CN112251043B - 硅基罗丹明荧光染色试剂及其制备方法和应用 - Google Patents

硅基罗丹明荧光染色试剂及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112251043B
CN112251043B CN202011023009.6A CN202011023009A CN112251043B CN 112251043 B CN112251043 B CN 112251043B CN 202011023009 A CN202011023009 A CN 202011023009A CN 112251043 B CN112251043 B CN 112251043B
Authority
CN
China
Prior art keywords
organic solvent
stirring
staining reagent
dissolving
silicon
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011023009.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112251043A (zh
Inventor
李坤
张宏
刘艳红
余孝其
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sichuan University
Original Assignee
Sichuan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sichuan University filed Critical Sichuan University
Priority to CN202011023009.6A priority Critical patent/CN112251043B/zh
Publication of CN112251043A publication Critical patent/CN112251043A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112251043B publication Critical patent/CN112251043B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B57/00—Other synthetic dyes of known constitution
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F7/00—Compounds containing elements of Groups 4 or 14 of the Periodic Table
    • C07F7/02—Silicon compounds
    • C07F7/08—Compounds having one or more C—Si linkages
    • C07F7/0803—Compounds with Si-C or Si-Si linkages
    • C07F7/081—Compounds with Si-C or Si-Si linkages comprising at least one atom selected from the elements N, O, halogen, S, Se or Te
    • C07F7/0812—Compounds with Si-C or Si-Si linkages comprising at least one atom selected from the elements N, O, halogen, S, Se or Te comprising a heterocyclic ring
    • C07F7/0816—Compounds with Si-C or Si-Si linkages comprising at least one atom selected from the elements N, O, halogen, S, Se or Te comprising a heterocyclic ring said ring comprising Si as a ring atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1029—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing one nitrogen atom as the heteroatom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1044—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing two nitrogen atoms as heteroatoms
    • C09K2211/1055—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing two nitrogen atoms as heteroatoms with other heteroatoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1096—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing other heteroatoms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)

Abstract

本发明公开了一种硅基罗丹明荧光染色试剂及其制备方法和应用，属于有机化学和生物化学领域。本发明以硅原子取代的罗丹明衍生物为基础骨架，通过进行不同形式的芳香胺的修饰，合成了具有大斯托克斯位移、高荧光强度能够标记免疫球蛋白IgG的硅基罗丹明荧光染色试剂，从而可用于体外SARS‑CoV‑2病毒特异性抗体荧光ELISA检测。本发明的硅基罗丹明荧光染色试剂具有较大的斯托克斯位移(＞140nm)可以有效避免激发和发射光的相互干扰，检测灵敏度高，基于该荧光抗体建立的荧光ELISA检测方法能够适用于不同带宽的酶标仪，应用范围广。

Description

硅基罗丹明荧光染色试剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及有机化学和生物化学领域，尤其涉及免疫学技术领域，具体涉及一种硅基罗丹明荧光染色试剂及其制备方法和应用。
背景技术
SARS-CoV-2病毒是引起2019严重急性呼吸道综合征(severe acute respiratorysyndrome，SARS)的一种新型冠状致病病原体，感染者以呼吸道症状和肺炎为主要临床表现。2020年2月药物国际病毒分类委员会将该病毒正式命名为SARS-CoV-2，世界卫生组织(World Health Organization，WHO)将疾病命名为2019冠状病毒病(2019corona virusdisease，COVID-19)。SARS-CoV-2病毒传播能力强、潜伏时间长、发病率高，传统的病毒防御措施控制效果不佳，全球大流行趋势明显，病毒防控形势严峻。
