CN110615813B - 一种小分子探针及其制备与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种光控靶向线粒体的小分子探针及其制备方法与应用，小分子探针含有线粒体定位基团、光控触发基团和正交基团三种修饰，合成过程简单，应用更高效、快捷。它们可以精准地定位到线粒体并在其内部聚集，光触发条件下，探针与线粒体蛋白质选择性地反应标记形成探针‑蛋白复合物，再通过正交反应检测被标记蛋白。本发明减少了传统提取线粒体蛋白的繁琐过程，通过直接破碎HeLa细胞样品提取了高纯度的线粒体活性蛋白，为进一步完善线粒体蛋白质组谱提供一种新的策略。HeLa细胞成像验证了甲基苯醌探针具有高效靶向线粒体能力；线粒体蛋白标记实验表明了探针具有良好的标记能力。

Description

一种小分子探针及其制备与应用
技术领域
本发明涉及化学和生物技术领域，具体地说，是一种光控靶向细胞线粒体的甲基苯醌小分子探针及其制备与应用。
背景技术
线粒体是真核细胞中重要的细胞器，普遍存在于有氧呼吸的真核细胞的细胞质中。线粒体参与重要的细胞生理过程如：三羧酸循环、脂肪酸和氨基酸氧化、调控ATP的合成、离子稳态调节等，在细胞能量代谢、生物合成和细胞凋亡等调控中起着关键作用。线粒体功能异常与许多人类疾病(如糖尿病、癌症、神经退行性疾病等)相关，因此线粒体在维持生命稳态起到重要作用，深入研究线粒体蛋白功能，将为疾病治疗提供新策略。
传统研究线粒体蛋白方法是差速离心结合密度梯度离心，但该方法存在缺陷：比如操作复杂、所用仪器要求严格、线粒体易破碎损失、细胞器粘连导致纯度污染、样品需求量大、难以特异地检测线粒体各个亚区间(基质、膜间隙)的蛋白质等，这些缺点严重制约了该技术的实用化。近年来，化学生物学与线粒体蛋白质组的不断结合提供了新的思路，如活性蛋白表达谱技术，活性小分子探针与活性蛋白结合，进而富集、质谱鉴定研究其靶标蛋白的功能。
本发明为了开发一种能减少分离步骤，利用可控方式靶向线粒体蛋白质，设计并合成了一类能够靶向活细胞线粒体蛋白的光触发小分子活性探针。该类探针由三部分构成：线粒体定位基团(三苯基膦)、光触发基团(2-硝基苄基)及正交基团(炔基)。此类探针可简化分离纯化线粒体步骤，也可以运用在活性样品中，能够应用于化学反应染色线粒体及提取线粒体蛋白质组等。
发明内容
本发明目的是提供一种光控靶向线粒体的小分子探针及其制备方法与应用，可利用紫外光触发释放甲基苯醌活性物质，并结合线粒体蛋白，可减免细胞器分离纯化步骤，直接快速提取线粒体蛋白。
本发明采用的技术方案是：
第一方面，本发明提供一种式(I)所示紫外光可控靶向线粒体的小分子探针，
Figure BDA0002138771700000021
第二方面，本发明提供一种式(I)所示小分子探针的制备方法，具体如下：
1、本发明所述制备式(I)所示小分子探针的反应路线如下：
(A)定位基团的合成
Figure BDA0002138771700000022
(B)甲基苯醌探针(I)合成
Figure BDA0002138771700000023
2、本发明所述式(I)所示小分子探针的制备方法，按照如下步骤进行：
(1)将三苯基膦、3-溴丙胺氢溴酸盐溶于乙腈中，加热回流12小时，反应结束后，冷却至室温，离心，取固体溶于异丙醇和乙醚中重结晶，晶体干燥后得到白色固体产物，即为式(1-1)所示化合物；
(2)将对羟基扁桃酸溶于无水二甲基甲酰胺，缓慢加入炔丙胺，1-羟基苯并三唑，冰浴搅拌(优选0℃搅拌10min)，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N，N-二异丙基乙胺，冰浴15min后，在氮气保护下室温反应16小时，反应液用乙酸乙酯萃取，有机相水洗三次，饱和食盐水洗涤一次后，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸除去有机溶剂得粗产物，以体积比10:1的二氯甲烷/甲醇为展开剂进行硅胶薄层层析，收集Rf值为0.4的产物，干燥，得到式(1-2)所示化合物；
