CN116496200A - 一种具有pH响应性的溶酶体/线粒体双色荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
一种具有pH响应性的溶酶体/线粒体双色荧光探针及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，公开了一种具有pH响应性的溶酶体/线粒体双色荧光探针及其制备方法和应用，该溶酶体/线粒体双色荧光探针化合物的结构式如式(I)所示：所述A‑为N甲基化阴离子；优选地，所述N甲基化阴离子选自Cl‑、Br‑、I‑、ClO4 ‑、TfO‑、TsO‑或BF4 ‑。本发明的荧光探针化合物具有pH响应性，进入细胞后可同时靶向溶酶体和线粒体，并产生不同颜色的荧光，可用于活细胞溶酶体和线粒体双色成像，对研究溶酶体和线粒体的相互作用具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种具有pH响应性的溶酶体/线粒体双色荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
线粒体和溶酶体是真核细胞内两个重要的细胞器，它们在生理或病理状态下均会存在相互作用，包括线粒体-溶酶体融合(即线粒体自噬)和线粒体-溶酶体接触。而这些相互作用是真核细胞中维持细胞稳态的重要过程，与神经退行性疾病和癌症等相关。值得注意的是，线粒体和溶酶体具有截然不同的pH环境，当它们发生相互作用时，两个细胞器以及其周围环境的pH必然会发生复杂的变化，而通过可视化手段去研究线粒体和溶酶体相互作用时产生的pH变化，将有助于从新的角度去理解线粒体和溶酶体相互作用的动态变化，从而推动溶酶体和线粒体相互作用相关疾病的研究进一步发展。
然而，针对线粒体和溶酶体相互作用时pH变化的研究十分具有挑战性，而目前研究线粒体和溶酶体的相互作用的方法也鲜有报道。有报道同时用商用线粒体探针MitoTracker和商用溶酶体探针LysoTracker对线粒体和溶酶体相互作用进行研究的方法，但是用两种探针染色可能会存在相互干扰、在细胞内代谢不同、花费大量时间摸索染色条件等问题。此外也有报道使用小分子荧光探针双通道成像溶酶体和线粒体，其线粒体响应机理是依赖于荧光分子的化学反应基团与线粒体发生共价结合而显色，但并不能观察线粒体和溶酶体发生相互作用时的pH变化。
因此，发明一种具有pH响应性且可同时靶向溶酶体和线粒体并发出不同颜色荧光的荧光探针以实现同时区分并双色成像溶酶体和线粒体是现阶段本领域的研究目标。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出了一种具有pH响应性的溶酶体/线粒体双色荧光探针及其制备方法和应用，该溶酶体/线粒体双色荧光探针化合物进入细胞后可同时靶向溶酶体和线粒体，并产生不同颜色的荧光。此外，本发明的荧光探针化合物还能够对不同的pH值作出响应。
本发明还提出了一种上述化合物的制备方法。
本发明还提出了一种荧光探针。
本发明还提出了上述的化合物或荧光探针在制备溶酶体和/或线粒体检测试剂中的应用。
本发明还提出了上述的溶酶体/线粒体双色荧光探针在制备研究溶酶体和线粒体相互作用检测试剂中的应用。
本发明的第一方面，提供了一种结构式如式(I)所示的化合物：
所述A-为N甲基化阴离子。
根据本发明实施例的化合物，至少具有如下有益效果：
(1)本发明的化合物进入细胞后可同时靶向溶酶体和线粒体，并产生不同颜色的荧光，其中在溶酶体内的激发波长是405nm，发射波长为555nm，能使显示出绿色荧光；在线粒体内的激发波长是561nm，发射波长为595nm，能使线粒体显示出红色荧光。
(2)本发明的化合物具有优异的pH致色的能力，在pH为酸性的溶酶体内，化合物的酚羟基应电离程度低，导致推电子效应下降，发射绿色荧光；然而在pH为弱碱性的线粒体内，化合物的酚羟基解离程度大幅提高，使氧原子电子密度升高，推电子效应上升，吸收和发生的波长发生红移，发射红色荧光。
在本发明的一些实施方式中，所述N甲基化阴离子选自Cl-、Br-、I-、ClO4 -、TfO-、TsO-或BF4 -。
优选地，所述N甲基化阴离子选自Cl-、Br-、I-中的一种。
更优选地，所述N甲基化阴离子为Br-。
当所述A-为Br-时，所述化合物的化学名为(E)-1-(2-carboxyethyl)-2-(4-hydroxy-3,5-dimeth oxystyryl)-3,3-dimethyl-3H-indol-1-ium，简称为INSA，其化学结构式如式(Ⅱ)所示：