SARS-CoV-2属于β属冠状病毒B亚群。高分辨电子显微镜观察，SARS-CoV-2病毒表面存在日冕状突起，形似王冠。基因测序分析显示，SARS-CoV-2与SARS-CoV存在80％的同源性和MERS-CoV有50％的同源性。SARS-CoV-2病毒包含有棘突蛋白S(Spike)、基质蛋白M(matrix)，包膜蛋白E(Envelope)和核蛋白N(nuclearprotein)等结构蛋白。其中，S蛋白包含S1和S2两个片段。S1蛋白是病毒与宿主细胞识别的关键蛋白，以高亲和力与细胞表面的血管细胞受体血管紧张肽转化酶2(angiotensin.Convertingenzyme 2,ACE2)结合，具有抗原性和免疫原性。因此，S1蛋白也被作为抗病毒药物筛选和新型疫苗制备的主要靶点。
高传染性COVID-19在全球范围内蔓延，目前，快速、灵敏、安全地检测SARS-CoV-2病毒依然是病毒防控的关键。基于核酸检测的方法如实时定量PCR、恒温PCR等。虽然核酸检测的灵敏度较高，但仍然存在样本取样差异大、前期处理过程复杂、对实验操作人员的要求高、检测实验室需具有P2级以上生物安全级别以及样本需要冷链运输等问题，给感染者的快速排查带来一定的难度。与核酸检测的方法不同，酶联免疫结合方法(Enzyme-LinkedImmunoSorbent Assay,ELISA)的样本为全血或血清，与咽拭子相比，血样中病毒载量低、取样方便、操作简便、结果稳定、对实验室的要求性相对较低。因此，血清抗体的ELISA检测可以作为病毒核酸检测的有效补充或替代方法。
ELISA法是利用抗原和抗体特异性结合的原理对特定的抗原或血清抗体进行检测的方法。SARS-CoV-2病毒侵染宿主后，由于病毒表面蛋白的抗原性，而激活宿主自身的免疫应答过程。免疫细胞活化、增殖产生免疫效应物质抗体。COVID-19患者在感染SARS-CoV-2病毒后14天，即可在血清中检测到特异性免疫球蛋白IgG。
荧光法ELISA是将荧光染料通过特定的反应官能团与二抗IgG进行偶联，二抗与一抗特异性结合后，通过测定荧光强度值反映样本中抗原或抗体的含量。与紫外吸光法相比，荧光法具有检测灵敏度高、无需特定的底物、操作步骤较少、结果稳定可重复等优点，适用于免疫检测试剂盒的开发。但是，传统的染料如：花菁类、酞菁类和荧光素等由于斯托克位移小，在带宽为18nm的光栅式或滤光片式常规酶标仪中均存在激发光和发射光相互干扰的情况，限制了荧光法在ELISA检测中的应用。
因此，开发大斯托克位移、高荧光强度的荧光染料，并高效标记免疫球蛋白IgG，对于建立高灵敏度的荧光ELISA并用于SARS-CoV-2病毒特异性抗体检测具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于硅原子取代的罗丹明衍生物骨架的大斯托克位移、高荧光强度的荧光染料及其制备方法和用途，以解决现有抗体标记染料斯托克斯位移小难以应用于荧光法ELISA检测的问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
一种硅基罗丹明荧光染色试剂，具有式(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示结构：
Figure BDA0002701272680000021
其中，R1为C1-C10烷基链或芳香基团。
在本发明的一些示例中，R1为亚甲基。
在本发明的一些示例中，R1为芳香基团：苯基、萘基或吡啶基。
在本发明较佳的实施例中，上述硅基罗丹明荧光染色试剂为：
Figure BDA0002701272680000031
一种制备具有式(Ⅰ)的硅基罗丹明荧光染色试剂的方法，其包括以下步骤：
(1.1)将间溴苯胺和1，4-二溴丁烷溶于第一有机溶剂中并加入第一弱碱加热搅拌，反应得到中间体A1；
(1.2)在惰性气氛下将所述中间体A1加入至三氯氧磷和DMF的混合溶液中搅拌，然后加入水淬灭反应，得到的反应液用二氯甲烷或乙酸乙酯萃取，得到中间体A2；
(1.3)将所述中间体A2和第一还原剂加入至第二有机溶剂中搅拌，然后加入水淬灭反应，得到的反应液用二氯甲烷或乙酸乙酯萃取，得到中间体A3；
(1.4)将所述中间体A1和所述中间体A3加入至第三有机溶剂，加入三氟化硼乙醚搅拌，反应得到中间体A4；
(1.5)将所述中间体A4溶于第四有机溶剂并将溶液冷却至0℃以下，加入强碱，在搅拌下加入二氯二甲基硅烷，随后加入水淬灭反应，得到的反应液用二氯甲烷或乙酸乙酯萃取，得到中间体A5；
(1.6)将所述中间体A5溶于第五有机溶剂中，在搅拌下加入高锰酸钾继续搅拌，反应得到中间体A6；
(1.7)将所述中间体A6溶于第六有机溶剂中，在搅拌下加入第二弱碱，再加入三氟甲磺酸酐，在搅拌下加入
Figure BDA0002701272680000032
制得具有式(Ⅰ)的硅基罗丹明荧光染色试剂；其中，R1为C1-C10烷基链或芳香基团。
在本发明较佳的实施例中，上述方法的步骤(1.1.)中：搅拌时间为10-14h；所述第一有机溶剂为DMSO和DMF中的一种或两种组合，所述第一弱碱为碳酸钠、碳酸钾、磷酸钾和磷酸钠中的一种或多种组合；
步骤(1.2)中：在0℃充分搅拌后升温至60-80℃并搅拌过夜；
步骤(1.3)中：在室温下搅拌6-10h；所述第一还原剂为硼氢化钠、硼氢化钾和氢化铝锂中的一种或多种组合，所述第二有机溶剂为甲醇、乙醇、二氧六环和四氢呋喃中的一种或多种组合；
步骤(1.4)中：在室温下搅拌5-7h；所述第三有机溶剂为二氯甲烷和三氯甲烷中的一种或两种组合；
步骤(1.5)中：将所述溶液进一步冷却至-70～-80℃，搅拌时间为45-80min；所述第四有机溶剂为四氢呋喃和乙醚中的一种或两种组合，所述强碱为正丁基锂、仲丁基锂或叔丁基锂；
步骤(1.6)中：加入高锰酸钾之前，将体系温度冷却至0℃，然后加入高锰酸钾搅拌5-7h；所述第五有机溶剂为丙酮和乙腈中的一种或两种组合；
步骤(1.7)中：加入三氟甲磺酸酐之前，将体系温度冷却至0℃，然后加入三氟甲磺酸酐搅拌45-80min，加入
Figure BDA0002701272680000041
后在室温下搅拌5-7h；所述第六有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈和DMF中的一种或多种组合，所述第二弱碱为吡啶、三乙胺和4-二甲氨基吡啶中的一种或多种组合。
一种制备具有式(Ⅱ)的硅基罗丹明荧光染色试剂的方法，其包括以下步骤：
(2.1)将6-溴吲哚溶于第七有机溶剂中在搅拌条件下加入碘甲烷和第一弱碱反应，得到中间体B1；
(2.2)将所述中间体B2溶于第八有机溶剂中并在搅拌条件下加入第二还原剂，得到中间体B2；
(2.3)将所述中间体B2加入至三氯氧磷和DMF的混合溶液中搅拌，反应得到中间体B3；
(2.4)将所述中间体B3和第一还原剂加入至第二有机溶剂中搅拌，反应得到中间体B4；
(2.5)将所述中间体B2和所述中间体B4加入至第三有机溶剂，加入三氟化硼乙醚搅拌，反应得到中间体B5；
(2.6)将所述中间体B5溶于第四有机溶剂并将溶液冷却至0℃以下，加入强碱，在搅拌下加入二氯二甲基硅烷，随后加入水淬灭反应，得到的反应液用二氯甲烷萃取，得到中间体B6；
(2.7)将所述中间体B6溶于第五有机溶剂中，在搅拌下加入高锰酸钾继续搅拌，反应得到中间体B7；
(2.8)将所述中间体B7溶于第六有机溶剂中，在搅拌下加入第二弱碱，再加入三氟甲磺酸酐，在搅拌下加入
Figure BDA0002701272680000042
制得具有式(Ⅱ)的硅基罗丹明荧光染色试剂；其中，R1为C1-C10烷基链或芳香基团。
在本发明较佳的实施例中，上述方法的步骤(2.1)中：所述第七有机溶剂为四氢呋喃、DMF、乙醚和乙腈中的一种或多种组合，所述第一弱碱为碳酸钠、碳酸钾、磷酸钾和磷酸钠中的一种或多种组合；
