CN104311639A - 一种生长抑素的合成工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明属于多肽药物合成技术领域，尤其涉及一种十四肽生长抑素固相合成工艺的改进，步骤如下：步骤1，将经溶胀处理的树脂和溶于DCM的Fmoc‐Cys(Acm)‐OH和DIEA加入反应罐，搅拌反应以形成Fmoc‐Cys(Acm)‐树脂；步骤2，向上一步骤所得的Fmoc‐Cys(Acm)‐树脂中加入DMF溶液，使物料脱去保护基团，加入溶解于DMF中的Fmoc‐Ser(tBu)‐OH和缩合剂，搅拌反应以形成Fmoc‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂；步骤3，循环步骤2去保护基团、保护氨基酸活化、偶联反应的操作，以形成十四肽树脂；步骤4，对上一步骤所得的十四肽树脂进行收缩处理，然后经裂解液裂解，除去树脂，得还原型粗肽固体；步骤5，加水溶解粗肽固体，加碘的乙醇溶液氧化，形成环化十四肽；环肽溶液上制备液相纯化，再经冷冻干燥后，制得精肽。
Description
技术领域
本发明属于多肽药物合成技术领域，尤其涉及一种十四肽生长抑素固相合成工艺的改进。
背景技术
生长抑素是人工合成的环状十四氨基酸肽，其英文名为：Somatostatin，结构式为：
分子式为：C76H104N18O19S2，分子量为：1637.89。
人工合成的环状十四肽生长抑素与天然生长抑素在化学结构和作用机理上完全相同。生理性生长抑素主要存在于丘脑下部和胃肠道，其主要功能是抑制胃的分泌和蠕动，以及在下丘脑/垂体中抑制促生长素的释放。临床可应用于严重急性食道静脉曲张出血，严重急性胃或十二指肠溃疡出血，或并发急性糜烂性胃炎或出血性胃炎，胰腺外科术后并发症的预防和治疗，胰、胆和肠瘘的辅助治疗，糖尿病酮症酸中毒的辅助治疗。
固相合成生长抑素的优点是简化了合成工艺中每步反应的后处理操作，避免因手工操作和物料转移而产生的损失，产率较高且能够实现自动化等。目前存在的固相合成生长抑素方法比较多，关于固相合成生长抑素的专利主要集中在使用树脂为起始原料，逐步偶联具有保护基团的氨基酸，其间依次脱去Fmoc‐保护基团，用缩合剂进行接肽反应，循环反应得到十四肽树脂，然后使用裂解试剂切割保护树脂，再进行氧化、纯化等。具有接肽速率快，收率高，周期短等优点，但仍存在问题。
CN 1552728A采用Wang Resin合成生长抑素。由于十二肽生长抑素的C端氨基酸为Cys，后者在强烈的反应条件下易发生消旋，而载体树脂与第一个保护氨基酸的链接，不仅直接影响到后面氨基酸的用量，也直接影响到目标肽的收率。与Wang Resin相比，2‐CTC Resin与氨基酸连接时，由于2‐CTC Resin位阻较大，且没必要活化氨基酸的羧基，由此可避免氨基酸与树脂连接时引起的Cys消旋。在合成生长抑素时，选择2‐CTCResin树脂更为适宜。
CN 1508152A，CN 102952175A，CN 103265620A，CN 103275189A，均采用2‐ClTrtResin作为原料，而C端第一保护氨基酸选用Fmoc‐Cys(Acm)‐OH，两者都具有较大的位阻，不利于合成。并且以上专利在去保护反应、氨基酸活化、缩合反应的过程中所控制的温度都在25℃以上，这易引起Thr、Cys、Thr的氧化，影响生长抑素的产率。
目前的固相合成生长抑素的方法都存在空间位阻的空间因素，阻碍氨基酸的合成，影响目标多肽的产率，且合成过程易消旋，使产品旋光度降低。这些限制了生长抑素的大规模生产和使用。
我们惊喜的发现，使用2‐CTC树脂作为原料，并选用空间位阻较小Fmoc‐Cys(Acm)‐OH作为起始氨基酸，降低了合成的难度。此外，各步骤控制去保护温度0～25℃，通入惰性保护气体；控制氨基酸活化温度0～25℃，活化过程通入惰性保护气体；控制偶联反应温度0～25℃，通入惰性保护气体，能有效抑制易氧化氨基酸Trp、Cys、Thr的氧化，提高了产物品质和收率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生长抑素合成工艺，期待该方法可以使生长抑素的收率和品质得以提高。
本发明采用2‐CTC树脂作为载体，在该树脂上首先连接保护半胱氨酸(Fmoc‐Cys(Acm)‐OH)，然后脱掉保护基团，依次偶联活化的保护氨基酸，循环重复去保护基团、保护氨基酸活化、偶联步骤，形成十四肽树脂，其中活化、偶联、去保护温度均控制在0～25℃，并充入惰性气体；肽树脂偶联结束后，用甲醇洗涤三次，抽干收缩，然后使用裂解液(TFA：TIS＝95：5，V/V)切割树脂，得粗肽固体，加水溶解成1mg/mL的溶液，加入碘的乙醇溶液进行环化，液相纯化后冻干得精肽。
优选的，本发明生长抑素的合成方法如下：
步骤1，将经溶胀处理的树脂和溶于DCM的Fmoc‐Cys(Acm)‐OH和DIEA加入反应罐(DIEA：Fmoc‐Cys(Acm)‐OH＝2～3：1，摩尔比)，偶联温度0～35℃，通入惰性气体，搅拌反应12～36h以形成Fmoc‐Cys(Acm)‐树脂；
步骤2，向上一步骤所得的Fmoc‐Cys(Acm)‐树脂中加入重量浓度为18～25％PIP的DMF溶液，温度0～35℃，通入惰性气体，使物料脱去保护基团，加入溶解于DMF中的Fmoc‐Ser(tBu)‐OH和缩合剂，反应温度0～35℃，通入惰性气体，搅拌反应以形成Fmoc‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂；
步骤3，循环步骤2去保护基团、保护氨基酸活化、偶联反应的操作，依次偶联Fmoc‐Thr(tBu)‐OH、Fmoc‐Phe‐OH、Fmoc‐Thr(tBu)‐OH、Fmoc‐Lys(Boc)‐OH、Fmoc‐Trp(Boc)‐OH、Fmoc‐Phe‐OH、Fmoc‐Phe‐OH、Fmoc‐Asn(Trt)‐OH、Fmoc‐Lys(Boc)‐OH、Fmoc‐Cys(Acm)‐OH、Fmoc‐Gly‐OH、Fmoc‐Ala‐OH，以形成十四肽树脂；
