WO2023140228A1 - タンパク質の変性状態又は凝集状態を可視化する方法 - Google Patents

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伸一 佐藤
啓太 中根
孝介 ▲ど▼▲ど▼
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国立大学法人東北大学
国立研究開発法人理化学研究所
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    • C07D271/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two nitrogen atoms and one oxygen atom as the only ring hetero atoms
    • C07D271/12—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two nitrogen atoms and one oxygen atom as the only ring hetero atoms condensed with carbocyclic rings or ring systems
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    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for visualizing the denatured or aggregated state of proteins, an agent for visualizing the denatured or aggregated state of proteins, a method for identifying denatured or aggregated proteins in a sample, and a method for identifying proteins that bind to test compounds.
  • proteins change to a denatured state or an aggregated state such as amyloid fibrils due to heating or specific conditions.
  • the former is an important phenomenon for basic protein research, and the latter is deeply involved in neurodegenerative diseases. Therefore, the development of techniques for visualizing the denaturation and aggregation states of proteins will have a great impact academically and industrially.
  • Non-Patent Document 1 Conventional methods commonly use low-molecular-weight chemical probes that visualize structures (denatured structure) in which the hydrophobic structure that was originally buried inside the protein is exposed on the protein surface during the heat denaturation process and aggregated structures such as beta sheets.
  • Conventional fluorescent chemical probes generally have the characteristic of non-covalently interacting with denatured/aggregated structures to enhance fluorescence.
  • the present invention was made against this background, and aims to provide means for detecting denatured or aggregated proteins with high sensitivity, which can also be applied to protein mixed systems.
  • NBD nitrobenzoxadiazole
  • [1] A method for visualizing the denatured or aggregated state of a protein, wherein the protein is represented by the following general formula (I) ⁇ R 1 ⁇ 1 ⁇ 12 ⁇ ( ⁇ 1 ⁇ -CH 2 -CH 2 - ⁇ -CO-NH- ⁇ ) ⁇ 3 ⁇ 10 ⁇ ( ⁇ 1 ⁇ ) ⁇ 3 ⁇ 10 ⁇ ( ⁇ 1 ⁇ ) ⁇ -(CH 2 -CH 2 -O-)n-CH 3 ⁇ (n ⁇ 1 ⁇ 4 ⁇ ) ⁇ R 2 ⁇ R 3 ⁇ 1 ⁇ 3 ⁇ X 1 ⁇ -SO 2 NR 4 R 5 ⁇ ( ⁇ R 4 ⁇ R 5 ⁇ 1 ⁇ 3 ⁇ ) ⁇ X 2 ⁇ (i) ⁇ (v) (In the formula, * indicates a bond and bonds to the nitrogen atom in general formula (I).) and X 3 is absent or represents an oxygen atom or a sulfur atom. ] and a step of detecting the fluorescence of the reactant of the compound represented by general formula (I).
  • R in general formula (I) 1 is a linear alkyl group with 4 to 12 carbon atoms (provided that one or more -CH 2 -CH 2 - may be substituted with -CO-NH-. ), a branched chain alkyl group having 3 to 5 carbon atoms (wherein one or more carbon atoms not adjacent to each other in the alkyl group may be substituted by a nitrogen atom or an oxygen atom), a cycloalkyl group having 4 to 6 carbon atoms which may be substituted by a substituent (however, one or more carbon atoms which are not adjacent to each other in the cycloalkyl group may be substituted by a nitrogen atom or an oxygen atom), a phenyl group which may be substituted by a substituent, a 2-thienyl group which may be substituted by a substituent, a substituent an optionally substituted 3-thienyl group, an optionally substituted 2-furanyl group, an optionally substituted 3-furany
  • R in general formula (I) 1 is n-butyl, n-octyl, iso-propyl, sec-butyl, tert-butyl, 3-pentyl, 1-methyl-2-methylamino-ethyl, cycloalkyl, 3-azetidyl, 3-piperidinyl, 3-aminomethylcyclobutyl, 3-aminocyclopentyl, 4-aminocyclohexyl, phenyl, 2-thienyl, 3-thienyl, 2-furanyl, 3-furanyl , 2-pyridyl group, 3-pyridyl group, 4-pyridyl group, or -(CH 2 -CH 2 -O-) 2 -CH 3
  • the method according to [1] which is a group represented by
  • R 1 in general formula (I) is an n-butyl group, n-octyl group, iso-propyl group, 3-pentyl group, or a group represented by -( CH2 - CH2 -O-) 2 - CH3 .
  • An agent for visualizing the denatured or aggregated state of proteins which has the following general formula (I) ⁇ R 1 ⁇ 1 ⁇ 12 ⁇ ( ⁇ 1 ⁇ -CH 2 -CH 2 - ⁇ -CO-NH- ⁇ ) ⁇ 3 ⁇ 10 ⁇ ( ⁇ 1 ⁇ ) ⁇ 3 ⁇ 10 ⁇ ( ⁇ 1 ⁇ ) ⁇ -(CH 2 -CH 2 -O-)n-CH 3 ⁇ (n ⁇ 1 ⁇ 4 ⁇ ) ⁇ R 2 ⁇ R 3 ⁇ 1 ⁇ 3 ⁇ X 1 ⁇ -SO 2 NR 4 R 5 ⁇ ( ⁇ R 4 ⁇ R 5 ⁇ 1 ⁇ 3 ⁇ ) ⁇ X 2 ⁇ (i) ⁇ (v) (In the formula, * indicates a bond and bonds to the nitrogen atom in general formula (I).) and X 3 is absent or represents an oxygen atom or a sulfur atom.
  • a visualization agent characterized by comprising a compound represented by.
  • R in general formula (I) 1 is a linear alkyl group with 4 to 12 carbon atoms (provided that one or more -CH 2 -CH 2 - may be substituted with -CO-NH-. ), a branched chain alkyl group having 3 to 5 carbon atoms (wherein one or more carbon atoms not adjacent to each other in the alkyl group may be substituted by a nitrogen atom or an oxygen atom), a cycloalkyl group having 4 to 6 carbon atoms which may be substituted by a substituent (however, one or more carbon atoms which are not adjacent to each other in the cycloalkyl group may be substituted by a nitrogen atom or an oxygen atom), a phenyl group which may be substituted by a substituent, a 2-thienyl group which may be substituted by a substituent, a substituent an optionally substituted 3-thienyl group, an optionally substituted 2-furanyl group, an optionally substituted 3-furany
  • R in general formula (I) 1 is n-butyl, n-octyl, iso-propyl, sec-butyl, tert-butyl, 3-pentyl, 1-methyl-2-methylamino-ethyl, cycloalkyl, 3-azetidyl, 3-piperidinyl, 3-aminomethylcyclobutyl, 3-aminocyclopentyl, 4-aminocyclohexyl, phenyl, 2-thienyl, 3-thienyl, 2-furanyl, 3-furanyl , 2-pyridyl group, 3-pyridyl group, 4-pyridyl group, or -(CH 2 -CH 2 -O-) 2 -CH 3
  • the visualization agent according to [5] which is a group represented by
  • R 1 in general formula (I) is an n-butyl group, n-octyl group, iso-propyl group, 3-pentyl group, or a group represented by -( CH2 - CH2 -O-) 2 - CH3 .
  • a method for identifying denatured or aggregated proteins in a sample wherein the sample is represented by the following general formula (I) ⁇ R 1 ⁇ 1 ⁇ 12 ⁇ ( ⁇ 1 ⁇ -CH 2 -CH 2 - ⁇ -CO-NH- ⁇ ) ⁇ 3 ⁇ 10 ⁇ ( ⁇ 1 ⁇ ) ⁇ 3 ⁇ 10 ⁇ ( ⁇ 1 ⁇ ) ⁇ -(CH 2 -CH 2 -O-)n-CH 3 ⁇ (n ⁇ 1 ⁇ 4 ⁇ ) ⁇ R 2 ⁇ R 3 ⁇ 1 ⁇ 3 ⁇ X 1 ⁇ -SO 2 NR 4 R 5 ⁇ ( ⁇ R 4 ⁇ R 5 ⁇ 1 ⁇ 3 ⁇ ) ⁇ X 2 ⁇ (i) ⁇ (v) (In the formula, * indicates a bond and bonds to the nitrogen atom in general formula (I).) and X 3 is absent or represents an oxygen atom or a sulfur atom. ] A method comprising the steps of contacting with a compound represented by the following steps, separating proteins in the sample, and detecting the fluorescence of the reaction product of the compound represented by general
  • R in general formula (I) 1 is a linear alkyl group with 4 to 12 carbon atoms (provided that one or more -CH 2 -CH 2 - may be substituted with -CO-NH-. ), a branched-chain alkyl group having 3 to 5 carbon atoms (wherein one or more carbon atoms not adjacent to each other in the alkyl group may be substituted by a nitrogen atom or an oxygen atom), a cycloalkyl group having 4 to 6 carbon atoms which may be substituted by a substituent (wherein one or more carbon atoms which are not adjacent to each other may be substituted by a nitrogen atom or an oxygen atom in the cycloalkyl group), a phenyl group which may be substituted by a substituent, a 2-thienyl group which may be substituted by a substituent, a substituent an optionally substituted 3-thienyl group, an optionally substituted 2-furanyl group, an optionally substituted 3-furany
  • R in general formula (I) 1 is n-butyl, n-octyl, iso-propyl, sec-butyl, tert-butyl, 3-pentyl, 1-methyl-2-methylamino-ethyl, cycloalkyl, 3-azetidyl, 3-piperidinyl, 3-aminomethylcyclobutyl, 3-aminocyclopentyl, 4-aminocyclohexyl, phenyl, 2-thienyl, 3-thienyl, 2-furanyl, 3-furanyl , 2-pyridyl group, 3-pyridyl group, 4-pyridyl group, or -(CH 2 -CH 2 -O-) 2 -CH 3
  • the method according to [9] which is a group represented by
  • R 1 in general formula (I) is an n-butyl group, n-octyl group, iso-propyl group, 3-pentyl group, or a group represented by -( CH2 - CH2- O-) 2 - CH3 .
  • a method of identifying a protein that binds to a test compound comprising the steps of: (1) adding a test compound and a fluorescent substance to a sample containing protein; (2) heating the sample of step (1); (3) separating proteins contained in the sample of step (2); (4) measuring the fluorescence intensity of each protein separated in step (3); (5) adding a fluorescent substance to a sample containing protein; (6) heating the sample of step (5); (7) separating proteins contained in the sample of step (6); (8) measuring the fluorescence intensity of each protein separated by step (7); (9) The fluorescence intensity of each protein measured in step (4) is compared with the fluorescence intensity of each protein measured in step (8), and the fluorescence intensity measured in step (4) is lower than the fluorescence intensity measured in step (8).
  • R in general formula (I) 1 is a linear alkyl group with 4 to 12 carbon atoms (provided that one or more -CH 2 -CH 2 - may be substituted with -CO-NH-. ), a branched-chain alkyl group having 3 to 5 carbon atoms (wherein one or more carbon atoms not adjacent to each other in the alkyl group may be substituted by a nitrogen atom or an oxygen atom), a cycloalkyl group having 4 to 6 carbon atoms which may be substituted by a substituent (wherein one or more carbon atoms which are not adjacent to each other may be substituted by a nitrogen atom or an oxygen atom in the cycloalkyl group), a phenyl group which may be substituted by a substituent, a 2-thienyl group which may be substituted by a substituent, a substituent an optionally substituted 3-thienyl group, an optionally substituted 2-furanyl group, an optionally substituted 3-furany
  • R in general formula (I) 1 is n-butyl, n-octyl, iso-propyl, sec-butyl, tert-butyl, 3-pentyl, 1-methyl-2-methylamino-ethyl, cycloalkyl, 3-azetidyl, 3-piperidinyl, 3-aminomethylcyclobutyl, 3-aminocyclopentyl, 4-aminocyclohexyl, phenyl, 2-thienyl, 3-thienyl, 2-furanyl, 3-furanyl , 2-pyridyl group, 3-pyridyl group, 4-pyridyl group, or -(CH 2 -CH 2 -O-) 2 -CH 3
  • the method according to [13] which is a group represented by
  • R 1 in general formula (I) is an n-butyl group, n-octyl group, iso-propyl group, 3-pentyl group, or a group represented by -( CH2 - CH2- O-) 2 - CH3 .
  • R 1a represents an iso-propyl group, n-butyl group, 3-pentyl group, cyclobutyl group, cyclopentyl group, cyclohexyl group, cycloheptyl group, cyclooctyl group, 2-adamantyl group, n-hexyl group, n-octyl group, n-decyl group, n-dodecyl group, iso-butyl group, 5-nonyl group, or diethylene glycol group; represents an atom, and R 1c represents a methyl group or an iso-propyl group.
  • the present invention provides a novel method for visualizing the denatured or aggregated state of proteins.
  • This method can visualize the denatured or aggregated state of proteins with higher sensitivity than the conventional methods using fluorescent chemical probes.
  • fluorescent probes are covalently bound to denatured or aggregated proteins and leave a history of denaturation or aggregation, so use in protein mixed systems and application to proteomics analysis are possible.
  • the figure which shows the evaluation result of the improvement of the fluorescence property in response to heating A diagram showing the results of quantification of the aggregation state of Amyloid ⁇ 1-40. The figure which shows the quantification result of the aggregation state of (alpha)-synuclein.
  • a diagram showing the results of detection of heat-denatured proteins by two-dimensional electrophoresis (protocol for collecting pellets).
  • the upper row shows a fluorescence image by N-NBD
  • the middle row shows an Oriole-stained image
  • the lower row shows an enlarged image of the upper fluorescence image.
  • FIG. 10 is a diagram showing a comparison of each probe in fluorescence detection by probes of denatured HSP90 by addition of Geldanamycin.
  • FIG. 3 shows the results of spot extraction from a two-dimensional electrophoresis gel after denaturation detection and identification by mass spectrometry.
  • the "linear alkyl group having 1 to 12 carbon atoms” is, for example, methyl group, ethyl group, n-propyl group, n-butyl group, n-pentyl group, n-hexyl group, n-heptyl group, n-octyl group, n-nonyl group, n-decyl group, n-undecyl group, n-dodecyl group.
  • the "linear alkyl group having 4 to 12 carbon atoms” is, for example, n-butyl group, n-pentyl group, n-hexyl group, n-heptyl group, n-octyl group, n-nonyl group, n-decyl group, n-undecyl group, n-dodecyl group.
  • the "branched alkyl group having 3 to 10 carbon atoms” includes, for example, iso-propyl group, iso-butyl group, sec-butyl group, tert-butyl group, iso-pentyl group, sec-pentyl group, tert-pentyl group, 3-pentyl group, neopentyl group, iso-hexyl group, sec-hexyl group, tert-hexyl group, neohexyl group, iso-heptyl group, sec-heptyl group, tert-heptyl group, neoheptyl group, iso-octyl group, sec-octyl group, tert-octyl group, neooctyl group, iso-nonyl group, sec-nonyl group, tert-nonyl group, neononyl group, iso-dec
  • the "branched alkyl group having 3 to 5 carbon atoms" is, for example, iso-propyl group, iso-butyl group, sec-butyl group, tert-butyl group, iso-pentyl group, sec-pentyl group, tert-pentyl group, 3-pentyl group, neopentyl group.
  • a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms is, for example, a cyclopropyl group, a cyclobutyl group, a cyclopentyl group, a cyclohexyl group, a cycloheptyl group, a cyclooctyl group, a cyclononyl group, and a cyclodecyl group.
  • a cycloalkyl group having 4 to 6 carbon atoms is, for example, a cyclobutyl group, a cyclopentyl group, or a cyclohexyl group.
  • Aryl groups in the present invention are, for example, phenyl groups, 1-naphthyl groups, and 2-naphthyl groups.
  • a “heteroaryl group” in the present invention is, for example, a 2-thienyl group, a 3-thienyl group, a 2-furanyl group, a 3-furanyl group, a 2-pyridyl group, a 3-pyridyl group, and a 4-pyridyl group.
  • the method for visualizing the denatured or aggregated state of a protein of the present invention comprises the steps of: contacting a protein with a compound represented by the following general formula (I); and detecting the fluorescence of a reaction product of the compound represented by the following general formula (I).
  • the compound represented by the general formula (I) does not emit fluorescence in a normal state, but when it comes close to a protein, it reacts with the amino group of the lysine residue in the protein (the carbon atom on the aromatic ring to which X3 binds and the nitrogen atom of the amino group of the lysine residue covalently bond), and emits fluorescence (Yamaguchi, T. et al., Chem. Sci. 5, 1021-1029 (2014)).
  • the compound represented by the general formula (I) is hydrophobic, whereas the surface of the protein that is not denatured or aggregated is hydrophilic, so the compound represented by the general formula (I) hardly binds to the protein that is not denatured or aggregated.
  • denaturation or aggregation of proteins produces a hydrophobic structure on the protein surface, and the compound represented by general formula (I) binds to this structure to emit fluorescence. Therefore, the denatured state and aggregation state of the protein can be visualized by the fluorescence emitted by the reaction product of the compound represented by the general formula (I).
  • R 1 may represent a linear alkyl group.
  • the straight-chain alkyl group is generally a straight-chain alkyl group having 1 to 12 carbon atoms, preferably a straight-chain alkyl group having 4 to 12 carbon atoms, more preferably an n-butyl group or an n-octyl group, still more preferably an n-octyl group.
  • the linear alkyl group contains -CH2 - CH2- (that is, has 2 or more carbon atoms, preferably 3 or more carbon atoms)
  • -CH2 - CH2- may be substituted with -CO-NH-. The substitution may be one, two, or three in the linear alkyl group.
  • R 1 may represent a branched chain alkyl group.
  • the branched-chain alkyl group is generally a branched-chain alkyl group having 3 to 10 carbon atoms, preferably a branched-chain alkyl group having 3 to 5 carbon atoms, more preferably an iso-propyl group, a sec-butyl group, a tert-butyl group, or a 3-pentyl group, and still more preferably an iso-propyl group.
  • One or more carbon atoms that are not adjacent to each other in the branched chain alkyl group may be replaced by a nitrogen atom or an oxygen atom.
  • branched chain alkyl group There may be only one, two or three such substitutions in the branched chain alkyl group.
  • a specific example of the branched chain alkyl group in which a carbon atom is substituted with a nitrogen atom or an oxygen atom is a 1-methyl-2-methylamino-ethyl group.
  • R 1 may represent a cycloalkyl group.
  • the cycloalkyl group is generally a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms, preferably a cycloalkyl group having 4 to 6 carbon atoms, more preferably a cyclohexyl group.
  • One or more carbon atoms that are not adjacent to each other in the cycloalkyl group may be replaced with a nitrogen atom or an oxygen atom.
  • the substitution may be one, two or three in the cycloalkyl group.
  • cycloalkyl groups in which carbon atoms are substituted with nitrogen atoms or oxygen atoms include 3-azetidyl group, 3-tetrahydrofuranyl group, 3-piperidinyl group and 4-tetrahydropyranyl group.
  • Cycloalkyl groups may be optionally substituted with substituents. Examples of substituents include an amino group and an aminomethyl group.
  • substituents include an amino group and an aminomethyl group.
  • cycloalkyl groups substituted with substituents include 3-aminomethylcyclobutyl group, 3-aminocyclopentyl group and 4-aminocyclohexyl group.
  • R 1 may represent an aryl group.
  • Aryl groups are preferably phenyl groups.
  • Aryl groups may be optionally substituted with substituents. Examples of substituents include an amino group and an aminomethyl group.
  • R 1 may represent a heteroaryl group.
  • a heteroaryl group is preferably 2-thienyl, 3-thienyl, 2-furanyl, 3-furanyl, 2-pyridyl, 3-pyridyl or 4-pyridyl.
  • Heteroaryl groups may be optionally substituted with substituents. Examples of substituents include an amino group and an aminomethyl group.
  • R 1 may represent a group represented by (CH 2 —CH 2 —O—)n—CH 3 .
  • n is usually an integer of 1-4, preferably 2 or 3.
  • R 1 may represent an adamantyl group.
  • the adamantyl group may be either a 1-adamantyl group or a 2-adamantyl group, but the 2-adamantyl group is preferred.
  • R 1 may represent a halogen atom.