(3)将步骤(2)获得的式(1-2)所示化合物和碳酸钾加入无水N，N-二甲基甲酰胺，滴加2-硝基苄溴，室温搅拌反应6小时，用二氯甲烷萃取三次，有机相水洗三次，饱和食盐水洗涤一次后，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸除去有机溶剂得粗产物，以体积比1:2的乙酸乙酯/石油醚为展开剂进行硅胶薄层层析，收集Rf值为0.45的产物，干燥，得到式(1-3)所示化合物；
(4)将步骤(3)获得的式(1-3)所示化合物加入无水N，N-二甲基甲酰胺中，恒压滴定漏斗滴加对硝基苯基氯甲酸酯，冰浴(0℃)滴加30分钟，然后加入三乙胺，室温反应5小时，二氯甲烷萃取三次，有机相水洗三次，饱和食盐水洗涤一次后，用无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸除去有机溶剂得粗产物，以体积比1:1的乙酸乙酯/石油醚为展开剂进行硅胶薄层层析，收集Rf值为0.5的产物，干燥，得到式(1-4)所示化合物；
(5)将步骤(4)获得的式(1-4)所示化合物溶于二氯甲烷中，加入式(1-1)所示化合物，随后加入三乙胺，室温反应过夜，反应液加入10倍体积去离子水并用乙酸乙酯萃取，有机层用饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后，过滤，滤液浓缩至0.5～1g/mL(优选0.8g/mL)后，以体积比10:1的二氯甲烷/甲醇为展开剂进行硅胶薄层层析，收集Rf值为0.38的产物，干燥，获得所述式(I)所示荧光控靶向线粒体小分子探针。
进一步，步骤(1)中乙腈体积用量以3-溴丙胺氢溴酸盐物质的量计为10-30mL/mmol(优选15mL/mmol)；三苯基膦与3-溴丙胺氢溴酸盐的投料物质的量之比为1:1～2，优选1:1，异丙醇体积用量以以3-溴丙胺氢溴酸盐物质的量计为100mL/mmol，乙醚体积用量以以3-溴丙胺氢溴酸盐物质的量计为70mL/mmol。
进一步，步骤(2)中无水N，N-二甲基甲酰胺的体积用量以对羟基扁桃酸物质的量计为0.5-2mL/mmol(优选1.87mL/mmol)；对羟基扁桃酸与炔丙胺、1-羟基苯并三唑、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N，N-二异丙基乙胺的投料物质的量之比为1:1～2:0.01～0.03:1～3:1～4，优选1:1:0.02:1.5:1.5。
进一步，步骤(3)中所述N，N-二甲基甲酰胺体积用量以式(1-2)所示化合物物质的量计为10-50mL/mmol(优选10mL/mmol)；式(1-2)所示化合物和碳酸钾，2-硝基苄溴的投料物质的量之比为1:2～5:1～2，优选1:3:1。
进一步，步骤(4)中所述无水N，N-二甲基甲酰胺用量以式(1-3)所示化合物物质的量计为5-8mL/mmol(优选6.7mL/mmol)；式(1-3)所示化合物和对硝基苯基氯甲酸酯，三乙胺的投料物质的量之比为1:1～3:2～6，优选1:1:3。
进一步，步骤(5)中所述二氯甲烷体积用量以式(1-4)所示化合物物质的量计为5-30mL/mmol(优选5mL/mmol)；所述式(1-4)所示化合物与式(1-1)，N，N-二异丙基乙胺投料物质的量之比为1～2:1～5:1～6，优选1:1:3。
第三方面，本发明还提供了一种所述光控靶向线粒体小分子探针在细胞成像中的应用，所述细胞为宫颈癌细胞HeLa。
本发明还提供一种所述光控靶向线粒体小分子探针在在蛋白标记中的应用，所述探针(I)通过与宫颈癌HeLa细胞共孵育，靶向活细胞中的线粒体，并与线粒体中的原位蛋白质进行反应，标记活性蛋白。
