CN102875639A

CN102875639A - 一种肽的固相合成方法及其合成的肽

Info

Publication number: CN102875639A
Application number: CN2012103648252A
Authority: CN
Inventors: 王宇恩; 陈永汉; 刘剑; 马亚平; 袁建成
Original assignee: Hybio Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Hybio Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2012-09-26
Filing date: 2012-09-26
Publication date: 2013-01-16

Abstract

本发明提供了一种含不对称二硫键的肽的固相合成方法，以及由此方法合成的肽。

Description

一种肽的固相合成方法及其合成的肽

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种含不对称二硫键的肽的固相合成方法，以及由此方法合成的肽。

背景技术

二硫键(disulfide)在蛋白质及多肽分子中对保持其生物活性和构象稳定有着举足轻重的作用。含有二硫键的小分子肽通过溶液法或固相合成法合成时，通常是将脱保护的线性肽链中的两个半胱氨酸(Cys)残基的巯基氧化成二硫键。两个半胱氨酸形成一个二硫键的方法有很多，例如，中国专利申请CN102336808A报道了一种奥曲肽二硫键氧化环合的方法，其采用醋酸铵缓冲液作为氧化工作液，在pH 7.5-8.5下，将合成的奥曲肽前体直八肽氧化成环八肽，所述方法氧化条件温和，副反应少，产物纯度高，最后产品收率高，适用于规模化生产。当多肽分子含多对Cys残基时，二硫键的形成受许多因素影响，可能导致形成多种异构体，产物的产率降低，且给分离纯化带来许多麻烦。

现有技术中没有不对称二硫键的合成方法，而实际多肽药物中有许多含有不对称二硫键的药物。因此，需要一种含不对称二硫键的肽的合成方法。

发明内容

本发明提供了一种含不对称二硫键的肽的合成方法，其包括以下步骤：

(1)合成与固相载体2-三苯甲基氯树脂相连接的肽，所述肽包含三个或三个以上的半胱氨酸或高半胱氨酸的残基，其中两个所述半胱氨酸或高半胱氨酸的侧链各自被S-烷基-硫基保护基团保护，其中所述烷基为未被取代的或被芳基、芳氧基、烷氧基、其卤代变体或卤素进一步取代，其中两个保护基为相同或不同，其中其余的半胱氨酸或高半胱氨酸的侧链被三苯甲基-、叔丁基-、乙酰氨基甲基-、烷基化的乙酰氨基甲基-、烷基化的三苯甲基-保护基团保护，

(2)使所述肽与S-烷基-硫基保护基团去除剂反应，

(3)使所述肽在氧气存在下且在无非均相催化剂存在下形成不对称二硫键，

(4)裂解肽树脂得到含不对称二硫键的肽。

此外，本发明还提供一种合成的含不对称二硫键的肽，其具有以下通式：

其中，m，n＝1或2，其中Y＝H或Y是第一保护基团，o为0-50，x为2-50，q＝0-50，其中R₁(o)、R₂(x)、R₃(q)各自独立地是选自以下的氨基酸的侧链：天然氨基酸，包括环氨基酸；非天然氨基酸，包括环氨基酸或非酰氨结合的二肽基区段，天然氨基酸的非天然衍生物或其类似物，其中所述氨基酸链各自不包含或包含第二保护基团，各侧链的第二保护基团相同或不同，A是树脂或树脂连接臂，R₁₀、R₁₁各自为烷基，该烷基为未被取代的或被芳基、芳氧基、烷氧基、其卤代变体或卤素进一步取代，这些烷基相同或不同。

本发明的方法简单，所述方法通过定位氧化在肽分子中形成不对称二硫键，其定向效率高，因而产生的副产物少。

具体实施方式

(2)使所述肽与S-烷基-硫基保护基团去除剂反应，

(4)裂解肽树脂得到含不对称二硫键的肽。

在一个优选实施方案中，本发明的方法还包括在步骤(4)后采用HPLC方法纯化所述肽，最终得到精肽；优选所述纯化方法为：将所述肽经过滤后用以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以三氟乙酸(TFA)水溶液为A相、色谱纯乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化，其中流动相A相为体积比为0.1％TFA水溶液，B相为纯乙腈。