  • Halogen atoms include fluorine, chlorine, bromine, iodine and astatine atoms. Among these, a bromine atom and an iodine atom are preferred.
  • R in general formula (I) 1 is a linear alkyl group with 1 to 12 carbon atoms (provided that one or more -CH 2 -CH 2 - may be substituted with -CO-NH-. ), a branched chain alkyl group having 3 to 10 carbon atoms (wherein one or more carbon atoms that are not adjacent to each other in the alkyl group may be substituted by a nitrogen atom or an oxygen atom), a cycloalkyl group having 3 to 10 carbon atoms that may be substituted by a substituent (however, one or more carbon atoms that are not adjacent to each other in the cycloalkyl group may be substituted by a nitrogen atom or an oxygen atom), an optionally substituted aryl group, an optionally substituted heteroaryl group, -(CH 2 -CH 2 -O-)n-CH 3 (n represents an integer of 1 to 4.), an adamantyl group, or a halogen atom, preferably a straight-
  • a branched chain alkyl group having 3 to 5 carbon atoms wherein one or more carbon atoms not adjacent to each other in the alkyl group may be substituted by a nitrogen atom or an oxygen atom
  • a cycloalkyl group having 4 to 6 carbon atoms which may be substituted by a substituent (however, one or more carbon atoms which are not adjacent to each other in the cycloalkyl group may be substituted by a nitrogen atom or an oxygen atom)
  • a phenyl group which may be substituted by a substituent a 2-thienyl group which may be substituted by a substituent, a substituent an optionally substituted 3-thienyl group, an optionally substituted 2-furanyl group, an optionally substituted 3-furanyl group, an optionally substituted 2-pyridyl group, an optionally substituted 3-pyridyl group, an optionally substituted 4-pyridyl group, or -(CH 2 -CH 2 -O-
  • 3-thienyl group 2-furanyl group, 3-furanyl group, 2-pyridyl group, 3-pyridyl group, 4-pyridyl group, or -(CH 2 -CH 2 -O-) 2 -CH 3 and more preferably n-butyl group, n-octyl group, iso-propyl group, 3-pentyl group, or -(CH 2 -CH 2 -O-) 2 -CH 3 is a group represented by
  • R 2 and R 3 each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group.
  • the alkyl group is generally a linear or branched alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, preferably a methyl group.
  • R 2 and R 3 may be the same group or different groups.
  • R 2 and R 3 may be the groups described above, but are preferably hydrogen atoms.
  • X1 represents a nitro group or a group represented by -SO2NR4R5 .
  • R4 and R5 each independently represent an alkyl group.
  • the alkyl group is generally a straight or branched alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, preferably a methyl group.
  • R 4 and R 5 may be the same group or different groups.
  • X 1 may be any of the groups described above, preferably a nitro group.
  • X 2 is represented by the following formulas (i) to (v) (In the formula, * indicates a bond and bonds to the nitrogen atom in general formula (I).) Represents a group represented by any one of X 2 may be any of the groups described above, but is preferably a group represented by formula (i).
  • X 3 in general formula (I) is absent or represents an oxygen atom or a sulfur atom.
  • X3 may be any of the groups described above, preferably an oxygen atom.
  • R 1 represents a halogen atom
  • X 3 is preferably absent.
  • "X 3 does not exist" means that R 1 is directly bonded to the benzoxadiazole ring.
  • the proteins to be visualized are not particularly limited, and proteins that may be denatured or aggregated can be visualized. Modification mainly means heat denaturation, but may also be denaturant denaturation, acid denaturation, pressure denaturation, and the like. Specific examples of proteins that may aggregate include Amyloid ⁇ and ⁇ -synuclein.
  • the method of contacting the protein with the compound represented by general formula (I) is not particularly limited, and examples include a method of adding the compound represented by general formula (I) to a solution containing protein.
  • the amount of the compound represented by general formula (I) to be used is not particularly limited, it is usually 100 to 10000 mol, preferably 100 to 1000 mol, per 1 mol of the protein to be visualized.
  • the reactant (compound with protein) of the compound represented by general formula (I) emits fluorescence.
  • This fluorescence detection can be performed according to a conventional method.
  • nitrobenzoxadiazole derivatives (N-NBD) in which X3 contains a nitrogen atom are known to emit fluorescence, and the fluorescence of the reaction product of the compound represented by general formula (I) can be detected in a similar manner.
  • visualization of the denatured or aggregated state of a protein refers to making the denatured or aggregated state of a protein visible. For example, clarifying whether the protein of interest is denatured or aggregated, or clarifying the extent to which the protein of interest is denatured or aggregated (quantification of the degree of denaturation or aggregation) corresponds to "visualization of the denaturation or aggregation state of the protein" in the present invention.
  • the method of the present invention for identifying a denatured protein or aggregated protein in a sample is characterized by comprising the steps of contacting the sample with the compound represented by the general formula (I), separating the protein in the sample, and detecting the fluorescence of the reaction product of the compound represented by the general formula (I).
  • a sample containing only one kind of protein may be used as the sample, but usually a sample containing a mixture of multiple proteins is used.
  • the method of contacting the sample with the compound represented by general formula (I) is not particularly limited, and examples include a method of adding the compound represented by general formula (I) to the sample.
  • Proteins in a sample can be separated by methods commonly used for protein separation, such as electrophoresis and gel filtration.
  • Identification Method A method for identifying a protein that binds to the test compound of the present invention includes the following steps (1) to (9).
  • a test compound and a compound represented by general formula (I) are added to a sample containing protein.
  • the sample containing protein is not particularly limited, and examples thereof include cell lysates and cell extracts.
  • the test compound is also not particularly limited, and is, for example, a physiologically active compound.
  • step (2) the sample in step (1) is heated.
  • Heating conditions are not particularly limited as long as the temperature and time are such that the protein is denatured.
  • the heating temperature can be, for example, 40 to 80° C.
  • the heating time can be, for example, 1 to 30 minutes.
  • step (3) proteins contained in the sample in step (2) are separated. Proteins in a sample can be separated by methods commonly used for protein separation, such as electrophoresis and gel filtration.
  • step (4) the fluorescence intensity of each protein separated in step (3) is measured. Fluorescence intensity can be measured according to a conventional method.
  • step (5) the compound represented by general formula (I) is added to the sample containing protein.
  • Step (5) can be performed in the same manner as step (1), except that no test compound is added.
  • step (6) the sample in step (5) is heated.
  • Step (6) can be performed in the same manner as step (2).
  • step (7) proteins contained in the sample in step (6) are separated.
  • Step (7) can be performed in the same manner as step (3).
  • step (8) the fluorescence intensity of each protein separated in step (7) is measured.
  • Step (8) can be performed in the same manner as step (4).
  • step (9) the fluorescence intensity of each protein measured in step (4) is compared with the fluorescence intensity of each protein measured in step (8), and proteins whose fluorescence intensity measured in step (4) is lower than the fluorescence intensity measured in step (8) are identified as proteins that bind to the test compound.
  • the principle by which a protein that binds to a test compound can be identified by comparing fluorescence intensities is as follows. Binding of the test compound to a protein contained in the sample renders the protein resistant to heat denaturation and reduces the extent of heat denaturation. This decrease in the degree of thermal denaturation can be detected as a decrease in fluorescence intensity of the compound represented by general formula (I). Therefore, a protein whose fluorescence intensity measured in step (4) is lower than that measured in step (8) is a protein that has acquired heat denaturation resistance and is a protein that binds to the test compound.
  • 1-2.nBuONBD F-NBD (25.0 mg, 140 ⁇ mol), butanol (TCI, B0944; 310 ⁇ L, 3.40 mmol), DIEPA (Nacalai, 14014-42; N-ethyl-N-isopropylpropan-2-amine, 138 ⁇ L, 140 ⁇ mol), CH 2 Cl in a ChemiStation (EYELA, Personal Organic Synthesis Apparatus) tube (capacity 15 mL). 2 (Nacalai, 22430-74; 3.8 mL) was added and reacted at room temperature for 24 hours.
  • EYELA Personal Organic Synthesis Apparatus
  • 3-pentyl ONBD F-NBD 38.4 mg, 210 ⁇ mol
  • pentan-3-ol Nacalai, 02717-12; 1 mL
  • EYELA Personal Organic Synthesis Apparatus
  • Example 2 Evaluation of improvement in fluorescence properties in response to heating Bovine carbonic anhydrase (Aldrich, C3934) was diluted with 10 mM PBS to a final concentration of 10 ⁇ M. A 1 mM DMSO solution of brinzolamide (TCI, B4258) was added in an amount of 1 equivalent with respect to the protein, and allowed to stand at room temperature for 30 minutes. For comparison, the same amount of DMSO was added and the same operation was performed. Subsequently, a 100 mM ONBD compound stock solution (DMSO solution) was added to a final concentration of 1 mM, gently vortexed, and then 50 ⁇ L of the solution was transferred to a PCR tube.
  • DMSO solution 100 mM ONBD compound stock solution
  • the PCR tube was heated from 25°C with a real-time PCR measuring device (Takara Bio, Thermal Cycler Dice, TP800) with a protocol of increasing the temperature by 5°C every 180 seconds. Fluorescence (ONBD compounds in FAM mode) was measured during the last 15 seconds of each step. SyproOrange (Invitrogen S6650, 5000 ⁇ concentration in DMSO) for comparison was added to a final concentration of 10 ⁇ , the same operation was performed, and fluorescence was measured in ROX mode. As ONBD compounds, the following five types of MeONBD, iPrONBD, nBuONBD, iBuONBD, and octylONBD were used.
  • Fig. 1 shows the relationship between temperature and fluorescence intensity.
  • Fig. 1 shows the relationship between temperature and fluorescence intensity.
  • the ONBD compound enables quantification of the degree of thermal denaturation of proteins (visualization of protein denaturation state).
  • Example 3 Quantification of aggregation state of aggregating proteins 3-1.
  • Amyloid ⁇ 1-40 (Trifluoroacetate Form, 4307-v, Peptide Institute) was diluted with a buffer (100 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7.4) to a final concentration of 100 ⁇ M, and a solution was prepared from 100 mM ONBD compound and Thioflavin T in 10 mM DMSO so that the final concentration of the fluorescent compound was 1 mM.
  • Fig. 2 shows the relationship between the time from the start of measurement and the fluorescence intensity.
  • addition of both ONBD compounds resulted in an increase in fluorescence intensity over time that was much greater than that of Thioflavin T, a known amyloid- ⁇ detection dye. From this result, it is considered that the ONBD compound enables quantification of protein aggregation (visualization of protein aggregation state).
  • ⁇ -synuclein ⁇ -Synuclein fibril (Cosmo Bio, SYN03) was diluted in 10 mM MES buffer (pH 7.4) to prepare a 500 nM solution. The solution was dispensed into 96-well half-well black plates (Greiner, 675086) in 50 ⁇ L portions. A 100 mM ONBD compound and Thioflavin T stock solution (DMSO solution) was once diluted to 1 mM with the above buffer, added to the wells to a final concentration of 10 ⁇ M, and pipetted.
  • DMSO solution Thioflavin T stock solution
  • Fig. 3 shows the relationship between the time from the start of measurement and the fluorescence intensity in the presence or absence of ⁇ -Synuclein fibril.
  • a-Synuclein fibril in the presence of ⁇ -Synuclein fibril, an increase in fluorescence intensity over time was observed when any ONBD compound was added, and the increase in fluorescence intensity was particularly pronounced when octylONBD was added. From this result, it is considered that the ONBD compound enables quantification of protein aggregation (visualization of protein aggregation state).
  • Example 4 Detection of heat-denatured proteins by two-dimensional electrophoresis Lysate of HEK293FT cells solubilized with 1x RIPA buffer (Nacalai, 08714-04) and bovine carbonic anhydrase (hereinafter referred to as "CAII") (Aldrich, C3934) were diluted with the same buffer to prepare a protein mixture solution with a protein concentration of 3.0 mg/mL in the cell lysate and a CAII concentration of 1 ⁇ M or 5 ⁇ M. did. To this, brinzolamide (TCI, B4258) was added from a 1 mM DMSO solution to 1 equivalent with respect to CAII, and allowed to stand at room temperature for 30 minutes.
  • RIPA buffer Nacalai, 08714-04
  • CAII bovine carbonic anhydrase
  • DMSO solution 100 mM ONBD compound stock solution (DMSO solution) was added to the supernatant to a final concentration of 1 mM, and after lightly vortexing, 50 ⁇ L of the solution was transferred to a PCR tube.
  • the PCR tube was heated at 65° C. for 5 minutes in a thermal cycler (Applied biosystems, Mini Amp Plus) and then allowed to stand at room temperature.
  • the protocol for preparing subsequent two-dimensional electrophoresis samples was carried out by the following two methods.
  • Two-dimensional electrophoresis was performed according to the Auto 2D plus (Merck) long-term protocol, and fluorescence images of the resulting gels were acquired with a fluorescence imager (Vilver Lourmat, Fusion Solo S). After that, all proteins contained in the gel were stained with silver staining (Nacalai, Silvest Stein One, 06865-81) or Oriole (Biorad, 1610495) according to the manufacturer's protocol, and images were similarly taken.
  • As the ONBD compound iPrONBD described above was used.
  • Fig. 4 shows the two-dimensional electrophoretic image when the sample was prepared according to the protocol for recovering the whole protein
  • Fig. 5 shows the two-dimensional electrophoretic image when the sample was prepared according to the protocol for recovering the pellet.
  • the addition of brinzolamide decreased the fluorescence intensity of CAII in both protocols, but the decrease in fluorescence intensity was more pronounced in the pellet recovery protocol.
  • the reason why the fluorescence intensity of CAII decreased due to the addition of brinzolamide is considered to be that CAII acquired resistance to thermal denaturation due to the binding of brinzolamide. From this result, it is considered possible to identify denatured proteins and quantify the degree of denaturation using ONBD compounds even under conditions where proteins are mixed.
  • cyclo-pentyl-ONBD F-NBD (TCI, A5593; 20.0 mg, 110 ⁇ mol) and cyclopentanol (Nacalai, 10222-32; 1 mL) were added to a ChemiStation (EYELA, personal organic synthesizer) tube (capacity 15 mL) and reacted at 60 ° C. for 24 hours. After stopping the reaction, the product was dried under reduced pressure and separated by PTLC (Hexane: CHCl 3 ) to obtain cyclo-pentyl-ONBD as a yellow solid (19.0 mg, 70%, 76 ⁇ mol).
  • cyclo-hexyl-ONBD F-NBD (TCI, A5593; 20.0 mg, 110 ⁇ mol) and cyclohexanol (Nacalai, 10111-95; 1 mL) were added to a ChemiStation (EYELA, personal organic synthesizer) tube (capacity 15 mL) and reacted at 60 ° C. for 24 hours. After stopping the reaction, the product was dried under reduced pressure and separated by PTLC (Hexane: CHCl 3 ) to obtain cyclo-hexyl-ONBD as a yellow solid (17.0 mg, 60%, 65 ⁇ mol).
  • cyclo-heptyl-ONBD F-NBD (TCI, A5593; 20.0 mg, 110 ⁇ mol) and cycloheptanol (Angene International Limited, AG0034NE; 1 mL) were added to a ChemiStation (EYELA, personal organic synthesizer) tube (capacity 15 mL) and reacted at 65 ° C. for 15 hours. After the reaction was terminated, the product was dried under reduced pressure and separated by PTLC (Hexane: CH 2 Cl 2 ) to obtain cyclo-heptyl-ONBD as a yellow solid (13.0 mg, 40%, 47 ⁇ mol).
  • 2-adamantyl-ONBD F-NBD (TCI, A5593; 20.0 mg, 110 ⁇ mol)
  • 2-adamantanol (TCI, A0720; 1 mL)
  • DMF (wako, 045-02911; N,N-Dimethylformamide, 3 mL)
  • a microwave Biotage, microwave synthesizer initiator plus
  • the product was dried under reduced pressure and separated by PTLC (Hexane: CHCl 3 ) to obtain 2-adamantyl-ONBD as a yellow solid (10.0 mg, 31%, 34 ⁇ mol).
  • n-hexyl-ONBD F-NBD (TCI, A5593; 20.0 mg, 110 ⁇ mol) and 1-Hexanol (Nacalai, 18013-45; 1 mL) were added to a microwave (Biotage, microwave synthesizer initiator plus) vial (capacity 0.5-2 mL) and reacted at 150° C. for 1 hour. After stopping the reaction, the product was dried under reduced pressure and separated by PTLC (Hexane: CHCl 3 ) to obtain n-Hexyl-ONBD as a yellow solid (20.0 mg, 69%, 75 ⁇ mol).
  • n-Octyl-ONBD F-NBD (TCI, A5593; 20.0 mg, 110 ⁇ mol) and 1-Octanol (TCI, O0036; 1 mL) were added to a microwave (Biotage, microwave synthesizer initiator plus) vial (capacity 0.5-2 mL) and reacted at 160°C for 1 hour. After the reaction was terminated, the residue was dried under reduced pressure and separated by PTLC (Hexane: CHCl 3 ) to obtain n-Octyl-ONBD as a yellow solid (20.0 mg, 62%, 68 ⁇ mol).
  • n-Decyl-ONBD F-NBD (TCI, A5593; 20.0 mg, 110 ⁇ mol) and 1-Decanol (Nacalai, 10618-62; 1 mL) were added to a ChemiStation (EYELA, personal organic synthesizer) tube (capacity 15 mL) and reacted at 60 ° C. for 16 hours. After stopping the reaction, the product was dried under reduced pressure and separated by PTLC (Hexane: CHCl 3 ) to obtain n-Decyl-ONBD as a yellow solid (26.3 mg, 75%, 81.8 ⁇ mol).
  • EYELA personal organic synthesizer
  • n-Dodecyl-ONBD F-NBD (TCI, A5593; 20.0 mg, 110 ⁇ mol) and 1-Dodecanol (Nacalai, 20118-15; 1 mL) were added to a microwave (Biotage, microwave synthesizer initiator plus) vial (capacity 0.5-2 mL) and reacted at 170 ° C. for 1 hour. After stopping the reaction, the reaction mixture was dried under reduced pressure and separated by PTLC (Hexane: CHCl 3 ) to obtain n-Dodecyl-ONBD as a yellow solid (20.0 mg, 52%, 57 ⁇ mol).
  • 5-nonyl-ONBD F-NBD (TCI, A5593; 20.0 mg, 110 ⁇ mol) and cyclooctanol (TCI, C0623; 1 mL) were added to a microwave (Biotage, microwave synthesizer initiator plus) vial (capacity 0.5-2 mL) and reacted at 150° C. for 1 hour. After the reaction was terminated, the product was dried under reduced pressure and separated by PTLC (Hexane: CHCl 3 ) to obtain 5-nonyl-ONBD as a yellow solid (10.0 mg, 31%, 34 ⁇ mol).
  • Br-NBD (4) 3 (161 mg, 809 ⁇ mol) was dissolved in H 2 SO 4 (Nacalai, 32519-95; 1.3 mL) in a round-bottomed flask (capacity 50 mL), NaNO 3 (Nacalai, 31916-15; 89.4 mg, 1.05 mmol) was added dropwise to 50% H 2 SO 4 (1 mL), and allowed to react at room temperature for 30 minutes. After stopping the reaction, the solution was heated to 85°C, poured into ice water, and the precipitated solid was filtered, dried, and separated by column chromatography (Hexane: AcOEt) to obtain Br-NBD as a brown solid (150 mg, 76%, 615 ⁇ mol).
  • 4-iodobenzo[c][1,2,5]oxadiazole (8) 7 (31 mg, 86 ⁇ mol), NaN 3 (Nacalai, 31208-82; 6.2 mg, 95 ⁇ mol), and DMSO (wako, 048-32811; 3 mL) were added to a round-bottomed flask (capacity 30 mL) and allowed to react at room temperature for 2 hours. After stopping the reaction, the solution was heated to 120°C and poured into ice water, and the precipitated solid was filtered and dried. After that, the brown solid of 4-iodobenzo[c][1,2,5]oxadiazole (8) was used for the reaction in the 4th step without purification.
