CN112521451A - 一种稳定多肽及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明一种稳定多肽，其结构式如下所示：
Figure DDA0002772890980000011
X代表任意氨基酸，M代表甲硫氨酸氨基酸；linker代表连接子，M的位置在多肽的首端、末端或者多肽的任意两个氨基酸之间。本发明还提供了上述的一种稳定多肽的制备方法，在所述的多肽的首端、末端或者多肽的氨基酸之间设置一个甲硫氨酸氨基酸。本发明采用在酸性条件下，通过4‑溴巴豆酸，2‑溴乙酸，3‑溴丙酸，4‑溴丁酸，5‑溴戊酸等一系列烷基化试剂，通过烷基化及化学选择性，选择含有一个甲硫氨酸残基的天然的线性多肽，通过末端关环的方式从而构建稳定多肽。本发明构建的稳定环肽的细胞膜穿透性和稳定性较其线性天然的线性多肽有显著性的提高。

Description

一种稳定多肽及其制备方法
技术领域
本发明属于生物化学领域，涉及一种多肽的制备方法，具体来说是一种稳定多肽及其制备方法。
背景技术
蛋白的结构和功能的多样性使其成为大自然中功能最丰富、最具吸引力的一类分子。人类基因组计划揭示了大约有20000至25000个基因参与蛋白质的编码，但是这些基因编码的蛋白质远远不能满足蛋白作为生命活动的主要承担者的复杂性。蛋白质翻译后修饰，在不改变基因序列的前提下，对蛋白质进行再修饰，赋予蛋白新的结构和功能，促使蛋白能精准的调控整个生命活动。常见的蛋白翻译后修饰包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、SUMO化、羟基化、糖基化、脂化等等，不同位点或者不同种类的蛋白修饰对蛋白的结构或功能产生重要影响。
21世纪以来，不断发展和完善的稳定多肽技术在锁定多肽活性构象的同时，多肽作为对靶点具有较高选择性和亲和性的配体，近几年也被用于介导蛋白选择性的共价修饰。香港中文大学的夏江教授在该领域做了优秀的工作，他们利用α-氯乙酰胺在多肽配体的介导下与PDZΔRGS3的空间位点靠近的Cys发生共价反应，在细胞内可实现高选择性的蛋白共价修饰。2016年，哈弗大学的Walensky教授和澳大利亚昆士兰大学的Fairlie教授分别在BIM蛋白的BH3螺旋上引入全碳氢侧链的方法稳定多肽螺旋结构，同时在多肽N端引入丙烯酰胺基团，该多肽抑制剂在与BFL-1蛋白结合时，多肽上的丙烯酰胺在空间诱导下实现与BFL-1蛋白的Cys共价反应，形成稳定多肽的共价抑制剂，提高了多肽抑制剂的抗肿瘤效果。同年，加州大学旧金山分校的王磊教授用全碳氢侧链稳定P53多肽螺旋的同时，在多肽的侧链引入磺酰氟化合物，该多肽与MDM4相互结合时，多肽侧链上的磺酰氟基团与蛋白上的赖氨酸空间靠近，从而触发共价反应，形成蛋白-多肽共价体。
基于多肽配体诱导的蛋白共价修饰需要在稳定多肽二级结构的同时在侧链上额外引入与蛋白Cys反应的基团，合成步骤更繁琐，而且引入的化学基团有可能出现非特异性结合的问题。然而，以上稳定多肽技术，都不可避免的在多肽分子本身额外的引入了一个有可能与靶点有潜在有利/不利相互作用的侧链。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种稳定多肽及其制备方法，所述的这种稳定多肽及其制备方法要解决现有技术中制备稳定多肽的合成步骤繁琐，而且引入的化学基团有可能出现非特异性结合的技术问题。
