CN109810138B - 一种靶向线粒体小分子探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种靶向线粒体的活性小分子探针及其制备方法与应用,活性探针含有线粒体定位基团、反应基团和微型正交基团三种修饰,合成过程简单,应用更高效、快捷。它们可以精确靶向线粒体并在其内部富集,与内源性线粒体蛋白质选择性地反应标记,尤其通过炔基的引入,使得探针可与生物素-链霉亲和素结合,从而获取更多的蛋白。该发明的探针摒弃传统复杂的线粒体分离步骤,通过直接破碎样品提取高纯度的线粒体蛋白质组,更有效、更便捷地抓取更多的线粒体蛋白,为进一步完善线粒体蛋白质组学的“目录”提供新的手段。
Description
技术领域
本发明涉及化学和生物技术领域,具体地说,是一种靶向线粒体小分子活性探针及其制备方法和应用。
背景技术
线粒体是真核细胞内一种重要的细胞器,是生物氧化过程的主要场所,为细胞生理活动提供能量,被称为“细胞能量制造工厂”。由于线粒体在维持生命稳态中发挥着重要作用,涉及细胞能量障碍及氧化损伤的多种疾病(如神经退行性疾病、癌症、衰老、心血管疾病等)都与线粒体的功能紊乱相关。因此,完善线粒体的研究,深入了解它的功能,将为疾病防治提供新策略。
随着线粒体提取和分离技术与二维凝胶电泳、质谱串联技术的结合,线粒体内蛋白质目录也越来越详细。利用细胞器比重和大小的区别,从全细胞匀浆液内提取纯化线粒体的离心分离技术是现今获取大量高纯度线粒体蛋白质的有效手段之一。而这种方法因其操作复杂、所用仪器要求严格、线粒体易破碎损失、细胞器粘连导致纯度污染、样品需求量大等缺点严重制约了该技术的实用化。
本发明为了开发一种不仅能免除繁琐分离步骤,同时更简单、更准确、更高效地研究线粒体蛋白的新方法,结合线粒体膜蛋白电位的特性,设计并合成了一类能够在活细胞、组织内原位靶向线粒体蛋白的小分子活性探针。该类探针结合了线粒体定位基团、巯基反应基团及正交基团,使得探针可以穿透生物膜并自发地集中在线粒体中,与线粒体内的蛋白质选择性地反应标记。此类探针可省略分离纯化线粒体步骤,也可以运用在活性样品中,利用化学反应染色线粒体及提取线粒体蛋白质组。
发明内容
本发明目的是为了能减少线粒体繁琐分离步骤,通过结合线粒体膜蛋白电位的特性,制备了一类能够在活性细胞内原位靶向线粒体蛋白的小分子探针。
本发明采用的技术方案是:
第一方面,本发明提供一种式(I)所示靶向线粒体活性小分子探针,
式(I)中,R为三苯基膦、罗丹明B及线粒体定位多肽(GFXrFXK,G为L-甘氨酸,FX为L-环己基丙氨酸,r为D-精氨酸,K为L-赖氨酸)。
所述罗丹明B结构式为:
进一步,式(I)所示靶向线粒体活性小分子探针为式(I-1)、(I-2)、(I-3)所示化合物之一:
第二方面,本发明提供一种式(I)所示靶向线粒体活性小分子探针的制备方法,具体如下:
1、本发明所述式(I-1)所示靶向线粒体活性小分子探针的制备方法,反应路线如下:
2、本发明所述式(I-1)所示靶向线粒体活性小分子探针的制备方法,按照如下步骤进行:
(1)将Fmoc-L-炔丙基甘氨酸(即N-芴甲氧羰基-L-炔丙基甘氨酸)溶于二氯甲烷中,加入1-羟基苯并三唑(HOBT)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)及三乙胺(TEA),室温反应1小时后,加入化合物(1-1,购于安耐吉),继续反应8小时后,反应液加入10倍体积去离子水并用二氯甲烷萃取,有机层用饱和盐水洗涤,无水硫酸钠干燥后,过滤,滤液浓缩至0.5~1g/mL后,以体积比10:1的二氯甲烷/甲醇为展开剂进行硅胶薄层层析,收集Rf值为0.5的产物,干燥,得到式(1-2)所示化合物;
(2)将步骤(1)获得的式(1-2)所示化合物溶于二氯甲烷中,加入哌啶,在室温反应1小时后,反应液蒸除溶剂后用乙醚洗涤去除哌啶,洗涤后的残余物加入10倍体积去离子水后用石油醚萃取3次,收集水相并用石油醚洗涤2次后,最后收集洗涤后的水相,冷冻干燥机冻干,得到式(1-3)所示化合物,并直接用于下一步;
(3)将步骤(2)所得式(1-3)所示化合物溶于甲醇中,加入三乙胺,搅拌过程中,缓慢滴加氯乙酰氯,在室温反应4小时,反应液减压旋蒸去除溶剂,并用乙醚沉淀,过滤,抽干,获得式(I-1)所示小分子探针;
进一步,步骤(1)中溶解Fmoc-L-炔丙基甘氨酸的二氯甲烷体积用量以式(1-1)所示化合物物质的量计为10-30mL/mmol(优选20mL/mmol);式(1-1)所示化合物与Fmoc-L-炔丙基甘氨酸、1-羟基苯并三唑(HOBT)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和三乙胺(TEA)的投料物质的量之比为1:1~2:1~3:1~3:1~4,优选1:1:1.5:1.5:2。