  • I-NBD (9) 8 (31 mg, 130 mmol) was dissolved in H 2 SO 4 (Nacalai, 32519-95; 1.3 mL) in a round-bottomed flask (capacity 30 mL), and a mixture of 50% H 2 SO 4 (1 mL) and NaNO 3 (Nacalai, 31916-15; 14 mg, 160 mmol) was added dropwise to react at room temperature for 30 minutes. After stopping the reaction, the solution was heated to 85° C., poured into ice water, and the precipitated solid was filtered, dried, and separated by column chromatography (Hexane: AcOEt) to obtain I-NBD as a brown solid (10 mg, 27%, 34 ⁇ mol).
  • DEG-ONBD F-NBD TCI, A5593; 48.0 mg, 260 ⁇ mol
  • 2-(2-Methoxyethoxy)ethanol TCI, M0537; 15 ⁇ L, 130 ⁇ mol
  • DIEPA Nacalai, 14014-42; 9 ⁇ L, 510 ⁇ mol
  • CH 2 Cl 2 Nacalai, 22430-74; 1.5 mL
  • 6-2.i-Pr-ODBD F-DBD (TCI, A5595; 15 mg, 61 ⁇ mol), 2-Propanol (wako, 165-09161; 120 ⁇ L, 1.5 mmol), Sodium hydride (Nacalai, 31525-22; 1.5 mg, 61 ⁇ mol), DMF DMF (wa ko, 045-02911; N,N-Dimethylformamide, 3 mL) was added and reacted at room temperature for 24 hours. After the reaction was terminated, the residue was dried under reduced pressure and separated by column chromatography (hexane: AcOEt) to obtain i-Pr-ODBD as a yellow solid (8.5 mg, 49%, 30.0 ⁇ mol).
  • Example 7 Probe characteristics for detection of thermal denaturation of NBD derivative and carbonic anhydrase An NBD derivative or Sypro Orange was added to carbonic anhydrase II and heated in the presence or absence of brinzolamide, which is an inhibitor of carbonic anhydrase II.
  • Example 8 Probe characteristics for detection of thermal denaturation of DBD derivative and carbonic anhydrase A DBD derivative was added to carbonic anhydrase II and heated in the presence or absence of brinzolamide, which is an inhibitor of carbonic anhydrase II.
  • Example 6 shows the synthesis method for novel compounds among the DBD derivatives used in the experiment. The change in fluorescence intensity due to heating was measured, and the S/N, Tm, and ⁇ Tm of each DBD derivative were determined in the same manner as in Example 7 (Fig. 7).
  • Example 9 Fluorescent imaging of intracellular denatured proteins HEK293T cells were seeded (8 x 10 4 cells/mL, 2 mL) on a glass-based dish (IWAKI 3910-035) coated with a poly-L-lysine solution (Sigma-Aldrich P4707), and after overnight culture, 1 ⁇ L of a 10 mM ONBD compound in DMSO solution was added (final concentration 5 ⁇ M). After 30 minutes of treatment in a CO 2 incubator at 37° C., images were obtained by observation with a confocal laser fluorescence microscope (ZEISS LSM900, Ex 488 nm/Em 400-550 nm). FIG. 8 shows images when using iPr-ONBD, 3-Pen-ONBD, Octyl-ONBD, or DEG-ONBD as the ONBD compound.
  • ZEISS LSM900 confocal laser fluorescence microscope
  • HEK293T cells Fluorescence imaging under proteasome inhibitor treatment conditions (ONBD compound simultaneous treatment) HEK293T cells were seeded (1 x 10 5 cells/mL, 2 mL) on a glass base dish (IWAKI 3910-035) coated with a poly-L-lysine solution (Sigma-Aldrich P4707), and after overnight culture, 2 ⁇ L of 5 mM MG-132 in DMSO (final concentration 5 ⁇ M) and 1 ⁇ L of 2 mM OctylNBD compound in DMSO (final concentration 1 ⁇ M).
  • Example 11 Fluorescence imaging under proteasome inhibitor treatment conditions (post-treatment with ONBD compound) ⁇ -L- ⁇ (Sigma-Aldrich P4707) ⁇ (IWAKI 3910-035) ⁇ HEK293T ⁇ (1 x 10 5 cells/mL, 2mL) ⁇ 1 ⁇ 5 mM ⁇ MG-132( ⁇ ) ⁇ DMSO ⁇ 2 ⁇ L( ⁇ 5 ⁇ M) ⁇ CO 2 ⁇ 12 ⁇ 2 mM ⁇ OctylNBD ⁇ DMSO ⁇ 1 ⁇ L ⁇ 30 ⁇ ( ⁇ 1 ⁇ M) ⁇ (ZEISS LSM900 ⁇ Ex 488nm/ Em 400-550 nm) ⁇ ( ⁇ 10) ⁇
  • Amyloid ⁇ 1-40 (Trifluoroacetate Form, 4307-v, Peptide Institute) was diluted with a buffer (150 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7.4) to a final concentration of 100 ⁇ M, and a 10 mM DMSO solution of the probe compound or Thioflavin T was used to adjust the final concentration of the fluorescent compound to 100 ⁇ M. .
  • FIG. 11 shows changes in fluorescence intensity over time when Thioflavin T is used and when octyl ONBD, iPr ONBD, or BrNBD is used as a probe compound.
  • Example 13 Preparation of mass spectrometry sample for labeling site detection
  • Bovine carbonic anhydrase (Aldrich, C3934) was diluted in 10 mM PBS to a final concentration of 10 ⁇ M.
  • TCI brinzolamide
  • the same amount of DMSO was added and the same operation was performed.
  • a 100 mM ONBD compound stock solution (DMSO solution) was added to a final concentration of 1 mM, gently vortexed, and then 50 ⁇ L of the solution was transferred to a PCR tube.
  • the PCR tubes were heated at each temperature for 5 minutes using a thermal cycler (Applied biosystems, Mini Amp Plus) as a precision heating device.
  • 5 x SDS-PAGE sample buffer was added to the reaction solution (final conc. 50 mM Tris-HCl pH 6.8, 125 mM 2-mercaptoethanol, 2% sodium dodecyl sulfate (SDS), 0.025% bromophenol blue, 10% glycerol) and heated at 95°C for 5 minutes. After that, SDS-PAGE was performed using 4-20% acrylamide gel (Biorad). After detecting the fluorescence of the resulting gel with a fluorescence imager (Vilver Lourmat, Fusion Solo S), proteins contained in the gel were stained with CBB.
  • a fluorescence imager Vilver Lourmat, Fusion Solo S
  • the band corresponding to the protein of interest was isolated and the excised band was cut (approximately 1 mm pieces).
  • the gel piece was transferred to a microtube, 1 mL of water was added, incubated at 37°C for 10 minutes, and then the solution was removed. This washing operation was repeated three times.
  • a 50% acetonitrile/100 mM Tris buffer (pH 8.0) solution was added, incubated at 37°C for 10 minutes, and then the solution was removed. Acetonitrile was added to the dehydration tube and incubated at 37°C for 10 minutes. After removing the solution, trypsin solution was added to each tube and incubated overnight at 37°C.
  • the resulting solution was quenched with an aqueous trifluoroacetic acid (TFA) solution (final concentration 0.1% v/v) and desalted using a C18 pipette tip (Nikkyo Technos, NTCR-KT200-C18-2). After desalting, the solvent was removed with a centrifugal evaporator (Tokyo Rikakiki).
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the fluorescence intensity of each tryptic fragment was measured to visualize the degree of denaturation around the Lys residue in Bovine carbonic anhydrase.
  • the fluorescence intensity when heated in the presence of brinzolamide and the fluorescence intensity when heated in the absence of brinzolamide were compared to investigate the effect of brinzolamide on the degree of denaturation around each Lys residue (FIG. 12).
  • the brinzolamide made the denaturation difficult as a whole, but there were cases where the denaturation became easy depending on the site.
  • Example 14 Purification of modified fragment using anti-NBD antibody and preparation of sample for mass spectrometric measurement A band corresponding to the labeled bovine carbonic anhydrase was separated by SDS-PAGE, and the excised band was cleaved (about 1 mm piece). The gel piece was transferred to a microtube, 1 mL of water was added, and the mixture was allowed to stand at 37°C for 10 minutes. The solution was removed and the washing operation was repeated 3 times. For destaining, 50% acetonitrile in 100 mM Tris buffer (pH 8.0) was added, allowed to stand at 37°C for 10 minutes, and then the solution was removed.
  • Tris buffer pH 8.0
  • Acetonitrile was added to the dehydration tube, and the tube was allowed to stand at 37°C for 10 minutes. After removing the solution, trypsin solution was added to each tube and allowed to stand overnight at 37°C. A 10% trifluoroacetic acid (TFA) aqueous solution (final concentration 0.4%) was added to quench the reaction. 50% acetonitrile/0.1% TFA was added and allowed to stand at 37°C for 10 minutes. After lightly stirring, the mixture was centrifuged, the extract was recovered, 80% acetonitrile/0.1% TFA was added, and the mixture was allowed to stand at 37°C for 2 minutes. The mixture was lightly stirred and centrifuged to recover the extract.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • the collected extracts were collectively concentrated using a concentration centrifuge.
  • Protein G Dynabeads (Invitrogen, 10003D) were added to the sample from which the organic solvent had been removed, the sample was set on a magnetic bead recovery stand, and the supernatant was removed. After washing with Pi-Na buffer (20 mM phosphate buffer (pH 6.8-70), 150 mM NaCl), adding TG buffer (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.01% Decyl ⁇ -D-glucopyranoside (TCI, D5680)), anti-NBD antibody (Bio-Rad, 0100-0023) was added and mixed by inversion at 4°C. .
  • the supernatant was removed, and after washing with Pi-Na buffer, TG buffer was added, and the mixture was mixed by inversion on a rotator overnight at 4°C.
  • the supernatant was collected from the sample tube, washed three times with TG buffer, washed three times with 0.01% DG buffer (10-fold dilution of 0.1% Decyl ⁇ -Dglucopyranoside), added with 0.15% TFA, and mixed by inversion on a rotator for 10 minutes.
  • the sample was concentrated in a concentration centrifuge and desalted using a spin-down C18 tip (Nikkyo Technos, NTCR-KT200-C18-2). After desalting, the solvent was removed by centrifugation. Samples were redissolved in 5% acetonitrile/0.1% TFA and prepared as LC-MS/MS samples.
  • Mass spectrometry was performed as follows. Using LC-nano-ESI-MS consisting of a quadrupole time-of-flight mass spectrometer (Triple TOF (registered trademark) 5600 system; SCIEX) equipped with a nanospray ion source and a nanoLC system (Eksigent Nano LC Ultra 1D Plus; SCIEX, Massachusetts, USA), peptide fragments were quantitatively analyzed and proteins were identified.
  • the trap column used for nanoLC was NanoLC Trap ChromXP C18, 3 ⁇ m 120 ⁇ (SCIEX), and the separation column used was a 12.5 cm ⁇ 75 ⁇ m capillary column packed with 3 ⁇ m C18-silica particles (Nikkyo Technos).
  • Mass spectrometry was performed while separating peptides with the following mobile phases by a micropump (flow rate of 300 nL/min) gradient method.
  • nanoLC-MS/MS data were acquired in information-dependent acquisition mode controlled by Analyst® TF 1.5.1 software (SCIEX). The integration time was 0.25 s, the full MS (MS1, TOF-MS) scan range was 400-1250 m/z, no repeat measurement of the previous target ion was allowed for 12 s, the mass tolerance was 50 mDa, and the top 10 signals were selected for the MS2 scan for each full MS scan.
  • the MS2 (product ion) scan accumulation time and range were 0.05 s and 100-1500 m/z, respectively. All experiments were repeated three times. MS/MS spectra were searched using the analysis software MaxQuant, targeting the known amino acid sequences of each protein, or the entire human protein structure obtained from uniprot. Regarding the modified peptide fragments of the probe molecule, NBD modification (+C 6 HN 3 O 3 , 163.0018 Da) to the lysine residue was considered, and the modified peptide fragments were quantitatively compared.
  • FIG. 13 shows the results of mass spectrometry before and after enrichment with the anti-NBD antibody.
  • Example 15 Visualization of denaturation state of CA by two-dimensional electrophoresis and effect of presence or absence of ligand (BrNDB) Using BrNDB as a probe, two-dimensional electrophoresis of bovine carbonic anhydrase (CA) was performed in the presence or absence of brinzolamide in the same manner as in Example 4 (Fig. 14). As shown in FIG. 14, the fluorescence intensity of CA decreased in the presence of brinzolamide, and it was possible to visualize the acquisition of heat resistance by the addition of brinzolamide.
  • Example 16 Visualization of denaturation state of CA by two-dimensional electrophoresis and effect of presence or absence of ligand (comparison of iPrONBD and BrNBD) Using iPrONBD or BrNDB as a probe, two-dimensional electrophoresis was performed in the same manner as in Example 15, and the results were compared (Fig. 15). As shown in FIG. 15, the decrease in fluorescence intensity of CA was more pronounced when BrNDB was used. Different probes are suitable depending on the denaturation temperature. Under these denaturing conditions (65°C, 5 min), Br-NBD is a suitable probe.
  • Example 17 Effect of addition of geldanamycin on HSP90 precipitation and fluorescence detection using denatured HSP90 probe
  • HeLa cells were scraped off with a scraper, washed with ice-cold PBS three times, protease inhibitor cocktail (Nacalai, 25955-24) was resuspended in ice-cold M-PER buffer (Thermo Fisher Scientific, 78503), and allowed to stand on ice for 10 minutes. The supernatant was separated from the cell lysate by centrifugation at 20,000 xg for 20 minutes at 4°C. Protein concentration was determined using the BCA method.
  • Equal amounts of geldanamycin (TCI, G0334; final concentration 50 ⁇ M) and DMSO were added to the supernatant (2 mg/ml), treated at room temperature for 10 minutes, and then added with 10 ⁇ concentration CaCl 2 buffer (0.5 M Tris, 0.5 M NaCl, 0.2 M CaCl 2 , pH 8.0) and allowed to stand at room temperature for 5 minutes.
  • 10 ⁇ concentration CaCl 2 buffer 0.5 M Tris, 0.5 M NaCl, 0.2 M CaCl 2 , pH 8.0
  • a 100 mM ONBD stock solution (DMSO solution) was added to the sample to a final concentration of 1 mM, allowed to stand at 37°C for 30 minutes, and then transferred to a PCR tube.
  • the PCR tube was heated at each temperature for 5 minutes using a thermal cycler (MiniAmp Plus) and then allowed to stand at room temperature.
  • Fig. 16 shows the results of SDS-PAGE when iPrONBD was used as ONBD and the relative fluorescence intensity at each heating temperature. Even when the intracellular HSP90 was targeted, it was possible to visualize the acquisition of heat denaturation resistance of the target by the addition of the ligand.
  • Example 18 Comparison of each probe in fluorescence detection by geldanamycin-modified HSP90 probe Using various probes, SDS-PAGE was performed in the same manner as in Example 17 under heating conditions of 45°C for 5 minutes (Fig. 17). The probe on the right is suitable for detecting proteins at higher temperatures, but it is not suitable for detecting proteins that denature at low temperatures (around 45°C), such as HSP90.
  • Example 19 Reaction of probe molecule in intracellular environment (comparison of denatured HSP90 by addition of Geldanamycin) HeLa cells were scraped off with a scraper, washed three times with ice-cold PBS, protease inhibitor cocktail (Nakarai, 25955-24) resuspended in ice-cold M-PER buffer (Thermo Fisher Scientific, 78503), and left standing on ice for 10 minutes. The supernatant was separated from the cell lysate by centrifugation at 20,000 xg for 20 minutes at 4°C. Protein concentration was determined using the BCA method.
  • Equal amounts of geldanamycin (TCI, G0334; final concentration 50 ⁇ M) and DMSO were added to the supernatant (2 mg/ml), treated at room temperature for 10 minutes, and then added with 10 ⁇ concentration CaCl 2 buffer (0.5 M Tris, 0.5 M NaCl, 0.2 M CaCl 2 , pH 8.0) and allowed to stand at room temperature for 5 minutes.
  • 10 ⁇ concentration CaCl 2 buffer 0.5 M Tris, 0.5 M NaCl, 0.2 M CaCl 2 , pH 8.0
  • a 100 mM iPrONBD stock solution (DMSO solution) was added to the sample to a final concentration of 1 mM, allowed to stand at 37°C for 30 minutes, and then transferred to a PCR tube.
  • the PCR tube was heated at 45° C. for 5 minutes using a thermal cycler (MiniAmp Plus) and then allowed to stand at room temperature.
  • Example 20 Protein identification from spots of two-dimensional electrophoresis Two-dimensional electrophoresis was performed according to the long-term protocol of Auto 2D plus (Merck), and the resulting gel was subjected to a fluorescence image using a fluorescence imager (Vilver Lourmat, Fusion Solo S). Thereafter, all proteins contained in the gel were stained with CBB staining (Nacalai, CBB Stain One super, 11642-44) according to the manufacturer's protocol, and images were taken in the same manner. A target spot to be identified was cut out, the gel piece was transferred to a microtube, 1 mL of water was added, and the mixture was allowed to stand at 37°C for 10 minutes. The solution was removed and the washing operation was repeated 3 times.
  • CBB staining Nacalai, CBB Stain One super, 11642-44
  • the present invention can be used in industrial fields related to denatured proteins and aggregated proteins.

Abstract

タンパク質混在系においても適用でき、変性又は凝集タンパク質を高感度に検出する手段として、タンパク質の変性状態又は凝集状態を可視化する方法であって、タンパク質をニトロベンゾオキサジアゾール誘導体と接触させる工程、及びニトロベンゾオキサジアゾール誘導体とタンパク質との反応物の蛍光を検出する工程を含むことを特徴とする方法を提供する。

Description

タンパク質の変性状態又は凝集状態を可視化する方法
　本発明は、タンパク質の変性状態又は凝集状態を可視化する方法、タンパク質の変性状態又は凝集状態の可視化剤、試料中の変性タンパク質又は凝集タンパク質を特定する方法、及び試験化合物と結合するタンパク質を同定する方法に関する。
　タンパク質は加熱や特定の条件によって、変性状態やアミロイド線維などの凝集状態に変化することが知られている。前者はタンパク質の基礎研究に重要な現象であり、後者は神経変性疾患に深く関与する。よって、タンパク質の変性状態・凝集状態を可視化する手法の開発は学術的・産業的にインパクトの大きなものとなる。
　従来の手法は、熱変性過程で本来はタンパク質の内部に埋もれている疎水性構造がタンパク質表面に露出した構造（変性構造）やベータシートなどの凝集構造を可視化する低分子性の化学ブローブが汎用されている（非特許文献１）。従来の蛍光性化学プローブは総じて、非共有結合で変性・凝集構造に相互作用し、蛍光性が向上するという特徴を有している。
Valtonen, Salla, Emmiliisa Vuorinen, Ville Eskonen, Morteza Malakoutikhah, Kari Kopra, and Harri Harma. 2021. "Sensitive, Homogeneous, and Label-Free Protein-Probe Assay for Antibody Aggregation and Thermal Stability Studies." MAbs 13 (1): 1955810.