步骤4，对上一步骤所得的十四肽树脂进行收缩处理，然后经裂解液(TFA：TIS＝95：5，V/V)裂解，除去树脂，得还原型粗肽固体；
步骤5，加水溶解粗肽固体，加碘的乙醇溶液氧化，形成环化十四肽；环肽溶液上制备液相纯化，再经冷冻干燥后，制得精肽。
特别优选的，本发明的生长抑素的合成方法步骤如下：
步骤1的方法如下：取固相合成树脂2‐CTC加入到反应器内，加入DCM浸泡洗涤3次，每次10min，加入DCM，搅拌溶胀；取Fmoc‐Cys(Acm)‐OH加入到溶解罐，加入DCM搅拌溶解，加入DIEA溶解澄清，DIEA与Fmoc‐Cys(Acm)‐OH的摩尔比值为2～3：1，优选比值为2：1；之后转入反应罐内保持温度0～25℃，优选反应温度为20～25℃，并通入惰性保护气体，搅拌反应24h；偶联结束，依次加入DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
步骤2的方法如下：脱去保护基团：洗涤完毕的Fmoc‐Cys(Acm)‐树脂中加入重量浓度为18～25％PIP的DMF溶液，搅拌反应15min，去保护温度0～25℃，优选温度10～20℃，去保护结束，用DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；保护氨基酸活化：保护氨基酸Fmoc‐Ser(tBu)‐OH、Cl‐HOBt加入到溶解罐，加入DMF搅拌溶解，加入DIC溶解澄清，通入惰性保护气体，控制活化温度0～25℃，优选温度0～10℃；偶联反应：氨基酸活化结束后转入反应罐内搅拌反应3h，偶联温度0～25℃，优选温度20～25℃，偶联过程惰性气体保护，偶联结束，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
步骤3的方法如下：循化去保护基团、保护氨基酸活化、偶联反应的操作，依次偶联Fmoc‐Thr(tBu)‐OH、Fmoc‐Phe‐OH、Fmoc‐Thr(tBu)‐OH、Fmoc‐Lys(Boc)‐OH、Fmoc‐Trp(Boc)‐OH、Fmoc‐Phe‐OH、Fmoc‐Phe‐OH、Fmoc‐Asn(Trt)‐OH、Fmoc‐Lys(Boc)‐OH、Fmoc‐Cys(Acm)‐OH、Fmoc‐Gly‐OH、Fmoc‐Ala‐OH，得到Fmoc‐Ala‐Gly‐Cys(Acm)‐Lys(Boc)‐Asn(Trt)‐Phe‐Phe‐Trp(Boc)‐Lys(Boc)‐Thr(tBu)‐Phe‐Thr(tBu)‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂，去保护采用重量浓度为重量浓度为20％PIP的DMF溶液，偶联剂为Cl‐HOBt/DIC，去保护温度优选10～20℃，氨基酸活化温度优选0～10℃，偶联温度优选20～25℃，并通入惰性气体。
步骤4的方法如下：用甲醇洗涤步骤3所得十四肽树脂，抽干；干燥后的肽树脂按1g：10ml的比例加入裂解液(TFA：TIS＝95：5，V/V)，搅拌反应2h，抽滤，除去树脂，滤液加入乙醚内沉降3h，离心得到粗肽固体。
步骤5的环化方法如下：取粗肽固体加水溶解成1mg/ml的溶液，慢慢滴入碘的乙醇溶液，滴加完毕后搅拌，检测反应结束后加入过量的硫代硫酸钠，中和过量的碘。步骤5的纯化方法如下：
初纯：流动相A：TFA/纯化水、B：乙腈(色谱纯)，波长：230nm
洗脱梯度如下：流动相B用5％平衡2min，在1min内升到35％，保持35％直到洗脱结束；循环上样洗脱进行操作，收集主峰溶液。
精纯一步：流动相A相：HAC/TEA/纯化水，B相：乙腈，波长：230nm
洗脱梯度如下：流动相B用5％平衡2min，在1min内升到26％，在40min内升到28％，保持直到洗脱结束。循环上样洗脱进行操作，收集主峰溶液。
精纯二步：流动相A相：HAC/纯化水，B相：乙腈，波长：230nm
洗脱梯度如下：流动相B用5％平衡2min，在1min内升到19％，在20min内升到22％，在22％保持20min洗脱结束。循环上样洗脱进行操作，收集主峰溶液。
转盐：流动相A相：醋酸铵/纯化水；B相：乙腈，波长：230nm
梯度洗脱梯度：流动相B用5％转盐20min。洗脱流动相C：0.3％HAC水溶液，洗脱梯度：流动相B用5％平衡15min,在1min内升到25％，在25％保持20min洗脱结束。
收集所需要的流出液，去盐，除尽乙腈，冻干获得精生长抑素。
以下为本发明名词术语的解释：
本发明的方法可用于工业化大规模生产高纯度的生长抑素原料药，提高了生长抑素的生产效率(收率高)和生长抑素原料药的纯度(纯度高)，节约保护氨基酸用量(成本低)。
本发明和现有技术的不同在于，本发明采用2‐CTC树脂和Fmoc‐Cys(Acm)‐OH作为起始物料；各步骤去保护、活化、偶联反应中控制温度<25℃，并通入惰性气体；采用碘的乙醇溶液作为氧化剂，去除Acm保护基团，环化还原型粗肽。
和现有技术比较，本发明优于现有技术的地方为:(1)采用2‐CTC树脂和空间位阻较小的Fmoc‐Cys(Acm)‐OH作为起始物料，降低了合成的难度；(2)在去保护、活化、偶联反应中控制温度<25℃，并通入惰性气体，有效抑制易氧化氨基酸Trp、Cys、Thr的氧化；(3)采用碘的乙醇溶液作为氧化剂，能在酸性条件下进行氧化。
以下通过比较实验数据说明本发明的有益效果：
具体实施方式
以下实施例是为了说明本发明而非限制本发明，任何符合本发明的实质的技术方案和工艺均属于本发明的保护范围。
实施例1：合成生长抑素
(1)合成Fmoc‐Cys(Acm)‐树脂