本发明提供了一种稳定多肽，其结构式如下所示：
Figure BDA0002772890960000021
X代表任意氨基酸，M代表甲硫氨酸氨基酸；linker代表连接子，M的位置在多肽的首端、末端或者多肽的任意两个氨基酸之间。
进一步的，甲硫氨酸氨基酸与连接子之间具有三个氨基酸。
本发明还提供了上述的一种稳定多肽的制备方法，在一个多肽的首端、末端或者多肽的氨基酸之间设置一个甲硫氨酸氨基酸。
本发明通过液相，质谱，核磁共振技术等，证实了化学选择性的烷基化多肽甲硫氨酸—该方法的可行性和普适性。
本发明提供了上述的多肽在体外条件下的可还原性。
本发明通过连接荧光素多肽的流式细胞分析和激光共聚焦实验，证实该关环多肽显著的提高了其线性多肽的穿膜性。
本发明还提供了上述的稳定多肽在药物递送、蛋白-蛋白相互用作用配体筛选或者在蛋白翻译后修饰的应用。
本发明提供了一种基于其末端分子内的关环策略，采用分子内甲硫氨酸烷基化构建稳定的多肽用于蛋白质偶联。本发明的方法通过在其多肽的首端、末端或者多肽任意两个氨基酸之间设置甲硫氨酸实现分子内的关环策略，在胞外时保留稳定多肽的穿膜性和稳定性，在胞内与靶点相互作用时，其锍盐中心可以与蛋白表面上的Cys进行结合。
本发明通过液相，质谱，核磁共振技术等，证实了基于末端分子内的关环策略的多肽—该方法的可行性和普适性。
本发明通过连接荧光素多肽的流式细胞分析和激光共聚焦实验，证实该关环多肽显著的提高了其线性多肽的穿膜性。
本发明提供的上述的多肽在和目标蛋白表面上的Cys可以进行结合，通过胶图以及一级质谱可以确定其反应的效率。我们再通过二级质谱确定了其与蛋白反应的具体位点。
连接甲硫氨酸的位置不同时产生了不同环大小的多肽。当M的位置在末端时(所示多肽的右侧)，其多肽和连接子的成环大小最大，或当M的位置在首端时(所示多肽的的左侧)，其多肽和连接子的成环大小最小。
当多肽与其连接子之间有三个氨基酸的时候，其成环的稳定多肽差率最高。
本发明的方法包括可以对于芳香化合物，烯烃化合物，脂肪链化合物都有明显的效果，尤其对于溴丙酸的反应性，展示出其最优的效果。
本发明的方法的稳定多肽在药物递送，蛋白-蛋白相互用作用配体筛选，以及蛋白翻译后修饰的应用。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明是目前首例基础锍盐中心的通过脂肪链的末端关环方法的发现。同时，该稳定环肽的细胞膜穿透性和稳定性较其线性天然的线性多肽有显著性的提高，从实验数据中可以看出有将近75％以上的提升效果。最后，我们构建了蛋白体系，该方法可以高效的与目标蛋白进行共价结合，并且相对于之前的研究方法，此方法的选择性更高并且更加稳定。此方法更加贴合人体实际情况，可以用脂肪链作为连接子，为后续的研究，打下了坚实的基础。
附图说明
图1A)模板多肽AAAMKY-CONH2在实验条件下采用不同烷基化试剂的反应示意图。
图1B)为以溴丙酸作为连接子，以简单的六肽作为模板，通过改变其甲硫氨酸的位置，来判定该方法的环大小的承受强度。
图2A)为通过4个不同的模板序列的多肽，对于其成环后的多肽和线性肽的流式实验对比。
图2B)为成环肽Fmoc-DapRRRMK(FAM)Y-NH2和线性肽在激光共聚焦实验下的实验数据图对比，可以充分的说明我们的环肽比线性肽的穿膜性更好。