　従来の蛍光プローブをタンパク質混在系に適用した場合、どのタンパク質の変性・凝集に応答して蛍光が向上したかを観測することが困難であるため、適用は主に精製されたタンパク質に対する変性・凝集の観測に使用されている。また、より高感度に高いS/N比を与える蛍光性化学プローブの開発が望まれている。
　本発明は、このような背景の下になされたものであり、タンパク質混在系においても適用でき、変性又は凝集タンパク質を高感度に検出する手段を提供することを目的とする。
　本発明者は、上記課題を解決するため、鋭意検討を重ねた結果、ニトロベンゾオキサジアゾール（NBD）が、変性や凝集したタンパク質と選択的に結合し、蛍光を発するようになることを見出し、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は、以下の〔１〕～〔１７〕を提供する。
〔１〕タンパク質の変性状態又は凝集状態を可視化する方法であって、タンパク質を下記の一般式(I)
〔式中、R1は、炭素数1～12の直鎖アルキル基（但し、アルキル基中の1以上の-CH2-CH2-は-CO-NH-に置換されていてもよい。）、炭素数3～10の分岐鎖アルキル基（但し、アルキル基中の互いに隣接しない1以上の炭素原子は窒素原子又は酸素原子に置換されていてもよい。）、置換基で置換されていてもよい炭素数3～10のシクロアルキル基（但し、シクロアルキル基中の互いに隣接しない1以上の炭素原子は窒素原子又は酸素原子に置換されていてもよい。）、置換基で置換されていてもよいアリール基、置換基で置換されていてもよいヘテロアリール基、-(CH2-CH2-O-)n-CH3で表される基（nは1～4の整数を表す。）、アダマンチル基、又はハロゲン原子を表し、R2及びR3は、それぞれ独立して、水素原子、又は炭素数1～3の直鎖若しくは分岐鎖アルキル基を表し、X1は、ニトロ基、又は-SO2NR4R5で表される基（ここで、R4及びR5は、それぞれ独立して、炭素数1～3の直鎖若しくは分岐鎖アルキル基を表す。）を表し、X2は、下記の式(i)～(v)
（式中、*は結合手を示し、一般式(I)中の窒素原子に結合する。）
のいずれかで表される基を表し、X3は、存在しないか、又は酸素原子若しくは硫黄原子を表す。〕
で表される化合物と接触させる工程、及び一般式(I)で表される化合物の反応物の蛍光を検出する工程を含むことを特徴とする方法。
〔２〕一般式(I)におけるR1が、炭素数4～12の直鎖アルキル基（但し、アルキル基中の1以上の-CH2-CH2-は-CO-NH-に置換されていてもよい。）、炭素数3～5の分岐鎖アルキル基（但し、アルキル基中の互いに隣接しない1以上の炭素原子は窒素原子又は酸素原子に置換されていてもよい。）、置換基で置換されていてもよい炭素数4～6のシクロアルキル基（但し、シクロアルキル基中の互いに隣接しない1以上の炭素原子は窒素原子又は酸素原子に置換されていてもよい。）、置換基で置換されていてもよいフェニル基、置換基で置換されていてもよい2-チエニル基、置換基で置換されていてもよい3-チエニル基、置換基で置換されていてもよい2-フラニル基、置換基で置換されていてもよい3-フラニル基、置換基で置換されていてもよい2-ピリジル基、置換基で置換されていてもよい3-ピリジル基、置換基で置換されていてもよい4-ピリジル基、又は-(CH2-CH2-O-)n-CH3で表される基（nは2又は3を表す。）であることを特徴とする〔１〕に記載の方法。
〔３〕一般式(I)におけるR1が、n-ブチル基、n-オクチル基、iso-プロピル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、3-ペンチル基、1-メチル-2-メチルアミノ-エチル基、シクロアルキル基、3-アゼチジル基、3-ピペリジニル基、3-アミノメチルシクロブチル基、3-アミノシクロペンチル基、4-アミノシクロヘキシル基、フェニル基、2-チエニル基、3-チエニル基、2-フラニル基、3-フラニル基、2-ピリジル基、3-ピリジル基、4-ピリジル基、又は-(CH2-CH2-O-)2-CH3で表される基であることを特徴とする〔１〕に記載の方法。
〔４〕一般式(I)におけるR1が、n-ブチル基、n-オクチル基、iso-プロピル基、3-ペンチル基、又は-(CH2-CH2-O-)2-CH3で表される基であることを特徴とする〔１〕に記載の方法。
〔５〕タンパク質の変性状態又は凝集状態の可視化剤であって、下記の一般式(I)
〔式中、R1は、炭素数1～12直鎖アルキル基（但し、アルキル基中の1以上の-CH2-CH2-は-CO-NH-に置換されていてもよい。）、炭素数3～10の分岐鎖アルキル基（但し、アルキル基中の互いに隣接しない1以上の炭素原子は窒素原子又は酸素原子に置換されていてもよい。）、置換基で置換されていてもよい炭素数3～10のシクロアルキル基（但し、シクロアルキル基中の互いに隣接しない1以上の炭素原子は窒素原子又は酸素原子に置換されていてもよい。）、置換基で置換されていてもよいアリール基、置換基で置換されていてもよいヘテロアリール基、-(CH2-CH2-O-)n-CH3で表される基（nは1～4の整数を表す。）、アダマンチル基、又はハロゲン原子を表し、R2及びR3は、それぞれ独立して、水素原子、又は炭素数1～3の直鎖若しくは分岐鎖アルキル基を表し、X1は、ニトロ基、又は-SO2NR4R5で表される基（ここで、R4及びR5は、それぞれ独立して、炭素数1～3の直鎖若しくは分岐鎖アルキル基を表す。）を表し、X2は、下記の式(i)～(v)
（式中、*は結合手を示し、一般式(I)中の窒素原子に結合する。）
のいずれかで表される基を表し、X3は、存在しないか、又は酸素原子若しくは硫黄原子を表す。〕
で表される化合物を含むことを特徴とする可視化剤。
〔６〕一般式(I)におけるR1が、炭素数4～12の直鎖アルキル基（但し、アルキル基中の1以上の-CH2-CH2-は-CO-NH-に置換されていてもよい。）、炭素数3～5の分岐鎖アルキル基（但し、アルキル基中の互いに隣接しない1以上の炭素原子は窒素原子又は酸素原子に置換されていてもよい。）、置換基で置換されていてもよい炭素数4～6のシクロアルキル基（但し、シクロアルキル基中の互いに隣接しない1以上の炭素原子は窒素原子又は酸素原子に置換されていてもよい。）、置換基で置換されていてもよいフェニル基、置換基で置換されていてもよい2-チエニル基、置換基で置換されていてもよい3-チエニル基、置換基で置換されていてもよい2-フラニル基、置換基で置換されていてもよい3-フラニル基、置換基で置換されていてもよい2-ピリジル基、置換基で置換されていてもよい3-ピリジル基、置換基で置換されていてもよい4-ピリジル基、又は-(CH2-CH2-O-)n-CH3で表される基（nは2又は3を表す。）であることを特徴とする〔５〕に記載の可視化剤。
〔７〕一般式(I)におけるR1が、n-ブチル基、n-オクチル基、iso-プロピル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、3-ペンチル基、1-メチル-2-メチルアミノ-エチル基、シクロアルキル基、3-アゼチジル基、3-ピペリジニル基、3-アミノメチルシクロブチル基、3-アミノシクロペンチル基、4-アミノシクロヘキシル基、フェニル基、2-チエニル基、3-チエニル基、2-フラニル基、3-フラニル基、2-ピリジル基、3-ピリジル基、4-ピリジル基、又は-(CH2-CH2-O-)2-CH3で表される基であることを特徴とする〔５〕に記載の可視化剤。
〔８〕一般式(I)におけるR1が、n-ブチル基、n-オクチル基、iso-プロピル基、3-ペンチル基、又は-(CH2-CH2-O-)2-CH3で表される基であることを特徴とする〔５〕に記載の可視化剤。
〔９〕試料中の変性タンパク質又は凝集タンパク質を特定する方法であって、試料を下記の一般式(I)
〔式中、R1は、炭素数1～12の直鎖アルキル基（但し、アルキル基中の1以上の-CH2-CH2-は-CO-NH-に置換されていてもよい。）、炭素数3～10の分岐鎖アルキル基（但し、アルキル基中の互いに隣接しない1以上の炭素原子は窒素原子又は酸素原子に置換されていてもよい。）、置換基で置換されていてもよい炭素数3～10のシクロアルキル基（但し、シクロアルキル基中の互いに隣接しない1以上の炭素原子は窒素原子又は酸素原子に置換されていてもよい。）、置換基で置換されていてもよいアリール基、置換基で置換されていてもよいヘテロアリール基、-(CH2-CH2-O-)n-CH3で表される基（nは1～4の整数を表す。）、アダマンチル基、又はハロゲン原子を表し、R2及びR3は、それぞれ独立して、水素原子、又は炭素数1～3の直鎖若しくは分岐鎖アルキル基を表し、X1は、ニトロ基、又は-SO2NR4R5で表される基（ここで、R4及びR5は、それぞれ独立して、炭素数1～3の直鎖若しくは分岐鎖アルキル基を表す。）を表し、X2は、下記の式(i)～(v)
（式中、*は結合手を示し、一般式(I)中の窒素原子に結合する。）
のいずれかで表される基を表し、X3は、存在しないか、又は酸素原子若しくは硫黄原子を表す。〕
で表される化合物と接触させる工程、試料中のタンパク質を分離する工程、及び一般式(I)で表される化合物の反応物の蛍光を検出する工程を含むことを特徴とする方法。
〔１０〕一般式(I)におけるR1が、炭素数4～12の直鎖アルキル基（但し、アルキル基中の1以上の-CH2-CH2-は-CO-NH-に置換されていてもよい。）、炭素数3～5の分岐鎖アルキル基（但し、アルキル基中の互いに隣接しない1以上の炭素原子は窒素原子又は酸素原子に置換されていてもよい。）、置換基で置換されていてもよい炭素数4～6のシクロアルキル基（但し、シクロアルキル基中の互いに隣接しない1以上の炭素原子は窒素原子又は酸素原子に置換されていてもよい。）、置換基で置換されていてもよいフェニル基、置換基で置換されていてもよい2-チエニル基、置換基で置換されていてもよい3-チエニル基、置換基で置換されていてもよい2-フラニル基、置換基で置換されていてもよい3-フラニル基、置換基で置換されていてもよい2-ピリジル基、置換基で置換されていてもよい3-ピリジル基、置換基で置換されていてもよい4-ピリジル基、又は-(CH2-CH2-O-)n-CH3で表される基（nは2又は3を表す。）であることを特徴とする〔９〕に記載の方法。
〔１１〕一般式(I)におけるR1が、n-ブチル基、n-オクチル基、iso-プロピル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、3-ペンチル基、1-メチル-2-メチルアミノ-エチル基、シクロアルキル基、3-アゼチジル基、3-ピペリジニル基、3-アミノメチルシクロブチル基、3-アミノシクロペンチル基、4-アミノシクロヘキシル基、フェニル基、2-チエニル基、3-チエニル基、2-フラニル基、3-フラニル基、2-ピリジル基、3-ピリジル基、4-ピリジル基、又は-(CH2-CH2-O-)2-CH3で表される基であることを特徴とする〔９〕に記載の方法。
〔１２〕一般式(I)におけるR1が、n-ブチル基、n-オクチル基、iso-プロピル基、3-ペンチル基、又は-(CH2-CH2-O-)2-CH3で表される基であることを特徴とする〔９〕に記載の方法。
〔１３〕試験化合物と結合するタンパク質を同定する方法であって、以下の工程：
（１）タンパク質を含む試料に、試験化合物と蛍光物質を添加する工程、
（２）工程（１）の試料を加熱する工程、
（３）工程（２）の試料中に含まれるタンパク質を分離する工程、
（４）工程（３）によって分離された各タンパク質の蛍光強度を測定する工程、
（５）タンパク質を含む試料に、蛍光物質を添加する工程、
（６）工程（５）の試料を加熱する工程、
（７）工程（６）の試料中に含まれるタンパク質を分離する工程、
（８）工程（７）によって分離された各タンパク質の蛍光強度を測定する工程、
（９）工程（４）で測定された各タンパク質の蛍光強度と工程（８）で測定された各タンパク質の蛍光強度を比較し、工程（４）で測定された蛍光強度が、工程（８）で測定された蛍光強度よりも低いタンパク質を、試験化合物と結合するタンパク質と同定する工程
を含み、蛍光物質が、下記の一般式(I)
〔式中、R1は、炭素数1～12の直鎖アルキル基（但し、アルキル基中の1以上の-CH2-CH2-は-CO-NH-に置換されていてもよい。）、炭素数3～10の分岐鎖アルキル基（但し、アルキル基中の互いに隣接しない1以上の炭素原子は窒素原子又は酸素原子に置換されていてもよい。）、置換基で置換されていてもよい炭素数3～10のシクロアルキル基（但し、シクロアルキル基中の互いに隣接しない1以上の炭素原子は窒素原子又は酸素原子に置換されていてもよい。）、置換基で置換されていてもよいアリール基、置換基で置換されていてもよいヘテロアリール基、-(CH2-CH2-O-)n-CH3で表される基（nは1～4の整数を表す。）、アダマンチル基、又はハロゲン原子を表し、R2及びR3は、それぞれ独立して、水素原子、又は炭素数1～3の直鎖若しくは分岐鎖アルキル基を表し、X1は、ニトロ基、又は-SO2NR4R5で表される基（ここで、R4及びR5は、それぞれ独立して、炭素数1～3の直鎖若しくは分岐鎖アルキル基を表す。）を表し、X2は、下記の式(i)～(v)
（式中、*は結合手を示し、一般式(I)中の窒素原子に結合する。）
のいずれかで表される基を表し、X3は、存在しないか、又は酸素原子若しくは硫黄原子を表す。〕
で表される化合物であることを特徴とする方法。
〔１４〕一般式(I)におけるR1が、炭素数4～12の直鎖アルキル基（但し、アルキル基中の1以上の-CH2-CH2-は-CO-NH-に置換されていてもよい。）、炭素数3～5の分岐鎖アルキル基（但し、アルキル基中の互いに隣接しない1以上の炭素原子は窒素原子又は酸素原子に置換されていてもよい。）、置換基で置換されていてもよい炭素数4～6のシクロアルキル基（但し、シクロアルキル基中の互いに隣接しない1以上の炭素原子は窒素原子又は酸素原子に置換されていてもよい。）、置換基で置換されていてもよいフェニル基、置換基で置換されていてもよい2-チエニル基、置換基で置換されていてもよい3-チエニル基、置換基で置換されていてもよい2-フラニル基、置換基で置換されていてもよい3-フラニル基、置換基で置換されていてもよい2-ピリジル基、置換基で置換されていてもよい3-ピリジル基、置換基で置換されていてもよい4-ピリジル基、又は-(CH2-CH2-O-)n-CH3で表される基（nは2又は3を表す。）であることを特徴とする〔１３〕に記載の方法。
〔１５〕一般式(I)におけるR1が、n-ブチル基、n-オクチル基、iso-プロピル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、3-ペンチル基、1-メチル-2-メチルアミノ-エチル基、シクロアルキル基、3-アゼチジル基、3-ピペリジニル基、3-アミノメチルシクロブチル基、3-アミノシクロペンチル基、4-アミノシクロヘキシル基、フェニル基、2-チエニル基、3-チエニル基、2-フラニル基、3-フラニル基、2-ピリジル基、3-ピリジル基、4-ピリジル基、又は-(CH2-CH2-O-)2-CH3で表される基であることを特徴とする〔１３〕に記載の方法。
〔１６〕一般式(I)におけるR1が、n-ブチル基、n-オクチル基、iso-プロピル基、3-ペンチル基、又は-(CH2-CH2-O-)2-CH3で表される基であることを特徴とする〔１３〕に記載の方法。
〔１７〕下記の一般式(Ia)、(Ib)、又は(Ic)
〔式中、R1aは、iso-プロピル基、n-ブチル基、3-ペンチル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、2-アダマンチル基、n-ヘキシル基、n-オクチル基、n-デシル基、n-ドデシル基、iso-ブチル基、5-ノニル基、又はジエチレングリコール基を表し、R1bは、臭素原子、又はヨウ素原子を表し、R1cは、メチル基、又はiso-プロピル基を表す。〕
で表される化合物。
　本明細書は、本願の優先権の基礎である日本国特許出願、特願2022-005871の明細書及び／又は図面に記載される内容を包含する。
　本発明は、タンパク質の変性状態又は凝集状態を可視化する新規な方法を提供する。この方法は、従来の蛍光性化学ブローブを使用する方法よりも、高感度にタンパク質の変性状態又は凝集状態を可視化することができる。また、従来の方法とは異なり、蛍光ブローブが変性又は凝集タンパク質と共有結合し、変性又は凝集の履歴として残るので、タンパク質混在系での使用、ブロテオミクス解析への適用が可能である。
加熱に応答した蛍光特性の向上の評価結果を示す図。 Amyloid β1－40の凝集状態の定量結果を示す図。 α-synucleinの凝集状態の定量結果を示す図。 熱変性タンパク質の2次元電気泳動による検出結果を示す図（全タンパク質を回収するプロトコル）。上段はN-NBDによる蛍光画像、中段は銀染色画像、下段は上段の蛍光画像の拡大像をそれぞれ示す。 熱変性タンパク質の2次元電気泳動による検出結果を示す図（ペレットを回収するプロトコル）。上段はN-NBDによる蛍光画像、中段はOriole染色画像、下段は上段の蛍光画像の拡大像をそれぞれ示す。 NBD誘導体とcarbonic anhydraseの熱変性検出に対するプローブ特性を示す図。 DBD誘導体とcarbonic anhydraseの熱変性検出に対するプローブ特性を示す図。 細胞内でのプローブの反応性を示す図。 プロテアソーム阻害剤共存条件の細胞内でのOctyl-ONBDによる変性タンパク質の染色の結果を示す図。 プロテアソーム阻害剤非添加、添加条件の細胞内でのOctyl-ONBDによる変性タンパク質の染色の結果を示す図。 Amyloidβ1-40凝集状態の定量結果を示す図。 carbonic anhydrase (CA)のプローブ反応部位の特定と定量結果を示す図。 carbonic anhydrase (CA)のプローブ反応部位の特定と定量結果を示す図。 carbonic anhydrase (CA)のプローブ反応部位の特定と定量結果を示す図。 carbonic anhydrase (CA)のプローブ反応部位の特定と定量結果を示す図。 抗NBD抗体による標識ペプチド断片の濃縮と質量分析による検出結果を示す図。 二次元電気泳動によるCAの変性状態の可視化とリガンドの有無による影響を示す図（BrNDBを用いた場合）。 二次元電気泳動によるCAの変性状態の可視化とリガンドの有無による影響を示す図（iPrONBDとBrNBDの比較）。 Geldanamycinの添加によるHSP90沈殿への影響と変性HSP90のプローブによる蛍光検出の結果を示す図。 Geldanamycinの添加による変性HSP90のプローブによる蛍光検出における各プローブの比較を示す図。 細胞内環境でのプロープ分子の反応を示す図（Geldanamycinの添加による変性HSP90の比較）。 変性度検出後の二次元電気泳動ゲルからのスポット切り出しと質量分析による同定の結果を示す図。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明において「炭素数1～12の直鎖アルキル基」とは、例えば、メチル基、エチル基、n-プロピル基、n-ブチル基、n-ペンチル基、n-ヘキシル基、n-ヘプチル基、n-オクチル基、n-ノニル基、n-デシル基、n-ウンデシル基、n-ドデシル基である。
　本発明において「炭素数4～12の直鎖アルキル基」とは、例えば、n-ブチル基、n-ペンチル基、n-ヘキシル基、n-ヘプチル基、n-オクチル基、n-ノニル基、n-デシル基、n-ウンデシル基、n-ドデシル基である。
　本発明において「炭素数3～10の分岐鎖アルキル基」とは、例えば、iso-プロピル基、iso-ブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、iso-ペンチル基、sec-ペンチル基、tert-ペンチル基、3-ペンチル基、ネオペンチル基、iso-ヘキシル基、sec-ヘキシル基、tert-ヘキシル基、ネオヘキシル基、iso-ヘプチル基、sec-ヘプチル基、tert-ヘプチル基、ネオヘプチル基、iso-オクチル基、sec-オクチル基、tert-オクチル基、ネオオクチル基、iso-ノニル基、sec-ノニル基、tert-ノニル基、ネオノニル基、iso-デシル基、sec-デシル基、tert-デシル基、ネオデシル基である。
　本発明において「炭素数3～5の分岐鎖アルキル基」とは、例えば、iso-プロピル基、iso-ブチル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、iso-ペンチル基、sec-ペンチル基、tert-ペンチル基、3-ペンチル基、ネオペンチル基である。