本发明提供的化合物是以1-(2-羧乙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚环阳离子环和丁香醛拼接而成的荧光分子，该荧光分子具给电子基团(D)和吸电子基团(A)形成D-π-A构型，是典型的具有扭曲的分子内电荷转移发光机制的探针分子。同时由于酚羟基与季铵阳离子远程共轭使得该酚羟基的解离程度与所述化合物的共轭体系密切相关，以致该酚羟基赋予了所述化合物pH致色的能力，可作为所述化合物的pH响应基团。
此外，本发明提供的化合物具有独特N-羧乙基吲哚阳离子环，一方面该结构能使其通过内吞作用靶向溶酶体，另一方面该结构为典型的正电荷线粒体靶向基团，使其能够同时靶向线粒体。
在本发明的一些实施方式中，当A-选自Cl-、I-、ClO4 -、TfO-、TsO-或BF4 -时，其获得的探针与INSA探针具有相当的效果，在制备过程中可以在INSA探针的基础上通过离子交换得到。
本发明的第二方面，提供了一种上述化合物的制备方法，包括如下步骤：
将化合物2与4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲醛，反应后即得；其中，所述化合物2的结构式如式(V)所示：
所述A-为N甲基化阴离子；
优选地，所述N甲基化阴离子选自Cl-、Br-、I-、ClO4 -、TfO-、TsO-或BF4 -。
根据本发明实施例的制备方法，至少具有如下有益效果：本发明的化合物制备方法简单、成本低廉，且制得的化合物产品结构稳定，便于储存，适用于工业化生产。
在本发明的一些实施方式中，所述反应在第一溶剂中进行，第一溶剂选自乙醇、乙腈、正丁醇中的至少一种。
优选地，所述第一溶剂为乙醇。
在本发明的一些实施方式中，所述反应的温度为75～85℃。
优选地，所述反应的温度为90℃。
在本发明的一些实施方式中，所述反应的时间为8～16h。
优选地，所述反应的时间为12h。
在本发明的一些实施方式中，所述4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲醛的结构式如式(VI)所示：
在本发明的一些实施方式中，所述化合物2的制备方法包括如下步骤：将2,3,3-三甲基-3H-吲哚与化合物1混合反应后即可；
其中，所述化合物1的结构式如式(IV)所示：
所述A选自Cl、Br、I中的一种。
在本发明的一些实施方式中，所述混合反应在第二溶剂中进行，所述第二溶剂选自乙腈、丙酮、乙醇、DMF、甲醇中的至少一种。
优选地，所述第二溶剂为乙腈。
优选地，所述混合反应的温度为75～85℃；
更优选地，所述混合反应的温度为90℃。
优选地，所述混合反应的时间为8～16h。
更优选地，所述混合反应的时间为12h。
在本发明的一些实施方式中，所述2,3,3-三甲基-3H-吲哚的结构式如式(III)所示：
在本发明的一些实施方式中，所述A-为Br-。
在本发明的一些实施方式中，所述化合物2的结构式如式(VII)所示：
在本发明的一些实施方式中，当A-为ClO4 -、TfO-、TsO-或BF4 -时，其对应的化合物2可以由式(VII)所示的化合物经过离子交换得到。
本发明的第三方面，提供了一种荧光探针，包含上述结构式的化合物。
在本发明的一些实施方式中，所述荧光探针为具有pH响应性的溶酶体/线粒体双色荧光探针。
优选地，所述具有pH响应性的溶酶体/线粒体双色荧光探针为结构式如式(I)所示的化合物。
本发明的第四方面，提供了上述化合物或荧光探针在制备溶酶体和/或线粒体检测试剂中的应用。
根据本发明实施例的应用，至少具有如下有益效果：将本发明的溶酶体/线粒体双色荧光探针应用于溶酶体和/或线粒体检测能够有效提高检测效率。
本发明的第五方面，提供了上述化合物或荧光探针在制备研究溶酶体和线粒体相互作用检测试剂中的应用。
在本发明的一些实施方式中，当所述检测试剂用于人骨肉瘤细胞溶酶体和线粒体双成像时，所述荧光探针在溶酶体内的激发波长是405nm，发射波长为555nm，呈现绿色荧光；在线粒体内的激发波长是561nm，发射波长为595nm，呈现红色荧光。
在本发明的一些实施方式中，所述荧光探针的使用浓度为10～20μM；
优选地，所述荧光探针的使用浓度为12～18μM；
更优选地，所述荧光探针的使用浓度为15μM。
在本发明的一些实施方式中，所述荧光探针处理细胞的时间为1～3h；