在一个具体实施方案中，步骤(1)中用于合成肽的偶联剂是本领域公知的，所述偶联剂可以是混合酸酐(例如丙膦酸酐)或其他酰化剂，例如活化的酯或酰基卤(例如异丁基氯甲酸酯)，或者碳二亚胺(例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺、N，N-二异丙基碳二亚胺)，活化的苯并三嗪衍生物(例如DEPBT：3-(二乙氧基磷酰氧基)-1，2，3-苯并三嗪-4(3H)-酮)或苯并三唑的脲鎓或鏻盐衍生物(例如，HBTU(六氟磷酸O-1H-苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’-四甲基脲鎓)、BOP(六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三-(二甲基氨基)-鏻)、PyBOP(六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三吡咯烷鏻)、PyAOP、HCTU(六氟磷酸O-(1H-6-氯-苯并三唑-1-基)1，1，3，3-四甲基脲鎓)、TCTU(四氟硼酸O-(1H-6-氯苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓)、HATU(六氟磷酸O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓)、TATU(四氟硼酸O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲鎓)、TOTU(四氟硼酸O-[氰基(乙氧基羰基)亚甲基氨基]-N，N，N’，N”-四甲基脲鎓)、HAPyU(六氟磷酸O-(苯并三唑-1-基)氧基双-(吡咯烷)-脲鎓))。

步骤(1)优选在碱存在下发生反应，所述碱优选为N，N-二异丙基乙胺、N，N’-二烷基苯胺、2，4，6-三烷基吡啶或N-烷基吗啉，其中所述烷基是直链或支链C₁-C₄烷基，更优选为N-甲基吗啉或2，4，6-三甲基吡啶，最优选为2，4，6-三甲基吡啶。

步骤(1)优选使用偶联添加剂，特别是苯并三唑类的偶联添加剂，优选为N-羟基苯并三唑衍生物或N-羟基苯并三嗪衍生物，更优选为N-羟基丁二酰亚胺、N-羟基-3，4-二氢-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(HOOBt)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)和N-羟基苯并三唑(HOBt)，最优选为N-羟基苯并三唑(HOBt)。

步骤(1)优选使用，例如，20％哌啶/N-甲基吗啉溶液，20％哌啶/DMF溶液，进行碱不稳定性Nα的脱保护，尤其用于固相合成中N-末端的Fmoc(9-芴甲氧羰基)或Boc(叔丁氧羰基)保护。

在一个具体实施方案中，步骤(1)所得的肽的替代度范围可小于0.5mmol/g，优选为0.1-0.5mmol/g，更优选为0.3mmol/g。

在一个具体实施方案中，所述S-烷基-硫基保护基团优选为S-叔丁基硫基(StBu)保护基团。

在一个具体实施方案中，所述半胱氨酸或高半胱氨酸可被至少3个残基隔开，优选被至少5个残基隔开。

在一个具体实施方案中，所述肽可具有至少另一种侧链保护基团，该保护基团可为Trt(三苯甲基)、tBu(叔丁基)、Pbf(2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基)、OtBu(叔丁氧基)、Acm(乙酰氨基甲基)、Boc(叔丁氧羰基)；优选所述肽包括2-100个氨基酸残基。

在一个具体实施方案中，所述高半胱氨酸的侧链包括2-15个亚甲基和1个巯基。

在一个具体实施方案中，所述S-烷基-硫基保护基团去除剂可为三烷基膦或巯基试剂，优选为三正丁基膦或硫醇类，其中所述三烷基膦或硫醇类的投料倍数优选大于10倍，更优选为10倍-100倍，最优选为50倍。