　本発明において「炭素数3～10のシクロアルキル基」とは、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、シクロノニル基、シクロデシル基である。
　本発明において「炭素数4～6のシクロアルキル基」とは、例えば、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基である。
　本発明において「アリール基」とは、例えば、フェニル基、1-ナフチル基、2-ナフチル基である。
　本発明において「ヘテロアリール基」とは、例えば、2-チエニル基、3-チエニル基、2-フラニル基、3-フラニル基、2-ピリジル基、3-ピリジル基、4-ピリジル基である。
（１）可視化方法及び可視化剤
　本発明のタンパク質の変性状態又は凝集状態を可視化する方法は、タンパク質を下記の一般式(I)で表される化合物と接触させる工程、及び下記の一般式(I)で表される化合物の反応物の蛍光を検出する工程を含むことを特徴とするものであり、本発明のタンパク質の変性状態又は凝集状態の可視化剤は、下記の一般式(I)で表される化合物を含むことを特徴とするものである。
　最初に、本発明のタンパク質の変性状態又は凝集状態を可視化する方法の原理を説明する。一般式(I)で表される化合物は、通常の状態では蛍光を発しないが、タンパク質と近接すると、タンパク質中のリジン残基のアミノ基と反応し（X3が結合する芳香環上の炭素原子とリジン残基のアミノ基の窒素原子が共有結合する）、蛍光を発するようになる（Yamaguchi, T. et al., Chem. Sci. 5, 1021-1029 (2014) ）。一般式(I)で表される化合物は疎水性であるのに対し、変性や凝集していないタンパク質の表面は親水性なので、一般式(I)で表される化合物は、変性や凝集していないタンパク質にはほとんど結合しない。一方、タンパク質が変性や凝集することにより、タンパク質表面に疎水性の構造が生じるので、この構造に一般式(I)で表される化合物は結合し、蛍光を発する。従って、この一般式(I)で表される化合物の反応物の発する蛍光により、タンパク質の変性状態や凝集状態を可視化できる。
　一般式(I)においてR1は、直鎖アルキル基を表してもよい。直鎖アルキル基は、通常、炭素数１～12の直鎖アルキル基であり、好ましくは、炭素数4～12の直鎖アルキル基であり、より好ましくは、n-ブチル基又はn-オクチル基であり、更に好ましくは、n-オクチル基である。直鎖アルキル基が、-CH2-CH2-を含む場合（即ち、炭素数が2以上、好ましくは、炭素数が3以上）、-CH2-CH2-は-CO-NH-に置換されていてもよい。この置換は、直鎖アルキル基中に１つだけでもよく、2つでもよく、3つでもよい。
　一般式(I)においてR1は、分岐鎖アルキル基を表してもよい。分岐鎖アルキル基は、通常、炭素数3～10の分岐鎖アルキル基であり、好ましくは、炭素数3～5の分岐鎖アルキル基であり、より好ましくは、iso-プロピル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、又は3-ペンチル基であり、更に好ましくは、iso-プロピル基である。分岐鎖アルキル基中の互いに隣接しない1以上の炭素原子は窒素原子又は酸素原子に置換されていてもよい。この置換は、分岐鎖アルキル基中に１つだけでもよく、2つでもよく、3つでもよい。炭素原子が窒素原子又は酸素原子に置換された分岐鎖アルキル基の具体例としては、1-メチル-2-メチルアミノ-エチル基を挙げることができる。
　一般式(I)においてR1は、シクロアルキル基を表してもよい。シクロアルキル基は、通常、炭素数3～10のシクロアルキル基であり、好ましくは、炭素数4～6のシクロアルキル基であり、より好ましくは、シクロヘキシル基である。シクロアルキル基中の互いに隣接しない1以上の炭素原子は窒素原子又は酸素原子に置換されていてもよい。この置換は、シクロアルキル基中に１つだけでもよく、2つでもよく、3つでもよい。炭素原子が窒素原子又は酸素原子に置換されたシクロアルキル基の具体例としては、3-アゼチジル基、3-テトラヒドロフラニル基、3-ピペリジニル基、4－テトラヒドロピラニル基を挙げることができる。シクロアルキル基は、置換基で置換されていてもよい。置換基としては、アミノ基、アミノメチル基を挙げることができる。置換基で置換されたシクロアルキル基の具体例としては、3-アミノメチルシクロブチル基、3-アミノシクロペンチル基、4-アミノシクロヘキシル基を挙げることができる。
　一般式(I)においてR1は、アリール基を表してもよい。アリール基は、好ましくは、フェニル基である。アリール基は、置換基で置換されていてもよい。置換基としては、アミノ基、アミノメチル基を挙げることができる。
　一般式(I)においてR1は、ヘテロアリール基を表してもよい。ヘテロアリール基は、好ましくは、2-チエニル、3-チエニル、2-フラニル、3-フラニル、2-ピリジル、3-ピリジル、又は4-ピリジルである。ヘテロアリール基は、置換基で置換されていてもよい。置換基としては、アミノ基、アミノメチル基を挙げることができる。
　一般式(I)においてR1は、(CH2-CH2-O-)n-CH3で表される基を表してもよい。ここで、nは、通常、1～4の整数であり、好ましくは、2又は3である。
　一般式(I)においてR1は、アダマンチル基を表してもよい。アダマンチル基は、1-アダマンチル基、2-アダマンチル基のいずれでもよいが、2-アダマンチル基が好ましい。
　一般式(I)においてR1は、ハロゲン原子を表してもよい。ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、アスタチン原子を挙げることができる。これらの中でも、臭素原子、ヨウ素原子が好ましい。
　一般式(I)においてR1は、炭素数1～12の直鎖アルキル基（但し、アルキル基中の1以上の-CH2-CH2-は-CO-NH-に置換されていてもよい。）、炭素数3～10の分岐鎖アルキル基（但し、アルキル基中の互いに隣接しない1以上の炭素原子は窒素原子又は酸素原子に置換されていてもよい。）、置換基で置換されていてもよい炭素数3～10のシクロアルキル基（但し、シクロアルキル基中の互いに隣接しない1以上の炭素原子は窒素原子又は酸素原子に置換されていてもよい。）、置換基で置換されていてもよいアリール基、置換基で置換されていてもよいヘテロアリール基、-(CH2-CH2-O-)n-CH3で表される基（nは1～4の整数を表す。）、アダマンチル基、又はハロゲン原子であればよいが、好ましくは、炭素数4～12の直鎖アルキル基（但し、アルキル基中の1以上の-CH2-CH2-は-CO-NH-に置換されていてもよい。）、炭素数3～5の分岐鎖アルキル基（但し、アルキル基中の互いに隣接しない1以上の炭素原子は窒素原子又は酸素原子に置換されていてもよい。）、置換基で置換されていてもよい炭素数4～6のシクロアルキル基（但し、シクロアルキル基中の互いに隣接しない1以上の炭素原子は窒素原子又は酸素原子に置換されていてもよい。）、置換基で置換されていてもよいフェニル基、置換基で置換されていてもよい2-チエニル基、置換基で置換されていてもよい3-チエニル基、置換基で置換されていてもよい2-フラニル基、置換基で置換されていてもよい3-フラニル基、置換基で置換されていてもよい2-ピリジル基、置換基で置換されていてもよい3-ピリジル基、置換基で置換されていてもよい4-ピリジル基、又は-(CH2-CH2-O-)n-CH3で表される基（nは2又は3を表す。）であり、より好ましくは、n-ブチル基、n-オクチル基、iso-プロピル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、3-ペンチル基、1-メチル-2-メチルアミノ-エチル基、シクロアルキル基、3-アゼチジル基、3-ピペリジニル基、3-アミノメチルシクロブチル基、3-アミノシクロペンチル基、4-アミノシクロヘキシル基、フェニル基、2-チエニル基、3-チエニル基、2-フラニル基、3-フラニル基、2-ピリジル基、3-ピリジル基、4-ピリジル基、又は-(CH2-CH2-O-)2-CH3で表される基であり、更に好ましくは、n-ブチル基、n-オクチル基、iso-プロピル基、3-ペンチル基、又は-(CH2-CH2-O-)2-CH3で表される基である。
　一般式(I)においてR2及びR3は、それぞれ独立して、水素原子又はアルキル基を表す。アルキル基は、通常、炭素数1～3の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基であり、好ましくは、メチル基である。R2とR3は同一の基であってもよく、異なる基であってもよい。R2及びR3は、前記した基であればよいが、好ましくは、水素原子である。
　一般式(I)においてX1は、ニトロ基、又は-SO2NR4R5で表される基を表す。ここで、R4及びR5は、それぞれ独立して、アルキル基を表す。アルキル基は、通常、炭素数1～3の直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基であり、好ましくは、メチル基である。R4とR5は同一の基であってもよく、異なる基であってもよい。X1は、前記した基であればよいが、好ましくは、ニトロ基である。
　一般式(I)においてX2は、下記の式(i)～(v)
（式中、*は結合手を示し、一般式(I)中の窒素原子に結合する。）
のいずれかで表される基を表す。X2は、前記した基であればよいが、好ましくは、式(i)で表される基である。
　一般式(I)においてX3は、存在しないか、又は酸素原子若しくは硫黄原子を表す。X3は、前記した基であればよいが、好ましくは、酸素原子である。但し、R1がハロゲン原子を表す場合は、X3は存在しないことが好ましい。ここで、「X3は存在しないこと」とは、R1が直接ベンゾオキサジアゾール環と結合することをいう。
　可視化の対象とするタンパク質は特に限定されず、変性の可能性のあるタンパク質や凝集の可能性のあるタンパク質を可視化の対象とすることができる。変性は、主に熱変性を意味するが、変性剤変性、酸変性、圧力変性などであってもよい。凝集の可能性のあるタンパク質の具体例としては、Amyloidβ、α-synucleinなどを挙げることができる。
　タンパク質を一般式(I)で表される化合物と接触させる方法は特に限定されず、例えば、タンパク質を含む溶液中に一般式(I)で表される化合物を添加する方法などを挙げることができる。
　使用する一般式(I)で表される化合物の量は特に限定されないが、可視化の対象とするタンパク質1 molに対し、通常、100～10000 molであり、好適には、100～1000 molである。
　一般式(I)で表される化合物の反応物（タンパク質との結合物）は蛍光を発する。この蛍光の検出は、常法に従って行うことができる。一般式（I)で示される化合物のうち、X3が窒素原子を含むニトロベンゾオキサジアゾール誘導体（N-NBD）は蛍光を発することが知られているので、同様の方法で、一般式(I)で表される化合物の反応物の蛍光を検出することができる。
　本発明において「タンパク質の変性状態又は凝集状態の可視化」とは、タンパク質の変性状態又は凝集状態を見える状態にすることをいう。例えば、対象とするタンパク質が変性又は凝集しているかどうかを明らかにすること、あるいは対象とするタンパク質がどの程度変性又は凝集しているかを明らかにすること（変性度又は凝集度の定量）は、本発明における「タンパク質の変性状態又は凝集状態の可視化」に該当する。
（２）特定方法
　本発明の試料中の変性タンパク質又は凝集タンパク質を特定する方法は、試料を上記の一般式(I)で表される化合物と接触させる工程、試料中のタンパク質を分離する工程、及び一般式(I)で表される化合物の反応物の蛍光を検出する工程を含むことを特徴とするものである。
　最初に、この方法の原理を説明する。変性タンパク質や凝集タンパク質に結合する化合物は数多く知られているが（例えば、Thioflavin Tは凝集タンパク質であるアミロイドβと結合する。）、これらの化合物は、通常、タンパク質と非共有結合的に結合するため、電気泳動などを行うと、タンパク質から離れてしまう。従って、このような化合物によって、変性タンパク質や凝集タンパク質が試料中に存在するかどうかを明らかにすることはできても、試料中に複数のタンパク質が含まれている場合、変性タンパク質や凝集タンパク質がどのタンパク質であるかを特定することはできない。これに対して、一般式(I)で表される化合物は、上述したように、タンパク質のリジン残基と共有結合をするので、タンパク質から容易に離れることはない。このため、試料中に複数のタンパク質が含まれていても、電気泳動をはじめとしたタンパク質分離操作により、一般式(I)で表される化合物とタンパク質の反応物が発する蛍光を検出することにより、変性タンパク質や凝集タンパク質がどのタンパク質であるかを特定することが可能である。
　試料としては、一種類のタンパク質のみを含む試料を使用してもよいが、通常、複数のタンパク質が混在している試料を使用する。
　試料を一般式(I)で表される化合物と接触させる方法は特に限定されず、例えば、試料中に一般式(I)で表される化合物を添加する方法などを挙げることができる。
　試料中のタンパク質の分離は、タンパク質の分離に常用されている方法、例えば、電気泳動、ゲルろ過などによって行うことができる。
　一般式(I)で表される化合物の反応物の蛍光の検出は、上述した本発明の可視化方法と同様に行うことができる。
（３）同定方法
　本発明の試験化合物と結合するタンパク質を同定する方法は、下記の（１）～（９）の工程を含むものである。
　工程（１）では、タンパク質を含む試料に、試験化合物と一般式(I)で表される化合物を添加する。タンパク質を含む試料は特に限定されず、例えば、細胞破砕液、細胞抽出液などである。試験化合物も特に限定されず、例えば、生理活性化合物などである。
　工程（２）では、工程（１）の試料を加熱する。加熱条件は、タンパク質が変性するような温度、時間であれば特に限定されない。加熱温度は、例えば、40～80℃とすることができ、加熱時間は、例えば、1～30分とすることができる。
　工程（３）では、工程（２）の試料中に含まれるタンパク質を分離する。試料中のタンパク質の分離は、タンパク質の分離に常用されている方法、例えば、電気泳動、ゲルろ過などによって行うことができる。
　工程（４）では、工程（３）によって分離された各タンパク質の蛍光強度を測定する。蛍光強度の測定は、常法に従って行うことができる。
　工程（５）では、タンパク質を含む試料に、一般式(I)で表される化合物を添加する。工程（５）は、試験化合物を添加しない点以外は、工程（１）と同様に行うことができる。
　工程（６）では、工程（５）の試料を加熱する。工程（６）は、工程（２）と同様に行うことができる。
　工程（７）では、工程（６）の試料中に含まれるタンパク質を分離する。工程（７）は、工程（３）と同様に行うことができる。
　工程（８）では、工程（７）によって分離された各タンパク質の蛍光強度を測定する。工程（８）は、工程（４）と同様に行うことができる。
　工程（９）では、工程（４）で測定された各タンパク質の蛍光強度と工程（８）で測定された各タンパク質の蛍光強度を比較し、工程（４）で測定された蛍光強度が、工程（８）で測定された蛍光強度よりも低いタンパク質を、試験化合物と結合するタンパク質と同定する。蛍光強度の比較によって、試験化合物と結合するタンパク質を同定できる原理は以下の通りである。試料中に含まれるタンパク質に試験化合物が結合すると、そのタンパク質は熱変性抵抗性を獲得し、熱変性の程度が減少する。この熱変性の程度の減少は、一般式(I)で表される化合物の蛍光強度の低下として検出することができる。従って、工程（４）で測定された蛍光強度が、工程（８）で測定された蛍光強度よりも低いタンパク質は、熱変性抵抗性を獲得したタンパク質であり、試験化合物と結合したタンパク質である。
　以下に、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕　化合物の合成
1-1. iPrONBD
　ChemiStation（EYELA, パーソナル有機合成装置）用チューブ（容量15 mL）にF-NBD（TCI, A5593; 20.0 mg, 110 μmol）とpropan-2-ol (TCI, I0277; 1 mL)を加えて、60℃、23時間反応させた。反応停止後、減圧して乾固させたのち、カラムクロマトグラフィー（hexane: AcOEt）により分離し、iPrONBDを緑色のアモルファス（11.3 mg, 46%, 50.6 μmol）として得た。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH 8.54 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 6.66 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 5.05 (sept, J = 6.0 Hz, 1H), 1.57 (d, J = 6.0 Hz, 6H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC 154.3, 145.8, 144.3, 134.4, 129.3, 105.0, 74.9, 21.7; HRMS (ESI, positive): calcd. for [C9H9N3O4+Na]+ 246.0485, found 246.0487.
1-2. nBuONBD
　ChemiStation（EYELA, パーソナル有機合成装置）用チューブ（容量15 mL）にF-NBD（25.0 mg, 140 μmol）、butanol (TCI, B0944; 310 μL, 3.40 mmol)、DIEPA (ナカライ, 14014-42; N-ethyl-N-isopropylpropan-2-amine, 138 μL, 140 μmol)、CH2Cl2 (ナカライ, 22430-74; 3.8 mL)を加えて、室温、24時間反応させた。反応停止後、減圧して乾固させたのち、カラムクロマトグラフィー（hexane: AcOEt）により分離し、nBuONBDを黄色の固体（27.0 mg, 83%, 110 μmol）として得た。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH 8.54 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.68 (d, J = 9.0 Hz, 1 H), 4.40 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 2.00-1.96 (m, 2H), 1.62-1.56 (m, 2H), 1.02 (t, J = 7.2 Hz, 3H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC 155.2, 145.4, 144.1, 134.3, 129.6, 104.4, 71.3, 30.7, 19.2, 13.8; HRMS (ESI, positive): calcd. for [C10H12N3O4+Na]+ 260.0642, found 260.0645.
1-3. 3-pentylONBD
　ChemiStation（EYELA, パーソナル有機合成装置）用チューブ（容量15 mL）にF-NBD（38.4 mg, 210 μmol）とpentan-3-ol (ナカライ, 02717-12;1 mL)を加えて、60℃、22時間反応させた。反応停止後、減圧して乾固させたのち、CHCl3を用いてPTLCにより分離し、3-pentylONBDを緑色のアモルファス（8.8 mg, 17%, 35 μmol）として得た。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH 8.54 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.64 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 4.67 (quint, J = 6.0 Hz, 1H), 1.94-1.85 (m, 4H) 1.04 (t, J = 7.2 Hz, 6H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC 155.1, 145.8, 144.3, 134.4, 129.2, 105.1, 84.9, 26.1, 9.6; HRMS (ESI, negative): calcd. for [C11H13N3O4-H]- 250.0822, found 250.0856.