步骤(2.2)中：所述第八有机溶剂为乙酸和丙酸中的一种或两种组合，所述第二还原剂氰基硼氢化钠；
步骤(2.4)中：所述第一还原剂为硼氢化钠、硼氢化钾和氢化铝锂中的一种或多种组合，所述第二有机溶剂为甲醇、乙醇、二氧六环和四氢呋喃中的一种或多种组合；
步骤(2.5)中：所述第三有机溶剂为二氯甲烷和三氯甲烷中的一种或两种组合；
步骤(2.6)中：所述第四有机溶剂为四氢呋喃和乙醚中的一种或两种组合，所述强碱为正丁基锂、仲丁基锂或叔丁基锂；
步骤(2.7)中：所述第五有机溶剂为丙酮和乙腈中的一种或两种组合；
步骤(2.8)中：所述第六有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈和DMF中的一种或多种组合，所述第二弱碱为吡啶、三乙胺和4-二甲氨基吡啶中的一种或多种组合。
一种制备具有式(Ⅲ)的硅基罗丹明荧光染色试剂的方法，其包括以下步骤：
(3.1)将将间溴苯胺、丙酮和碘单质溶于第九有机溶剂中，加入第一弱碱加热搅拌，反应得到中间体C1；
(3.2)将所述中间体C1溶于第七有机溶剂，搅拌下，加入所述第一弱碱和碘甲烷，反应得到中间体C2；
(3.3)将所述中间体C2加入至三氯氧磷和DMF的混合溶液中搅拌，反应得到中间体C3；
(3.4)将所述中间体C3和第一还原剂加入至第二有机溶剂中搅拌，反应得到中间体C4；
(3.5)将所述中间体C2和所述中间体C4加入至第三有机溶剂，加入三氟化硼乙醚搅拌，反应得到中间体C5；
(3.6)将所述中间体C5溶于第四有机溶剂并将溶液冷却至0℃以下，加入强碱，在搅拌下加入二氯二甲基硅烷，随后加入水淬灭反应，得到的反应液用二氯甲烷萃取，得到中间体C6；
(3.7)将所述中间体C6溶于第五有机溶剂中，在搅拌下加入高锰酸钾继续搅拌，反应得到中间体C7；
(3.8)将所述中间体C7溶于第六有机溶剂中，在搅拌下加入第二弱碱，再加入三氟甲磺酸酐，在搅拌下加入
Figure BDA0002701272680000051
制得具有式(Ⅲ)的硅基罗丹明荧光染色试剂；其中，R1为C1-C10烷基链或芳香基团。
在本发明较佳的实施例中，上述方法的步骤(3.1.)中：所述第九有机溶剂为四氢呋喃、乙腈和DMF中的一种或多种组合，所述第一弱碱为碳酸钠、碳酸钾、磷酸钾和磷酸钠中的一种或多种组合；
步骤(3.2)中：所述第七有机溶剂为四氢呋喃、DMF、乙醚和乙腈中的一种或多种组合；
步骤(3.4)中：所述第一还原剂为硼氢化钠、硼氢化钾和氢化铝锂中的一种或多种组合，所述第二有机溶剂为甲醇、乙醇、二氧六环和四氢呋喃中的一种或多种组合；
步骤(3.5)中：所述第三有机溶剂为二氯甲烷和三氯甲烷中的一种或两种组合；
步骤(3.6)中：所述第四有机溶剂为四氢呋喃和乙醚中的一种或两种组合，所述强碱为正丁基锂、仲丁基锂或叔丁基锂；
步骤(3.7)中：所述第五有机溶剂为丙酮和乙腈中的一种或两种组合；
步骤(3.8)中：所述第六有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈和DMF中的一种或多种组合，所述第二弱碱为吡啶、三乙胺和4-二甲氨基吡啶中的一种或多种组合。
硅基罗丹明荧光染色试剂在标记SARS-CoV-2病毒特异性抗体中的应用。
硅基罗丹明荧光染色试剂在制备用于检测SARS-CoV-2的试剂盒中的应用。该试剂盒主要原料为硅基罗丹明染色试剂标记的免疫球蛋白IgG，相应的PBS洗涤液，Spike蛋白等。
本发明具有以下有益效果：
本发明以硅原子取代的罗丹明衍生物为基础骨架，通过进行不同形式的芳香胺的修饰，合成了具有大斯托克斯位移、高荧光强度能够标记免疫球蛋白IgG的硅基罗丹明荧光染色试剂，从而可用于体外SARS-CoV-2病毒特异性抗体荧光ELISA检测。本发明制得的硅基罗丹明荧光染色试剂具有较大的斯托克斯位移(＞140nm)可以有效避免激发和发射光的相互干扰，检测灵敏度高。本发明的硅基罗丹明荧光染色试剂可以应用于免疫球蛋白IgG的标记，基于该荧光抗体建立的荧光ELISA检测方法能够适用于不同带宽的酶标仪，应用范围广。
本发明实施例的硅基罗丹明荧光染色试剂能够修饰免疫球蛋白，从而获得荧光标记IgG，所标记的抗体适能用于不同带宽的多功能酶标仪，并且易于包装为商品化的荧光法ELISA检测试剂盒。同时，此类分子的分子量小、反应条件温和，对抗体活性无明显影响。此外，该类分子的荧光强度大，单个抗体分子上结合2-3个荧光分子，即可实现特异性荧光检测。本发明的制备方法收率高、反应条件温和。
附图说明
图1(a)为本发明实施例1的合成路线图。图1(b)为本发明实施例2的合成路线图。图1(c)为本发明实施例3的合成路线图。
图2(a)为本发明实施例1的染色试剂的氢谱。图2(b)为本发明实施例1的染色试剂的碳谱。图2(c)为本发明实施例1的染色试剂的高分辨质谱。
图3为本发明实施例1的染色试剂在PBS溶液中的紫外吸收光谱。
图4为本发明实施例2的染色试剂在PBS溶液中的紫外吸收光谱。
图5为本发明实施例3的染色试剂在PBS溶液中的紫外吸收光谱。
图6为本发明实施例1的染色试剂在PBS溶液中的荧光发射光谱。
图7为本发明实施例2的染色试剂在PBS溶液中的荧光发射光谱。
图8为本发明实施例3的染色试剂在PBS溶液中的荧光发射光谱。
图9为本发明实施例1的化合物修饰二抗应用于荧光法ELISA在酶标仪不同带宽条件下检测SARS-CoV-2 Spike S1蛋白抗体的实验。
图10为本发明实施例1的化合物按不同接枝度修饰二抗用于SARS-CoV-2 SpikeS1蛋白抗体的ELISA实验。
图11为本发明实施例2的化合物修饰二抗应用于荧光法ELISA检测SARS-CoV-2Spike S1蛋白抗体的稳定性实验。
图12为本发明实施例3的化合物修饰二抗应用于荧光法ELISA检测COVID-19患者血清样本IgG实验。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明的下列实施例中，间溴苯胺、丁基锂、三氯氧磷、各类溶剂、催化剂、碱购于阿拉丁科技有限公司，驴抗兔IgG和羊抗人IgG购于美国Thermo Fisher Scientific公司，Spike S1蛋白购于北京义翘神州生物技术有限公司，黑色酶标板购于美国Corning公司。
需要说明的是，本发明的有机溶剂、还原剂、弱碱以及强碱等原料包括但不限于下文实施例中所记载的具体物质，本领域技术人员可以根据以下可选择的技术方案进行选择：
第一有机溶剂为二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)和二甲基甲酰胺(N,N-Dimethylformamide，DMF)中的一种或两种组合。第一有机溶剂为高沸点的DMSO和DMF，避免溶剂参与至反应。
第二有机溶剂为甲醇、乙醇、二氧六环和四氢呋喃中的一种或多种组合。第二有机溶剂的反应涉及到强还原剂，因而选用不会参与反应的甲醇、乙醇、二氧六环和四氢呋喃，避免使用常见卤代烃、DMSO和DMF等会参与反应的溶剂。
第三有机溶剂为二氯甲烷和三氯甲烷中的一种或两种组合。第三有机溶剂参与的反应为三氟化硼乙醚催化的亲电取代反应，用二氯甲烷或三氯甲烷作为溶剂能稳定中间体的形成，促进反应的发生，避免其他种类的有机溶剂会导致反应的失败，无法得到目标化合物。
第四有机溶剂为四氢呋喃和乙醚中的一种或两种组合。第四有机溶剂参与的反应涉及到有机强碱，例如正丁基锂，因此只能选用四氢呋喃和乙醚这两种不会与有机强碱发生反应的有机溶剂，避免其他种类有机溶剂加入会与有机强碱发生反应，而产生极大的危险性。
第五有机溶剂为丙酮和乙腈中的一种或两种组合。第五有机溶剂参与的反应涉及到强氧化剂高锰酸钾，因而以丙酮和乙腈作为溶剂，避免有机溶剂与该强氧化剂发生反应、导致反应失败无法得到目标化合物。