在一个具体实施方案中，步骤(2)的溶剂可为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、异丙醇(iPr-OH)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)，或其混合物，优选N，N-二甲基甲酰胺/异丙醇混合液(混合比优选为10∶1)；步骤(2)优选在惰性气体保护下进行反应，所述惰性气体优选为氮气、氩气，更优选为氮气。

在一个具体实施方案中，步骤(3)的溶剂可为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、二氯亚砜(DMSO)，或其混合物，优选DMF和DCM的混合液(混合比优选为4∶1)；步骤(3)优选在碱存在下发生反应，所述碱可为碱性盐(如乙酸钠)或胺(例如叔胺)，优选为胺，更优选为叔胺，最优选为三乙胺；步骤(3)中所述的氧气优选是鼓泡到反应液体中的；步骤(3)的所述非均相催化剂可为炭；步骤(3)的反应时间优选为10h-40h，更优选为20h-35h，最优选为30h。

在一个具体实施方案中，步骤(4)是脱除所有侧链保护基同时将粗肽从树脂上切割下来得到含不对称二硫键的肽，其中肽树脂裂解所采用的裂解液优选为三氟乙酸(TFA)、三异丙基硅烷(TIS)和水的混合试剂，所述混合溶剂的比例优选为：TFA为85％-99％(V/V)、TIS为10％-1％(V/V)、余量为水，更优选比例为90％-95％(V/V)、TIS为5％-3％(V/V)、余量为水，最优选为TFA∶TIS∶水＝94∶3∶3(V/V)；或者，所述裂解液优选为三氟乙酸(TFA)、三异丙基硅烷(TIS)、苯甲醚、苯甲硫醚的混合试剂，所述混合试剂的比例优选为TFA∶TIS∶甲醚∶苯甲硫醚＝90∶3∶2∶5

本文所使用的术语“芳基”指其中至少一个环为芳香族的C_6-12单环烃环或双环烃环。所述基团的实例包括苯基、萘基和四氢萘基。

本文所使用的术语“芳氧基”指-O-芳基。所述基团的实例包括苯氧基。

本文所使用的术语“烷基”指直链或支链C₁-C₆烷基。所述基团的实例包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基。

本文所使用的术语“烷氧基”指-O-烷基，其中烷基是直链或支链C₁-C₆烷基。所述基团的实例包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、戊氧基和己氧基。

除非另外具体指出，本文所使用的术语“卤素”指氟原子、氯原子、溴原子或碘原子。

本文所使用的术语“替代度”指每克树脂含有的可与氨基酸反应的有效活性基团的摩尔数。

以下通过实施例形式举例说明本发明，但不应将此理解为本发明主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。以下实施例中使用的原料或试剂可通过商业途径购得，或者通过本领域技术人员已知的常规方法制备得到；所使用的实验仪器可通过商业途径购得。

实施例

以含有3个半胱氨酸残基和一个不对称二硫键的已知多肽NH₂-Cys-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-[Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys]-Asp-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH为例来阐释本发明。本发明的方法包括以下步骤：

(1)与2-CTC树脂相连接的29肽的制备

实施例1：替代度为0.1mmol/g的Fmoc-Tyr(tBu)-CTC树脂的制备称取替代度为0.8mmol/g的2-CTC树脂(2-三苯甲基氯树脂)30g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取8.26g Fmoc-Tyr(tBu)-OH用DMF溶解，冰水浴下加入4.66mlDIPEA(N，N-二异丙基乙胺)活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，控制反应温度25℃反应2h。加入150ml无水甲醇封闭30min。用DMF洗涤3次，DCM洗3次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Tyr(tBu)-CTC树脂，检测替代度为0.110mmol/g。

实施例2：替代度为0.3mmol/g的Fmoc-Tyr(tBu)-CTC树脂的制备

称取替代度为0.8mmol/g的2-CTC树脂30g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取11.01gFmoc-Tyr(tBu)-OH用DMF溶解，冰水浴下加入6.21ml DIPEA活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，控制反应温度25℃反应2h。加入150ml无水甲醇封闭30min。用DMF洗涤3次，DCM洗3次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Tyr(tBu)-CTC树脂，检测替代度为0.310mmol/g。