〔実施例２〕　加熱に応答した蛍光特性の向上の評価
　Bovine carbonic anhydrase (Aldrich, C3934)を10 mM PBSに終濃度が10 μMになるように希釈した。brinzolamide (TCI, B4258)の1 mM DMSO溶液からタンパク質に対して1当量になるように加え、室温で30分静置した。比較対象では、DMSOを同じ量加え、同じ操作を行った。続いて、100 mMのONBD化合物のストック溶液（DMSO溶液）から終濃度が1 mMになるように加え、軽くボルテックスで攪拌した後、溶液50 μLをPCRチューブに移した。PCRチューブをリアルタイムPCR測定装置（タカラバイオ、Thermal Cycler Dice, TP800）で25℃から180秒毎に5℃昇温するプロトコルで加熱した。各ステップの最後15秒の時間で蛍光（ONBD化合物はFAMモード）を測定した。比較対象のSyproOrange（Invitrogen S6650, 5000× concentration in DMSO）から終濃度10×の濃度になるように加え、同様の操作をおこない、蛍光はROXモードで測定した。ONBD化合物としては、下記のMeONBD、iPrONBD、nBuONBD、iBuONBD、及びoctylONBDの5種類を使用した。
　温度と蛍光強度との関係を図１に示す。図１に示すように、いずれのONBD化合物を加えた場合も、Bovine carbonic anhydraseの熱変性が生じる60℃付近から蛍光強度の上昇がみられ、特に、iPrONBDを加えた場合の蛍光強度の上昇が顕著であった。この結果から、ONBD化合物によってタンパク質の熱変性度の定量（タンパク質の変性状態の可視化）が可能であると考えられる。
〔実施例３〕　凝集性タンパク質の凝集状態の定量
3-1. Amyloid β1－40
　Amyloid β1－40（ペプチド研、Trifluoroacetate Form, 4307-v）をバッファー（100 mM NaCl, 20 mM Tris pH7.4）に終濃度が 100 μMになるように希釈し、100 mMのONBD化合物及びThioflavin Tの10 mMのDMSO溶液から蛍光化合物の終濃度が 1 mMになるように溶液を調製した。96 well half well black plate（Greiner, 675086）の各wellに溶液の50 μLを加え、プレートリーダー（Teccan, Infinite200 Pro F PLEX）で37℃の恒温条件下、毎分1秒のプレート振盪をしながら蛍光（Ex: Em = 485±20/530±20 nmのフィルターを使用）を測定した。ONBD化合物としては、上述したMeONBD、iPrONBD、及びoctylONBDの3種類を使用した。
　測定開始からの時間と蛍光強度の関係を図２に示す。図２に示すように、いずれのONBD化合物を加えた場合も、時間の経過に伴う蛍光強度の上昇がみられ、その上昇度は既知のアミロイドβ検出色素であるThioflavin Tよりもはるかに大きかった。この結果から、ONBD化合物によってタンパク質の凝集性の定量（タンパク質の凝集状態の可視化）が可能であると考えられる。
3-2. α-synuclein
　α-Synuclein fibril（コスモバイオ, SYN03）を10 mM MES buffer (pH 7.4)に希釈し、500 nM溶液を作製した。その溶液を96 well half well black plate（Greiner, 675086）に50 μLずつ分注した。100 mMのONBD化合物及びThioflavin Tのストック溶液（DMSO溶液）を一度1 mM に上記のバッファーで希釈し、終濃度が10 μMになるようにwellに加え、ピペッティングした。プレートリーダー（Teccan, Infinite200 Pro F PLEX）で37℃の恒温条件下、毎分1秒のプレート振盪をしながら蛍光（Ex: Em = 485±20/530±20 nmのフィルターを使用） を測定した。ONBD化合物としては、上述したiPrONBD及びoctylONBDの他、下記のPEGONBDの3種類を使用した。
　α-Synuclein fibrilの存在又は非存在下における測定開始からの時間と蛍光強度の関係を図３に示す。図３に示すように、α-Synuclein fibrilの存在下においては、いずれのONBD化合物を加えた場合も、時間の経過に伴う蛍光強度の上昇がみられ、特に、octylONBDを加えた場合の蛍光強度の上昇が顕著であった。この結果から、ONBD化合物によってタンパク質の凝集性の定量（タンパク質の凝集状態の可視化）が可能であると考えられる。
〔実施例４〕　熱変性タンパク質の2次元電気泳動による検出
　1x RIPA buffer(ナカライ, 08714-04)で可溶化したHEK293FT細胞の破砕液とbovine carbonic anhydrase （以下「CAII」という。）(Aldrich, C3934)を同バッファーで希釈し、細胞破砕液のタンパク質濃度3.0 mg/mL、CAIIの濃度1 μMもしくは5 μMのタンパク質混合溶液を調製した。それに対して、brinzolamide (TCI, B4258)の1 mM DMSO溶液からCAIIに対して1当量になるように加え、室温で30分静置した。比較対象のサンプルでは、同量のDMSOを加え同じの操作を行った。その後、14,000×gで10分遠心し、上清を回収した。上清に対して、100 mMのONBD化合物のストック溶液（DMSO溶液）から終濃度が1 mMになるように加え、軽くボルテックスで攪拌した後、溶液50 μLをPCRチューブに移した。PCRチューブをサーマルサイクラー（Applied biosystems, Mini Amp Plus）で65℃、5分間加熱し、その後、室温に静置した。その後の2次元電気泳動サンプルを調製するプロトコルは以下の2通りの方法で行った。
（全タンパク質を回収するプロトコル）バイオラッド社のReadyPrep 2-D clenup kitのプロトコルに従い、サンプルを調製し、最後に得られるペレットをAuto2D Glycine type Reagent Kitに含まれる膨潤バッファー（ampolyte pH3-10を含む）15 μLで溶解させた。
（ペレットを回収するプロトコル）加熱後のサンプルを遠心し（20,000×gで20分）、上清を廃棄して残ったペレットに対して、Auto2D Glycine type Reagent Kitに含まれる膨潤バッファー（ampolyte pH3-10を含む）15 μLで溶解させた。
　2次元電気泳動に関しては、Auto 2D plus（Merck）の長時間プロトコルに従って行い、得られたゲルは蛍光イメージャー（Vilver Lourmat, Fusion Solo S）で蛍光画像を取得した。その後、ゲルに含まれる全タンパク質の染色は、銀染色（ナカライ、シルベストステイン　ワン、06865-81）もしくは、Oriole（Biorad, 1610495）をメーカープロトコルに従って行い、画像を同様に撮影した。ONBD化合物としては、上述したiPrONBDを使用した。
　全タンパク質を回収するプロトコルに従ってサンプルを調製した場合の2次元電気泳動像を図４に、ペレットを回収するプロトコルに従ってサンプルを調製した場合の2次元電気泳動像を図５に示す。図４及び図５に示すように、いずれのプロトコルに従った場合も、brinzolamideの添加により、CAIIの蛍光強度が低下していたが、ペレットを回収するプロトコルに従った場合の方が蛍光強度の低下は顕著であった。brinzolamideの添加により、CAIIの蛍光強度が低下したのは、brinzolamideの結合によってCAIIが熱変性に対する抵抗性を獲得したためであると考えられる。この結果から、タンパク質が混在する条件下であっても、ONBD化合物によって、変性タンパク質を特定し、その変性度を定量することが可能であると考えられる。
〔実施例５〕　ニトロベンゾオキサジアゾール（NBD）誘導体の合成
5-1. cyclo-butyl-ONBD
　ChemiStation（EYELA, パーソナル有機合成装置）用チューブ（容量15 mL）にF-NBD（TCI, A5593; 20.0 mg, 110 μmol）とcyclobutanol (Angene International Limited, AG002XN2; 1 mL) を加えて、60℃、18時間反応させた。反応停止後、減圧して乾固させたのち、PTLC (Hexane: CHCl3)により分離し、cyclo-butyl-ONBDを黄色固体（14.0 mg, 54%, 35 μmol）として得た。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH 8.51 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.50 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 6.50 (quint., J = 7.2 Hz, 1H), 2.64-2.59 (m, 2H), 2.46-2.39 (m, 2H), 2.05-1.99 (m, 1H), 1.86-1.78 (m, 1H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC 153.5, 145.4, 144.1, 134.1, 129.7, 105.1, 75.0, 30.2, 13.4; HRMS (ESI, positive): calcd. for [C10H9N3O4+Na]+ 258.0485, found 258.0495.
5-2. cyclo-pentyl-ONBD 
　ChemiStation（EYELA, パーソナル有機合成装置）用チューブ（容量15 mL）にF-NBD（TCI, A5593; 20.0 mg, 110 μmol）とcyclopentanol (ナカライ, 10222-32; 1 mL) を加えて、60℃、24時間反応させた。反応停止後、減圧して乾固させたのち、PTLC (Hexane: CHCl3)により分離し、cyclo-pentyl-ONBDを黄色固体（19.0 mg, 70%, 76 μmol）として得た。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH 8.53 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.63 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 5.18 (m, 1H), 2.10-2.07 (m, 4H), 1.91-1.89 (m, 2H), 1.75-1.73 (m, 2H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC 154.5, 145.7, 144.2, 134.2, 129.3, 84.1, 32.9, 24.2; HRMS (ESI, positive): calcd. for [C11H11N3O4+Na]+ 272.0642, found 272.0641.
5-3. cyclo-hexyl-ONBD 
　ChemiStation（EYELA, パーソナル有機合成装置）用チューブ（容量15 mL）にF-NBD（TCI, A5593; 20.0 mg, 110 μmol）とcyclohexanol (ナカライ, 10111-95; 1mL) を加えて、60℃、24時間反応させた。反応停止後、減圧して乾固させたのち、PTLC (Hexane: CHCl3)により分離し、cyclo-hexyl-ONBDを黄色固体（17.0 mg, 60%, 65 μmol）として得た。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH 8.52 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 6.65 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 4.78 (m, 1H), 2.13-2.10 (m, 2H), 1.92-1.89 (m, 2H), 1.81-1.75 (m, 2H), 1.66-1.62 (m, 2H), 1.50-1.37 (m, 2H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC 154.3, 145.8, 144.2, 134.3, 129.1, 105.1, 79.8, 31.2, 25.2, 23.5; HRMS (ESI, positive): calcd. for [C12H13N3O4+Na]+ 286.0798, found 286.0814.
5-4. cyclo-heptyl-ONBD
　ChemiStation（EYELA, パーソナル有機合成装置）用チューブ（容量15 mL）にF-NBD（TCI, A5593; 20.0 mg, 110 μmol）とcycloheptanol (Angene International Limited, AG0034NE; 1 mL) を加えて、65℃、15時間反応させた。反応停止後、減圧して乾固させたのち、PTLC (Hexane: CH2Cl2)により分離し、cyclo-heptyl-ONBDを黄色固体（13.0 mg, 40%, 47 μmol）として得た。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH 8.53 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 6.58 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 4.91 (m, 1H), 2.18 (m, 2H), 2.01 (m, 2H), 1.81 (m, 2H), 1.66 (m, 4H), 1.54 (m, 2H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC 154.3, 145.8, 144.2, 134.3, 129.1, 105.1, 82.5, 33.4, 28.3, 22.8; HRMS (ESI, positive): calcd. for [C13H15N3O4+Na]+ 300.0955, found 300.0978.
5-5. cyclo-octyl-ONBD 
　Microwave（Biotage, microwave合成装置イニシエータ・プラス）用バイアル（容量0.5-2 mL）にF-NBD（TCI, A5593; 20.0 mg, 110 μmol）とcyclooctanol (TCI, C0623; 1 mL) を加えて、150℃、1時間反応させた。反応停止後、減圧して乾固させたのち、PTLC (Hexane: CH2Cl2)により分離し、cyclo-octyl-ONBDを黄色固体（10.0 mg, 31%, 34 μmol）として得た。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH 8.52 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 6.57 (d, J = 7.8 Hz, 1 H), 4.94-4.90 (m, 1H), , 2.12-2.04 (m, 4H), 1.90-1.83 (m, 2H), 1.72-1.49(m, 8H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC 154.2, 145.8, 144.2, 134.4, 129.0, 105.1, 82.8, 31.5, 26.9, 25.7, 23.1; HRMS (ESI, positive): calcd. for [C14H17N3O4+Na]+ 314.1111, found 314.1112.
5-6. 2-adamantyl-ONBD 
　Microwave（Biotage, microwave合成装置イニシエータ・プラス）用バイアル（容量0.5-2 mL）にF-NBD（TCI, A5593; 20.0 mg, 110 μmol）と2-adamantanol (TCI, A0720; 1 mL)、DMF (wako, 045-02911; N,N-Dimethylformamide, 3 mL) を加えて、150℃、1時間反応させた。反応停止後、減圧して乾固させたのち、PTLC (Hexane: CHCl3)により分離し、2-adamantyl-ONBDを黄色固体（10.0 mg, 31%, 34 μmol）として得た。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH 8.51 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.64 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 4.94 (s, 1H), 2.33 (s, 2H), 2.22 (d, J = 12 Hz, 2H) , 2.02-1.94 (m, 4H) , 1.86-1.81 (m, 4H) , 1.66 (d, J = 12 Hz, 1 H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC 154.2, 145.9, 144.3, 134.3, 129.1, 105.4, 84.2, 37.1, 36.3, 31.6, 31.5, 27.0, 26.9
5-7. n-hexyl-ONBD 
　Microwave（Biotage, microwave合成装置イニシエータ・プラス）用バイアル（容量0.5-2 mL）にF-NBD（TCI, A5593; 20.0 mg, 110 μmol）と1-Hexanol (ナカライ, 18013-45; 1 mL) を加えて、150℃、1時間反応させた。反応停止後、減圧して乾固させたのち、PTLC (Hexane: CHCl3)により分離し、n-Hexyl-ONBDを黄色固体（20.0 mg, 69%, 75 μmol）として得た。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH 8.53 (d, J = 8.7 Hz, 1H), 6.65 (d, J = 8.7 Hz, 1 H), 4.37 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.00-1.97 (m, 2H), 1.56-1.50 (m, 2H), 1.40-1.32 (m, 4H), 0.91 (t, J = 7.2 Hz, 3H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC 155.2, 145.4, 144.1, 134.2, 129.7, 104.3, 71.5, 31.4, 28.6, 25.6, 22.6, 14.0; HRMS (ESI, positive): calcd. for [C12H15N3O4+Na]+ 288.0955, found 288.0974.
5-8. n-Octyl-ONBD
　Microwave（Biotage, microwave合成装置イニシエータ・プラス）用バイアル（容量0.5-2 mL）にF-NBD（TCI, A5593; 20.0 mg, 110 μmol）と1-Octanol (TCI, O0036; 1 mL) を加えて、160℃、1時間反応させた。反応停止後、減圧して乾固させたのち、PTLC (Hexane: CHCl3)により分離し、n-Octyl-ONBDを黄色固体（20.0 mg, 62%, 68 μmol）として得た。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH 8.52 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.65 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 4.37 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.00-1.92 (m, 2H), 1.57-1.50 (m, 2H), 1.40-1.25 (m, 8H), 0.87 (t, J = 6.6 Hz, 3H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC 155.2, 145.2, 144.1, 134.1, 129.7, 104.3, 71.5, 32.0, 29.7, 29.6, 29.5, 29.4, 29.3, 25.9, 22.8, 14.2; HRMS (ESI, positive): calcd. for [C14H19N3O4+Na]+ 316.1262, found 316.1268.
5-9. n-Decyl-ONBD
　ChemiStation（EYELA, パーソナル有機合成装置）用チューブ（容量15 mL）にF-NBD（TCI, A5593; 20.0 mg, 110 μmol）と1-Decanol (ナカライ, 10618-62; 1 mL) を加えて、60℃、16時間反応させた。反応停止後、減圧して乾固させたのち、PTLC (Hexane: CHCl3)により分離し、n-Decyl-ONBDを黄色固体（26.3 mg, 75%, 81.8 μmol）として得た。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH 8.52 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.65 (d, J = 8.1 Hz, 1 H), 4.73 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.02-1.93 (m, 2H), 1.56-1.50 (m, 2H), 1.40-1.26 (m, 12H), 0.86 (t, J = 7.2 Hz, 3H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC 155.2, 145.4, 144.1, 134.1, 129.7, 104.3, 71.5, 32.0, 29.7, 29.6, 29.5, 29.4, 29.3, 28.6, 25.9, 22.8, 14.2; HRMS (ESI, positive): calcd. for [C16H23N3O4+Na]+ 344.1589, found 344.1581.
5-10. n-Dodecyl-ONBD
　Microwave（Biotage, microwave合成装置イニシエータ・プラス）用バイアル（容量0.5-2 mL）にF-NBD（TCI, A5593; 20.0 mg, 110 μmol）と1-Dodecanol (ナカライ, 20118-15; 1 mL) を加えて、170℃、1時間反応させた。反応停止後、減圧して乾固させたのち、PTLC (Hexane: CHCl3)により分離し、n-Dodecyl-ONBDを黄色固体（20.0 mg, 52%, 57 μmol）として得た。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH 8.53 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.65 (d, J = 8.1 Hz, 1 H), 4.37 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.03-1.95 (m, 2H), 1.55-1.50 (m, 2H), 1.40-1.36 (m, 2H),1.33-1.25(m, 14H), 0.87(t, J = 7.2 Hz, 3H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC 155.2, 145.4, 144.1, 134.1, 129.7, 104.3, 71.5, 32.0, 29.7, 29.7, 29.6, 29.5, 29.4, 29.3, 28,6, 25.9, 22.8, 14.2; HRMS (ESI, positive): calcd. for [C18H27N3O4+Na]+ 372.1894, found 372.1896.
5-11. i-Butyl-ONBD
　ChemiStation（EYELA, パーソナル有機合成装置）用チューブ（容量5 mL）にF-NBD（TCI, A5593; 25.0 mg, 140 μmol）と2-methylpropan-1-ol (TCI, 310 μL, 3.40 mmol)、DIEPA (ナカライ, 14014-42; N-ethyl-N-isopropylpropan-2-amine, 138 μL, 140 μmol)、CH2Cl2 (ナカライ, 22430-74; 3.8 mL)を加えて、室温、24時間反応させた。反応停止後、減圧して乾固させたのち、カラムクロマトグラフィー (Hexane: AcOEt)により分離し、i-Butyl-ONBDを黄色固体（22.3 mg, 69%, 94.0 μmol）として得た。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH 8.53 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 6.65 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 4.13 (d, J = 6.6 Hz, 2H), 2.33-2.29 (m, 1H) 1.15-1.09 (m, 6H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC 155.3, 145.4, 144.1, 134.2, 129.7, 104.4, 28.1, 19.1; HRMS (ESI, positive): calcd. for [C10H11N3O4+Na]+ 260.0642, found 260.0653.
5-12. 5-nonyl-ONBD 
　Microwave（Biotage, microwave合成装置イニシエータ・プラス）用バイアル（容量0.5-2 mL）にF-NBD（TCI, A5593; 20.0 mg, 110 μmol）とcyclooctanol (TCI, C0623; 1 mL) を加えて、150℃、1時間反応させた。反応停止後、減圧して乾固させたのち、PTLC (Hexane: CHCl3)により分離し、5-nonyl-ONBDを黄色固体（10.0 mg, 31%, 34 μmol）として得た。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH 8.53 (d, J =8.7 Hz, 1H), 6.62 (d, J = 8.7 Hz, 1 H), 4.79-4.72 (m, 1H), 1.90-1.77 (m, 4H), 1.47-1.31 (m, 8H), 0.89 (t, J = 7.2 Hz, 6H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC 155.1, 145.7, 144.3, 134.3, 129.1, 104.9, 82.8, 33.4, 27.5, 22.7, 14.0; HRMS (ESI, positive): calcd. for [C15H21N3O4+Na]+ 330.1424, found 330.1440.
5-13. Br-NBD (N25_044)
1,3-dibromo-2-nitrosobenzene (2)
　丸底フラスコ（容量50 mL）に2,6-Dibromoaniline（BLD pharmatech Ltd., BD34272; 500 mg, 1.99 mmol）と75% mCPBA (Oakwood products, Inc., 080350; 3-Choloroperbenzonic acid 75% ,458 mg, 1.99 mmol)、CHCl3 (ナカライ, 08401-94; 3.8 mL)を加えて、室温、24時間反応させた。反応停止後、CHCl3で希釈し、飽和NaS2O4水溶液、飽和NaHCO3、及び飽和食塩水で洗浄し、有機層をNa2SO4上で乾燥し、濾過し、減圧して乾固させたのち、1,3-dibromo-2-nitrosobenzene (2)の褐色固体を精製せずに2ステップ目の反応に用いた。
4-bromobenzo[c][1,2,5]oxadiazole (3)
　丸底フラスコ（容量50 mL）に2（500 mg, 1.89 mmol）とNaN3 (ナカライ, 31208-82; 135 mg, 2.08 mmol)、DMSO (wako, 048-32811; 10 mL)、を加えて、室温、2時間反応させた。反応停止後、溶液を120℃に加熱し、氷水に注ぎ、析出した固体をフィルター濾過し、乾燥させたのち、4-bromobenzo[c][1,2,5]oxadiazole (3) を褐色固体（300 mg, 81%, 1.52 mmol）として得た。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH 7.81 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.63 (d, J = 7.8 Hz, 1 H), 7.29 (m, 1H).
Br-NBD (4)
　丸底フラスコ（容量50 mL）に3（161 mg, 809 μmol）とH2SO4 (ナカライ, 32519-95; 1.3 mL)に溶解し、50% H2SO4 (1 mL)にNaNO3（ナカライ, 31916-15; 89.4 mg, 1.05 mmol）を滴加し、室温、30分間反応させた。反応停止後、溶液を85℃に加熱し、氷水に注ぎ、、析出した固体をフィルター濾過し、乾燥させたのち、カラムクロマトグラフィー (Hexane: AcOEt)により分離し、Br-NBDを褐色固体（150 mg, 76%, 615 μmol）として得た。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH 8.37 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.86 (d, J = 7.8 Hz, 1 H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC 150.6, 142.4, 136.3, 132.3, 130.6, 119.2.
5-14. I-NBD
2,6-diiodoaniline (6)
　丸底フラスコ（容量50 mL）に2-Iodoaniline（TCI, I0046; 50 mg, 230 μmol）とN-Iodosuccinimide (ナカライ, 19331-74; 51 mg, 230 μmol)、Acetic Acid (ナカライ, 00211-95; 13 μL, 230 μmol)、Toluene (wako, 204-01861; 3.8 mL)を加えて、室温、24時間反応させた。反応停止後、減圧して乾固させたのち、カラムクロマトグラフィー（hexane: AcOEt）により分離し、2,6-diiodoaniline (6) を褐色固体（31 mg, 39%, 90 μmol）として得た。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH 7.61 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 6.14 (t, J = 7.8 Hz, 1 H), 4.60 (s, 2H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC 146.2, 139.5, 121.3, 81.6.
