H-碘化吲哚盐
①将步骤1中合成的2，3，3-三甲基-3H-吲哚-5-羧酸溶于乙腈，加入碘甲烷，加热至45℃，反应12h；
②待步骤①中反应液冷却至室温，加入乙醚，直至无沉淀产生止，抽滤，乙醚洗，真空干燥，得米色固体5-羧基-1，2，3，3-四甲基-3H-碘化吲哚盐，其结构如(2)所示：
步骤3，合成比率型荧光探针
I.将步骤2中合成的5-羧基-1，2，3，3-四甲基-3H-碘化吲哚盐和4-羟基苯甲醛混合溶于无水乙醇，超声至混合均匀，升温至80℃，回流4h；
II.待步骤I中反应液冷却后，抽滤，用冷冻的无水乙醇洗涤，真空干燥，得橙红色固体，即线粒体靶向的pH敏感的比率型荧光探针。
3.如权利要求2所述的一种线粒体靶向的pH敏感的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，所述的步骤a中4-羧基苯肼盐酸盐和氢氧化钠的摩尔比为1∶4。
4.如权利要求2所述的一种线粒体靶向的pH敏感的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，所述的步骤c中4-羧基苯肼盐酸盐和3-甲基-2-丁酮的摩尔比为：1∶1。
5.如权利要求2所述的一种线粒体靶向的pH敏感的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，所述的步骤①中2，3，3-三甲基-3H-吲哚-5-羧酸与碘甲烷的摩尔比为：1∶4。
6.如权利要求2所述的一种线粒体靶向的pH敏感的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，所述的步骤b中醋酸钠与4-羧基苯肼盐酸盐的摩尔比为4∶1。
7.如权利要求2所述的一种线粒体靶向的pH敏感的比率型荧光探针的制备方法，其特征在于，所述的步骤I中5-羧基-1，2，3，3-四甲基-3H-碘化吲哚盐和4-羟基苯甲醛的摩尔比为：1∶1。
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