优选地，所述荧光探针处理细胞的时间为1.5～2.5h；
更优选地，所述荧光探针处理细胞的时间为2h。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明化合物2的核磁共振氢谱图；
图2为本发明化合物2的核磁共振碳谱图；
图3为本发明荧光探针INSA的核磁共振氢谱图；
图4为本发明荧光探针INSA的核磁共振碳谱图；
图5为本发明荧光探针INSA的质谱表征图；
图6为本发明荧光探针INSA在不同pH下的紫外可见吸收光谱图；
图7为本发明荧光探针INSA在不同pH下的可见光下颜色渐变图；
图8为本发明荧光探针INSA的在405nm激发下不同pH响应的荧光光谱；
图9为本发明荧光探针INSA的在561nm激发下不同pH响应的荧光光谱；
图10为本发明荧光探针INSA与市售溶酶体探针LysoTracker Deep Red的共定位实验结果；
图11为本发明荧光探针INSA与市售线粒体探针MitoTracker Deep Red的共定位实验结果；
图12为本发明荧光探针INSA原位监测活细胞溶酶体和线粒体的相互作用图；
图13为对比例荧光探针BESA在405nm和561nm激发光下的荧光成像结果图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
本发明的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
在本发明的具体实施方式中，所述人骨肉瘤细胞U2-OS细胞购买于美国典型培养物保藏中心(American type culture collection，ATCC)。
所述U-2OS细胞培养基购买于Gibco。
所述Britton-Robinson缓冲溶液购买于北京雷根生物技术有限公司。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1双色荧光探针INSA的制备
本实施例提出了一种具有pH响应性的溶酶体/线粒体双色荧光探针的制备及表征，其涉及的具体制备流程如下：
①称取300mg 2,3,3-三甲基-3H-吲哚溶于1.0mL乙腈溶剂中，加入300mg 3-溴丙酸，80℃下搅拌反应12h，冷至室温，减压旋蒸，除去乙腈，以甲醇︰二氯甲烷(体积比1︰10)为洗脱剂通过硅胶层析纯化，得到无色油状物，即化合物2(324mg，产率54％)。
所得化合物2的表征数据为：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.02(dd,J＝5.8,3.0Hz,1H),7.87(dd,J＝5.8,3.0Hz,1H),7.64–7.57(m,2H),4.69(t,J＝7.0Hz,2H),3.02(t,J＝7.0Hz,2H),2.90(s,3H),1.55(s,7H).13CNMR(126MHz,DMSO-d6)δ198.18,171.74,141.98,141.03,129.54,129.12,123.73,115.82,54.50,43.85,31.38,22.11(2C),14.82.ESI-MS m/z:232.1[M-Br]+。
所得化合物2的核磁共振氢谱图和核磁共振碳谱图分别如图1和图2所示，其中图1为化合物2核磁共振氢谱图，图2为化合物2核磁共振碳谱图。
②称取70mg化合物2和100mg 4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲醛溶于0.5mL乙醇溶剂中，回流搅拌反应12h，加入乙醚析出深红色油状物，然后再次加入微量乙醇溶解，随后乙醚析出，该过程重复三到五次，抽滤干燥得到终产物INSA(45mg，产率49％)。
所得终产物INSA的表征数据为：
1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ12.54(s,1H),10.02(s,1H),8.39(d,J＝15.8Hz,1H),7.86–7.80(m,2H),7.63–7.47(m,5H),4.85(t,J＝6.7Hz,2H),3.90(s,3H),2.92(t,J＝6.7Hz,2H),1.79(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ181.38,171.99,154.76,148.57(2C),144.12,143.33,140.82,129.04,128.54,127.23,125.21,123.06,114.59,109.54,109.30,56.67(2C),51.79,42.21,32.50,26.24(2C).Purity:99.6％by HPLC.HRMS(ESI):calcdfor(M-Br)+(C23H26NO5 +)396.1805,found 396.1809。