与现有技术相比，本发明主要效果体现在：本发明结合线粒体的膜蛋白电位的特性，设计并合成了一种能够靶向活性细胞线粒体蛋白的探针。该探针含有光触发基团、定位基团和正交基团，合成操作过程方便、快捷。它们可以精准的定位到线粒体并在其内部聚集，光触发后，形成甲基苯醌活性中间体，与线粒体蛋白质选择性地反应标记形成探针-蛋白复合物，再通过正交反应，探针-蛋白复合物可与生物素－链霉亲和素结合，从而富集靶标蛋白。本发明摒弃了传统提取线粒体蛋白的繁琐过程，通过直接破碎HeLa细胞样品提取了高纯度的线粒体活性蛋白，为进一步完善线粒体蛋白质组谱提供一种新的策略。HeLa细胞成像验证了甲基苯醌探针具有高效靶向线粒体能力；线粒体蛋白标记实验表明了探针具有良好的标记能力。
附图说明
图1为本发明中探针(I)的核磁氢谱。
图2为本发明中探针(I)的核磁碳谱。
图3为共聚焦显微镜显示在HeLa细胞中探针(I)和线粒体之间的共定位。(1)是用探针(I-1)处理的细胞成像。(2)是用MitoTrackerTM Deep Red FM(Invitrogen，M22426)染色的细胞成像。(3)是用Hoechst核染色、1)和2)的细胞成像重叠图。
图4为本发明中通过凝胶荧光成像(a)和考马斯亮蓝染色(b)的探针(I)的线粒体蛋白质标记图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明所述室温为22-26℃。
实施例1小分子探针(I)的合成
1、化合物1-1的合成
Figure BDA0002138771700000051
将三苯基膦(263mg，1mmol)，3-溴丙胺氢溴酸盐(219mg，1mmol)溶于乙腈(15mL)中，加热回流12小时。反应结束后，将反应物冷却至室温，离心，取固体溶于100mL异丙醇和乙醚(70mL)中重结晶，晶体干燥，得式(1-1)白色固体化合物0.47mmol，产率47％。
1H NMR(500MHz,DMSO)δ7.96–7.93(m,2H),7.93–7.89(m,3H),7.86(dd,J＝7.0,5.7Hz,4H),7.83–7.78(m,8H),3.80(t,J＝15.0Hz,2H),3.02(t,J＝7.3Hz,2H),1.86(dd,J＝17.3,13.7Hz,2H).
2、化合物(1-2)的合成
Figure BDA0002138771700000052
将对羟基扁桃酸(451mg，2.68mmol)溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中，缓慢加入炔丙胺(190μL，2.68mmol)，1-羟基苯并三唑(68mg，0.05mmol)，0℃搅拌10分钟，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(782mg4.08mmol)和N,N-二异丙基乙胺(0.70mL，4.01mmol)，继续冰浴15分钟后转至室温反应，氮气保护，反应过程以薄层层析(TCL，以体积比1：8的石油醚/乙酸乙酯为展开剂)追踪检测。反应16小时后，用乙酸乙酯萃取三次，有机相水洗三次，饱和食盐水洗涤一次，合并有机相并用无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸除去有机溶剂得粗产物，以体积比10:1的二氯甲烷/甲醇为展开剂进行硅胶薄层层析，收集Rf值为0.4的产物，干燥，得式(1-2)化合物2.09mmol，产率78.0％。
1H NMR(500MHz,DMSO)δ9.38(s,1H),8.35(t,J＝5.8Hz,1H),7.18(d,J＝8.5Hz,2H),6.71(d,J＝8.5Hz,2H),6.02(d,J＝4.5Hz,1H),4.82(d,J＝4.5Hz,1H),3.85(dt,J＝5.6,2.8Hz,2H),3.04(t,J＝2.4Hz,1H).