称取0.83kg的2‐CTC树脂(100‐200目，0.6mmol/g)，加入DCM洗涤3次，每次10min，加入DCM，室温搅拌溶胀；加入用DCM溶解的Fmoc‐Cys(Acm)‐OH(摩尔量为树脂的2倍)，加入330ml DIEA(摩尔量为树脂的4倍)，通入惰性气体，于22.5±2.5℃条件下反应24小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，得到肽偶合树脂，经检测，偶联率达0.92。
在一个补充的试验步骤中，重复以上步骤(1)，不同的是偶联温度为17.5±2.5℃，得到肽偶合树脂，经检测，偶联率达0.89。在一个补充的试验步骤中，重复以上步骤(1)，不同的是偶联温度为27.5±2.5℃，得到肽偶合树脂，经检测，偶联率达0.85。在一个补充的试验步骤中，重复以上步骤(1)，不同的是使用Fmoc‐Cys(Acm)‐OH作为起始氨基酸，偶联温度为34.5±2.5℃，经检测，偶联率达0.82。从以上补充试验可见，在缩合反应中加入适量降低偶联反应温度，特别是偶联温度为20～25℃范围内是非常有利的。
(2)合成Fmoc‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂
再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入DMF溶解的Fmoc‐Ser(tBu)‐OH(摩尔量为树脂的2倍)、Cl‐HOBT(摩尔量为树脂的2倍)，加入DIC溶解澄清(摩尔量为树脂的2倍)，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
(3)合成Fmoc‐Thr(tBu)‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂
再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入DMF溶解的Fmoc‐Thr(tBu)‐OH(摩尔量为树脂的2倍)、Cl‐HOBT(摩尔量为树脂的2倍)，加入DIC溶解澄清(摩尔量为树脂的2倍)，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
(4)合成Fmoc‐Phe‐Thr(tBu)‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂
再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入DMF溶解的Fmoc‐Phe‐OH(摩尔量为树脂的2倍)、Cl‐HOBT(摩尔量为树脂的2倍)，加入DIC溶解澄清(摩尔量为树脂的2倍)，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
(5)合成Fmoc‐Thr(tBu)‐Phe‐Thr(tBu)‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂
再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入用DMF溶解的Fmoc‐Thr(tBu)‐OH(摩尔量为树脂的2倍)、Cl‐HOBT(摩尔量为树脂的2倍)，加入DIC溶解澄清(摩尔量为树脂的2倍)，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
(6)合成Fmoc‐Lys(Boc)‐Thr(tBu)‐Phe‐Thr(tBu)‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂
再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入用DMF溶解的Fmoc‐Lys(Boc)‐OH(摩尔量为树脂的2倍)、Cl‐HOBT(摩尔量为树脂的2倍)，加入DIC溶解澄清(摩尔量为树脂的2倍)，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
(7)合成Fmoc‐Trp(Boc)‐Lys(Boc)‐Thr(tBu)‐Phe‐Thr(tBu)‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂
再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入用DMF溶解的Fmoc‐Trp(Boc)‐OH(摩尔量为树脂的2倍)、Cl‐HOBT(摩尔量为树脂的2倍)，加入DIC溶解澄清(摩尔量为树脂的2倍)，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
(8)合成Fmoc‐Phe‐Trp(Boc)‐Lys(Boc)‐Thr(tBu)‐Phe‐Thr(tBu)‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂
再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入用DMF溶解的Fmoc‐Phe‐OH(摩尔量为树脂的2倍)、Cl‐HOBT(摩尔量为树脂的2倍)，加入DIC溶解澄清(摩尔量为树脂的2倍)，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
(9)合成Fmoc‐Phe‐Phe‐Trp(Boc)‐Lys(Boc)‐Thr(tBu)‐Phe‐Thr(tBu)‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂
再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入用DMF溶解的Fmoc‐Phe‐OH(摩尔量为树脂的2倍)、Cl‐HOBT(摩尔量为树脂的2倍)，加入DIC溶解澄清(摩尔量为树脂的2倍)，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