实施例3：替代度为0.5mmol/g的Fmoc-Tyr(tBu)-CTC树脂的制备

称取替代度为0.8mmol/g的2-CTC树脂30g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，取16.52gFmoc-Tyr(tBu)-OH用DMF溶解，冰水浴下加入9.32ml DIPEA活化后，加入上述装有树脂的反应柱中，控制反应温度25℃反应2h。加入150ml无水甲醇封闭30min。用DMF洗涤3次，DCM洗3次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Tyr(tBu)-CTC树脂，检测替代度为0.480mmol/g。

实施例4：与2-CTC 树脂相连接的29肽，即NH2-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Stbu)-Phe-Gly-Gly-Arg(Pbf)-Met-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Ile-Gly-Ala-Gln(Trt)-Ser(tBu)-Gly-Leu-Gly-Cys(Stbu)-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Phe-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-CTC树脂的制备

称取替代度为0.310mmol/g的Fmoc-Tyr(tBu)-CTC树脂32.24g(10mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀Fmoc-Tyr(tBu)-CTC树脂30分钟后，用DBLK(20％哌啶/DMF溶液)脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。将32.4gFmoc-Arg(Pbf)-OH(50mmol)，8.1g HOBt(1-羟基苯并三唑)(60mmol)，3.78g DIC(N，N-二异丙基碳二亚胺)(60mmol)溶于体积比为1∶1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h)。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照肽序，依次完成各个偶联，然后用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到NH2-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Stbu)-Phe-Gly-Gly-Arg(Pbf)-Met-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Ile-Gly-Ala-Gln(Trt)-Ser(tBu)-Gly-Leu-Gly-Cys(Stbu)-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Phe-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-CTC树脂75g。

实施例5：与2-CTC 树脂相连接的29肽，即NH2-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Stbu)-Phe-Gly-Gly-Arg(Pbf)-Met-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Ile-Gly-Ala-Gln(Trt)-Ser(tBu)-Gly-Leu-Gly-Cys(Stbu)-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Phe-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-CTC树脂的制备

称取替代度为0.110mmol/g的Fmoc-Tyr(tBu)-CTC树脂90.91g(10mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀Fmoc-Tyr(tBu)-CTC树脂30分钟后，用DBLK(20％哌啶/DMF溶液)脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。将32.4gFmoc-Arg(Pbf)-OH(50mmol)，8.1g HOBt(1-羟基苯并三唑)(60mmol)，3.78g DIC(N，N-二异丙基碳二亚胺)(60mmol)溶于体积比为1∶1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h)。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照肽序，依次完成各个偶联，然后用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到NH2-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Stbu)-Phe-Gly-Gly-Arg(Pbf)-Met-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Ile-Gly-Ala-Gln(Trt)-Ser(tBu)-Gly-Leu-Gly-Cys(Stbu)-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Phe-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-CTC树脂128.5g。

实施例6：与2-CTC树脂相连接的29肽，即NH2-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Stbu)-Phe-Gly-Gly-Arg(Pbf)-Met-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Ile-Gly-Ala-Gln(Trt)-Ser(tBu)-Gly-Leu-Gly-Cys(Stbu)-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Phe-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-CTC树脂的制备

称取替代度为0.480mmol/g的Fmoc-Tyr(tBu)-CTC树脂20.83g(10mmol)，加入固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀Fmoc-Tyr(tBu)-CTC树脂30分钟后，用DBLK(20％哌啶/DMF溶液)脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。将32.4gFmoc-Arg(Pbf)-OH(50mmol)，8.1g HOBt(1-羟基苯并三唑)(60mmol)，3.78g DIC(N，N-二异丙基碳二亚胺)(60mmol)溶于体积比为1∶1的DCM和DMF混合溶液，加入固相反应柱中，室温反应2h(反应终点以茚三酮法检测为准，如果树脂无色透明，则反应完全，树脂显色，表示反应不完全，需再偶联反应1h)。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照肽序，依次完成各个偶联，然后用DBLK脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗2次。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到NH2-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Stbu)-Phe-Gly-Gly-Arg(Pbf)-Met-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Ile-Gly-Ala-Gln(Trt)-Ser(tBu)-Gly-Leu-Gly-Cys(Stbu)-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Phe-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-CTC树脂52.4g。