3、化合物(1-3)的合成
Figure BDA0002138771700000061
将化合物1-2(205mg，1.0mmol)和碳酸钾(3.0mmol)溶于无水N，N-二甲基甲酰胺(10ml)中，逐滴滴加2-硝基苄溴(211mg，1.0mmol)，室温下搅拌反应6小时。用二氯甲烷萃取三次，有机相水洗三次，饱和食盐水洗涤一次，合并有机相并用无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸除去有机溶剂得粗产物，以体积比1:2的乙酸乙酯/石油醚为展开剂进行硅胶薄层层析，收集Rf值为0.45的产物，干燥，得式(1-3)化合物0.68mmol，产率68.0％。
1HNMR(500MHz,)δ8.37(t,J＝5.8Hz),8.12(d,J＝8.0Hz),7.78(d,J＝4.1Hz),7.62(dt,J＝8.5,4.3Hz),7.32(d,J＝8.7Hz),6.97(d,J＝8.7Hz),6.11(s),5.45(s),4.88(s),3.92–3.79(m),3.04(t,J＝2.5Hz).
4、化合物1-4的合成
Figure BDA0002138771700000062
将化合物1-3(500mg，1.49mmol)溶于无水N，N-二甲基甲酰胺(10mL)中，恒压滴定漏斗逐滴滴加对硝基苯基氯甲酸酯(300mg，1.49mmol)，在0℃条件下滴加30分钟。然后加入三乙胺(451mg，4.46mmol)，室温反应5小时左右。用二氯甲烷萃取三次，有机相水洗三次，饱和食盐水洗涤一次，合并有机相并用无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸除去有机溶剂得粗产物，以体积比1:1的乙酸乙酯/石油醚为展开剂进行硅胶薄层层析，收集Rf值为0.5的产物，干燥，得式(1-4)化合物1.21mmol，产率81％。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.18(d,J＝2.2Hz,2H),8.17(d,J＝2.2Hz,2H),7.86(d,J＝8.3Hz,1H),7.72(d,J＝6.6Hz,1H),7.53(t,J＝7.8Hz,1H),7.36(s,2H),7.06(d,J＝8.7Hz,2H),6.93(d,J＝2.2Hz,2H),6.92(d,J＝2.2Hz,2H),5.78(s,1H),5.52(s,2H),4.39(d,J＝2.3Hz,2H),2.34(t,J＝2.5Hz,1H).
5、探针(I)的合成
Figure BDA0002138771700000071
将化合物1-4(500mg，1.0mmol)溶于二氯甲烷(5mL)中，加入式1-1(320mg，1.0mmol)所示化合物，然后加入三乙胺(303mg，3.0mmol)，在室温条件下反应过夜，反应液加入10倍体积去离子水，乙酸乙酯萃取三次，有机层用饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后，过滤，滤液浓缩至0.8g/mL后，以体积比10:1的二氯甲烷/甲醇为展开剂进行硅胶薄层层析，收集Rf值为0.38的产物，干燥，获得所述式(I)探针0.2mmol，产率20％，核磁图谱见图1和图2。
1H NMR(500MHz,CDCl3)δ9.19(t,J＝5.9Hz,1H),8.12(d,J＝8.0Hz,1H),7.79(d,J＝4.1Hz,2H),7.77(s,2H),7.68–7.65(m,15H),7.50(d,J＝8.5Hz,2H),7.47(t,J＝8.0Hz,2H),6.80(d,J＝8.6Hz,2H),5.91(s,1H),5.33(s,2H),3.86(d,J＝5.4Hz,2H),3.68(d,J＝7.0Hz,2H),2.06(s,1H),1.86(d,J＝5.0Hz,2H).13CNMR(126MHz,CDCl3)δ170.43,158.01,154.87,146.83,135.13,135.11,134.01,133.55,133.39,133.31,130.57,130.47,128.62,128.34,124.88,118.37,117.69,114.73,80.06,75.39,70.75,66.75,38.27,38.14,30.42.