第六有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈和DMF中的一种或多种组合。第六有机溶剂参与的反应涉及到三氟甲磺酸酐，故采用非质子性溶剂二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈或DMF，避免质子性溶剂参与反应且导致中间体的溶解性不佳。
第七有机溶剂为四氢呋喃、DMF、乙醚和乙腈中的一种或多种组合。第七有机溶剂参与的反应为亲电取代反应，以四氢呋喃、DMF、乙醚或乙腈作为溶剂可避免参与反应。
第八有机溶剂为乙酸和丙酸中的一种或两种组合。第八有机溶剂参与的反应需要弱酸性环境，且必须对底物有较好的溶解性，因此只能选用这两种溶剂。
第九有机溶剂为四氢呋喃、乙腈和DMF中的一种或多种组合。第九有机溶剂涉及到底物的芳构化，因此不能选用会参与反应的卤代烃以及质子性溶剂，故只能选用四氢呋喃、乙腈或DMF。
第一弱碱为碳酸钠、碳酸钾、磷酸钾和磷酸钠中的一种或多种组合。第一弱碱作为缚酸剂，以除去反应中产生的卤化氢，且不能碱性太强发生消除反应，因此只能选择这几种组合。
第二弱碱为吡啶、三乙胺和4-二甲氨基吡啶中的一种或多种组合。第二弱碱涉及到与三氟甲磺酸酐形成活性中间体，并且兼具缚酸剂的作用，因此，只能选择这几种组合。
强碱为正丁基锂、仲丁基锂或叔丁基锂。必须要用这几种金属锂试剂来拔除芳香烃上的溴原子，只能有这三种选择。
第一还原剂为硼氢化钠、硼氢化钾和氢化铝锂中的一种或多种组合。该反应涉及到醛基的还原，且不能将卤素原子脱去，因此只能选择这几种还原剂。
第二还原剂为氰基硼氢化钠。该反应为酸性条件下的还原胺化反应，因此只能选择氰基硼氢化钠为还原剂。
本发明实施例的硅基罗丹明荧光染色试剂是以硅原子取代的氨基罗丹明衍生物骨架作为基础，对感染SARS-CoV-2后产生的特异性免疫球蛋白(以下简称IgG)进行荧光修饰，从而达到检测感染SARS-CoV-2的目的。
本发明实施例的硅基罗丹明荧光染色试剂通过对硅原子取代氨基罗丹明与马来酰亚胺进行反应，得到了可以与IgG氨基进行反应的马来酰亚胺硅原子取代氨基罗丹明的衍生物。
本发明实施例的硅基罗丹明荧光染色试剂具有式(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示结构：
Figure BDA0002701272680000081
其中，R1为C1-C10烷基链或芳香基团。
请参照图1(a)-图1(c)的上述三种化合物的合成路线图。其中，三种形式硅基罗丹明荧光染色试剂的合成方法区别主要在于：式(Ⅰ)化合物的起始原料为间溴苯胺，经过与1，4-二溴丁烷进行亲电取代反应制得间体A1；式(Ⅱ)化合物的起始原料为6-溴吲哚，经过与碘甲烷进行亲电取代反应得到中间体B1，而后与氰基硼氢化钠进行还原反应制得中间体B2；式(Ⅲ)化合物的起始原料为间溴苯胺，经过与丙酮进行芳构化反应制得中间体C1，而后与碘甲烷进行亲电取代反应制得第二中间体C2。随后，分别用制得的各自形式的中间体进行同样的反应，从而制得最终的三种不同形式的染色试剂。
下面结合实施例对本发明进一步说明。本发明的下列实施例以R1亚甲基为例，分别对上述三种化合物的合成过程进行详细说明，本领域技术人员应当理解当R1为C1-C10烷基链或芳香基团中任意基团时，对应获得上述三种化合物也可以参照同样的合成过程，因此不再一一展开赘述。
实施例1：
本实施例具有式(Ⅰ)的硅基罗丹明荧光染色试剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)合成中间体A1
合成路线如下：
Figure BDA0002701272680000091
将间溴苯胺(1.0mmol)、1，4-二溴丁烷(1.5mol)和碳酸钾(3.0mmol)在乙腈(5mL)中混合搅拌12小时，随后加入100mL水。分离有机层，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取水层。将有机萃取物用盐水洗涤，并使用Na2SO4干燥。溶剂除减压蒸馏后，用200-300目硅胶柱层析纯化。用石油醚/乙酸乙酯(20：1)洗脱，得到中间体A1为淡黄色液体，产率为68％。
(2)合成中间体A2
合成路线如下：
Figure BDA0002701272680000092
在氮气保护下，将A1(1mmol)加入到三氯氧磷(2g，21mmol，60％分散在矿物油中)和DMF的混合溶液中，将得到的溶液在0℃搅拌1小时，然后缓慢将混合物加热至70摄氏度并搅拌过夜。随后加入水使反应猝灭。分离有机层，用二氯甲烷(30mL×3)萃取水层。将有机萃取物用盐水洗涤，并使用Na2SO4干燥。溶剂除减压蒸馏后，用200-300目硅胶柱层析纯化。用石油醚/乙酸乙酯(6:1)洗脱，得到中间体A2为白色固体，产率为82％。
(3)合成中间体A3
合成路线如下：
Figure BDA0002701272680000093
将化合物A2(1mmol),硼氢化钠(2mmol)加入10.0mL甲醇中，室温反应8小时，薄层色谱监测反应完全后，将反应混合物倒入100mL水中，用二氯甲烷萃取。有机层用盐水、水洗涤，并使用Na2SO4干燥。溶剂除减压蒸馏后，得到中间体A3为白色固体，产率为98％。
(4)合成中间体A4
合成路线如下：
Figure BDA0002701272680000094
在二氯甲烷(10mL)中加入化合物A1(1mmol)和A3(1mmol)后，将三氟化硼乙醚溶液(2mmol)滴入搅拌液中。然后将混合物在室温下搅拌约6小时，以薄层色谱监控反应完全后，旋蒸除去溶剂，粗品经200-300目硅胶柱层析纯化，用石油醚/乙酸乙酯(5:1)洗脱，得到浅黄色固体A4，产率为67％。
(5)合成中间体A5
合成路线如下：
Figure BDA0002701272680000101
在氮气保护下，向反应瓶中加入A4(10mmol)，随后加入无水四氢呋喃(40mL)溶解化合物A4(1mmol)，待体系冷却至零下七十八摄氏度，将正丁基锂溶液(11mmol)滴入搅拌液中，然后将混合物在零下七十八摄氏度下搅拌约1小时，加入二氯二甲基硅烷(5.5mmol)，升温至室温反应12小时，以薄层色谱监控反应完全后，像体系中加入100ml水，二氯甲烷萃取，旋蒸除去溶剂，得到浅黄色液体A5。
(6)合成中间体A6
合成路线如下：
Figure BDA0002701272680000102
在丙酮(50mL)中加入化合物A5(1mmol)，待体系冷却至零度时，分批加入高锰酸钾(3mmol)。然后将混合物在室温下搅拌约6小时，以薄层色谱监控反应完全后，抽滤除去二氧化锰，旋蒸除去溶剂，粗品经200-300目硅胶柱层析纯化，用石油醚/乙酸乙酯(2:1)洗脱，得到浅黄色固体A6，产率为32％。
(7)合成具有式(Ⅰ)的硅基罗丹明荧光染色试剂：化合物A7
合成路线如下：
Figure BDA0002701272680000103
在二氯甲烷(50mL)中加入化合物A6(1mmo)和吡啶(8mmol)，待体系冷却至零度时，加入三氟甲磺酸酐(3mmol)，继续搅拌1小时。然后将1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(10mmol)加入体系之中，在室温下搅拌约6小时，以薄层色谱监控反应完全后，旋蒸除去溶剂，粗品经200-300目硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇(60:1)洗脱，得到酒红色固体A7，产率为57％。
本实施例制得的硅基罗丹明荧光染色试剂的氢谱、碳谱和高分辨质谱分别如图2(a)-图2(c)所示。