(2)脱除半胱氨酸的Stbu保护基团

实施例7

将实施例4得到的75g(10mmol)肽树脂加入到反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，加入200ml的反应溶剂(iPr-OH∶DMF＝1∶10)，然后加入10倍当量的正三丁基膦20g，鼓氮气反应6h。反应结束后抽走反应液，用DMF和DCM分别洗涤树脂四遍。反应完成后裂解小样(50mg)，测得脱除Stbu保护的肽树脂裂解得到的粗肽的HPLC纯度为85％。得到的肽树脂直接用于下步反应。

实施例8

将实施例5得到的128.5g(10mmol)肽树脂反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，加入300ml的反应溶剂(iPr-OH∶DMF＝1∶10)，然后加入10倍当量的正三丁基膦20g，鼓氮气反应6h。反应结束后抽走反应液，用DMF和DCM分别洗涤树脂四遍。反应完成后裂解小样(50mg)，测得脱除Stbu保护的肽树脂裂解得到的粗肽的HPLC纯度为83％。得到的肽树脂直接用于下步反应。

实施例9

将实施例6得到的52.4g(10mmol)肽树脂反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，加入150ml的反应溶剂(iPr-OH∶DMF＝1∶10)，然后加入10倍当量的正三丁基膦20g，鼓氮气反应6h。反应结束后抽走反应液，用DMF和DCM分别洗涤树脂四遍。反应完成后裂解小样(50mg)，测得脱除Stbu保护的肽树脂裂解得到的粗肽的HPLC纯度为70％。得到的肽树脂直接用于下步反应。

实施例10

将实施例4得到的75g(10mmol)肽树脂加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，加入200ml的反应溶剂(iPr-OH∶DMF＝1∶10)，然后加入20倍当量的正三丁基膦40g，鼓氮气反应6h。反应结束后抽走反应液，用DMF和DCM分别洗涤树脂四遍。反应完成后裂解小样(50mg)，测得脱除Stbu保护的肽树脂裂解得到的粗肽的HPLC纯度为65％。得到的肽树脂直接用于下步反应。

实施例11

将实施例4得到的75g(10mmol)肽树脂加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟后，加入200ml的反应溶剂(iPr-OH∶DMF＝1∶10)，然后加入50倍当量的正三丁基膦100g，鼓氮气反应6h。反应结束后抽走反应液，用DMF和DCM分别洗涤树脂四遍。反应完成后裂解小样(50mg)，测得脱除Stbu保护的肽树脂裂解得到的粗肽的HPLC纯度为70％。得到的肽树脂直接用于下步反应。

(3)不对称二硫键的形成

实施例12

将实施例7得到的肽树脂(10mmol)加入150ml DMF和50mlDCM，然后加入10当量的三乙胺12.3ml，通入氧气搅拌反应10h。反应完成后，抽走反应液，用DMF和DCM分别洗涤树脂4遍，甲醇收缩得到肽树脂73.3g。进行小样(50mg)裂解分析含不对称二硫键的粗肽的HPLC纯度为60％。

实施例13

将实施例7得到的肽树脂(10mmol)加入150ml DMF和50mlDCM，然后加入10当量的三乙胺12.3ml，通入氧气搅拌反应30h。反应完成后，抽走反应液，用DMF和DCM分别洗涤树脂4遍，甲醇收缩得到肽树脂73.2g。进行小样(50mg)裂解分析含不对称二硫键的粗肽的HPLC纯度为80％。