实施例2评估探针(I)和HeLa细胞中线粒体之间的共定位
1、HeLa细胞培养条件
选用宫颈癌细胞HeLa。细胞培养基(含10％胎牛血清、0.1mg/ml链霉素和100U/ml青霉素的DMEM高糖培养基(购自杭州泽衡生物科技有限公司))，在37℃、5％CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养。
2、探针(I)和线粒体之间的共定位
将105个宫颈癌细胞HeLa接种至含有细胞培养基的细胞成像玻璃皿中，37℃/5％CO2过夜培养贴壁后，弃培养基，加入含10μM探针(I)的200μL新鲜相同的细胞培养基，在37℃/5％CO2下孵育30分钟。然后，用pH7.4磷酸缓冲液洗涤细胞一次，细胞继续孵育30分钟。之后，将细胞用100nM MitoTrackerTM Deep Red FM(购于Invitrogen)染色30分钟。随后用200μL、pH7.4的磷酸缓冲液洗涤细胞，并用200μL含有3.7％甲醛的磷酸缓冲液固定15分钟，然后弃去甲醛，用冰磷酸缓冲液洗涤三次。再用200μL含0.1％Triton X-100的磷酸缓冲液透化细胞15分钟，然后用冰磷酸缓冲液洗涤细胞两次，随后加入100μL新鲜配置的点击化学试剂(组成：25μL 10Μm罗丹明聚乙二醇叠氮，25μL 100μM三(3-羟丙基三唑基甲基)胺，25μL 100μM三(2-羧乙基)膦盐酸盐，25μL 100μM硫酸铜，溶剂为去离子水)在室温下孵育2小时。随后依次用2×磷酸缓冲液，含有0.1％Tween-20，0.5mM乙二胺四乙酸钠盐的磷酸缓冲液，2×磷酸缓冲液洗涤细胞数次。然后用300ng/mL Hoechst 33342对细胞进行核染色。最后用磷酸缓冲液洗去成像皿里的培养基，避光。样品用荧光成像仪进行荧光成像。所有图像均在LeicaTCS SP5X共聚焦显微镜系统的不同检测通道上获得(探针通道：罗丹明染料λex＝543nm，λem＝570-640nm；MitoTracker通道：λex＝644nm，λem＝665-740nm；Hoechst通道：λex＝405nm，λem＝440-470nm)并用Leica Application Suite Advanced Fluorescence(LAS AF)处理。
结果如图3所示，由共聚焦显微镜系统的探针(I)检测通道下获得的细胞图像1)与MitoTracker检测通道下获得的细胞图像2)及Hoechst细胞核染色图像对比，显示图像重叠较好，如图像3)所示，证明本发明探针(I)可成功定位到HeLa细胞中的线粒体。
实施例3凝胶荧光成像和考马斯亮蓝染色检测探针(I)对线粒体蛋白质的标记效果。
将宫颈癌细胞HeLa接种在含有400μL细胞培养基(同实施例2)的12孔细胞培养板(Corning)中，并置于37℃/5％CO2培养箱中过夜贴壁。待细胞融合度达90％时，分别加入0.4mL含不同终浓度(40μM、20μM、10μM、5μM、2.5μM和0μM)探针(I)的细胞培养基，放入37℃/5％CO2细胞培养箱内孵育1小时，孵育结束后吸掉孔板里的液体，用新的培养液洗涤一次，加入新鲜培养液再孵育0.5小时。孵育结束后加入150μL PBS，在UV下照射10分钟，孵育0.5小时。待孵育结束后每孔加入1mL预冷的PBS，将细胞刮下加入200μL磷酸缓冲液(含0.1％Triton X-100，100μM苯甲基磺酰氟)，进行细胞裂解，获得细胞裂解物。然后将8μL点击化学试剂(终浓度组成：10μM罗丹明叠氮，100μM三(3-羟丙基三唑基甲基)胺，100μM(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)，100μM(硫酸铜)，溶剂为去离子水)加入到200μL细胞裂解物中，在室温下孵育2小时，反应结束后，加入1mL预冷丙酮，在-20℃放置过夜。随后离心(13,000rpm，10分钟，4℃)，弃去上清液，收集沉淀用200μL预冷甲醇将细胞吹散，在-20℃放置1小时。然后离心(13000rpm，10分钟，4℃)，弃去上清液，置于通风橱中倒置使残留的甲醇挥发干。然后加入50μL1×标准SDS上样缓冲液，超声(25℃，50kHz)处理20分钟使其完全溶解，随后在100℃下加热10分钟以使其变性。最后将样品加入到12％SDS-PAGE凝胶孔中，进行电泳。取出凝胶后，用荧光成像扫描仪(GEAmersham)进行扫描，最后将凝胶用考马斯亮蓝G250溶液染色。
得到结果如图4所示，根据凝胶荧光成像图(左)和考马斯亮蓝染色图(右)发现，探针(I)成功标记细胞内蛋白，并且随探针浓度的增加标记蛋白量增多。当探针浓度为40μM时标记效果较好，因此确定其为最优标记条件。同时根据实例2和实例3中的结果结合，说明探针很好地标记了线粒体内的蛋白。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求保护范围内。