所得终产物INSA的核磁共振氢谱图、核磁共振碳谱图和质谱图如图3～图5所示，其中图3为INSA的核磁氢谱图，图4为INSA的核磁碳谱图，图5为INSA的高分辨质谱图。
实施例2荧光探针INSA的双色发光特性表征
为了研究上述实施例1制得的荧光探针INSA在不同pH的Britton-Robinson缓冲溶液中是否具有不同的光物理学性质。将实施例1制得的荧光探针INSA置于不同pH值溶液中，并检测其吸收峰和颜色变化。
在不同pH下的紫外可见吸收光谱检测结果如图6所示，结果表明本发明制得的荧光探针INSA在酸性条件下会出现450nm吸收峰，并且强度会随着pH值从4.0到8.5增大而减小；与此同时所述探针INSA会随着pH值的增大逐渐出现550nm的吸收峰，而且INSA在不同pH的等吸光点在495nm。
不同pH下的可见光下颜色观察结果如图7所示，结果表明在可见光下，本发明制得的荧光探针INSA溶液会随着pH值从8.5到4减小而出现由紫色到黄色的颜色渐变。
进一步地，本实施例分别在405nm激发光和561nm激发光下测试了荧光探针INSA的荧光强度变化，结果表明本发明的荧光探针INSA在405nm激发下，INSA的荧光强度会随着pH值从4.0到8.5增大而减少，具体如图8所示；而在561nm激发下，INSA的荧光强度会随着pH值从4.0到8.5增大而增大，具体如图9所示。
以上结果证明，荧光探针INSA具有pH致色的特点，且在酸性和弱碱性下会发出两种不同波长(555nm和595nm)的荧光，具有双色发光的特性。
实施例3荧光探针INSA在活细胞荧光成像中的应用
(一)激光共聚焦显微镜成像实验
将人骨肉瘤细胞U2-OS细胞放在培养基(DMEM培养液和10％胚牛血清)中，放置于条件为37℃、5％CO2和20％O2的培养箱中培养24h。取荧光探针INSA(用U-2OS细胞培养基稀释至终浓度为15μM)，将配制的探针加入到培养皿中继续培养2h后，使用培养基清洗样本3次，进行激光共聚焦显微镜成像，
结果如图10和图11所示，其中图10中激发波长为405的通道(INSA,λex＝405nm,λem＝460-560nm)得到绿色圆点状荧光信号；图11中激发波长为561的通道(INSA,λex＝561nm,λem＝570-670nm)得到红色棒状荧光信号。这些结果表明，荧光探针INSA在能够进行双色成像，而且成像两种不同的细胞器。
(二)共定位实验
为了进一步观察荧光探针INSA双色成像的两种不同细胞器是否分别为溶酶体和线粒体。本实施例还进行了探针INSA(15μM)与市售溶酶体探针LysoTracker Deep Red(50nM)以及市售线粒体探针MitoTracker Deep Red(50nM)的共定位实验。
市售溶酶体探针的定位结果见图10中激发波长为647nm的通道图所示，其中在图10中，荧光探针INSA呈经典溶酶体形态的绿色圆点状荧光信号(INSA,λex＝405nm,λem＝460-560nm)与市售溶酶体探针LysoTracker Deep Red(LysoTracker Deep Red,λex＝647nm)能够很好地重叠，经image J软件处理荧光探针INSA(λex＝405nm,λem＝460-560nm)与LysoTracker Deep Red(λex＝647nm)的共定位系数(R)高达0.91。
市售线粒体探针的定位结果如图11中激发波长为647nm的通道图所示，结果表明荧光探针INSA呈经典线粒体形态的红色棒状荧光信号(INSA,λex＝561nm,λem＝570-670nm)与市售线粒体探针MitoTracker Deep Red(MitoTracker Deep Red,λex＝647nm)也能够很好地重叠，经image J软件处理荧光探针INSA(λex＝561nm,λem＝570-670nm)与MitoTracker Deep Red(λex＝647nm)的共定位系数(R)高达0.90，说明荧光探针INSA能够同时双色成像溶酶体和线粒体，在溶酶体中发射绿色荧光，在线粒体中发红色荧光。