进一步,步骤(2)中二氯甲烷体积用量以式(1-2)所示化合物物质的量计为50-100mL/mmol(优选60mL/mmol),式(1-2)所示化合物和哌啶的投料物质的量之比为1:3~6,优选1:5。
进一步,步骤(3)中甲醇体积用量以式(1-3)所示化合物物质的量计为10-100mL/mmol(优选75mL/mmol),式(1-3)所示化合物与氯乙酰氯和三乙胺的投料物质的量之比为1:4~12:10~50,优选1:10:20。
3、本发明式(I-2)所示的靶向线粒体活性小分子探针的制备反应路线如下:
4、本发明所述式(I-2)所示靶向线粒体活性小分子探针的制备方法,按照如下步骤进行:
1)将Fmoc-L-炔丙基甘氨酸溶于二氯甲烷a中,加入1-羟基苯并三唑(HOBT)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和三乙胺(TEA),黑暗、室温下反应1小时后,加入式(2-1)所示化合物,在黑暗、室温反应8小时后,蒸发溶剂并通过硅胶薄层层析(二氯甲烷/甲醇=8:1,v/v)纯化,收集Rf值为0.48的产物,干燥,得到式(2-2)所示化合物;
2)将步骤1)所得式(2-2)所示化合物溶于二氯甲烷b中,加入哌啶,室温避光反应1小时,通过TLC监测反应完成后,旋转蒸发溶剂,重复3次;然后,加入二氯甲烷c溶解,再加入三乙胺,搅拌过程中,缓慢滴加氯乙酰氯,室温避光反应4小时后,通过TLC监测反应完成后,蒸发溶剂并通过硅胶薄层层析(二氯甲烷/甲醇=8:1,v/v)纯化,收集Rf值为0.45的产物,干燥,获得式(I-2)所示小分子探针;
进一步,步骤1)中二氯甲烷a体积用量以式(2-1)所示化合物物质的量计为50-200mL/mmol(优选100mL/mmol),式(2-1)所示化合物与Fmoc-L-炔丙基甘氨酸、1-羟基苯并三唑(HOBT)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和三乙胺的投料物质的量之比为1:1~2:1~3:1~3:1~4,优选1:1:2:2:2.2。
进一步,步骤2)中所述二氯甲烷b体积用量以式(2-2)所示化合物物质的量计为10-50mL/mmol(优选30mL/mmol),所述二氯甲烷c与二氯甲烷b体积比为3:1,式(2-2)所示化合物和哌啶的投料物质的量之比为1:3~6(优选1:5);式(2-2)所示化合物与氯乙酰氯与三乙胺的投料物质的量之比为1:4~12:10~50(优选1:5:10);所述二氯甲烷a、二氯甲烷b和二氯甲烷c均为二氯甲烷,为了区分不同步骤加入量而命名,字母本身没有含义。
5、本发明式(I-3)所示靶向线粒体活性小分子探针的制备反应路线如下:
6、本发明所述式(I-3)所示靶向线粒体活性小分子探针的制备方法,按照如下步骤进行:
将式(3-1)所示负载多肽的树脂(购于南京肽业,多肽修饰在Rink Amide树脂上,负载量为0.5mmol/g)加入N,N-二甲基甲酰胺a中进行溶胀清洗,去除清洗液,加入质量浓度20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液,在室温搅拌反应20分钟,依次用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、甲醇和N,N-二甲基甲酰胺各自清洗3次,获得清洗后的树脂;Fmoc-L-炔丙基甘氨酸溶于N,N-二甲基甲酰胺b,并加入1-羟基苯并三唑(HOBT)和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)、N,N-二异丙基乙胺(DIEA)混合,在室温搅拌预活化30分钟,然后加入清洗后的树脂,室温搅拌反应4小时后,依次用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、甲醇和N,N-二甲基甲酰胺各自清洗3次,加入体积浓度20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺中,室温搅拌反应半小时,再依次用N,N-二甲基甲酰胺,二氯甲烷,甲醇和N,N-二甲基甲酰胺各自清洗3次,然后加入二氯甲烷中溶胀,依次加入三乙胺和氯乙酰氯,室温搅拌反应2小时,依次用二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、甲醇和二氯甲烷各自清洗3次,最后加入切割试剂,在室温搅拌反应2小时,反应完毕后,过滤除去Rink Amide树脂,滤液减压蒸除溶剂,并用0℃的冰乙醚沉淀,最后将沉淀用高效液相制备色谱纯化,收集25~30%乙腈流动相下的组分,获得式(I-3)所示小分子探针;所述树脂为Rink Amide树脂,线粒体定位多肽负载量为0.2~1mmol/g;所述切割试剂为体积比95:2.5:2.5的三氟乙酸、三异丙基硅烷和二氯甲烷的混合。高效液相制备色谱纯化条件为:采用Gilson GX-281制备系统,色谱柱为Phenomenex Luna 5u 50×30.00mm5micron反相C18柱,0.1%甲酸/乙腈流动相(即以含0.1%甲酸的乙腈-水(含0.1%甲酸)溶液为流动相),收集目的峰组分(25~30%乙腈)。