图3A)为我们设计的5条针对于蛋白共价实验的多肽序列示意图以及多肽和其目标蛋白结合的示意图。
图3B)为三条具有靶向的多肽PDC-1,PDC-2,PDC-3与目标蛋白PDZ蛋白的共价效果示意图。
图3C)为多肽PDC-1与目标蛋白PDZ，突变73号位点的PDZ蛋白，突变33/34号位点的PDZ蛋白的共价示意图。
图3D)为多肽PDC-1与目标蛋白PDZ反应的时间梯度示意图。
图3E)为多肽PDC-1与目标蛋白PDZ反应的浓度梯度示意图。
图3F)为多肽PDC-1与目标蛋白PDZ，含有Cys的BCL2,Mgra,SarA蛋白的选择性实验的示意图。
图3G)为多肽PDC-1与目标蛋白PDZ在瞬转的293T细胞裂解里的浓度梯度示意图。
图3H)为多肽PDC-1与目标蛋白PDZ在瞬转的293T细胞裂解里的时间梯度示意图。
图4A)为多肽PDC-1-C3,PDC-2-C3,PDC-3-C3,PDC-1-C2,PDC-C6与目标蛋白PDZ的一级质谱示意图。
图4B)为多肽PDC-1-C3与目标蛋白PDZ的二级质谱示意图，通过质谱分析，我们可以确定其与PDZ蛋白上的33/34号位点上的Cys进行共价结合。
图5为基于锍盐中心的分子内关环的稳定多肽方法学用于蛋白的空间选择性共价修饰。
具体实施方式
下面结合附图对本发明进一步说明。
具体操作步骤为：
(1)多肽固相合成：多肽固相合成于Rink Amide MBHA树脂(负载度：0.54mmol/g)或者Wang树脂按照标准的Fmoc-固相合成策略。具体操作如下：将Rink Amide MBHA或者Wang树脂用DCM溶胀10分钟(两遍)。用50％的吗啡啉(溶于DMF)脱去Fmoc保护基30分钟每次，共两次。之后分别用DMF、DCM交叉洗涤各五次。Fmoc保护的氨基酸(5eq，以起始树脂负载度计算)，HATU(4.9eq)混合用DMF溶解充分，随后加入DIPEA(10eq)活化。此反应液预先反应1分钟之后溶液变成黄色，加入树脂反应1-2小时(根据氨基酸位阻，氨基酸残基大的基团反应时间加长，或者增加反应次数)。溴丙酸试剂(2eq)和DIPEA(4eq)溶于DMF后加入树脂中反应2小时反应结束之后分，别用DMF、DCM交叉洗涤各五次。待多肽链组装完毕。
(2)将多肽从树脂上切下：取20mg树脂与EP管中，加入0.5ml的TFA/TIPS/H2O/EDT(v:v:v:v＝94:1:2.5:2.5)剪切液震荡反应1h,树脂过滤除去，用氮气把剪切液吹干，然后加入0.5ml冷的乙醚沉淀两分钟；离心弃去上清，沉淀的多肽于空气中挥干。
(3)多肽的纯化：将反应完全的反应液离心，过膜，使用高效液相色谱纯化。产物转化率根据产物峰在高效液相色谱图上的峰面积积分比上原料和产物总的峰面积积分计算而来。不同烷基化试剂对于文中使用的模板多肽有不同的产物转化率，对几种具有代表性的卤代羧酸化合物(4-溴巴豆酸，2-溴乙酸，3-溴丙酸，4-溴丁酸，5-溴戊酸)进行反应。如图1A所示，溴丙酸的linker反应的转化率比其他几个linker的转化率高，并且最终可以得到92％目标产物(图1A)。改变甲硫酸的位置从而形成的不同的序列多肽对于溴丙酸也有不同产物转化率，后续为了进一步对分子内关环策略进行研究，测试了在不同序列中，侧链成环位置对于关环的影响。具体设计如图1B所示，通过改变甲硫氨酸的位置设计出6条序列不同的多肽。实验证明，i，i+3位置时，产物为1-C3，可以得到最高的转化率92％。当甲硫氨酸在C-端(i，i+5)位置时，产物为2-C3，得到转化率最低12％(图1B)。