(10)合成Fmoc‐Asn(Trt)‐Phe‐Phe‐Trp(Boc)‐Lys(Boc)‐Thr(tBu)‐Phe‐Thr(tBu)‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂
再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入用DMF溶解的Fmoc‐Asn(Trt)‐OH(摩尔量为树脂的2倍)、Cl‐HOBT(摩尔量为树脂的2倍)，加入DIC溶解澄清(摩尔量为树脂的2倍)，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
(11)合成Fmoc‐Lys(Boc)‐Asn(Trt)‐Phe‐Phe‐Trp(Boc)‐Lys(Boc)‐Thr(tBu)‐Phe‐Thr(tBu)‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂
再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入用DMF溶解的Fmoc‐Lys(Boc)‐OH(摩尔量为树脂的2倍)、Cl‐HOBT(摩尔量为树脂的2倍)，加入DIC溶解澄清(摩尔量为树脂的2倍)，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
(12)合成Fmoc‐Cys(Acm)‐Lys(Boc)‐Asn(Trt)‐Phe‐Phe‐Trp(Boc)‐Lys(Boc)‐Thr(tBu)‐Phe‐Thr(tBu)‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂
再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入用DMF溶解的Fmoc‐Cys(Acm)‐OH(摩尔量为树脂的2倍)、Cl‐HOBT(摩尔量为树脂的2倍)，加入DIC溶解澄清(摩尔量为树脂的2倍)，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
(13)合成Fmoc‐Gly‐Cys(Acm)‐Lys(Boc)‐Asn(Trt)‐Phe‐Phe‐Trp(Boc)‐Lys(Boc)‐Thr(tBu)‐Phe‐Thr(tBu)‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂
再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入用DMF溶解的Fmoc‐Gly‐OH(摩尔量为树脂的2倍)、Cl‐HOBT(摩尔量为树脂的2倍)，加入DIC溶解澄清(摩尔量为树脂的2倍)，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。
(14)合成Fmoc‐Ala‐Gly‐Cys(Acm)‐Lys(Boc)‐Asn(Trt)‐Phe‐Phe‐Trp(Boc)‐Lys(Boc)‐Thr(tBu)‐Phe‐Thr(tBu)‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂
再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入用DMF溶解的Fmoc‐Ala‐O(摩尔量为树脂的2倍)、Cl‐HOBT(摩尔量为树脂的2倍)，加入DIC溶解澄清(摩尔量为树脂的2倍)，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次。洗涤后用甲醇收缩，真空干燥过夜，得到肽偶联树脂2.03kg，树脂合成收率95.6％。
(15)肽树脂的裂解
取步骤(14)所得十四肽偶联树脂，按1g：10mL的比例加入裂解液(TFA：TIS＝95：5，V/V)，搅拌反应2h，抽滤，除去树脂，滤液加入乙醚内沉降3h，离心得还原型线性粗肽777.36g，线性粗肽收率94.8％。
(16)粗肽氧化
加水溶解粗肽固体，将粗肽配成1mg/ml的溶液，慢慢滴入碘的乙醇溶液，滴加完毕后搅拌，检测反应结束后加入过量的硫代硫酸钠，中和过量的碘，获得生长抑素粗品。
(17)精制纯化
初纯：流动相A：TFA/纯化水、B：乙腈(色谱纯)，波长：230nm
洗脱梯度如下：流动相B用5％平衡2min，在1min内升到35％，保持35％直到洗脱结束；循环上样洗脱进行操作，收集主峰溶液。
精纯一步：流动相A相：HAC/TEA/纯化水，B相：乙腈，波长：230nm
洗脱梯度如下：流动相B用5％平衡2min，在1min内升到26％，在40min内升到28％，保持直到洗脱结束。循环上样洗脱进行操作，收集主峰溶液。
精纯二步：流动相A相：HAC/纯化水，B相：乙腈，波长：230nm
洗脱梯度如下：流动相B用5％平衡2min，在1min内升到19％，在20min内升到22％，在22％保持20min洗脱结束。循环上样洗脱进行操作，收集主峰溶液。
转盐：流动相A相：醋酸铵/纯化水；B相：乙腈，波长：230nm
梯度洗脱梯度：流动相B用5％转盐20min。洗脱流动相C：0.3％HAC水溶液，洗脱梯度：流动相B用5％平衡15min，在1min内升到25％，在25％保持20min洗脱结束。
收集所需要的流出液，去盐，除尽乙腈，冻干获得精生长抑素383.29g，总收率为：46.8％。
本实施例获得的生长抑素精制品，其经生长抑素原料药2010年版药典记载的标准测定，完全符合该标准的规定。有关物质：最大单一杂质小于0.10％，总杂质小于0.50％，纯度大于99.50％，表明本发明产物具有良好的纯度。
实施例2：合成生长抑素
照实施例1的方法进行，不同仅为步骤(2)～(14)中，以树脂为基准，各组分的量改为：重量浓度为20％的PIP与树脂的摩尔比3：1；具有保护基团的氨基酸与树脂的摩尔比3：1；HOBT与树脂的摩尔比3：1。结果显示17个步骤总收率大于50％；终产物最大单一杂质小于0.30％，总杂质小于0.50％，纯度大于99.50％。
实施例3：合成生长抑素
照实施例1的方法进行，不同仅为步骤(2)～(14)中，氨基酸偶联树脂去保护温度为12.5±2.5℃，保护氨基酸活化温度为2.5±2.5℃，偶联温度为22.5±2.5℃，反应过程中通入惰性气体。结果显示17个步骤总收率大于45％；终产物最大单一杂质小于0.30％，总杂质小于0.50％，纯度大于99.50％。
Claims (10)
1.一种生长抑素的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，将经溶胀处理的树脂和溶于DCM的Fmoc‐Cys(Acm)‐OH和DIEA加入反应罐(DIEA：Fmoc‐Cys(Acm)‐OH＝2～3：1，摩尔比)，偶联温度0～35℃，通入惰性气体，搅拌反应12～36h以形成Fmoc‐Cys(Acm)‐树脂；
步骤2，向上一步骤所得的Fmoc‐Cys(Acm)‐树脂中加入重量浓度为18～25％PIP的DMF溶液，温度0～35℃，通入惰性气体，使物料脱去保护基团，加入溶解于DMF中的Fmoc‐Ser(tBu)‐OH和缩合剂，反应温度0～35℃，通入惰性气体，搅拌反应以形成Fmoc‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂；
步骤3，循环步骤2去保护基团、保护氨基酸活化、偶联反应的操作，依次偶联Fmoc‐Thr(tBu)‐OH、Fmoc‐Phe‐OH、Fmoc‐Thr(tBu)‐OH、Fmoc‐Lys(Boc)‐OH、Fmoc‐Trp(Boc)‐OH、Fmoc‐Phe‐OH、Fmoc‐Phe‐OH、Fmoc‐Asn(Trt)‐OH、Fmoc‐Lys(Boc)‐OH、Fmoc‐Cys(Acm)‐OH、Fmoc‐Gly‐OH、Fmoc‐Ala‐OH，以形成十四肽树脂；
步骤4，对上一步骤所得的十四肽树脂进行收缩处理，然后经裂解液(TFA：TIS＝95：5，V/V)裂解，除去树脂，得还原型粗肽固体；
步骤5，加水溶解粗肽固体，加碘的乙醇溶液氧化，形成环化十四肽；环肽溶液上制备液相纯化，再经冷冻干燥后，制得精肽。
2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，其中，步骤1使用2‐CTC树脂为起始原料，Fmoc‐Cys(Acm)‐OH为起始保护氨基酸，合成Fmoc‐Cys(Acm)‐树脂，其方法如下：取固相合成树脂2‐CTC加入到反应器内，加入DCM浸泡洗涤3次，每次10min，加入DCM，搅拌溶胀；取Fmoc‐Cys(Acm)‐OH加入到溶解罐，加入DCM搅拌溶解，加入DIEA溶解澄清，之后转入反应罐内搅拌反应，反应结束后，依次加入DMF、DCM洗涤；其中DIEA与Fmoc‐Cys(Acm)‐OH的摩尔比为2～3：1；氨基酸与树脂偶联温度为0～25℃，搅拌反应12～36h，并通入惰性气体。
3.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，步骤1DIEA与Fmoc‐Cys(Acm)‐OH的摩尔比为2：1；偶联温度为20～25℃，搅拌反应24h。
4.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，其中，步骤2合成Fmoc‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂方法如下：
脱保护基团：洗涤完毕的Fmoc‐Cys(Acm)‐树脂中加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，搅拌反应15min；脱保护结束，依次加入DMF、DCM洗涤；
保护氨基酸活化：保护氨基酸Fmoc‐Ser(tBu)‐OH、Cl‐HOBt加入到溶解罐，加入DMF搅拌溶解，加入DIC溶解澄清；
偶联反应：氨基酸活化结束后转入反应罐内搅拌反应3h；偶联结束，依次加入DMF、DCM洗涤。
其中，去保护温度0～25℃，通入惰性保护气体；氨基酸活化温度0～25℃，活化过程通入惰性保护气体；偶联反应温度0～25℃，通入惰性保护气体。
5.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，其中，步骤3合成十四肽树脂方法如下：
第一循环，重复4所述操作，加入Fmoc‐Thr(tBu)‐OH作为保护氨基酸，通过去Fmoc‐保护基团，活化保护氨基酸，偶联反应得到Fmoc‐Thr(tBu)‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂；
第二循环，重复4所述操作，加入Fmoc‐Phe‐OH作为保护氨基酸，通过去Fmoc‐保护基团，活化保护氨基酸，偶联反应得到Fmoc‐Phe‐Thr(tBu)‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂；
第三循环，重复4所述操作，加入Fmoc‐Thr(tBu)‐OH作为保护氨基酸，通过去Fmoc‐保护基团，活化保护氨基酸，偶联反应得到Fmoc‐Thr(tBu)‐Phe‐Thr(tBu)‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂；
第四循环，重复4所述操作，加入Fmoc‐Lys(Boc)‐OH作为保护氨基酸，通过去Fmoc‐保护基团，活化保护氨基酸，偶联反应得到Fmoc‐Lys(Boc)‐Thr(tBu)‐Phe‐Thr(tBu)‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂；
第五循环，重复4所述操作，加入Fmoc‐Trp(Boc)‐OH作为保护氨基酸，通过去Fmoc‐保护基团，活化保护氨基酸，偶联反应得到Fmoc‐Trp(Boc)‐Lys(Boc)‐Thr(tBu)‐Phe‐Thr(tBu)‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂；
第六循环，重复4所述操作，加入Fmoc‐Phe‐OH作为保护氨基酸，通过去Fmoc‐保护基团，活化保护氨基酸，偶联反应得到Fmoc‐Phe‐Trp(Boc)‐Lys(Boc)‐Thr(tBu)‐Phe‐Thr(tBu)‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂；
第七循环，重复4所述操作，加入Fmoc‐Phe‐OH作为保护氨基酸，通过去Fmoc‐保护基团，活化保护氨基酸，偶联反应得到Fmoc‐Phe‐Phe‐Trp(Boc)‐Lys(Boc)‐Thr(tBu)‐Phe‐Thr(tBu)‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂；
第八循环，重复4所述操作，加入Fmoc‐Asn(Trt)‐OH作为保护氨基酸，通过去Fmoc‐保护基团，活化保护氨基酸，偶联反应得到Fmoc‐Asn(Trt)‐Phe‐Phe‐Trp(Boc)‐Lys(Boc)‐Thr(tBu)‐Phe‐Thr(tBu)‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂；
第九循环，重复4所述操作，加入Fmoc‐Lys(Boc)‐OH作为保护氨基酸，通过去Fmoc‐保护基团，活化保护氨基酸，偶联反应得到Fmoc‐Lys(Boc)‐Asn(Trt)‐Phe‐Phe‐Trp(Boc)‐Lys(Boc)‐Thr(tBu)‐Phe‐Thr(tBu)‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂；
第十循，重复4所述操作，加入Fmoc‐Cys(Acm)‐OH作为保护氨基酸，通过去Fmoc‐保护基团，活化保护氨基酸，偶联反应得到Fmoc‐Cys(Acm)‐Lys(Boc)‐Asn(Trt)‐Phe‐Phe‐Trp(Boc)‐Lys(Boc)‐Thr(tBu)‐Phe‐Thr(tBu)‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂；
第十一循环，重复4所述操作，加入Fmoc‐Gly‐OH作为保护氨基酸，通过去Fmoc‐保护基团，活化保护氨基酸，偶联反应得到Fmoc‐Gly‐Cys(Acm)‐Lys(Boc)‐Asn(Trt)‐Phe‐Phe‐Trp(Boc)‐Lys(Boc)‐Thr(tBu)‐Phe‐Thr(tBu)‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂；
第十二循环，重复4所述操作，加入Fmoc‐Ala‐OH作为保护氨基酸，通过去Fmoc‐保护基团，活化保护氨基酸，偶联反应得到Fmoc‐Ala‐Gly‐Cys(Acm)‐Lys(Boc)‐Asn(Trt)‐Phe‐Phe‐Trp(Boc)‐Lys(Boc)‐Thr(tBu)‐Phe‐Thr(tBu)‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂；
其中，各步骤去保护温度0～25℃，通入惰性保护气体，搅拌反应15min；氨基酸活化温度0～25℃，活化过程通入惰性保护气体；偶联反应温度0～25℃，通入惰性保护气体，搅拌反应3h。
6.根据权利要求4、5所述的方法，其特征在于，去保护温度为10～20℃，活化保护氨基酸温度为0～10℃,偶联温度为20～25℃；投料比值为，
具有保护基团氨基酸：2‐CTC树脂＝2～3：1摩尔，
Cl‐HOBt：2‐CTC树脂＝2～3：1摩尔，
DIC：2‐CTC树脂＝2～3：1摩尔；
具有保护基团的Cys为Fmoc‐Cys(Acm)‐OH。
7.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，其中，步骤4采用裂解液(TFA：TIS＝95：5，V/V)对树脂进行十四肽裂解处理，同步进行切肽和脱除Acm以外的侧链保护基团，方法如下：
用甲醇洗涤步骤3所得十四肽树脂，抽干；干燥后的肽树脂按1g：10ml的比例加入裂解液(TFA：TIS＝95：5，V/V)，搅拌反应2h，抽滤，除去树脂，滤液加入乙醚内沉降3h，离心得到粗肽固体。
8.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，其中，步骤5所述的用I2环化粗肽，同步除去Cys(Acm)的Acm保护基团，方法如下：
取粗肽固体加水溶解成1mg/mL的溶液，慢慢滴入碘的乙醇溶液，滴加完毕后搅拌，检测反应结束后加入过量的硫代硫酸钠，中和过量的碘。
9.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，其中，步骤5所述的环化粗肽分离提纯方法如下：
初纯：流动相A：TFA/纯化水，B：乙腈(色谱纯)，波长：230nm
洗脱梯度如下：流动相B用5％平衡2min，在1min内升到35％，保持35％直到洗脱结束；循环上样洗脱进行操作，收集主峰溶液，
精纯一步：流动相A相：HAC/TEA/纯化水，B相：乙腈，波长：230nm
洗脱梯度：流动相B用5％平衡2min，在1min内升到26％，在40min内升到28％，保持直到洗脱结束，循环上样洗脱进行操作，收集主峰溶液，
精纯二步：流动相A相：HAC/纯化水，B相：乙腈，波长：230nm
洗脱梯度：流动相B用5％平衡2min，在1min内升到19％，在20min内升到22％，在22％保持20min洗脱结束，循环上样洗脱进行操作，收集主峰溶液，转盐：流动相A相：醋酸铵/纯化水，B相：乙腈，波长：230nm
洗脱梯度：流动相B用5％转盐20min，洗脱流动相C：0.3％HAC水溶液，洗脱梯度：流动相B用5％平衡15min,在1min内升到25％，在25％保持20min洗脱结束，
收集所需要的流出液，去盐，除尽乙腈，冻干获得精生长抑素。
10.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，步骤如下：
(1)合成Fmoc‐Cys(Acm)‐树脂
称取0.83kg的2‐CTC树脂(100‐200目，0.6mmol/g)，加入DCM洗涤3次，每次10min，加入DCM，室温搅拌溶胀；加入用DCM溶解的Fmoc‐Cys(Acm)‐OH(摩尔量为树脂的2倍)，加入330ml DIEA(摩尔量为树脂的4倍)，通入惰性气体，于22.5±2.5℃条件下反应24小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，得到肽偶合树脂；
(2)合成Fmoc‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂
再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入DMF溶解的Fmoc‐Ser(tBu)‐OH(摩尔量为树脂的2倍)、Cl‐HOBT(摩尔量为树脂的2倍)，加入DIC溶解澄清(摩尔量为树脂的2倍)，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次；
(3)合成Fmoc‐Thr(tBu)‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂
再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入DMF溶解的Fmoc‐Thr(tBu)‐OH(摩尔量为树脂的2倍)、Cl‐HOBT(摩尔量为树脂的2倍)，加入DIC溶解澄清(摩尔量为树脂的2倍)，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次；
(4)合成Fmoc‐Phe‐Thr(tBu)‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂
再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入DMF溶解的Fmoc‐Phe‐OH(摩尔量为树脂的2倍)、Cl‐HOBT(摩尔量为树脂的2倍)，加入DIC溶解澄清(摩尔量为树脂的2倍)，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次；
(5)合成Fmoc‐Thr(tBu)‐Phe‐Thr(tBu)‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂
再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入用DMF溶解的Fmoc‐Thr(tBu)‐OH(摩尔量为树脂的2倍)、Cl‐HOBT(摩尔量为树脂的2倍)，加入DIC溶解澄清(摩尔量为树脂的2倍)，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次；
(6)合成Fmoc‐Lys(Boc)‐Thr(tBu)‐Phe‐Thr(tBu)‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂
再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入用DMF溶解的Fmoc‐Lys(Boc)‐OH(摩尔量为树脂的2倍)、Cl‐HOBT(摩尔量为树脂的2倍)，加入DIC溶解澄清(摩尔量为树脂的2倍)，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次；
(7)合成Fmoc‐Trp(Boc)‐Lys(Boc)‐Thr(tBu)‐Phe‐Thr(tBu)‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂
再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入用DMF溶解的Fmoc‐Trp(Boc)‐OH(摩尔量为树脂的2倍)、Cl‐HOBT(摩尔量为树脂的2倍)，加入DIC溶解澄清(摩尔量为树脂的2倍)，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次；
(8)合成Fmoc‐Phe‐Trp(Boc)‐Lys(Boc)‐Thr(tBu)‐Phe‐Thr(tBu)‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂
再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入用DMF溶解的Fmoc‐Phe‐OH(摩尔量为树脂的2倍)、Cl‐HOBT(摩尔量为树脂的2倍)，加入DIC溶解澄清(摩尔量为树脂的2倍)，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次；
(9)合成Fmoc‐Phe‐Phe‐Trp(Boc)‐Lys(Boc)‐Thr(tBu)‐Phe‐Thr(tBu)‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂
再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入用DMF溶解的Fmoc‐Phe‐OH(摩尔量为树脂的2倍)、Cl‐HOBT(摩尔量为树脂的2倍)，加入DIC溶解澄清(摩尔量为树脂的2倍)，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次；
(10)合成Fmoc‐Asn(Trt)‐Phe‐Phe‐Trp(Boc)‐Lys(Boc)‐Thr(tBu)‐Phe‐Thr(tBu)‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂
再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入用DMF溶解的Fmoc‐Asn(Trt)‐OH(摩尔量为树脂的2倍)、Cl‐HOBT(摩尔量为树脂的2倍)，加入DIC溶解澄清(摩尔量为树脂的2倍)，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次；
(11)合成Fmoc‐Lys(Boc)‐Asn(Trt)‐Phe‐Phe‐Trp(Boc)‐Lys(Boc)‐Thr(tBu)‐Phe‐Thr(tBu)‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂
再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入用DMF溶解的Fmoc‐Lys(Boc)‐OH(摩尔量为树脂的2倍)、Cl‐HOBT(摩尔量为树脂的2倍)，加入DIC溶解澄清(摩尔量为树脂的2倍)，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次；
(12)合成Fmoc‐Cys(Acm)‐Lys(Boc)‐Asn(Trt)‐Phe‐Phe‐Trp(Boc)‐Lys(Boc)‐Thr(tBu)‐Phe‐Thr(tBu)‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂
再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入用DMF溶解的Fmoc‐Cys(Acm)‐OH(摩尔量为树脂的2倍)、Cl‐HOBT(摩尔量为树脂的2倍)，加入DIC溶解澄清(摩尔量为树脂的2倍)，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次；
(13)合成Fmoc‐Gly‐Cys(Acm)‐Lys(Boc)‐Asn(Trt)‐Phe‐Phe‐Trp(Boc)‐Lys(Boc)‐Thr(tBu)‐Phe‐Thr(tBu)‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂
再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入用DMF溶解的Fmoc‐Gly‐OH(摩尔量为树脂的2倍)、Cl‐HOBT(摩尔量为树脂的2倍)，加入DIC溶解澄清(摩尔量为树脂的2倍)，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次；
(14)合成Fmoc‐Ala‐Gly‐Cys(Acm)‐Lys(Boc)‐Asn(Trt)‐Phe‐Phe‐Trp(Boc)‐Lys(Boc)‐Thr(tBu)‐Phe‐Thr(tBu)‐Ser(tBu)‐Cys(Acm)‐树脂
再加入重量浓度为20％PIP的DMF溶液，于17.5±2.5℃搅拌反应15min，脱保护结束后，DMF洗涤6次，DCM洗涤2次；加入用DMF溶解的Fmoc‐Ala‐O(摩尔量为树脂的2倍)、Cl‐HOBT(摩尔量为树脂的2倍)，加入DIC溶解澄清(摩尔量为树脂的2倍)，于7.5±2.5℃搅拌反应，氨基酸活化后转入反应罐内于22.5±2.5℃，搅拌反应3小时，偶联结束后，DMF洗涤3次，DCM洗涤3次，洗涤后用甲醇收缩，真空干燥过夜，得到十四肽偶联树脂；
(15)肽树脂的裂解
取步骤(14)所得十四肽偶联树脂，按1g：10mL的比例加入裂解液(TFA：TIS＝95：5，V/V)，搅拌反应2h，抽滤，除去树脂，滤液加入乙醚内沉降3h，离心得还原型线性粗肽；
(16)粗肽氧化
加水溶解粗肽固体，将粗肽配成1mg/ml的溶液，慢慢滴入碘的乙醇溶液，滴加完毕后搅拌，检测反应结束后加入过量的硫代硫酸钠，中和过量的碘，获得生长抑素粗品；
(17)精制纯化
初纯：流动相A：TFA/纯化水、B：乙腈(色谱纯)，波长：230nm
洗脱梯度如下：流动相B用5％平衡2min，在1min内升到35％，保持35％直到洗脱结束；循环上样洗脱进行操作，收集主峰溶液；
精纯一步：流动相A相：HAC/TEA/纯化水，B相：乙腈，波长：230nm
洗脱梯度如下：流动相B用5％平衡2min，在1min内升到26％，在40min内升到28％，保持直到洗脱结束，循环上样洗脱进行操作，收集主峰溶液；
精纯二步：流动相A相：HAC/纯化水，B相：乙腈，波长：230nm
洗脱梯度如下：流动相B用5％平衡2min，在1min内升到19％，在20min内升到22％，在22％保持20min洗脱结束，循环上样洗脱进行操作，收集主峰溶液；
转盐：流动相A相：醋酸铵/纯化水；B相：乙腈，波长：230nm
梯度洗脱梯度：流动相B用5％转盐20min，洗脱流动相C：0.3％HAC水溶液，洗脱梯度：流动相B用5％平衡15min，在1min内升到25％，在25％保持20min洗脱结束；
收集所需要的流出液，去盐，除尽乙腈，冻干获得精生长抑素。
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