实施例14

将实施例7得到的肽树脂(10mmol)加入150ml DMF和50mlDCM，然后加入10当量的三乙胺12.3ml，通入氧气搅拌反应40h。反应完成后，抽走反应液，用DMF和DCM分别洗涤树脂4遍，甲醇收缩得到肽树脂73.0g。进行小样(50mg)裂解分析含不对称二硫键的粗肽的HPLC纯度为78％。

(4)肽树脂的裂解

实施例15

将实施例13得到的肽树脂73.2g加入750ml裂解试剂(TFA∶TIS∶水＝94∶3∶3，体积比)，室温搅拌2h。反应结束后加入7.5L冰冻的无水乙醚沉淀，用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体，即粗肽46.5g。收率为96％，HPLC纯度为64％。

(5)精肽的制备

实施例16

1)样品处理：将实施例15得到的粗肽用Φ0.45μm滤膜过滤，收集滤液备用。

2)第一次纯化：纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：15cm＊25cm。流动相：A相：0.1％三氟乙酸水溶液；B相：乙腈。流速：450-550ml/min。检测波长：230nm。梯度：B％：15％～35％(60min)。进样量为5-10g。

纯化过程：将色谱柱用50％以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为5-10g。线性梯度洗脱60min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液于水温不超过30℃下减压旋蒸浓缩至约50-75ml/g后备用。

3)第二次纯化：纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：15cm＊25cm。流动相：A相：40mmol/L磷酸二氢钠水溶液用氢氧化钠调pH至6.5；B相：乙腈。流速：450-550ml/min。检测波长：230nm。梯度：B％：15％～30％(60min)。进样量为5-10g。

纯化过程-1：将色谱柱用50％以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为500-2000ml样品溶液。线性梯度洗脱45min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液于水温不超过30℃下减压旋蒸浓缩至约50-75ml/g后备用。

纯化过程-2：将色谱柱用50％以上的乙腈冲洗干净后上样，上样量为750-2000ml样品溶液。线性梯度洗脱30min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液合并旋蒸浓缩至约20-30ml/g后转至合适大小西林瓶。后进行冷冻干燥，即可得到HPLC纯度大于98％的精肽，纯化收率可达35％以上。

最终所得的已知的29肽的结构确证数据为：MALDI-TOF：[M+Na]⁺：3120.6

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以进行其它多种形式的修改、替换或变更。本领域人员能够理解，本申请所描述的本发明技术方案的各个特征均可根据需要进行适当的组合。

Claims

1.一种含不对称二硫键的肽的合成方法，其包括以下步骤：

(1)合成与固相载体2-CTC树脂相连接的肽，所述肽包含三个或三个以上的半胱氨酸或高半胱氨酸的残基，其中两个所述半胱氨酸或高半胱氨酸的侧链各自被S-烷基-硫基保护基团保护，其中所述烷基为未被取代的或被芳基、芳氧基、烷氧基、其卤代变体或卤素进一步取代，其中两个保护基为相同或不同，其中其余的半胱氨酸或高半胱氨酸的侧链被三苯甲基-、叔丁基-、乙酰氨基甲基-、烷基化的乙酰氨基甲基-、烷基化的三苯甲基-保护基团保护，

(2)使所述肽与S-烷基-硫基保护基团去除剂反应，

(4)裂解肽树脂得到含不对称二硫键的肽。

2.权利要求1的合成方法，其中所述方法包括在步骤(4)后采用HPLC方法纯化所述肽，最终得到精肽；优选所述纯化方法为：将所述肽经过滤后用以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以三氟乙酸水溶液为A相、色谱纯乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化，其中流动相A相为体积比为0.1％TFA水溶液，B相为纯乙腈。