(4)多肽穿膜性实验：利用共聚焦显微镜对图2A所设计的多肽针对HeLa细胞的穿膜能力进行了分析。从图2B中可以明显的看出多肽的穿膜能力对比，以及其在细胞内部的分布情况。作者对其进行了激光共聚焦显微镜成像实验，发现N-端为Fmoc的环肽比N-端为AC的环肽的穿膜能力好，但是二者都比线性肽的穿膜能力好。结果与流式细胞术实验一致，进一步证明了分子内成环的环肽可以对于细胞穿膜能力有一定的提升。
(5)蛋白表达与纯化：利用分子克隆技术得到的携带有PDZΔRGS3基因的pET28A质粒，该质粒由香港中文大学夏江教授课题组赠送(ACS Chem.Biol.2016,11,149-158)以及它们的突变体(PDZΔRGS3C33S C34S和PDZΔRGS3C73S，突变根据PCR仪器进行点突变，相关的点突变的引物)转化至大肠杆菌E.coli.BL21(DE3)中，在LB固体培养基中37℃培养过夜。随后将单克隆菌落转至5ml的LB液体培养基中(含100μg/ml氨苄霉素)转入37℃继续培养12小时。待菌液浑浊，继续转入500ml的液体培养基中37℃培养至OD600～0.6。菌液转至16℃并加入1mM IPTG诱导蛋白表达8小时。离心收集菌体用裂解缓冲液(20mM Tris-HCl pH 7.5，500mMNaCl，3mM DTT，0.1mM PMSF)斡旋，利用超声破碎仪在冰上进行破碎。超声后14000g/min离心1小时后弃细胞碎片，取上清0.45μm滤膜过滤。镍柱用10mM咪唑的PBS溶液平衡5个柱体积(25ml)后对蛋白进行纯化，蛋白最终在250mM咪唑下洗脱下来，跑胶鉴定蛋白表达量。带His标签的BFL-1的蛋白表达方法与上述PDZΔRGS3表达方法类似。其他蛋白直接由作者所在课题组提供。
(6)纯蛋白与多肽的共价反应：将20μM的蛋白稀释液与环化的多肽配体(100μM)混匀，在37℃水浴中反应4小时，反应结束后加入适量的loading buffer混匀，沸水煮5-10分钟，用15％的胶分离，为了使蛋白与共价体分开，下层胶的跑胶时间尽量长，最后用考马斯亮蓝染色鉴定。对于不同蛋白选择性的共价反应条件，共价反应的时间梯度、当量梯度等实验根据实验目的进行条件调整，如图3所示，图3A为所用的多肽序列，图3B，3C，3D，3E，3F分别是在不同序列，与突变蛋白，时间梯度，浓度梯度，不同蛋白等一些的对比。
(7)细胞裂解液水平的蛋白-多肽共价反应：将含HA标签的PDZΔRGS3基因的pCAG-F真核质粒用lipo2000转染试剂(Invitrogen)转染到HEK-293T细胞中，瞬时表达48小时后将细胞收集用0.5％NP40细胞裂解缓冲液重悬，4℃14000g/min离心10分钟，重复两遍，取上清定浓度，将100μg的细胞裂解液与环肽进行共价反应，37℃孵育不同的时间段，跑胶，用蛋白免疫印迹的方法对蛋白进行分析鉴定，抗体用抗HA标签的抗体，结果如图3G和3H所示。
(8)质谱鉴定：
(a)跑胶：用15％的蛋白胶尽量让不同的蛋白彼此分开，染色前用超纯水冲洗胶块，尽量去除SDS等离子，之后染色，染胶的盒子不能用手直接接触，全程带手套，实验帽和口罩，染色不要太深。
(b)脱色：用脱色液(30％乙醇，10％的乙酸，ddH2O)脱色充分以后，用足量ddH2O浸泡胶块，使胶尽量溶胀并洗去残余离子，确保胶足够的干净。