实施例4荧光探针INSA在实时监测活细胞溶酶体和线粒体相互作用中的应用
将贴壁的人骨肉瘤细胞U2-OS细胞与荧光探针INSA(终浓度为15μM)在37℃、5％CO2和20％O2的培养箱中孵育2h后，在激光共聚焦显微镜下原位监测溶酶体和线粒体的相互作用，其中：绿色通道(λex＝405nm,λem＝460-560nm)用来观察溶酶体；红色通道(λex＝561nm,λem＝570-670nm)用来观察线粒体。
结果如图12所示，可以观察到溶酶体和线粒体存在接触、黏附和包围等相互作用，具体如图12中白色箭头所示，说明采用本发明制得的荧光探针INSA能够实时监测活细胞脂滴和线粒体相互作用。
对比例荧光探针BESA
本对比例提供了一种与荧光探针INSA结构类似的化合物BESA，其结构式如下：
采用实施例3的方法进行激光共聚焦显微镜成像，成像结果如图13所示，从图中可以看出化合物BESA在561nm通道并没有明显的线粒体信号，这可能是苯并噻唑母环溶解度和透膜性相对较差，导致无法透过线粒体双层膜。以上结果说明化合物BESA无法同时进入线粒体和溶酶体进行双色的成像。
综上所述，本发明提供了一种具有pH响应性的溶酶体/线粒体双色荧光探针及其制备方法和应用，该荧光探针具有pH致色的功能且能够同时双色成像活细胞或体内的溶酶体和线粒体，其中在溶酶体内显示绿色荧光，而在线粒体内显示红色荧光。
相比于现有的溶酶体线粒体双色成像探针，本发明提供的荧光探针与细胞器不发生共价化学反应，即可以在低干扰甚至不干扰细胞的正常状态下利用溶酶体和线粒体内pH的差异对溶酶体和线粒体双色成像并进行实时监测。同时本发明提供的荧光探针可以避免使用商用线粒体探针MitoTracker和溶酶体探针LysoTracker对溶酶体和线粒体进行研究时存在的相互干扰、花费大量时间摸索染色条件等问题。此外，本发明的荧光探针的制备过程简单、成本低廉，并且结构稳定，便于储存，在溶酶体和线粒体生物学功能研究上具有广阔的应用空间。
上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (10)
1.一种化合物，其特征在于，所述化合物的结构式如式(I)所示：
所述A-为N甲基化阴离子。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述N甲基化阴离子选自Cl-、Br-、I-、ClO4 -、TfO-、TsO-或BF4 -。
3.一种如权利要求1或2所述的化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将化合物2与4-羟基-3,5-二甲氧基苯甲醛混合，反应后即得；其中，所述化合物2的结构式如式(V)所示：
所述A-为N甲基化阴离子；
优选地，所述N甲基化阴离子选自Cl-、Br-、I-、ClO4 -、TfO-、TsO-或BF4 -。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述反应在第一溶剂中进行，所述第一溶剂选自乙醇、乙腈、正丁醇中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述反应的温度为75～85℃；优选地，所述反应的时间为8～16h。
6.根据权利要求3～5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述化合物2的制备方法包括如下步骤：将2,3,3-三甲基-3H-吲哚与化合物1混合反应后即可；其中，所述化合物1的结构式如式(IV)所示：
其中所述A选自Cl、Br、I中的一种。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述混合反应在第二溶剂中进行，所述第二溶剂选自乙腈、丙酮、乙醇、DMF、甲醇中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述混合反应的温度为75～85℃；优选地，混合所述反应的时间为8～16h。
9.一种荧光探针，其特征在于，包含如权利要求1或2所述的化合物。
10.如权利要求1或2所述的化合物或如权利要求9所述的荧光探针在以下任一项中的应用：
1)制备溶酶体和/或线粒体检测试剂；
2)制备研究溶酶体和线粒体相互作用检测试剂。
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