3.权利要求1的合成方法，其中在步骤(1)中用于合成肽的偶联剂包括选自以下的一种或多种：混合酸酐、活化的酯或酰基卤、碳二亚胺、活化的苯并三嗪衍生物、苯并三唑的脲鎓或鏻盐衍生物、BOP、PyBOP、PyAOP、HCTU、TCTU、HATU、TATU、TOTU、HAPyU，或其混合物；步骤(1)优选在碱存在下发生反应，所述碱优选为N，N-二异丙基乙胺、N，N’-二烷基苯胺、2，4，6-三烷基吡啶或N-烷基吗啉，其中所述烷基是直链或支链C₁-C₄烷基，更优选为N-甲基吗啉或2，4，6-三甲基吡啶，最优选为2，4，6-三甲基吡啶；步骤(1)优选使用偶联添加剂，特别是苯并三唑类的偶联添加剂，优选为N-羟基苯并三唑衍生物或N-羟基苯并三嗪衍生物，更优选为N-羟基丁二酰亚胺、N-羟基-3，4-二氢-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪、1-羟基-7-氮杂苯并三唑和N-羟基苯并三唑，最优选为N-羟基苯并三唑；步骤(1)优选使用20％哌啶/N-甲基吗啉溶液，20％哌啶/DMF溶液，进行碱不稳定性Nα的脱保护，尤其用于固相合成中N-末端的Fmoc或Boc保护。

4.权利要求1的合成方法，其中步骤(1)中的所述肽具有至少另一种侧链保护基团，包括Trt、tBu、Pbf、OtBu、Acm、Boc；优选地，所述S-烷基-硫基保护基团为S-叔丁基硫基保护基团；优选地，步骤(1)所得的肽的替代度范围可小于0.5mmol/g，优选为0.1-0.5mmol/g，更优选为0.3mmol/g。

5.权利要求1的合成方法，其中所述肽中半胱氨酸或高半胱氨酸被至少3个残基隔开，优选被至少5个残基隔开；优选地，所述肽包括2-100个氨基酸残基；优选地，所述高半胱氨酸的侧链包括2-15个亚甲基和1个巯基。

6.权利要求1的合成方法，其中所述S-烷基-硫基保护基团去除剂为三烷基膦或巯基试剂，优选为三正丁基膦或硫醇类；其中所述三烷基膦或硫醇类的投料倍数优选大于10倍，更优选为10倍-100倍，最优选为50倍。

7.权利要求1的合成方法，其中步骤(2)的溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、异丙醇、N-甲基吡咯烷酮，或其混合物，优选N，N-二甲基甲酰胺/异丙醇混合液(混合比优选为10∶1)；步骤(2)优选在惰性气体保护下进行反应，所述惰性气体优选为氮气、氩气，更优选为氮气。

8.权利要求1的合成方法，其中步骤(3)的溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、N-甲基吡咯烷酮、二氯亚砜，或其混合物，优选DMF和DCM的混合液(混合比优选为4∶1)；步骤(3)优选在碱存在下发生反应，所述碱可为碱性盐(如乙酸钠)或胺，优选为胺，更优选为叔胺，最优选为三乙胺；步骤(3)中所述的氧气优选是鼓泡到反应液体中的；步骤(3)的所述非均相催化剂可为炭；步骤(3)的反应时间优选为10h-40h，更优选为20h-35h，最优选为30h。

9.权利要求1的合成方法，其中步骤(4)是脱除所有侧链保护基同时将粗肽从树脂上切割下来得到含不对称二硫键的肽，其中肽树脂裂解所采用的裂解液优选为三氟乙酸、三异丙基硅烷和水的混合试剂，所述混合溶剂的比例优选为：TFA为85％-99％(V/V)、TIS为10％-1％(V/V)、余量为水，更优选比例为90％-95％(V/V)、TIS为5％-3％ (V/V)、余量为水，最优选为TFA∶TIS∶水＝94∶3∶3(V/V)；或者，所述裂解液优选为三氟乙酸、三异丙基硅烷、苯甲醚、苯甲硫醚的混合试剂，所述混合试剂的比例优选为TFA∶TIS∶苯甲醚∶苯甲硫醚＝90∶3∶2∶5。

10.一种根据权利要求1-9中任一项的方法合成的含不对称二硫键的肽，其具有以下通式：