实施例2
本实施例与实施例1基本相同，区别在于起始原料替换为6-溴吲哚制得的B中间体，其合成路线如图1(b)所示，其包括以下步骤：
(1)合成中间体B1
合成路线如下：
Figure BDA0002701272680000111
将6-溴吲哚(1.0mmol)、碘甲烷(1.5mol)和碳酸钾(2.0mmol)在乙腈(5mL)中混合搅拌12小时，随后加入100mL水。分离有机层，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取水层。将有机萃取物用盐水洗涤，并使用Na2SO4干燥。溶剂除减压蒸馏后，用200-300目硅胶柱层析纯化。用石油醚/乙酸乙酯(10：1)洗脱，得到中间体B1为淡黄色液体，产率为75％。
(2)合成中间体B2
合成路线如下：
Figure BDA0002701272680000112
将B1(1.0mmol)和氰基硼氢化钠(5.0mmol)在醋酸(5mL)中混合搅拌12小时，随后加入100mL水。分离有机层，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取水层。将有机萃取物用盐水洗涤，并使用Na2SO4干燥。溶剂除减压蒸馏后，用200-300目硅胶柱层析纯化。用石油醚/乙酸乙酯(10：1)洗脱，得到中间体B2，产率为58％。
(3)合成中间体B3
合成路线如下：
Figure BDA0002701272680000113
在氮气保护下，将B2(1mmol)加入到三氯氧磷(2g，21mmol，60％分散在矿物油中)和DMF的混合溶液中，将得到的溶液在0℃搅拌1小时，然后缓慢将混合物加热至70摄氏度并搅拌过夜。随后加入水使反应猝灭。分离有机层，用二氯甲烷(30mL×3)萃取水层。将有机萃取物用盐水洗涤，并使用Na2SO4干燥。溶剂除减压蒸馏后，用200-300目硅胶柱层析纯化。用石油醚/乙酸乙酯(6:1)洗脱，得到中间体B3。
(4)合成中间体B4
合成路线如下：
Figure BDA0002701272680000121
将化合物B3(1mmol),硼氢化钠(2mmol)加入10.0mL甲醇中，室温反应8小时，薄层色谱监测反应完全后，将反应混合物倒入100mL水中，用二氯甲烷萃取。有机层用盐水、水洗涤，并使用Na2SO4干燥。溶剂除减压蒸馏后，得到中间体B4。
(5)合成中间体B5
合成路线如下：
Figure BDA0002701272680000122
在二氯甲烷(10mL)中加入化合物B2(1mmol)和B4(1mmol)后，将三氟化硼乙醚溶液(2mmol)滴入搅拌液中。然后将混合物在室温下搅拌约6小时，以薄层色谱监控反应完全后，旋蒸除去溶剂，粗品经200-300目硅胶柱层析纯化，用石油醚/乙酸乙酯(5:1)洗脱，得到中间体B5。
(6)合成中间体B6
合成路线如下：
Figure BDA0002701272680000123
在氮气保护下，向反应瓶中加入B5(10mmol)，随后加入无水四氢呋喃(40mL)溶解化合物B5(1mmol)，待体系冷却至零下七十八摄氏度，将正丁基锂溶液(11mmol)滴入搅拌液中，然后将混合物在零下七十八摄氏度下搅拌约1小时，加入二氯二甲基硅烷(5.5mmol)，升温至室温反应12小时，以薄层色谱监控反应完全后，像体系中加入100ml水，二氯甲烷萃取，旋蒸除去溶剂，得到中间体B6。
(7)合成中间体B7
合成路线如下：
Figure BDA0002701272680000124
在丙酮(50mL)中加入化合物B6(1mmol)，待体系冷却至零度时，分批加入高锰酸钾(3mmol)。然后将混合物在室温下搅拌约6小时，以薄层色谱监控反应完全后，抽滤除去二氧化锰，旋蒸除去溶剂，粗品经200-300目硅胶柱层析纯化，用石油醚/乙酸乙酯(2:1)洗脱，得到中间体B7。
(8)合成具有式(Ⅱ)的硅基罗丹明荧光染色试剂：化合物B8
合成路线如下：
Figure BDA0002701272680000131
在二氯甲烷(50mL)中加入化合物B7(1mmo)和吡啶(8mmol)，待体系冷却至零度时，加入三氟甲磺酸酐(3mmol)，继续搅拌1小时。然后将1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(10mmol)加入体系之中，在室温下搅拌约6小时，以薄层色谱监控反应完全后，旋蒸除去溶剂，粗品经200-300目硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇(60:1)洗脱，得到化合物B8。
实施例3
本实施例与实施例1基本相同，区别在于起始原料替换为间溴苯胺制得的C中间体，其合成路线如图1(c)所示，其包括以下步骤：
(1)合成中间体C1
合成路线如下：
Figure BDA0002701272680000132
将间溴苯胺(1.0mmol)、丙酮(10mol)和碘单质(0.01mmol)在乙腈(5mL)中混合搅拌12小时，随后加入100mL水。分离有机层，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取水层。将有机萃取物用盐水洗涤，并使用Na2SO4干燥。溶剂除减压蒸馏后，用200-300目硅胶柱层析纯化。用石油醚/乙酸乙酯(10：1)洗脱，得到中间体C1为淡黄色液体，产率为47％。
(2)合成中间体C2
合成路线如下：
Figure BDA0002701272680000133
将C1(1mol)、碘甲烷(1mol)和碳酸钾(3.0mmol)在乙腈(5mL)中混合搅拌12小时，随后加入100mL水。分离有机层，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取水层。将有机萃取物用盐水洗涤，并使用Na2SO4干燥。溶剂除减压蒸馏后，用200-300目硅胶柱层析纯化。用石油醚/乙酸乙酯(20：1)洗脱，得到中间体C2。
(3)合成中间体C3
合成路线如下：
Figure BDA0002701272680000141
在氮气保护下，将C2(1mmol)加入到三氯氧磷(2g，21mmol，60％分散在矿物油中)和DMF的混合溶液中，将得到的溶液在0℃搅拌1小时，然后缓慢将混合物加热至70摄氏度并搅拌过夜。随后加入水使反应猝灭。分离有机层，用二氯甲烷(30mL×3)萃取水层。将有机萃取物用盐水洗涤，并使用Na2SO4干燥。溶剂除减压蒸馏后，用200-300目硅胶柱层析纯化。用石油醚/乙酸乙酯(6:1)洗脱，得到中间体C3。
(4)合成中间体C4
合成路线如下：
Figure BDA0002701272680000142
将化合物C3(1mmol),硼氢化钠(2mmol)加入10.0mL甲醇中，室温反应8小时，薄层色谱监测反应完全后，将反应混合物倒入100mL水中，用二氯甲烷萃取。有机层用盐水、水洗涤，并使用Na2SO4干燥。溶剂除减压蒸馏后，得到中间体C4。
(5)合成中间体C5
合成路线如下：
Figure BDA0002701272680000143
在二氯甲烷(10mL)中加入化合物C2(1mmol)和C4(1mmol)后，将三氟化硼乙醚溶液(2mmol)滴入搅拌液中。然后将混合物在室温下搅拌约6小时，以薄层色谱监控反应完全后，旋蒸除去溶剂，粗品经200-300目硅胶柱层析纯化，用石油醚/乙酸乙酯(5:1)洗脱，得到中间体C5。
(6)合成中间体C6
合成路线如下：
Figure BDA0002701272680000144