Claims (10)

1.一种式(I)所示小分子探针：
Figure FDA0003299406350000011
2.一种权利要求1所述小分子探针的制备方法，其特征在于所述方法为：(1)将三苯基膦，3-溴丙胺氢溴酸盐溶于乙腈中，加热回流，反应结束后，冷却至室温，离心，取固体溶于异丙醇和乙醚中重结晶，晶体干燥，得到式(1-1)所示化合物；
(2)将对羟基扁桃酸溶于无水N,N-二甲基甲酰胺，缓慢加入炔丙胺，1-羟基苯并三唑，冰浴搅拌，再加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N，N-二异丙基乙胺，冰浴15min后，氮气保护下室温反应完全，用乙酸乙酯萃取，有机相经水洗、饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸除去有机溶剂得粗产物，以体积比10:1的二氯甲烷/甲醇为展开剂进行硅胶薄层层析，收集Rf值为0.4的产物，干燥，得到式(1-2)所示化合物；
(3)将步骤(2)获得的式(1-2)所示化合物和碳酸钾加入无水N，N-二甲基甲酰胺中，滴加2-硝基苄溴，室温搅拌6h后，用二氯甲烷萃取后，依次水洗、饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸除去有机溶剂得粗产物，以体积比1:2的乙酸乙酯/石油醚为展开剂进行硅胶薄层层析，收集Rf值为0.45的产物，干燥，得到式(1-3)所示化合物；
(4)将步骤(3)获得的式(1-3)所示化合物加入无水N，N-二甲基甲酰胺中，恒压滴定漏斗滴加对硝基苯基氯甲酸酯，冰浴滴加30分钟，然后加入三乙胺，室温反应5小时，二氯甲烷萃取，水洗，饱和食盐水洗涤后，用无水硫酸钠干燥，过滤，旋蒸除去有机溶剂得粗产物，以体积比1:1的乙酸乙酯/石油醚为展开剂进行硅胶薄层层析，收集Rf值为0.5的产物，干燥，得到式(1-4)所示化合物；
(5)将步骤(4)获得的式(1-4)所示化合物溶于二氯甲烷中，加入式(1-1)所示化合物，随后加入三乙胺，室温反应过夜，反应液加入10倍体积去离子水并用乙酸乙酯萃取，有机层用饱和盐水洗涤，无水硫酸钠干燥后，过滤，滤液浓缩至0.5～1g/mL后，以体积比10:1的二氯甲烷/甲醇为展开剂进行硅胶薄层层析，收集Rf值为0.38的产物，干燥，获得所述式(I)探针；
Figure FDA0003299406350000021
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(1)中乙腈体积用量以3-溴丙胺氢溴酸盐物质的量计为10～30mL/mmol；三苯基膦与3-溴丙胺氢溴酸盐的投料物质的量之比为1:1～2。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(2)中N,N-二甲基甲酰胺的体积用量以对羟基扁桃酸物质的量计为0.5～2mL/mmol；对羟基扁桃酸与炔丙胺、1-羟基苯并三唑和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N，N-二异丙基乙胺的投料物质的量之比为1:1～2:0.01～0.03:1～3:1～4。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述N，N-二甲基甲酰胺体积用量以式(1-2)所示化合物物质的量计为10-50mL/mmol；式(1-2)所示化合物和碳酸钾，2-硝基苄溴的投料物质的量之比为1:2～5:1～2。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(4)中所述无水N，N-二甲基甲酰胺用量以式(1-3)所示化合物物质的量计为5-8mL/mmol；式(1-3)所示化合物和对硝基苯基氯甲酸酯，三乙胺的投料物质的量之比为1:1～3:2～6。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(5)中所述二氯甲烷体积用量以式(1-4)所示化合物物质的量计为5-30mL/mmol；所述式(1-4)所示化合物与式(1-1)，三乙胺投料物质的量之比为1:1～5:1～6。
8.一种权利要求1所述探针在制备细胞成像试剂中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述细胞为宫颈癌细胞HeLa。
10.一种权利要求1所述探针在制备蛋白质标记试剂中的应用。
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