1,3-diiodo-2-nitrosobenzene (7)
　丸底フラスコ（容量50 mL）にクルード6（31 mg, 90 μmol）と75% mCPBA (Oakwood products, Inc., 080350; 3-Choloroperbenzonic acid 75% , 47 mg, 270 μmol)、CHCl3 (ナカライ, 08401-94; 6 mL)を加えて、室温、24時間反応させた。反応停止後、CHCl3で希釈し、飽和NaS2O4水溶液、飽和NaHCO3、及びブラインで洗浄し、有機層をNa2SO4上で乾燥し、濾過し、減圧して乾固させたのち、1,3-diiodo-2-nitrosobenzene (7) を褐色固体（31 mg, 96%, 86 μmol）として得た。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH 7.61 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 6.15 (d, J = 8.1 Hz, 1 H).
4-iodobenzo[c][1,2,5]oxadiazole (8)
　丸底フラスコ（容量30 mL）に7（31 mg, 86 μmol）とNaN3 (ナカライ, 31208-82; 6.2 mg, 95 μmol)、DMSO (wako, 048-32811; 3 mL)、を加えて、室温、2時間反応させた。反応停止後、溶液を120℃に加熱し、氷水に注ぎ、析出した固体をフィルター濾過し、乾燥させたのち、4-iodobenzo[c][1,2,5]oxadiazole (8) の褐色固体を精製せずに4ステップ目の反応に用いた。
I-NBD (9)
　丸底フラスコ（容量30 mL）に8（31 mg, 130 mmol）とH2SO4 (ナカライ, 32519-95; 1.3 mL)に溶解し、50% H2SO4 (1 mL)とNaNO3（ナカライ, 31916-15; 14 mg, 160 mmol）の混合液を滴加し、室温、30分間反応させた。反応停止後、溶液を85℃に加熱し、氷水に注ぎ、析出した固体をフィルター濾過し、乾燥させたのち、カラムクロマトグラフィー (Hexane: AcOEt)により分離し、I-NBDを褐色固体（10 mg, 27%, 34 μmol）として得た。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH 8.20 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 8.14 (d, J = 7.5 Hz, 1 H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC 152.7, 141.0, 139.3, 130.2, 90.7.
5-15. Diethylenegylycol-ONBD (DEG-ONBD)
　ChemiStation（EYELA, パーソナル有機合成装置）用チューブ（容量15 mL）にF-NBD（TCI, A5593; 48.0 mg, 260 μmol）、2-(2-Methoxyethoxy)ethanol (TCI, M0537; 15 μL, 130 μmol)、DIEPA (ナカライ, 14014-42; N-ethyl-N-isopropylpropan-2-amine, 89 μL, 510 μmol)、CH2Cl2 (ナカライ, 22430-74; 1.5 mL)を加えて、0℃、1時間反応させた。反応停止後、減圧して乾固させたのち、カラムクロマトグラフィー（hexane: AcOEt）により分離し、Diethylenegylycol-ONBDを褐色のアモルファス（27.6 mg, 37%, 97.4 μmol）として得た。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH 8.52 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 6.76 (d, J = 9.0 Hz, 1 H), 4.58 (t, J = 4.6 Hz, 2H), 4.02 (t, J = 4.6 Hz, 2H), 3.74 (t, J = 4.6 Hz, 2H), 3.56 (t, J = 4.6 Hz, 2H), 3.36 (s, 3H); HRMS (ESI, positive): calcd. for [C11H13N3O6+Na]+ 306.0697, found 306.0726.
〔実施例６〕　ジメチルアミノスルホニルベンゾオキサジアゾール（DBD））誘導体の合成
6-1. Me-ODBD
　ChemiStation（EYELA, パーソナル有機合成装置）用チューブ（容量15 mL）にF-DBD（TCI, A5595; 15.0 mg, 61 μmol）、Methanol (ナカライ, 21914-74; 62 μL, 1.5 mmol)、Sodium hydride (ナカライ, 31525-22; 1.5 mg, 61 μmol)、DMF (wako, 045-02911; N,N-Dimethylformamide, 3 mL) を加えて、室温、24時間反応させた。反応停止後、減圧して乾固させたのち、カラムクロマトグラフィー（hexane: AcOEt）により分離し、Me-ODBDを黄色固体（15 mg, 95%, 58 μmol）として得た。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH 7.99 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 6.61 (d, J = 7.8 Hz, 1 H), 4.14 (s, 3H), 2.91 (s, 6H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC 152.7, 146.6, 145.0, 137.4, 118.1, 104.4, 57.2, 37.8; HRMS (ESI, positive): calcd. for [C9H11N3O4S+Na]+ 280.0362, found 280.0377.
6-2. i-Pr-ODBD
　ChemiStation（EYELA, パーソナル有機合成装置）用チューブ（容量15 mL）にF-DBD（TCI, A5595; 15 mg, 61 μmol）、2-Propanol (wako, 165-09161; 120 μL, 1.5 mmol)、Sodium hydride (ナカライ, 31525-22; 1.5 mg, 61 μmol)、DMF DMF (wako, 045-02911; N,N-Dimethylformamide, 3 mL) を加えて、室温、24時間反応させた。反応停止後、減圧して乾固させたのち、カラムクロマトグラフィー（hexane: AcOEt）により分離し、i-Pr-ODBDを黄色固体（8.5 mg, 49%, 30.0 μmol）として得た。1H NMR (600 MHz, CDCl3) δH 7.96 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.58 (d, J = 8.1 Hz, 1 H), 4.97-4.91 (m, 1H), 2.97-2.87 (m, 6H) 1.52 (d, J = 6.0 Hz, 6H); 13C NMR (150 MHz, CDCl3) δC 151.3, 146.8, 145.5, 137.7, 117.1, 105.5, 73.6, 37.8, 21.7; HRMS (ESI, positive): calcd. for [C11H15N3O4S+Na]+ 308.0675, found 308.0692.
〔実施例７〕　NBD誘導体とcarbonic anhydraseの熱変性検出に対するプローブ特性
　carbonic anhydrase IIにNBD誘導体又はSypro Orangeを加え、carbonic anhydrase IIの阻害剤であるBrinzolamideの存在又は非存在下で加熱した。実験に使用したNBD誘導体中、新規な化合物については、その合成法を実施例５に示した。加熱に伴う蛍光強度の変化を測定し、各NBD誘導体及びSypro OrangeのS/N、Tm、及びΔTmを求めた（図６）。Tmは、25℃における蛍光強度と最大蛍光強度の平均値を示す温度とした。S/N及びΔTmは、下記の式から算出した。
S/N＝最大蛍光強度/25℃における蛍光強度
ΔTm＝Brinzolamide存在下におけるTm－Brinzolamide非存在下におけるTm
〔実施例８〕　DBD誘導体とcarbonic anhydraseの熱変性検出に対するプローブ特性
　carbonic anhydrase IIにDBD誘導体を加え、carbonic anhydrase IIの阻害剤であるBrinzolamideの存在又は非存在下で加熱した。実験に使用したDBD誘導体中、新規な化合物については、その合成法を実施例６に示した。加熱に伴う蛍光強度の変化を測定し、実施例７と同様の方法で、各DBD誘導体のS/N、Tm、及びΔTmを求めた（図７）。
〔実施例９〕　細胞内変性タンパク質の蛍光イメージング
　ポリ-L-リシン溶液（Sigma-Aldrich P4707）でコートしたガラスベースディッシュ（IWAKI 3910-035）にHEK293T細胞を播種し（8 x 104 cells/mL, 2mL）、1晩培養後、10 mMのONBD化合物のDMSO溶液を1 μL加えた（最終濃度 5 μM）。37 ℃のCO2インキュベーター内で30分処理後、共焦点レーザー蛍光顕微鏡（ZEISS LSM900、Ex 488nm/ Em 400-550 nm）で観察し、画像を取得した。ONBD化合物として、iPr-ONBD、3-Pen-ONBD、Octyl-ONBD、又はDEG-ONBDを使用した場合の画像を図８に示す。
〔実施例１０〕　プロテアソーム阻害剤処理条件下での蛍光イメージング（ONBD化合物同時処理）
　ポリ-L-リシン溶液（Sigma-Aldrich P4707）でコートしたガラスベースディッシュ（IWAKI 3910-035）にHEK293T細胞を播種し（1 x 105 cells/mL, 2mL）、1晩培養後、5 mMのMG-132のDMSO溶液2 μL（最終濃度 5 μM）及び2 mMのOctylNBD化合物のDMSO溶液を1 μL加えた（最終濃度 1 μM）。37 ℃のCO2インキュベーター内で12時間処理後、共焦点レーザー蛍光顕微鏡（ZEISS LSM900、Ex 488nm/ Em 400-550 nm）で観察し、画像を取得した（図９）。プロテアソーム阻害剤添加によって、本来分解されなければいけない細胞内のユビキチン化タンパク質が分解されずに蓄積する。ユビキチン化された変性タンパク質が細胞内に蓄積し染色されていると考えられる。
〔実施例１１〕プロテアソーム阻害剤処理条件下での蛍光イメージング（ONBD化合物を後から処理）
　ポリ-L-リシン溶液（Sigma-Aldrich P4707）でコートしたガラスベースディッシュ（IWAKI 3910-035）にHEK293T細胞を播種し（1 x 105 cells/mL, 2mL）、1晩培養後、5 mMのMG-132（プロテアソーム阻害剤）のDMSO溶液2 μL（最終濃度 5 μM）を加えCO2インキュベーター内で12時間処理後、2 mMのOctylNBD化合物のDMSO溶液を1 μL加えて30分インキュベーション後に（最終濃度 1 μM）、共焦点レーザー蛍光顕微鏡（ZEISS LSM900、Ex 488nm/ Em 400-550 nm）で観察し、画像を取得した（図１０）。
〔実施例１２〕　Amyloid β 1-40凝集状態の定量
　Amyloid β1－40（ペプチド研、Trifluoroacetate Form, 4307-v）をバッファー（150 mM NaCl, 20 mM Tris pH7.4）に終濃度が 100 μMになるように希釈し、10 mMのプローブ化合物もしくはThioflavin TのDMSO溶液から蛍光化合物の終濃度が 100 μMになるように溶液を調整した。96 well half well black plate（Greiner, 675086）の各wellに溶液の50 μLを加え、プレートリーダー（Teccan, Infinite200 Pro F PLEX）で37℃の恒温条件下、毎分1秒のプレート振盪をしながら蛍光（Ex: Em = 485±20/530±20 nmのフィルターを使用）を測定した。
　凝集したAmyloid β1－40にプローブ化合物を加えることも行った。この場合、Amyloid β1－40の希釈液にプローブ化合物を添加せずに、上記の操作を行い、一定のインキュベーション時間経過後に、10 mMのプローブ化合物もしくはThioflavin TのDMSO溶液から蛍光化合物の終濃度が 100 μMになるように加え、引き続きプレートリーダーでの蛍光測定を継続した。Thioflavin Tを使用した場合、及びプローブ化合物としてoctyl ONBD、iPr ONBD、又はBrNBDを使用した場合の蛍光強度の経時的変化を図１１に示す。
〔実施例１３〕　標識部位検出のための質量分析サンプルの調製
　Bovine carbonic anhydrase (Aldrich, C3934)を10 mM PBSに終濃度が10 μMになるように希釈した。brinzolamide (TCI, B4258)の1 mM DMSO溶液からタンパク質に対して1当量になるように加え、室温で30分静置した。比較対象では、DMSOを同じ量加え、同じ操作を行った。続いて、100 mMのONBD化合物のストック溶液（DMSO溶液）から終濃度が1 mMになるように加え、軽くボルテックスで攪拌した後、溶液50 μLをPCRチューブに移した。PCRチューブをサーマルサイクラー（Applied biosystems, Mini Amp Plus）を精密加熱装置として使用し、各温度で、5分間加熱した。反応溶液に5 x SDS-PAGE サンプルバッファーを加え(final conc. 50 mM Tris-HCl pH 6.8, 125 mM 2-mercaptoethanol, 2% sodium dodecyl sulfate (SDS), 0.025% bromophenol blue, 10% glycerol)、95℃で5分加熱した。その後、4-20% アクリルアミドゲル(Biorad)を使ってSDS-PAGEを行った。得られたゲルの蛍光を蛍光イメージャー（Vilver Lourmat, Fusion Solo S）で検出した後、ゲルに含まれるタンパク質をCBB染色した。解析対象のタンパク質に対応するバンドを分離し、切り出したバンドを切断した（約1mm片）。ゲル片をマイクロチューブに移し、1 mLの水を加え、37 ℃で10分間インキュベートした後、溶液を除去した。この洗浄操作を3回繰り返した。脱染色のため、50%アセトニトリル／100 mM Tris buffer (pH 8.0) 溶液を加え、37 ℃で 10 分間インキュベートした後、溶液を除去した。脱水用チューブにアセトニトリルを加え、37 ℃で10分間インキュベートした。溶液を除去した後、トリプシン溶液を各チューブに加え、37℃で一晩インキュベートした。得られた溶液をトリフルオロ酢酸（TFA）水溶液（最終濃度 0.1% v/v）でクエンチし、C18ピペットチップ（日京テクノス、NTCR-KT200-C18-2）を用いて脱塩した。脱塩後、遠心エバポレーター（東京理化機器）で溶媒を除去した。
　各トリプシン消化断片の蛍光強度を測定し、Bovine carbonic anhydraseにおけるLys残基周辺の変性度を可視化した。また、brinzolamide存在下で加熱した場合とbrinzolamide非存在下で加熱した場合の蛍光強度を比較し、各Lys残基周辺の変性度に対するbrinzolamideの影響を調べた（図１２）。図１２に示すように、brinzolamideによって全体的に変性しづらくなっているが、部位によっては変性しやくなっている場合もあった。
〔実施例１４〕　Anti-NBD抗体を使った修飾断片の精製と質量分析測定サンプルの調製
　SDS-PAGEにより、標識されたBovine carbonic anhydraseに対応するバンドを分離し、切り出したバンドを切断した（約1mm片）。ゲル片をマイクロチューブに移し、1 mLの水を加え、37℃で10分間静置した。溶液を除去し、洗浄操作を3回繰り返した。脱染は、100 mM Tris buffer (pH 8.0) 中の50% アセトニトリル を加え、37 ℃で10分間静置後、溶液を除去した。脱水用チューブにアセトニトリルを加え、37 ℃で10分間静置した。溶液を除去した後、トリプシン溶液を各チューブに加え、37 ℃で一晩静置した。10%トリフルオロ酢酸(TFA)水溶液（終濃度0.4%）になるように加えて反応をクエンチした。50% アセトニトリル / 0.1% TFAを加え、37℃で10分間静置した。軽く撹拌後、遠心をかけ、抽出液を回収し、80% アセトニトリル / 0.1% TFAを加え、37℃で2分間静置した。軽く撹拌、遠心をかけ抽出液を回収した。回収した抽出液をまとめて濃縮遠心機にて濃縮した。有機溶媒を除去したサンプルに対して、Protein G Dynabeads (invitrogen, 10003D)を加え、磁気ビーズ回収スタンドにセットし、上清を取り除いた。Pi-Na buffer (20 mM phosphate buffer (pH 6.8-70), 150mM NaCl)で洗浄し、TG buffer (20mM Tris-HCl pH 8.0, 0.01% Decyl β-D-glucopyranoside (TCI, D5680))を加えたのち、anti-NBD抗体(Bio-Rad, 0100-0023)を加えて、4℃で転倒混和した。上清を取り除き、Pi-Na bufferで洗浄後、TG bufferを加えて、4℃で一晩、ローテーターで転倒混和した。サンプルチューブから上清を回収し、TG bufferで3回洗浄後、0.01 % DG buffer (0.1% Decyl β-Dglucopyranosideの10倍希釈液)で3回洗浄したのち、0.15 % TFAを添加し、10分間、ローテーターで転倒混和し、これを3回行った。サンプルを濃縮遠心機により、濃縮し、スピンダウンC18チップ（日京テクノス、NTCR-KT200-C18-2）を用いて脱塩を行った。脱塩後、遠心分離により溶媒を除去した。5% アセトニトリル / 0.1% TFAをサンプルに再溶解させ、LC-MS/MSサンプルとして調整した。
　質量分析は、以下の通り行った。ナノスプレーイオン源を搭載した四重極飛行時間型質量分析計(Triple TOF（登録商標） 5600 system; SCIEX)とnanoLCシステム(Eksigent Nano LC Ultra 1D Plus; SCIEX, Massachusetts, USA)からなるLC-nano-ESI-MSを用いて、ペプチド断片の定量解析、タンパク質の同定を行った。nanoLCに用いたトラップカラムはNanoLC Trap ChromXP C18, 3 μm 120Å(SCIEX) 、分離カラムは3 μm C18-シリカ粒子を充填した12.5 cm × 75 μm キャピラリカラム（日京テクノス）を用いた。マイクロポンプ（流速300nL/min）グラジエント法により、以下の移動相によってペプチドを分離しつつ、質量分析を行った。A：2%アセトニトリル、0.1%ギ酸、移動相B：アセトニトリル、0.1%ギ酸 aq. 0-20分：5-45%B、20-21分：45-100%B、21-26分：100%B。nanoLC-MS/MS データは、Analyst（登録商標） TF 1.5.1 ソフトウェア (SCIEX) で制御された情報依存型取得モードで取得した。蓄積時間は0.25秒、フルMS（MS1、TOF-MS）スキャン範囲は400-1250 m/z、12秒間は前ターゲットイオンの繰り返し測定を行えない設定、質量公差は50 mDa、フルMSスキャンごとに上位10シグナルをMS2スキャンに選択する設定であった。MS2（プロダクトイオン）スキャンの蓄積時間と範囲はそれぞれ0.05秒と100-1500 m/zであった。すべての実験は3回繰り返し行った。MS/MSスペクトルは、解析ソフトMaxQuantを用いて、それぞれのタンパク質の既知のアミノ酸配列、もしくはuniprotから取得されたヒトの全タンパク質構造を対象に検索した。プローブ分子の修飾されたペプチド断片に関しては、リジン残基へのNBD修飾（＋C6HN3O3, 163.0018 Da）を考慮し、修飾ペプチド断片を定量比較した。anti-NBD抗体による濃縮前後の質量分析結果を図１３に示す。
〔実施例１５〕　二次元電気泳動によるCAの変性状態の可視化とリガンドの有無による影響（BrNDB）
　プローブとしてBrNDBを使用し、実施例４と同様の方法で、brinzolamideの存在又は非存在下、Bovine carbonic anhydrase（CA）の二次元電気泳動を行った（図１４）。図１４に示すように、brinzolamideの存在下では、CAの蛍光強度が低下しており、brinzolamideの添加による熱抵抗性の獲得を可視化することできた。
〔実施例１６〕　二次元電気泳動によるCAの変性状態の可視化とリガンドの有無による影響（iPrONBDとBrNBDの比較）
　プローブとしてiPrONBD又はBrNDBを使用し、実施例１５と同様の方法で二次元電気泳動を行い、結果を比較した（図１５）。図１５に示すように、BrNDBを使用した場合の方がCAの蛍光強度の低下が顕著であった。変性温度に応じて適切なプローブが異なる。この変性条件（65℃、5分）では、Br-NBDが適切なプローブである。
〔実施例１７〕　Geldanamycinの添加によるHSP90沈殿への影響と変性HSP90のプローブによる蛍光検出
　HeLa細胞をスクレーパーではがし、氷冷したPBSで3回洗浄し、protease inhibitor cocktail (ナカライ, 25955-24)を氷冷したM-PER buffer (Thermo Fisher Scientific, 78503)に再懸濁させ、氷上で10分間静置した。20,000×g、20分間、4℃で遠心分離し、細胞溶解液から上清を分離した。タンパク濃度は、BCA法を用いて決定した。上清 (2 mg/ml) をgeldanamycin (TCI, G0334; 終濃度 50 μM) とDMSOを同量添加し、室温で10分間処理し、10×濃度のCaCl2緩衝液 (0.5 M Tris, 0.5 M NaCl, 0.2 M CaCl2, pH 8.0)の添加後に室温で5分間静置した。サンプルに対して、100mMのONBDのストック溶液(DMSO溶液)から終濃度が1mMになるように加え、37℃で30分間静置したのち、溶液をPCRチューブに移した。PCRチューブをサーマルサイクラー (MiniAmp Plus) を用いて各温度で5分間加熱し、その後、室温で静置した。サンプルを20,000×g、15分、4℃で遠心分離した。Pellet画分の1D SDS-PAGE (Bio-Rad, 4-10% アクリルアミドゲル)では1×SDSサンプルバッファーと混合し、5分間95℃で加熱し、SDS-PAGEを行った。
　ONBDとして、iPrONBDを使用した場合のSDS-PAGEの結果、及び各加熱温度における相対蛍光強度を図１６に示す。細胞内在性のHSP90を標的にした場合においてもリガンドの添加による標的の熱変性抵抗性の獲得を可視化することが可能であった。
〔実施例１８〕　Geldanamycinの添加による変性HSP90のプローブによる蛍光検出における各プローブの比較
　種々のプローブを使用し、加熱条件を45℃、5分として、実施例１７と同様の方法で、SDS-PAGEを行った（図１７）。右側のプローブはより高温でのタンパク質を検出するのに適しているが、HSP90のような低温側（45℃付近）で変性するようなタンパク質の検出には適しておらず、左型の反応性の高いプローブの使用が望ましかった。
〔実施例１９〕　細胞内環境でのプロープ分子の反応（Geldanamycinの添加による変性HSP90の比較）
　HeLa細胞をスクレーパーではがし、氷冷したPBSで3回洗浄し、protease inhibitor cocktail (ナカライ, 25955-24)を氷冷したM-PER buffer (Thermo Fisher Scientific, 78503)に再懸濁させ、氷上で10分間静置した。20,000×g、20分間、4℃で遠心分離し、細胞溶解液から上清を分離した。タンパク濃度は、BCA法を用いて決定した。上清 (2 mg/ml) をgeldanamycin (TCI, G0334; 終濃度 50 μM) とDMSOを同量添加し、室温で10分間処理し、10×濃度のCaCl2緩衝液 (0.5 M Tris, 0.5 M NaCl, 0.2 M CaCl2, pH 8.0)の添加後に室温で5分間静置した。サンプルに対して、100mMのiPrONBDのストック溶液(DMSO溶液)から終濃度が1mMになるように加え、37℃で30分間静置したのち、溶液をPCRチューブに移した。PCRチューブをサーマルサイクラー (MiniAmp Plus) を用いて45℃で5分間加熱し、その後、室温で静置した。バイオラッド社のReadyPrep 2-D clenup kitのプロトコルに従い、サンプルを調製し、最後に得られるペレットをAuto2D Glycine type Reagent Kitに含まれる膨潤バッファー（ampolyte pH3-10を含む）15 μLで溶解させた後、
二次元電気泳動を行った（図１８）。生細胞内でプローブを反応させ、細胞破砕液の総タンパク質を解析した結果においても、標的であるHSP90のリガンド添加による熱変性抵抗性の変化を可視化することが可能であった。
〔実施例２０〕　二次元電気泳動のスポットからのタンパク質同定
　2次元電気泳動に関しては、Auto 2D plus（Merck）の長時間プロトコルに従って行い、得られたゲルは蛍光イメージャー（Vilver Lourmat, Fusion Solo S）で蛍光画像を取得した。その後、ゲルに含まれる全タンパク質の染色は、CBB染色（ナカライ、CBBステインワンsuper,11642-44）をメーカープロトコルに従って行い、画像を同様に撮影した。同定したい対象のスポットを切り取り、ゲル片をマイクロチューブに移し、1 mLの水を加え、37℃で10分間静置した。溶液を除去し、洗浄操作を3回繰り返した。脱染は、100 mM Tris buffer (pH 8.0) 中の50% アセトニトリル を加え、37 ℃で10分間静置後、溶液を除去した。脱水用チューブにアセトニトリルを加え、37 ℃で10分間静置した。溶液を除去した後、トリプシン溶液（Promega, Trypsin Gold）を各チューブに加え、37 ℃で一晩静置した。10%トリフルオロ酢酸（TFA）水溶液（終濃度0.4%）になるように加えて反応をクエンチした。50% アセトニトリル /  0.1% TFAを加え、37℃で10分間静置した。軽く撹拌後、遠心をかけ、抽出液を回収し、80% アセトニトリル / 0.1% TFAを加え、37℃で2分間静置した。軽く撹拌、遠心をかけ抽出液を回収した。回収した抽出液をまとめて濃縮遠心機にて乾固し、5% アセトニトリル / 0.1% TFAで再溶解したサンプルに対して質量分析により、タンパク質を同定した（図１９）。質量分析は、実施例１４と同様の方法で行った。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
　本発明は、変性タンパク質や凝集タンパク質が関連する産業分野において利用可能である。

Claims (17)

  1. 　タンパク質の変性状態又は凝集状態を可視化する方法であって、タンパク質を下記の一般式(I)
    〔式中、R1は、炭素数1～12の直鎖アルキル基（但し、アルキル基中の1以上の-CH2-CH2-は-CO-NH-に置換されていてもよい。）、炭素数3～10の分岐鎖アルキル基（但し、アルキル基中の互いに隣接しない1以上の炭素原子は窒素原子又は酸素原子に置換されていてもよい。）、置換基で置換されていてもよい炭素数3～10のシクロアルキル基（但し、シクロアルキル基中の互いに隣接しない1以上の炭素原子は窒素原子又は酸素原子に置換されていてもよい。）、置換基で置換されていてもよいアリール基、置換基で置換されていてもよいヘテロアリール基、-(CH2-CH2-O-)n-CH3で表される基（nは1～4の整数を表す。）、アダマンチル基、又はハロゲン原子を表し、R2及びR3は、それぞれ独立して、水素原子、又は炭素数1～3の直鎖若しくは分岐鎖アルキル基を表し、X1は、ニトロ基、又は-SO2NR4R5で表される基（ここで、R4及びR5は、それぞれ独立して、炭素数1～3の直鎖若しくは分岐鎖アルキル基を表す。）を表し、X2は、下記の式(i)～(v)
    （式中、*は結合手を示し、一般式(I)中の窒素原子に結合する。）
    のいずれかで表される基を表し、X3は、存在しないか、又は酸素原子若しくは硫黄原子を表す。〕
    で表される化合物と接触させる工程、及び一般式(I)で表される化合物の反応物の蛍光を検出する工程を含むことを特徴とする方法。
  2. 　一般式(I)におけるR1が、炭素数4～12の直鎖アルキル基（但し、アルキル基中の1以上の-CH2-CH2-は-CO-NH-に置換されていてもよい。）、炭素数3～5の分岐鎖アルキル基（但し、アルキル基中の互いに隣接しない1以上の炭素原子は窒素原子又は酸素原子に置換されていてもよい。）、置換基で置換されていてもよい炭素数4～6のシクロアルキル基（但し、シクロアルキル基中の互いに隣接しない1以上の炭素原子は窒素原子又は酸素原子に置換されていてもよい。）、置換基で置換されていてもよいフェニル基、置換基で置換されていてもよい2-チエニル基、置換基で置換されていてもよい3-チエニル基、置換基で置換されていてもよい2-フラニル基、置換基で置換されていてもよい3-フラニル基、置換基で置換されていてもよい2-ピリジル基、置換基で置換されていてもよい3-ピリジル基、置換基で置換されていてもよい4-ピリジル基、又は-(CH2-CH2-O-)n-CH3で表される基（nは2又は3を表す。）であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 　一般式(I)におけるR1が、n-ブチル基、n-オクチル基、iso-プロピル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、3-ペンチル基、1-メチル-2-メチルアミノ-エチル基、シクロアルキル基、3-アゼチジル基、3-ピペリジニル基、3-アミノメチルシクロブチル基、3-アミノシクロペンチル基、4-アミノシクロヘキシル基、フェニル基、2-チエニル基、3-チエニル基、2-フラニル基、3-フラニル基、2-ピリジル基、3-ピリジル基、4-ピリジル基、又は-(CH2-CH2-O-)2-CH3で表される基であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  4. 　一般式(I)におけるR1が、n-ブチル基、n-オクチル基、iso-プロピル基、3-ペンチル基、又は-(CH2-CH2-O-)2-CH3で表される基であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  5. 　タンパク質の変性状態又は凝集状態の可視化剤であって、下記の一般式(I)
    〔式中、R1は、炭素数1～12の直鎖アルキル基（但し、アルキル基中の1以上の-CH2-CH2-は-CO-NH-に置換されていてもよい。）、炭素数3～10の分岐鎖アルキル基（但し、アルキル基中の互いに隣接しない1以上の炭素原子は窒素原子又は酸素原子に置換されていてもよい。）、置換基で置換されていてもよい炭素数3～10のシクロアルキル基（但し、シクロアルキル基中の互いに隣接しない1以上の炭素原子は窒素原子又は酸素原子に置換されていてもよい。）、置換基で置換されていてもよいアリール基、置換基で置換されていてもよいヘテロアリール基、-(CH2-CH2-O-)n-CH3で表される基（nは1～4の整数を表す。）、アダマンチル基、又はハロゲン原子を表し、R2及びR3は、それぞれ独立して、水素原子、又は炭素数1～3の直鎖若しくは分岐鎖アルキル基を表し、X1は、ニトロ基、又は-SO2NR4R5で表される基（ここで、R4及びR5は、それぞれ独立して、炭素数1～3の直鎖若しくは分岐鎖アルキル基を表す。）を表し、X2は、下記の式(i)～(v)
    （式中、*は結合手を示し、一般式(I)中の窒素原子に結合する。）
    のいずれかで表される基を表し、X3は、存在しないか、又は酸素原子若しくは硫黄原子を表す。〕
    で表される化合物を含むことを特徴とする可視化剤。
  6. 　一般式(I)におけるR1が、炭素数4～12の直鎖アルキル基（但し、アルキル基中の1以上の-CH2-CH2-は-CO-NH-に置換されていてもよい。）、炭素数3～5の分岐鎖アルキル基（但し、アルキル基中の互いに隣接しない1以上の炭素原子は窒素原子又は酸素原子に置換されていてもよい。）、置換基で置換されていてもよい炭素数4～6のシクロアルキル基（但し、シクロアルキル基中の互いに隣接しない1以上の炭素原子は窒素原子又は酸素原子に置換されていてもよい。）、置換基で置換されていてもよいフェニル基、置換基で置換されていてもよい2-チエニル基、置換基で置換されていてもよい3-チエニル基、置換基で置換されていてもよい2-フラニル基、置換基で置換されていてもよい3-フラニル基、置換基で置換されていてもよい2-ピリジル基、置換基で置換されていてもよい3-ピリジル基、置換基で置換されていてもよい4-ピリジル基、又は-(CH2-CH2-O-)n-CH3で表される基（nは2又は3を表す。）であることを特徴とする請求項５に記載の可視化剤。
  7. 　一般式(I)におけるR1が、n-ブチル基、n-オクチル基、iso-プロピル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、3-ペンチル基、1-メチル-2-メチルアミノ-エチル基、シクロアルキル基、3-アゼチジル基、3-ピペリジニル基、3-アミノメチルシクロブチル基、3-アミノシクロペンチル基、4-アミノシクロヘキシル基、フェニル基、2-チエニル基、3-チエニル基、2-フラニル基、3-フラニル基、2-ピリジル基、3-ピリジル基、4-ピリジル基、又は-(CH2-CH2-O-)2-CH3で表される基であることを特徴とする請求項５に記載の可視化剤。
  8. 　一般式(I)におけるR1が、n-ブチル基、n-オクチル基、iso-プロピル基、3-ペンチル基、又は-(CH2-CH2-O-)2-CH3で表される基であることを特徴とする請求項５に記載の可視化剤。
  9. 　試料中の変性タンパク質又は凝集タンパク質を特定する方法であって、試料を下記の一般式(I)
    〔式中、R1は、炭素数1～12の直鎖アルキル基（但し、アルキル基中の1以上の-CH2-CH2-は-CO-NH-に置換されていてもよい。）、炭素数3～10の分岐鎖アルキル基（但し、アルキル基中の互いに隣接しない1以上の炭素原子は窒素原子又は酸素原子に置換されていてもよい。）、置換基で置換されていてもよい炭素数3～10のシクロアルキル基（但し、シクロアルキル基中の互いに隣接しない1以上の炭素原子は窒素原子又は酸素原子に置換されていてもよい。）、置換基で置換されていてもよいアリール基、置換基で置換されていてもよいヘテロアリール基、-(CH2-CH2-O-)n-CH3で表される基（nは1～4の整数を表す。）、アダマンチル基、又はハロゲン原子を表し、R2及びR3は、それぞれ独立して、水素原子、又は炭素数1～3の直鎖若しくは分岐鎖アルキル基を表し、X1は、ニトロ基、又は-SO2NR4R5で表される基（ここで、R4及びR5は、それぞれ独立して、炭素数1～3の直鎖若しくは分岐鎖アルキル基を表す。）を表し、X2は、下記の式(i)～(v)
    （式中、*は結合手を示し、一般式(I)中の窒素原子に結合する。）
    のいずれかで表される基を表し、X3は、存在しないか、又は酸素原子若しくは硫黄原子を表す。〕
    で表される化合物と接触させる工程、試料中のタンパク質を分離する工程、及び一般式(I)で表される化合物の反応物の蛍光を検出する工程を含むことを特徴とする方法。
  10. 　一般式(I)におけるR1が、炭素数4～10の直鎖アルキル基（但し、アルキル基中の1以上の-CH2-CH2-は-CO-NH-に置換されていてもよい。）、炭素数3～5の分岐鎖アルキル基（但し、アルキル基中の互いに隣接しない1以上の炭素原子は窒素原子又は酸素原子に置換されていてもよい。）、置換基で置換されていてもよい炭素数4～6のシクロアルキル基（但し、シクロアルキル基中の互いに隣接しない1以上の炭素原子は窒素原子又は酸素原子に置換されていてもよい。）、置換基で置換されていてもよいフェニル基、置換基で置換されていてもよい2-チエニル基、置換基で置換されていてもよい3-チエニル基、置換基で置換されていてもよい2-フラニル基、置換基で置換されていてもよい3-フラニル基、置換基で置換されていてもよい2-ピリジル基、置換基で置換されていてもよい3-ピリジル基、置換基で置換されていてもよい4-ピリジル基、又は-(CH2-CH2-O-)n-CH3で表される基（nは2又は3を表す。）であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
  11. 　一般式(I)におけるR1が、n-ブチル基、n-オクチル基、iso-プロピル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、3-ペンチル基、1-メチル-2-メチルアミノ-エチル基、シクロアルキル基、3-アゼチジル基、3-ピペリジニル基、3-アミノメチルシクロブチル基、3-アミノシクロペンチル基、4-アミノシクロヘキシル基、フェニル基、2-チエニル基、3-チエニル基、2-フラニル基、3-フラニル基、2-ピリジル基、3-ピリジル基、4-ピリジル基、又は-(CH2-CH2-O-)2-CH3で表される基であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
  12. 　一般式(I)におけるR1が、n-ブチル基、n-オクチル基、iso-プロピル基、3-ペンチル基、又は-(CH2-CH2-O-)2-CH3で表される基であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
  13. 　試験化合物と結合するタンパク質を同定する方法であって、以下の工程：
    （１）タンパク質を含む試料に、試験化合物と蛍光物質を添加する工程、
    （２）工程（１）の試料を加熱する工程、
    （３）工程（２）の試料中に含まれるタンパク質を分離する工程、
    （４）工程（３）によって分離された各タンパク質の蛍光強度を測定する工程、
    （５）タンパク質を含む試料に、蛍光物質を添加する工程、
    （６）工程（５）の試料を加熱する工程、
    （７）工程（６）の試料中に含まれるタンパク質を分離する工程、
    （８）工程（７）によって分離された各タンパク質の蛍光強度を測定する工程、
    （９）工程（４）で測定された各タンパク質の蛍光強度と工程（８）で測定された各タンパク質の蛍光強度を比較し、工程（４）で測定された蛍光強度が、工程（８）で測定された蛍光強度よりも低いタンパク質を、試験化合物と結合するタンパク質と同定する工程
    を含み、蛍光物質が、下記の一般式(I)
    〔式中、R1は、炭素数1～12の直鎖アルキル基（但し、アルキル基中の1以上の-CH2-CH2-は-CO-NH-に置換されていてもよい。）、炭素数3～10の分岐鎖アルキル基（但し、アルキル基中の互いに隣接しない1以上の炭素原子は窒素原子又は酸素原子に置換されていてもよい。）、置換基で置換されていてもよい炭素数3～10のシクロアルキル基（但し、シクロアルキル基中の互いに隣接しない1以上の炭素原子は窒素原子又は酸素原子に置換されていてもよい。）、置換基で置換されていてもよいアリール基、置換基で置換されていてもよいヘテロアリール基、-(CH2-CH2-O-)n-CH3で表される基（nは1～4の整数を表す。）、アダマンチル基、又はハロゲン原子を表し、R2及びR3は、それぞれ独立して、水素原子、又は炭素数1～3の直鎖若しくは分岐鎖アルキル基を表し、X1は、ニトロ基、又は-SO2NR4R5で表される基（ここで、R4及びR5は、それぞれ独立して、炭素数1～3の直鎖若しくは分岐鎖アルキル基を表す。）を表し、X2は、下記の式(i)～(v)
    （式中、*は結合手を示し、一般式(I)中の窒素原子に結合する。）
    のいずれかで表される基を表し、X3は、存在しないか、又は酸素原子若しくは硫黄原子を表す。〕
    で表される化合物であることを特徴とする方法。
  14. 　一般式(I)におけるR1が、炭素数4～12の直鎖アルキル基（但し、アルキル基中の1以上の-CH2-CH2-は-CO-NH-に置換されていてもよい。）、炭素数3～5の分岐鎖アルキル基（但し、アルキル基中の互いに隣接しない1以上の炭素原子は窒素原子又は酸素原子に置換されていてもよい。）、置換基で置換されていてもよい炭素数4～6のシクロアルキル基（但し、シクロアルキル基中の互いに隣接しない1以上の炭素原子は窒素原子又は酸素原子に置換されていてもよい。）、置換基で置換されていてもよいフェニル基、置換基で置換されていてもよい2-チエニル基、置換基で置換されていてもよい3-チエニル基、置換基で置換されていてもよい2-フラニル基、置換基で置換されていてもよい3-フラニル基、置換基で置換されていてもよい2-ピリジル基、置換基で置換されていてもよい3-ピリジル基、置換基で置換されていてもよい4-ピリジル基、又は-(CH2-CH2-O-)n-CH3で表される基（nは2又は3を表す。）であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
  15. 　一般式(I)におけるR1が、n-ブチル基、n-オクチル基、iso-プロピル基、sec-ブチル基、tert-ブチル基、3-ペンチル基、1-メチル-2-メチルアミノ-エチル基、シクロアルキル基、3-アゼチジル基、3-ピペリジニル基、3-アミノメチルシクロブチル基、3-アミノシクロペンチル基、4-アミノシクロヘキシル基、フェニル基、2-チエニル基、3-チエニル基、2-フラニル基、3-フラニル基、2-ピリジル基、3-ピリジル基、4-ピリジル基、又は-(CH2-CH2-O-)2-CH3で表される基であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
  16. 　一般式(I)におけるR1が、n-ブチル基、n-オクチル基、iso-プロピル基、3-ペンチル基、又は-(CH2-CH2-O-)2-CH3で表される基であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
  17. 　下記の一般式(Ia)、(Ib)、又は(Ic)
    〔式中、R1aは、iso-プロピル基、n-ブチル基、3-ペンチル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、2-アダマンチル基、n-ヘキシル基、n-オクチル基、n-デシル基、n-ドデシル基、iso-ブチル基、5-ノニル基、又はジエチレングリコール基を表し、R1bは、臭素原子、又はヨウ素原子を表し、R1cは、メチル基、又はiso-プロピル基を表す。〕
    で表される化合物。
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