在氮气保护下，向反应瓶中加入C5(10mmol)，随后加入无水四氢呋喃(40mL)溶解化合物C5(1mmol)，待体系冷却至零下七十八摄氏度，将正丁基锂溶液(11mmol)滴入搅拌液中，然后将混合物在零下七十八摄氏度下搅拌约1小时，加入二氯二甲基硅烷(5.5mmol)，升温至室温反应12小时，以薄层色谱监控反应完全后，像体系中加入100ml水，二氯甲烷萃取，旋蒸除去溶剂，得到中间体C6。
(7)合成中间体C7
合成路线如下：
Figure BDA0002701272680000151
在丙酮(50mL)中加入化合物C6(1mmol)，待体系冷却至零度时，分批加入高锰酸钾(3mmol)。然后将混合物在室温下搅拌约6小时，以薄层色谱监控反应完全后，抽滤除去二氧化锰，旋蒸除去溶剂，粗品经200-300目硅胶柱层析纯化，用石油醚/乙酸乙酯(2:1)洗脱，得到中间体C7。
(8)合成具有式(Ⅲ)的硅基罗丹明荧光染色试剂：化合物C8
合成路线如下：
Figure BDA0002701272680000152
在二氯甲烷(50mL)中加入化合物C7(1mmo)和吡啶(8mmol)，待体系冷却至零度时，加入三氟甲磺酸酐(3mmol)，继续搅拌1小时。然后将1-(2-氨基乙基)-1H-吡咯-2,5-二酮(10mmol)加入体系之中，在室温下搅拌约6小时，以薄层色谱监控反应完全后，旋蒸除去溶剂，粗品经200-300目硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇(60:1)洗脱，得到化合物C8。
试验例1紫外吸收光谱
将上述实施例1-3制得的硅基罗丹明荧光染色试剂分别配制成10mM的DMSO母液。分别配为1、2、4、6、8、10uL的PBS溶液，扫描紫外吸收值，绘图。实施例1的染色试剂的紫外吸收光谱如图3所示，实施例2的染色试剂的紫外吸收光谱如图4所示，实施例3的染色试剂的紫外吸收光谱如图5所示。如图所示，实施例1和2有两个吸收峰。其中一个在λ＝375nm附近，另一个在λ＝480nm附近出现，实施例3有三个吸收峰，分别在λ＝325nm，λ＝375nm，λ＝510nm。
试验例2荧光光谱光R
将实施例1、2、3制得的硅基罗丹明荧光染色试剂配为10mM的DMSO母液。分别加入PBS溶液测定其荧光光谱，得到荧光发射曲线。在PBS的溶液中，待测物实施例1、2、3的最大发射波长发生明显红移，尤其是实施例2和3，其最大发射波长到了近红外发射区域。其中，实施例1的染色试剂的荧光强度如图6，实施例2的染色试剂的荧光强度如图7，实施例3的染色试剂的荧光强度如图8。
试验例3荧光ELISA在不同带宽条件下检测SARS-CoV-2 Spike S1蛋白抗体
将Spike S1抗原蛋白(2μg/mL)包被于黑色ELISA板中，4℃过夜后，加入2％BSA进行封闭，每孔100μL，置于37℃摇床封闭1h，然后加入兔抗人Spike S1蛋白多克隆抗体PAb，稀释比例为1:10000，37℃孵育1.5h。PBST漂洗三次后，按照不同的稀释比例加入硅原子取代罗丹明标记驴抗兔IgG二抗，37℃孵育1h，PBST漂洗三次后，采用多功能酶标仪检测不同带宽条件下的荧光强度，并以荧光强度为纵坐标，二抗的稀释比例为横坐标进行作图。其中，实施例1的荧光染料标记抗进行ELISA检测后在不同带宽条件下进行测定荧光强度如图9。可以明显看到，即便在超小的带宽为7.5nm的酶标仪检测下，依旧可以得到较为强烈的荧光信号，体现出了本申请硅基罗丹明荧光染料试剂具有大斯托克斯位移的优越性，避免了传统小斯托克斯位移染料均存在的激发光和发射光相互干扰的情况。
试验例4硅原子取代罗丹明与不同接枝度修饰二抗荧光强度检测
Spike S1蛋白包被于黑色ELISA板中，封闭，一抗孵育。洗板后按照不同的稀释比例分别加入不同接枝度修饰的羊抗人荧光二抗(投料比分别为：1/200、10/200、25/200、50/200和100/200)，37℃孵育1h后，采用多功能酶标仪检测荧光强度，带宽为20nm。以荧光强度为纵坐标，二抗的稀释比例为横坐标进行作图。其中，实施例1的硅原子取代罗丹明不同接枝度修饰二抗荧光强度检测如图10。可以看到，不同质量比的硅原子取代罗丹明和羊抗人抗体的标记情况有显著性差异，其中，硅原子取代罗丹明和羊抗人抗体质量比为50/200的标记效率最高，荧光强度显著高于其他质量比的组分。因此，以此条件为最优的羊抗人抗体标记条件。
试验例5荧光法ELISA检测SARS-CoV-2 Spike S1蛋白抗体的稳定性实验
Spike S1蛋白包被于黑色ELISA板中，置于4℃保存。分别于包被后第一天、第三天和第六天，取出一块板子，加入2％BSA，每孔100μL，置于37℃摇床封闭1h，然后，加入兔抗人Spike S1蛋白多克隆抗体PAb，稀释比例为1:10000，37℃孵育1.5h。洗板后按照不同的稀释比例加入硅原子取代罗丹明标记二抗驴抗兔IgG，37℃孵育1h后，采用多功能酶标仪检测荧光强度。带宽为20nm。并以荧光强度为纵坐标，二抗的稀释比例为横坐标进行作图。其中，实施例1的荧光法ELISA检测SARS-CoV-2 Spike蛋白抗体是稳定实验如图11。从图可知，随着时间的延长，Spike S1蛋白抗体的荧光强度略有下降，但是依旧体现出了较好的稳定性，因此硅原子取代的氨基罗丹明可以实现较长时间的稳定的抗体标记。
试验例6 COVID-19患者血清样本免疫球蛋白IgG检测
Spike S1蛋白包被于黑色ELISA板中，封闭，分别加入正常血清和COVID-19患者血清样本。洗板后按照不同的稀释比例分别加入硅原子取代罗丹明标记羊抗人荧光二抗，37℃孵育1h后，采用多功能酶标仪检测荧光强度，带宽为20nm。并以荧光强度为纵坐标，二抗的稀释比例为横坐标进行作图。其中，实施例1的荧光染料标记抗体进行COVID-19患者血清样本的检测如图12。从图可知，不同稀释比例的硅原子取代罗丹明标记羊抗人荧光二抗可以明显区分正常血清和新冠患者血清，新冠患者的血清显著高于正常血清。因此，可以利用该荧光标记策略方便简洁快速的检测新冠病人血清。
综上所述，本发明以硅原子取代的罗丹明骨架作为免疫球蛋白IgG标记的基础，通过合理的芳香胺的调控设计，得到了基于不同发射波长的硅原子取代的罗丹明骨架的抗体标记化学物，该类分子在具有大的斯托克位移和高的荧光强度，可以运用于荧光ELISA法检测SARS-CoV-2 Spike S1蛋白特异性抗体，此外，由于该染料具有大的斯托克位移和高的荧光前度，广泛适用于不同带宽的酶标仪检测。本发明的制备方法收率高、反应条件温和，制得的染色试剂斯托克斯位移大、荧光强度高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种硅基罗丹明荧光染色试剂，其特征在于，具有式(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示结构：
Figure FDA0003346020200000011
其中，R1为C1-C10烷基链。
2.根据权利要求1所述的硅基罗丹明荧光染色试剂，其特征在于，所述罗丹明荧光染色试剂为：
Figure FDA0003346020200000012
3.一种制备权利要求1所述的具有式(Ⅰ)的硅基罗丹明荧光染色试剂的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(1.1)将间溴苯胺和1，4-二溴丁烷溶于第一有机溶剂中并加入第一弱碱加热搅拌，反应得到中间体A1；
(1.2)在惰性气氛下将所述中间体A1加入至三氯氧磷和DMF的混合溶液中搅拌，然后加入水淬灭反应，得到的反应液用二氯甲烷或乙酸乙酯萃取，得到中间体A2；
(1.3)将所述中间体A2和第一还原剂加入至第二有机溶剂中搅拌，然后加入水淬灭反应，得到的反应液用二氯甲烷或乙酸乙酯萃取，得到中间体A3；