步骤中每次清洗使用的溶剂(二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、甲醇和二氯甲烷)体积用量以式(3-1)所示负载线粒体定位多肽的树脂量计0.1mL/mg。所述N,N-二甲基甲酰胺a的体积用量以式(3-1)所示负载线粒体定位多肽的树脂量计为0.1mL/mg,N,N-二甲基甲酰胺b的体积用量以式(3-1)所示负载线粒体定位多肽的树脂量计为0.05mL/mg,步骤中所述体积浓度20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液的每次体积用量以式(3-1)所示负载线粒体定位多肽的树脂量计为0.05mL/mg。式(3-1)所示负载线粒体定位多肽的树脂用量以线粒体定位多肽负载量计,所述多肽与Fmoc-L-炔丙基甘氨酸、1-羟基苯并三唑(HOBT)、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)和N,N-二异丙基乙胺(DIEA)的投料物质的量之比为1:2~4:2~4:2~4:4~10,优选1:4:4:4:8;所述多肽与氯乙酰氯、三乙胺的投料物质的量之比为1:4~12:10~50,优选1:5:10。步骤中三异丙基硅烷:三氟乙酸:二氯甲烷(TIS/TFA/DCM)体积比值为1:30~50:1~2,优选为1:38:1;所述的切割试剂的体积用量以式(3-1)所示负载线粒体定位多肽的树脂量计为0.03mL/mg。
第三方面,本发明还提供一种所述小分子探针在细胞线粒体成像或蛋白质标记中的应用,所述细胞为宫颈癌细胞HeLa。
本发明所述小分子探针(I-1)、(I-2)、(I-3)通过与细胞共孵育,可定位于活细胞中的线粒体,并与线粒体中的原位蛋白质的巯基进行反应,标记蛋白。
与现有技术相比,本发明有益效果主要体现在:本发明结合线粒体的膜蛋白点位的特性,设计并合成了一类能够在活性细胞、组织内原位靶向线粒体蛋白的小分子活性探针。活性探针含有线粒体定位基团、反应基团和微型正交基团三种修饰,合成过程简单,应用更高效、快捷。它们可以精确靶向线粒体并在其内部富集,与内源性线粒体蛋白质选择性地反应标记,尤其通过炔基的引入,使得探针可与生物素-链霉亲和素结合,从而获取更多的蛋白。该发明的探针摒弃传统复杂的线粒体分离步骤,通过直接破碎样品提取高纯度的线粒体蛋白质组,更有效、更便捷地抓取更多的线粒体蛋白,为进一步完善线粒体蛋白质组学的“目录”提供新的手段。通过凝胶内荧光成像和HeLa细胞成像验证,该探针可以穿透生物膜并自发地集中在线粒体中,与线粒体内的含巯基蛋白质选择性地反应标记,为研究线粒体蛋白提供了一种更简单、更准确、更高效的新方法。
附图说明
图1为本发明中探针(I-1)的核磁氢谱。
图2为本发明中探针(I-1)的核磁碳谱。
图3为本发明中探针(I-2)的核磁氢谱。
图4为本发明中探针(I-2)的核磁碳谱。
图5为本发明中探针(I-3)的液相色谱图。
图6为本发明中探针(I-3)的质谱图。
图7为共聚焦显微镜显示在宫颈癌细胞HeLa中探针(I-1)和线粒体之间的共定位。1)是用探针(I-1)处理的细胞成像。2)是用Mito Tracker Deep Red(Invitrogen)染色的细胞成像。3)是用Hoechst核染色、1)和2)的细胞成像重叠图。4)是相关的数字图像相关图DIC和Hoechst核染色的细胞成像重叠图。5)是1)和2)的共定位分析图。
图8为共聚焦显微镜显示在宫颈癌细胞HeLa细胞中探针(I-2)和线粒体之间的共定位。6)是用探针(I-2)处理的细胞成像。7)是用Mito Tracker Deep Red(Invitrogen)染色细胞成像。8)是用Hoechst核染色与6)和7)的细胞成像图的重叠。9)是数字图像相关图DIC和Hoechst核染色的细胞成像重叠图。10)是6)和7)的共定位分析图。
图9为共聚焦显微镜显示在宫颈癌细胞HeLa细胞中探针(I-3)和线粒体之间的共定位。11)是用探针(I-3)处理的细胞成像。12)是用Mito Tracker Deep Red(Invitrogen)染色细胞成像。13)是用Hoechst核染色与11)和12)的细胞成像重叠图。14)是数字图像相关图DIC和Hoechst核染色的细胞成像重叠图。15)是11)和12)的共定位分析图。