(c)切胶：将目的条带的胶切下来，切胶的时候尽量小心，避免切到别的条带，将切下来的条带放置离心管内，再把胶尽量切成小块，方便后续的脱色操作。
(d)胶块脱色：用至少200μL的ddH2O冲洗胶块，吸去ddH2O，加入200μL脱色液(脱色液的配方：50％乙腈+25mM NH4HCO3)，盖上管盖，弹起管底的胶块，使其充分浸泡在脱色液中，37℃脱色30分钟，可根据脱色情况更换新鲜的脱色液至胶块成透明色，而溶液变成浅蓝色，脱色完全后吸去所有脱色液。
(e)冲洗胶块：待脱色完毕后，用ddH2O冲洗胶块，每次5分钟，2次，此时胶块应该是透明亮丽的。
(f)脱水：加入100μL 50％乙腈，谈起胶块，脱水5分钟，胶块变白变小，1000g短暂离心，吸出溶液，再次短暂离心，用小吸头吸尽残留液体，尤其是在胶块表面的，干净的通风橱内敞开盖，稍放置几分钟，让残留的乙腈挥发干净。
(g)还原烷基化(选做，一般适用于有二硫键的蛋白体系)：10mM DTT 50μL淹没胶块，振荡混匀至胶块泡胀透明，56℃ 30分钟。冷却至室温，吸干，快速加55mM碘代乙酰胺(IAM)50μL，振荡混匀，暗处放置30分钟。分别用25mM NH4HCO3，50mM NH4HCO3/乙腈＝1:1，100％乙腈各洗一次，乙腈脱水至胶粒变白，真空干燥5分钟。
(h)胰酶酶解：胰酶的工作浓度一般是0.02ug/μL(promega包装的是100μg，按照说明书的要求，加入100μL 50mM乙酸，充分悬起溶解胰酶，之后按2μL一管分装，-80℃保存)。在酸性情况下，胰酶没有活性，它的工作pH是7-9。往上述胶块中加入2μL胰酶，盖上盖，放置10分钟使胰酶充分浸入胶块，胶块重新变为透明色，加入10-20μL覆盖液(配方：10％乙腈+25mM NH4HCO3)，使胶块充分浸泡，37℃酶切16-18小时。
(i)肽段的萃取和富集：将酶解好的样品短暂离心，胶块用50μL萃取液(配方：70％乙腈，2％三氟乙酸)萃取一次，37℃反应30分钟，吸出液体，溶液真空干燥。
(g)制样：将20μL溶液(配方：5％甲酸，0.1％三氟乙酸的超纯水溶液)溶解上述干燥的样品，直接上质谱机器检测或者-20℃保存待测。
我们可以通过上述实验得到我们的二级质谱的实验数据，如图4A和4B，通过对其进行分析可以清楚的看出我们的这项发明技术的可行性，可以通过二级质谱看出此技术为末端关环，且关环的位置如实验预期一样。
本发明新颖的分子内关环方法对半胱氨酸的选择性共价修饰，从图5A、5B、5C可以看出首次利用分子内关环策略对其进行选择性修饰。

Claims (4)

1.一种稳定多肽，其特征在于，其结构式如下所示：
Figure FDA0002772890950000011
X代表任意氨基酸，M代表甲硫氨酸氨基酸；linker代表连接子，M的位置在多肽的首端、末端或者多肽的任意两个氨基酸之间。
2.根据权利要求1所述的一种稳定多肽，其特征在于，甲硫氨酸氨基酸与连接子之间具有三个氨基酸。
3.权利要求1所述的一种稳定多肽的制备方法，其特征在于，在所述的多肽的首端、末端或者多肽的氨基酸之间设置一个甲硫氨酸氨基酸。
4.权利要求1所述的稳定多肽在药物递送、蛋白-蛋白相互用作用配体筛选或者在蛋白翻译后修饰的应用。
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