(1.4)将所述中间体A1和所述中间体A3加入至第三有机溶剂，加入三氟化硼乙醚搅拌，反应得到中间体A4；
(1.5)将所述中间体A4溶于第四有机溶剂并将溶液冷却至0℃以下，加入强碱，在搅拌下加入二氯二甲基硅烷，随后加入水淬灭反应，得到的反应液用二氯甲烷或乙酸乙酯萃取，得到中间体A5；
(1.6)将所述中间体A5溶于第五有机溶剂中，在搅拌下加入高锰酸钾继续搅拌，反应得到中间体A6；
(1.7)将所述中间体A6溶于第六有机溶剂中，在搅拌下加入第二弱碱，再加入三氟甲磺酸酐，在搅拌下加入
Figure FDA0003346020200000021
制得具有式(Ⅰ)的硅基罗丹明荧光染色试剂；其中，R1为C1-C10烷基链。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，
步骤(1.1)中：搅拌时间为10-14h；所述第一有机溶剂为DMSO和DMF中的一种或两种组合，所述第一弱碱为碳酸钠、碳酸钾、磷酸钾和磷酸钠中的一种或多种组合；
步骤(1.2)中：在0℃充分搅拌后升温至60-80℃并搅拌过夜；
步骤(1.3)中：在室温下搅拌6-10h；所述第一还原剂为硼氢化钠、硼氢化钾和氢化铝锂中的一种或多种组合，所述第二有机溶剂为甲醇、乙醇、二氧六环和四氢呋喃中的一种或多种组合；
步骤(1.4)中：在室温下搅拌5-7h；所述第三有机溶剂为二氯甲烷和三氯甲烷中的一种或两种组合；
步骤(1.5)中：将所述溶液进一步冷却至-70～-80℃，搅拌时间为45-80min；所述第四有机溶剂为四氢呋喃和乙醚中的一种或两种组合，所述强碱为正丁基锂、仲丁基锂或叔丁基锂；
步骤(1.6)中：加入高锰酸钾之前，将体系温度冷却至0℃，然后加入高锰酸钾搅拌5-7h；所述第五有机溶剂为丙酮和乙腈中的一种或两种组合；
步骤(1.7)中：加入三氟甲磺酸酐之前，将体系温度冷却至0℃，然后加入三氟甲磺酸酐搅拌45-80min，加入
Figure FDA0003346020200000022
后在室温下搅拌5-7h；所述第六有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈和DMF中的一种或多种组合，所述第二弱碱为吡啶、三乙胺和4-二甲氨基吡啶中的一种或多种组合。
5.一种制备权利要求1所述的具有式(Ⅱ)的硅基罗丹明荧光染色试剂的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(2.1)将6-溴吲哚溶于第七有机溶剂中在搅拌条件下加入碘甲烷和第一弱碱反应，得到中间体B1；
(2.2)将所述中间体B2溶于第八有机溶剂中并在搅拌条件下加入第二还原剂，得到中间体B2；
(2.3)将所述中间体B2加入至三氯氧磷和DMF的混合溶液中搅拌，反应得到中间体B3；
(2.4)将所述中间体B3和第一还原剂加入至第二有机溶剂中搅拌，反应得到中间体B4；
(2.5)将所述中间体B2和所述中间体B4加入至第三有机溶剂，加入三氟化硼乙醚搅拌，反应得到中间体B5；
(2.6)将所述中间体B5溶于第四有机溶剂并将溶液冷却至0℃以下，加入强碱，在搅拌下加入二氯二甲基硅烷，随后加入水淬灭反应，得到的反应液用二氯甲烷萃取，得到中间体B6；
(2.7)将所述中间体B6溶于第五有机溶剂中，在搅拌下加入高锰酸钾继续搅拌，反应得到中间体B7；
(2.8)将所述中间体B7溶于第六有机溶剂中，在搅拌下加入第二弱碱，再加入三氟甲磺酸酐，在搅拌下加入
Figure FDA0003346020200000031
制得具有式(Ⅱ)的硅基罗丹明荧光染色试剂；其中，R1为C1-C10烷基链。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，
步骤(2.1)中：所述第七有机溶剂为四氢呋喃、DMF、乙醚和乙腈中的一种或多种组合，所述第一弱碱为碳酸钠、碳酸钾、磷酸钾和磷酸钠中的一种或多种组合；
步骤(2.2)中：所述第八有机溶剂为乙酸和丙酸中的一种或两种组合，所述第二还原剂氰基硼氢化钠；
步骤(2.4)中：所述第一还原剂为硼氢化钠、硼氢化钾和氢化铝锂中的一种或多种组合，所述第二有机溶剂为甲醇、乙醇、二氧六环和四氢呋喃中的一种或多种组合；
步骤(2.5)中：所述第三有机溶剂为二氯甲烷和三氯甲烷中的一种或两种组合；
步骤(2.6)中：所述第四有机溶剂为四氢呋喃和乙醚中的一种或两种组合，所述强碱为正丁基锂、仲丁基锂或叔丁基锂；
步骤(2.7)中：所述第五有机溶剂为丙酮和乙腈中的一种或两种组合；
步骤(2.8)中：所述第六有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈和DMF中的一种或多种组合，所述第二弱碱为吡啶、三乙胺和4-二甲氨基吡啶中的一种或多种组合。
7.一种制备权利要求1所述的具有式(Ⅲ)的硅基罗丹明荧光染色试剂的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(3.1)将间溴苯胺、丙酮和碘单质溶于第九有机溶剂中，加入第一弱碱加热搅拌，反应得到中间体C1；
(3.2)将所述中间体C1溶于第七有机溶剂，搅拌下，加入所述第一弱碱和碘甲烷，反应得到中间体C2；
(3.3)将所述中间体C2加入至三氯氧磷和DMF的混合溶液中搅拌，反应得到中间体C3；
(3.4)将所述中间体C3和第一还原剂加入至第二有机溶剂中搅拌，反应得到中间体C4；
(3.5)将所述中间体C2和所述中间体C4加入至第三有机溶剂，加入三氟化硼乙醚搅拌，反应得到中间体C5；
(3.6)将所述中间体C5溶于第四有机溶剂并将溶液冷却至0℃以下，加入强碱，在搅拌下加入二氯二甲基硅烷，随后加入水淬灭反应，得到的反应液用二氯甲烷萃取，得到中间体C6；
(3.7)将所述中间体C6溶于第五有机溶剂中，在搅拌下加入高锰酸钾继续搅拌，反应得到中间体C7；
(3.8)将所述中间体C7溶于第六有机溶剂中，在搅拌下加入第二弱碱，再加入三氟甲磺酸酐，在搅拌下加入
Figure FDA0003346020200000041
制得具有式(Ⅲ)的硅基罗丹明荧光染色试剂；其中，R1为C1-C10烷基链。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，
步骤(3.1)中：所述第九有机溶剂为四氢呋喃、乙腈和DMF中的一种或多种组合，所述第一弱碱为碳酸钠、碳酸钾、磷酸钾和磷酸钠中的一种或多种组合；
步骤(3.2)中：所述第七有机溶剂为四氢呋喃、DMF、乙醚和乙腈中的一种或多种组合；
步骤(3.4)中：所述第一还原剂为硼氢化钠、硼氢化钾和氢化铝锂中的一种或多种组合，所述第二有机溶剂为甲醇、乙醇、二氧六环和四氢呋喃中的一种或多种组合；
步骤(3.5)中：所述第三有机溶剂为二氯甲烷和三氯甲烷中的一种或两种组合；
步骤(3.6)中：所述第四有机溶剂为四氢呋喃和乙醚中的一种或两种组合，所述强碱为正丁基锂、仲丁基锂或叔丁基锂；
步骤(3.7)中：所述第五有机溶剂为丙酮和乙腈中的一种或两种组合；
步骤(3.8)中：所述第六有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙腈和DMF中的一种或多种组合，所述第二弱碱为吡啶、三乙胺和4-二甲氨基吡啶中的一种或多种组合。
9.根据权利要求1或2所述的硅基罗丹明荧光染色试剂在标记SARS-CoV-2病毒特异性抗体中的应用。
10.根据权利要求1或2所述的硅基罗丹明荧光染色试剂在制备用于检测SARS-CoV-2的试剂盒中的应用。