图10为本发明中通过凝胶内荧光成像(a)和考马斯亮蓝染色(b)的探针(I-1)的原位蛋白质标记图谱。
图11为本发明中通过凝胶内荧光成像(a)和考马斯亮蓝染(b)色的探针(I-2)的原位蛋白质标记图谱。
图12为本发明中通过凝胶内荧光成像(a)和考马斯亮蓝染色(b)的探针(I-3)的原位蛋白质标记图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此:
本发明所述室温为22-26℃。
实施例1探针(I-1)的合成
1、化合物(1-2)的合成
向含Fmoc-L-炔丙基甘氨酸(0.94mmol,购于安耐吉)的二氯甲烷(20mL)溶液中加入1-羟基苯并三唑(1.41mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1.41mmol)和三乙胺(1.87mmol),在室温下搅拌1小时,然后加入化合物(1-1)(0.94mmol,购于安耐吉),在室温下搅拌反应8小时,通过TLC监测反应完成后,将反应液倒入200mL去离子水(为反应液体积的10倍)中,然后用二氯甲烷萃取,将有机层用饱和盐水洗涤后,无水硫酸钠干燥,过滤,滤液浓缩至溶质浓度0.5mg/mL粗品,以体积比10:1的二氯甲烷/甲醇为洗脱剂进行硅胶薄层色谱法进行分离,收集Rf值为0.5时的产物,干燥,得到化合物(1-2)0.63mmol,产率67%。
1H NMR(500MHz,DMSO)δ8.41(t,J=5.7Hz,1H),7.90(d,J=7.5Hz,2H),7.86(td,J=7.1,1.4Hz,3H),7.71-7.82(m,12H),7.66-7.80(m,2H),7.42(td,J=7.4,2.5Hz,2H),7.32(dt,J=12.1,6.0Hz,2H),4.28(dd,J=10.1,7.1Hz,1H),4.15-4.20(m,1H),4.05-4.11(m,2H),3.52-3.61(m,2H),3.16-3.32(m,2H),2.84(t,J=2.5Hz,1H),2.47-2.61(m,2H),1.59-1.73(m,2H).
13C NMR(126MHz,DMSO)δ170.33,155.87,143.74,143.68,140.68,139.41,137.42,134.91,133.56,133.48,130.28,130.18,128.93,127.68,127.29,127.10,125.43,125.29,121.39,120.11,120.03,118.73,118.69,118.05,118.00,109.79,80.86,72.83,65.84,53.95,46.53,22.09,22.07,21.68.
2、化合物(1-3)的合成
向步骤1制备的化合物(1-2)(0.12mmol)的二氯甲烷(6mL)溶液中加入哌啶(0.6mmol),混合,在室温下搅拌反应1个小时,通过TLC监测反应结束后,蒸馏除去溶剂至2mL,用乙醚(20mL)洗涤3次除去哌啶。然后将残余物溶于10倍体积(即100mL)去离子水中并用石油醚(20mL)洗涤3次,收集洗涤后的水相,冷冻干燥,得到化合物(1-3)0.11mmol,产率91%。
1H NMR(500MHz,DMSO)δ8.38(t,J=5.7Hz,1H),7.88-7.92(m,3H),7.76-7.90(m,12H),3.63(td,J=13.9,8.4Hz,2H),3.32(dd,J=12.1,6.0Hz,2H),3.25(dd,J=12.5,6.4Hz,2H),2.76(t,J=2.5Hz,1H),2.36-2.41(m,2H),1.66-1.73(m,2H).
3、探针(I-1)的合成
向步骤2制备的化合物(1-3)(0.20mmol)的无水甲醇(15mL)溶液中加入三乙胺(4.1mmol),在搅拌过程中,将氯乙酰氯(2.04mmol)缓慢滴加,约半个小时滴完,室温反应4小时,通过TLC监测反应完成后,将反应产物减压旋蒸去除溶剂,利用乙醚沉淀,过滤抽干,得到探针(I-1)0.04mmol,产率20%,核磁图谱见图1,图2。
1H NMR(500MHz,DMSO)δ8.68(d,J=7.7Hz,1H),8.56(t,J=5.7Hz,1H),7.89-7.93(m,3H),7.76-7.84(m,12H),4.32-4.37(m,1H),4.17(s,2H),3.61(td,J=13.9,8.3Hz,2H),3.22-3.31(m,2H),2.82(t,J=2.6Hz,1H),2.54-2.63(m,2H),1.63-1.63(m,2H).
13C NMR(126MHz,DMSO)δ169.46,166.02,134.94,134.92,133.60,133.51,130.31,130.21,118.66,117.98,80.29,73.07,52.14,42.54,22.06,21.58,18.55,18.14.
实施例2探针(I-2)的合成
1、化合物(2-2)的合成
向Fmoc-L-炔丙基甘氨酸(0.22mmol)的二氯甲烷(22mL)溶液中加入1-羟基苯并三唑(0.44mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.44mmol)和三乙胺(0.46mmol),在黑暗、室温下搅拌1小时。然后加入化合物(2-1)(0.22mmol),在黑暗、室温下搅拌8小时,通过TLC监测反应完成后,蒸发溶剂并通过硅胶薄层色谱法(硅胶,二氯甲烷/甲醇=8:1,v/v)收集Rf值为0.48的产物,干燥,得到化合物(2-2)0.16mmol,产率72%。
1H NMR(500MHz,MeOD)δ7.76-7.80(m,4H),7.61-7.63(m,3H),7.49-7.51(m,1H),7.26-7.38(m,6H),7.08(dd,J=10.8,9.1Hz,2H),6.98-6.96(m,2H),4.61-4.65(m,1H),4.34-4.38(m,2H),4.25-4.29(m,1H),3.63-3.70(m,8H),3.46-3.57(m,6H),3.35-3.39(m,2H),2.54-2.60(m,2H),2.31-2.35(m,1H),1.27-1.36(m,12H).
2、探针(I-2)的合成
向步骤1制备的化合物(2-2)(0.17mmol)的二氯甲烷(5mL)溶液中加入哌啶(0.85mmol),混合,在黑暗、室温下搅拌1小时,通过TLC监测反应完成后,蒸发溶剂。然后加入二氯甲烷(15mL)溶解,再加入三乙胺(1.7mmol),缓慢滴加氯乙酰氯(0.85mmol),在黑暗、室温下搅拌反应4小时,通过TLC监测反应完成后,将溶剂蒸发并通过硅胶薄层色谱法(硅胶,二氯甲烷/甲醇=8:1,v/v)纯化,收集Rf值为0.45的产物并干燥,得到探针(I-2)0.14mmol,产率82%,核磁图谱见图3,图4。
1H NMR(500MHz,DMSO)δ8.71(dd,J=37.4,7.4Hz,1H),7.71-7.79(m,3H),7.50-7.58(m,1H),7.15-7.17(m,1H),7.05-7.11(m,2H),6.94(d,J=1.8Hz,2H),4.80-4.85(m,2H),4.09(d,J=11.3Hz,2H),3.65(q,J=6.8Hz,8H),3.11-3.16(m,2H),2.81(s,1H),2.42-2.54(m,2H),1.20(t,J=7.1Hz,12H).
13C NMR(75MHz,DMSO)δ178.14,167.76,166.54,165.50,157.01,155.50,155.03,135.09,130.66,130.35,129.78,129.72,127.48,114.24,113.00,95.89,80.06,72.86,71.14,48.51,47.64,45.35,42.17,21.37,12.37.
实施例3探针(I-3)的合成
将式(3-1)所示负载多肽的树脂(100mg,购于南京肽业,多肽修饰在Rink Amide树脂上,负载量0.5mmol/g,含多肽量0.05mmol)加入N,N-二甲基甲酰胺10mL中进行溶胀清洗,去除清洗液,加入5mL含体积浓度20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液,室温下搅拌反应20分钟脱除Fmoc保护基。然后依次用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、甲醇和N,N-二甲基甲酰胺各自清洗3次,每次10mL,获得清洗后的树脂。然后将Fmoc-L-炔丙基甘氨酸(0.2mmol)溶于5mLN,N-二甲基甲酰胺,并加入1-羟基苯并三唑(0.2mmol),O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(0.2mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.4mmol)混合,室温搅拌活化半小时,将清洗后的树脂加入其中,在室温下搅拌反应4小时后,反应液依次用N,N-二甲基甲酰胺,二氯甲烷,甲醇和N,N-二甲基甲酰胺各自洗涤3次,每次10mL。然后加入5mL体积浓度20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液,在室温下反应半小时后,依次用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、甲醇和N,N-二甲基甲酰胺各自清洗3次,每次10mL。最后将树脂在10mL的二氯甲烷中溶胀后,加入三乙胺(0.5mmol)和氯乙酰氯(0.25mmol),在室温下搅拌反应2小时。然后依次用二氯甲烷,N,N-二甲基甲酰胺,甲醇和二氯甲烷各自清洗3次,每次10mL。最后将树脂加入3mL三氟乙酸/三异丙基硅烷/二氯甲烷(TFA/TIS/DCM)(体积比为95:2.5:2.5)切割试剂中,室温下搅拌反应2小时,将小分子探针从树脂上切下。之后,滤除树脂,减压除去溶剂,将得到的残余物用0℃冷乙醚沉淀,沉淀通过制备型高效液相色谱纯化,采用Gilson GX-281制备系统,色谱柱为Phenomenex Luna 5u50×30.00mm5micron反相C18柱,0.1%甲酸/乙腈流动相,收集目的峰组分(25~30%乙腈),旋蒸浓缩,冻干得到探针(I-3)0.01mmol,HPLC纯度99%,总收率20%,液相色谱及质谱图见图5,图6。
实施例4评估HeLa细胞中探针和线粒体之间的共定位
1、细胞培养条件
选用宫颈癌细胞HeLa,购自ATCC。使用细胞培养基(含10%胎牛血清、0.1mg/ml链霉素和100U/ml青霉素的DMEM高糖培养基(购自杭州泽衡生物科技有限公司)),在含37℃/5%CO2,饱和湿度的细胞培养箱中培养细胞。
2、探针(I-1)和线粒体之间的共定位
将105个宫颈癌细胞HeLa接种在细胞培养基的细胞成像玻璃皿中,贴壁过夜培养后,弃去培养基,加入含5μM探针(I-1)的200μL新鲜相同的细胞培养基,在37℃/5%CO2下进一步温育30分钟。然后,用pH7.4磷酸缓冲液(PBS)洗涤细胞一次,再将细胞继续温育3小时。之后,将细胞用100nM MitoTrackerTM Deep Red FM(购于Invitrogen)染色30分钟。随后用200μL、pH7.4的PBS洗涤细胞,并用200μL含体积浓度3.7%甲醛的PBS固定15分钟,然后吸去甲醛后,用冰PBS洗涤三次。再用200μL含体积浓度0.1%Triton X-100的PBS透化细胞15分钟,然后再次用冰PBS洗涤细胞两次,加入200μL新鲜配置的铜催化点击化学溶液(组成:2μMTER-PEG-N3(罗丹明聚乙二醇叠氮),4μM THPTA(三(3-羟丙基三唑基甲基)胺),40μM TCEP(三(2-羧乙基)膦盐酸盐),40μM CuSO4(硫酸铜),溶剂为去离子水)在室温下孵育2小时,同时轻轻摇动。随后分别用2×PBS,含有体积浓度0.1%Tween-20+0.5mM EDTA的PBS,2×PBS洗涤细胞数次。然后用300ng/mL Hoechst 33342对细胞进行核染色。用PBS缓冲液洗去成像皿里的培养基,加入防荧光淬灭封片剂,避光。样品用荧光成像仪进行荧光成像。所有图像均在Leica TCS SP5X共聚焦显微镜系统的不同检测通道上获得(探针通道:TER染料λex=543nm,λem=570-640nm;MitoTracker通道:λex=644nm,λem=665-740nm;Hoechst通道:λex=405nm,λem=440-470nm)并用Leica Application Suite Advanced Fluorescence(LAS AF)处理。使用ImageJ软件的Pearson相关系数(R)量化共定位。
得到结果如图7所示,由共聚焦显微镜系统的探针(I-1)检测通道下获得的细胞图像1)与MitoTracker检测通道下获得的细胞图像2)及Hoechst细胞核染色图像对比,显示图像重叠较好,如图7中3)、4)、5)所示,其Pearson相关系数R=0.913,比例尺=10μm。证明我们设计的探针(I-1)可成功定位于活细胞中的线粒体。
3、探针(I-2)和线粒体之间的共定位
实验操作同探针(I-1),得到结果如图8所示,由共聚焦显微镜系统的探针(I-2)检测通道下获得的细胞图像6)与MitoTracker检测通道下获得的细胞图像7)及Hoechst细胞核染色图像对比,显示图像重叠较好,如图像8)、9)、10)所示,其Pearson相关系数R=0.918,比例尺=10μm。证明我们设计的探针(I-2)可成功定位于活细胞中的线粒体。
4、探针(I-3)和线粒体之间的共定位
实验操作同探针(I-1),得到结果如图9所示,由共聚焦显微镜系统的探针(I-3)检测通道下获得的细胞图像11)与MitoTracker检测通道下获得的细胞图像12)及Hoechst细胞核染色图像对比,显示图像重叠较好,如图像13)、14)、15)所示,其Pearson相关系数R=0.871,比例尺=10μm。证明我们设计的探针(I-3)可成功定位于活细胞中的线粒体。
实施例5通过凝胶内荧光成像和考马斯亮蓝染色检测探针对线粒体蛋白质的标记情况。
1、探针(I-1)对线粒体蛋白质的标记情况
将HeLa细胞以20,000细胞/孔接种在含有500μL细胞培养基(同实施例4)的12孔细胞培养板(Corning)中,并置于37℃,5%CO2培养箱12小时使得细胞贴壁。待细胞生长至90%左右密度时更换一次培养基,加入0.4mL含不同终浓度(10μM,5μM和2μM)探针(I-1)的细胞培养基,随后置于37℃,5%CO2培养箱孵育,30分钟后除去含有探针的培养基,用冰PBS洗涤细胞一次,并加入0.4ml细胞培养基继续温育4小时。温育后,除去培养基,用PBS洗涤细胞三次,将细胞刮下加入100μL缓冲液(25mM PBS,0.1%Triton X-100,100μM PMSF(苯甲基磺酰氟),pH=8.0),进行细胞裂解,获得细胞裂解物。然后将4μL新鲜预制的铜催化点击化学混合物(终浓度组成:20μM TER-PEG-N3(罗丹明聚乙二醇叠氮),40μM THPTA(三(3-羟丙基三唑基甲基)胺),400μM TCEP(三(2-羧乙基)膦盐酸盐),400μM CuSO4(硫酸铜),溶剂为去离子水)加入到200μL细胞裂解物中,在室温下轻轻摇动并温育2小时,反应结束后,加入5倍体积-20℃预冷的丙酮,在-20℃放置1小时。随后离心(16,000r×20min,4℃),弃去上清液,收集沉淀的蛋白质,用-20℃预冷的甲醇将细胞吹散,在-20℃放置1小时。然后离心(16,000r×20min,4℃),弃去上清液,置于通风橱中让残留的甲醇挥发直至沉淀开始收缩。然后将残余物重新悬浮于60μL 1×标准SDS上样缓冲液中,超声(20℃,40kHz)处理10分钟使其完全溶解,并在95℃下加热10分钟以使其变性。将蛋白样品加入到12%SDS-PAGE凝胶孔中,进行电泳。取出凝胶后,用Typhoon 9410可变模式成像扫描仪(GE Amersham)进行凝胶内荧光扫描。最后将凝胶用考马斯亮蓝G250溶液染色后在图像扫描仪上进行图像扫描。
得到结果如图10所示,根据凝胶内荧光成像图和考马斯亮蓝染色图发现,探针(I-1)成功标记到蛋白,并且随探针浓度的增加标记蛋白量增多。当探针浓度为5μM时标记效果较好,因此确定其为最优标记条件。证明我们设计的探针(I-1)可与线粒体中的原位蛋白质进行反应,标记蛋白,且该探针为广谱性探针。
2、探针(I-2)对线粒体蛋白质的标记情况
实验操作同探针(I-1),得到结果如图11所示,根据凝胶内荧光成像图和考马斯亮蓝染色图发现,探针(I-2)成功标记到蛋白,并且随探针浓度的增加标记蛋白量增多,当探针浓度为5μM时标记效果较好,因此确定其为最优标记条件。证明我们设计的探针(I-2)可与线粒体中的原位蛋白质进行反应,标记蛋白,且该探针为广谱性探针。
3、探针(I-3)对线粒体蛋白质的标记情况。
实验操作同探针(I-1),得到结果如图12所示,根据凝胶内荧光成像图和考马斯亮蓝染色图发现,探针(I-3)成功标记到蛋白,并且随探针浓度的增加标记蛋白量增多,当探针浓度为10μM时标记效果较好,因此确定其为最优标记条件。证明我们设计的探针(I-3)可与线粒体中的原位蛋白质进行反应,标记蛋白,且该探针为广谱性探针。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明方法及其核心思想。应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也落入本发明权利要求保护范围内。
Claims (9)
2.一种权利要求1所述靶向线粒体小分子探针的制备方法,特征在于式(I-1)所示小分子探针的制备方法为:
(1)将Fmoc-L-炔丙基甘氨酸溶于二氯甲烷中,加入1-羟基苯并三唑、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及三乙胺,室温反应1小时后,加入化合物(1-1),继续反应8小时后,反应液加入10倍体积去离子水并用二氯甲烷萃取,有机层用饱和盐水洗涤,无水硫酸钠干燥后,过滤,滤液浓缩,以体积比10:1的二氯甲烷/甲醇为展开剂进行硅胶薄层层析,收集Rf值为0.5的产物,干燥,得到式(1-2)所示化合物;
(2)将步骤(1)获得的式(1-2)所示化合物溶于二氯甲烷中,加入哌啶,在室温反应1小时后,反应液蒸除溶剂后用乙醚洗涤去除哌啶,洗涤后的残余物加入10倍体积去离子水后用石油醚萃洗涤,收集洗涤后的水相,冷冻干燥,得到式(1-3)所示化合物;
(3)将步骤(2)所得式(1-3)所示化合物溶于甲醇中,加入三乙胺,搅拌过程中,缓慢滴加氯乙酰氯,在室温反应4小时,反应液减压旋蒸去除溶剂,并用乙醚沉淀,过滤,抽干,获得式(I-1)所示小分子探针;
3.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于步骤(1)中溶解Fmoc-L-炔丙基甘氨酸的二氯甲烷体积用量以式(1-1)所示化合物物质的量计为10-30mL/mmol;式(1-1)所示化合物与Fmoc-D-2-炔丙基甘氨酸、1-羟基苯并三唑、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和三乙胺的投料物质的量之比为1:1~2:1~3:1~3:1~4。
4.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于步骤(2)中二氯甲烷体积用量以式(1-2)所示化合物物质的量计为50-100mL/mmol,式(1-2)所示化合物和哌啶的投料物质的量之比为1:3~6;步骤(3)中甲醇体积用量以式(1-3)所示化合物物质的量计为10-100mL/mmol,式(1-3)所示化合物与氯乙酰氯和三乙胺的投料物质的量之比为1:4~12:10~50。
5.一种权利要求1所述靶向线粒体小分子探针的制备方法,特征在于式(I-2)所示小分子探针的制备方法为:
1)将Fmoc-L-炔丙基甘氨酸溶于二氯甲烷a中,加入1-羟基苯并三唑、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和三乙胺,黑暗、室温下反应1小时后,加入式(2-1)所示化合物,在黑暗、室温反应8小时后,蒸发溶剂并通过硅胶薄层层析纯化,以体积比8:1的二氯甲烷/甲醇为展开剂,收集Rf值为0.48的产物,干燥,得到式(2-2)所示化合物;
2)将步骤1)所得式(2-2)所示化合物溶于二氯甲烷b中,加入哌啶,室温避光反应1小时,通过TLC监测反应完成后,旋转蒸发溶剂;然后,加入二氯甲烷c溶解,再加入三乙胺,搅拌过程中,缓慢滴加氯乙酰氯,室温避光反应4小时后,通过TLC监测反应完成后,蒸发溶剂并通过硅胶薄层层析纯化,以体积比8:1的二氯甲烷/甲醇为展开剂纯化,收集Rf值为0.45的产物,干燥,获得式(I-2)所示小分子探针;
6.如权利要求5所述的制备方法,其特征在于步骤1)中二氯甲烷a体积用量以式(2-1)所示化合物物质的量计为50-200mL/mmol,式(2-1)所示化合物与Fmoc-L-炔丙基甘氨酸、1-羟基苯并三唑和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和三乙胺的投料物质的量之比为1:1~2:1~3:1~3:1~4;步骤2)中所述二氯甲烷b的体积用量以式(2-2)所示化合物物质的量计为10-50mL/mmol,所述二氯甲烷c与二氯甲烷b体积比为3:1,式(2-2)所示化合物和哌啶的投料物质的量之比为1:3~6;式(2-2)所示化合物与氯乙酰氯与三乙胺的投料物质的量之比为1:4~12:10~50。
7.一种权利要求1所述靶向线粒体小分子探针的制备方法,特征在于式(I-3)所示小分子探针的制备方法为:
将式(3-1)所示负载线粒体定位多肽的树脂加入N,N-二甲基甲酰胺a中进行溶胀清洗,去除清洗液,加入体积浓度20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液,在室温搅拌反应20分钟脱除Fmoc保护基,依次用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、甲醇和N,N-二甲基甲酰胺各自清洗3次,获得清洗后的树脂;将Fmoc-L-炔丙基甘氨酸溶于N,N-二甲基甲酰胺b,并加入1-羟基苯并三唑和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐、N,N-二异丙基乙胺,在室温搅拌预活化30分钟,然后加入清洗后的树脂,室温搅拌反应4小时后,依次用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、甲醇和N,N-二甲基甲酰胺各自清洗3次,加入体积浓度20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺在室温搅拌反应半小时,再依次用N,N-二甲基甲酰胺,二氯甲烷,甲醇和N,N-二甲基甲酰胺各自清洗3次,然后加入二氯甲烷进行溶胀,依次加入三乙胺和氯乙酰氯,室温搅拌反应2小时,依次用二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、甲醇和二氯甲烷各自清洗3次;最后加入切割试剂,在室温搅拌反应2小时,反应完毕后,过滤,滤液减压蒸除溶剂,并用0℃的冰乙醚沉淀,将沉淀用高效液相制备色谱纯化,收集25~30%乙腈流动相下的组分,获得式(I-3)所示小分子探针;所述树脂为Rink Amide树脂,线粒体定位多肽负载量为0.2~1mmol/g;所述切割试剂为体积比95:2.5:2.5的三氟乙酸、三异丙基硅烷和二氯甲烷的混合;
8.如权利要求7所述的制备方法,其特征在于所述体积浓度20%哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液每次体积用量以式(3-1)所示负载线粒体定位多肽的树脂量计为0.05mL/mg;式(3-1)所示负载线粒体定位多肽的树脂以负载的线粒体定位多肽物质的量计,所述多肽与Fmoc-L-炔丙基甘氨酸、1-羟基苯并三唑、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐和N,N-二异丙基乙胺的投料物质的量之比为1:2~4:2~4:2~4:4~10;所述多肽与氯乙酰氯、三乙胺的投料物质的量之比为1:4~12:10~50;所述切割试剂的体积用量以式(3-1)所示负载线粒体定位多肽的树脂量计为0.03mL/mg。
9.一种权利要求1所述靶向线粒体小分子探针在细胞线粒体成像或蛋白质标记中的应用。
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