CN202011023009.6A 2020-09-25 2020-09-25 硅基罗丹明荧光染色试剂及其制备方法和应用 Active CN112251043B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011023009.6A CN112251043B (zh) 2020-09-25 2020-09-25 硅基罗丹明荧光染色试剂及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011023009.6A CN112251043B (zh) 2020-09-25 2020-09-25 硅基罗丹明荧光染色试剂及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112251043A CN112251043A (zh) 2021-01-22
CN112251043B true CN112251043B (zh) 2022-03-01

Family

ID=74234041

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011023009.6A Active CN112251043B (zh) 2020-09-25 2020-09-25 硅基罗丹明荧光染色试剂及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112251043B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112500406B (zh) * 2020-09-25 2023-09-22 四川大学 基于碳原子的罗丹明衍生物骨架的溶酶体靶向染色试剂及其制备方法和应用
CN114805297A (zh) * 2022-05-31 2022-07-29 四川大学 一种大斯托克斯位移近红外发射染料及其制备方法和应用
CN116143682B (zh) * 2022-11-17 2024-04-05 四川大学 基于呫吨骨架的近红外二区造影剂及其制备方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3461814A1 (de) * 2017-09-29 2019-04-03 ATTO-TEC GmbH Neue poly-sulfonierte fluoreszenz-farbstoffe
CN111334067A (zh) * 2018-12-18 2020-06-26 中国科学院大连化学物理研究所 用于超分辨荧光成像的自闪烁荧光染料及其合成和应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3461814A1 (de) * 2017-09-29 2019-04-03 ATTO-TEC GmbH Neue poly-sulfonierte fluoreszenz-farbstoffe
CN111334067A (zh) * 2018-12-18 2020-06-26 中国科学院大连化学物理研究所 用于超分辨荧光成像的自闪烁荧光染料及其合成和应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Amino-Si-rhodamines: A new class of two-photon fluorescent dyes with intrinsic targeting ability for lysosomes;Zhang Hongxing et al.;《Biomaterials》;20171216;10-22 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112251043A (zh) 2021-01-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112251043B (zh) 硅基罗丹明荧光染色试剂及其制备方法和应用
US7172907B2 (en) Cyanine dye labelling reagents with meso-substitution
JP2019523787A (ja) 蛍光または有色レポーター基を含むイオン性ポリマー
US5877310A (en) Glycoconjugated fluorescent labeling reagents
JP3027770B2 (ja) イムノアッセイで使用するための干渉除去剤
US5641629A (en) Spectroscopically detectable nucleic acid ligands
US5650275A (en) Target detection method using spectroscopically detectable nucleic acid ligands
CN104704366B (zh) 异羟肟酸取代的氮杂吲哚啉-花菁染料和它的生物共轭物
JP2006518587A (ja) 分子タグを使用する多重分析プラットフォーム
EP1392776A2 (en) Acridone derivatives as labels for fluorescence detection of target materials
US20020012947A1 (en) Biomarkers for the labeling, visual detection and quantification of biomolecules
WO2006001944A1 (en) Substituted azaporphyrins as fluorescence labels
WO2010051544A2 (en) Rapid homogeneous diagnostic testing platform based on lanthanide fluorescent resonance energy transfer
JP4659213B2 (ja) エネルギー転移色素
KR100252688B1 (ko) 면역검정법에사용하기위한간섭억제제
Jiang et al. Preparation and time-resolved luminescence bioassay application of multicolor luminescent lanthanide nanoparticles
CN111675674A (zh) 一种aie分子及其合成方法
JP2001002951A (ja) 新規な蛍光色素およびその蛍光マーカーとしての使用
WO2011150541A1 (zh) 可视化检测抗原抗体反应的方法、试剂盒及其应用
WO2023207221A1 (zh) 一种鲁米诺衍生物及其制备方法与应用
CN105778894A (zh) 一种检测微量γ-球蛋白的荧光试剂、制备方法及应用
WO2022094932A1 (zh) 一种新冠病毒检测试纸条及其制备方法和使用方法
Dejouy et al. Synthetic routes to novel fluorogenic pyronins and silicon analogs with far-red spectral properties and enhanced aqueous stability
JPWO2006054426A1 (ja) 高蛍光量子収率型疎水性蛍光プローブ、それを用いる生体高分子検出法ならびに生体高分子間相互作用検出法
WO2023140228A1 (ja) タンパク質の変性状態又は凝集状態を可視化する方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant