CN107501408B

CN107501408B - 一种特立帕肽的制备方法

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Publication number: CN107501408B
Application number: CN201710866945.5A
Authority: CN
Inventors: 高剑; 李元波; 王艳峰; 叶鑫发; 余昊; 杨柱柱; 周芯宇; 何晓
Original assignee: Sichuan Haihui Pharmaceutical Co ltd; Sichuan Hairong Pharmaceutical Co Ltd Yangtze River Pharmaceutical Group
Current assignee: Sichuan Haihui Pharmaceutical Co ltd; Sichuan Hairong Pharmaceutical Co Ltd Yangtze River Pharmaceutical Group
Priority date: 2017-09-22
Filing date: 2017-09-22
Publication date: 2021-11-02
Anticipated expiration: 2037-09-22
Also published as: CN107501408A

Abstract

本发明公开了一种特立帕肽的制备方法，包括了它的合成与纯化，属于药物制备的领域。本发明通过1)在活化剂系统的存在下，由树脂固相载体和Fmoc‑Phe‑OH偶联得到Fmoc‑Phe‑树脂；2)通过固相合成法，按特立帕肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸得到全肽树脂；3)全肽树脂在32号氨基酸缩合时使用COMU作为缩合剂且每步合成过程中采用哌啶/Cl‑HOBT的DMF溶液作为脱保护剂；4)肽树脂裂解得到粗品，粗品经过初步纯化、精制及除盐等过程制得了特立帕肽，其工艺杂质中的消旋杂质D‑His³²‑特立帕肽含量小于0.1％。本发明提供了一种纯度高、成本低、适合规模化生产的特立帕肽制备工艺，此工艺既有效控制了工艺杂质又明显的提高了特立帕肽的总收率。

Description

一种特立帕肽的制备方法

技术领域

本发明属于多肽药物领域，具体涉及一种特立帕肽的制备方法。

背景技术

特立帕肽(Cas No：52232-67-4)是一种由美国礼来公司开发的一种合成的多肽激素，主要用于治疗原发性及性腺功能减退性骨质疏松症、绝经后骨质疏松症。特立帕肽的分子式为C₁₈₁H₂₉₁N₅₅O₅₁S₂，其对应的分子量为4117.75，特立帕肽由34个天然氨基酸组成，其肽序为：H-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-OH。礼来公司是采用基因表达得到特立帕肽，例如专利US6590081，然而，基因表达法有着技术门槛，工作复杂，三废严重等缺陷。中国专利CN102731643A公开了以CTC Resin为固相载体分为5个片段进行偶联，虽然该方法可以缩短合成周期，但是其总收率仅为32.2％。当下比较流行的合成方法为固相逐步合成法，该方法具有操作简单和设备要求低的优点，但是该方法也因为总收率较低而限制了特立帕肽的生产效率。如专利CN103467595A，其在逐步合成偶联到17位丝氨酸时，以未保护的丝氨酸和16位天冬酰胺羧基进行酯缩合，在获得粗肽后再将酯键转化为酰胺键，其总收率最高为42.1％。专利CN104017064A也公开了一种逐步合成方法，其在合成16-17位氨基酸时采用假脯氨酸二肽，并以特定的裂解液裂解，其总收率最高为38％。专利CN104530218A公开了一种逐步合成方法，以CTC Resin或Wang Resin树脂为固相载体合成，其总收率为34.72％。

L-His易消旋成D-His，因此，导致消旋杂质生成，即：D-His³²-特立帕肽。

D-His³²-特立帕肽的结构如下：H-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-D-His-Asn-Phe-OH。该杂质的存在严重影响特立帕肽的含量以及使用安全。因此需要找到有效的方法将其去除并使其达到优质标准级别0.1％以下。现有的合成方法，制备特立帕肽发现现有技术存在的技术问题是：合成纯度偏低、成本高，特别是杂质D-His³²-特立帕肽含量较大，不适合规模化生产的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种收率高、杂质D-His³²-特立帕肽含量小的特立帕肽的制备方法。

一种特立帕肽的固相合成方法，其特征在于：

所述特立帕肽的氨基酸序列为：H-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met

-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-L-His-Asn-Phe-OH；其编号如下：

包括如下步骤：

(1)在活化剂的存在下，树脂固相载体和Fmoc-Phe-OH偶联反应，得到Fmoc-Phe-树脂；

(2)通过固相合成法，在缩合剂存下在，按特立帕肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护的氨基酸得到全肽树脂，且每偶联上一个具有N端Fmoc保护的氨基酸后，采用脱保护剂脱除Fmoc基团，再偶联下一个具有N端Fmoc保护的氨基酸；

其中，在连接第32号氨基酸(即第2个组氨酸His)时，氨基酸缩合的缩合剂为COMU，其余的缩合剂为DIC/Cl-HOBT、TBTU/HOBT/DIEA、TBTU/Cl-HOBt/DIEA组合中的一种或多种；

所述的脱保护剂为哌啶/Cl-HOBt的DMF溶液或者哌啶的DMF溶液；

(3)采用含有PhSMe/PhOH/EDT体系的裂解液裂解2小时，将肽链从肽树脂上脱下，经过初步纯化、精制即得特立帕肽。

进一步地，所述步骤(2)包括如下步骤：

a.将Fmoc-Phe-树脂在脱保护剂中反应30min，脱除Fmoc基团，得到H-Phe-树脂；

b.在缩合剂存在下，H-Phe-树脂与Fmoc-Asn(Trt)-OH反应2h，偶联得到Fmoc-Asn(Trt)-Phe-树脂；

c.重复a、b步骤，按照特立帕肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护的氨基酸。

进一步地，步骤(1)所述的树脂固相载体为wang树脂或者2-CTC树脂。

进一步地，步骤(1)中所述的树脂固相载体是替代度为1.0～1.4mmol/g的树脂。

进一步地，步骤(1)所述的树脂固相载体为替代度为1.0～1.4mmol/g的CTC Resin树脂。

进一步地，步骤(1)中所述的活化剂为DIEA、TEA或者DBU，活化剂与Fmoc-Phe-OH的摩尔比范围为(4～8):1，优选为6:1。

进一步地，步骤(1)中树脂固相载体与Fmoc-Phe-OH的摩尔比为(1～4)：1，优选为2.8:1。

进一步地，步骤(2)中，所述缩合剂为TBTU/HOBT/DIEA或TBTU/Cl-HOBT/DIEA，缩合剂中三种化合物的摩尔比为1:1:1。

进一步地，步骤(2)中，缩合剂中Cl-HOBT或HOBT或COMU与步骤(1)中树脂固相载体的摩尔比为(1～4):1；每个具有N端Fmoc保护的氨基酸与步骤(1)中树脂固相载体的摩尔比为1：(1～4)。

进一步地，步骤(2)中所述的哌啶、Cl-HOBT、DMF体积比为1:1:8；所述哌啶与DMF的体积比为1:4；所述脱保护剂与树脂固相载体的体积摩尔比为100ml：(5～20)mmol，优选为100ml：7mmol。

进一步地，步骤(3)中所述的裂解液为体积比为PhSMe：PhOH：EDT：溶剂＝5:3:2:95的溶液；和/或，所述溶剂选自TFA、苯甲硫醚、苯酚、乙二硫醇、三异丙基硅烷、二甲硫醚一种或多种。

进一步地，步骤(3)中所述的纯化为采用C18反向色谱柱；和/或，所述的精制为用凝胶色谱法精制，填料为葡聚糖凝胶G-25。

本发明人研究发现，在32号氨基酸偶联使用新型偶联剂COMU,并在每步脱保护液中加入Cl-HOBt可有效的减少D-His³²-特立帕肽的生成，提高了粗肽的收率,降低了HPLC纯化难度。经过HPLC纯化后，杂质D-His³²-特立帕肽含量降低到0.1％以下。

本发明人对特立帕肽的制备方法进行了研究，提供了一种纯度高、成本低、适合规模化生产的特立帕肽制备工艺，此工艺既有效控制了工艺杂质又明显的提高了特立帕肽的总收率。

术语解释：

Fmoc：芴甲氧羰基

Fmoc-AA:芴甲氧羰基保护的氨基酸

TBTU:2-(1H-苯并三偶氮L-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯

HOBT:1-羟基苯并三唑

DIEA:N,N-二异丙基乙胺

COMU:(2-肟基-氰基乙酸乙酯)-N,N-二甲基-吗啉基脲六氟磷酸酯CAS:1075198-30-9

Cl-HOBT:6-氯-1-羟基苯并三氮唑

Ac₂O:乙酸酐

tBu:叔丁基

TrT:三苯甲基

Boc:叔丁氧羰基

Pbf:2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基

Phe:苯丙氨酸

His:组氨酸

Val:缬氨酸

Asp:天冬氨酸

Gln:谷氨酰胺

Leu:亮氨酸

Lys:赖氨酸

Arg:精氨酸

Trp:色氨酸

Glu:谷氨酸

Met:甲硫氨酸

Ser:丝氨酸

Gly:甘氨酸

Ile:异亮氨酸

DMF:N,N-二甲基甲酰胺

MeOH:甲醇

DCM:二氯甲烷

TFA:三氟乙酸

PhSMe:苯甲硫醚

PhOH:苯酚

EDT:乙二硫醇

MTBE:甲基叔丁基醚

ACN:乙腈

2-CTC Resin树脂：氯代(邻氯苯基)二苯基甲烷

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1特立帕肽的合成工艺路线

具体实施方式

实施例1

(1)Fmoc-Phe-CTC Resin树脂的制备

将20g(28mmol)替代度为1.4mmol/g的CTC Resin树脂加入到玻璃反应柱中，向其中加入200mL的DCM溶20min,抽干，重复3次；同时称取10mmol的Fmoc-Phe-OH和60mmol的DIEA，将这两种物质用200mL的DCM溶解，搅拌均匀后倒入玻璃反应柱中，搅拌反应1小时。其后抽除液体，用DCM进行洗涤，洗涤6次，每次用量200mL，再用DMF进行洗涤，洗涤6次，每次用量200mL；即得到Fmoc-Phe-CTC Resin树脂45.1g，替代度为0.4mmol/g。

(2)全肽树脂的合成

向步骤1)生成的Fmoc-Phe-CTC Resin树脂中加400mL配置好的体积浓度为20％的哌啶的DMF溶液，搅拌使其反应30min，之后抽除液体，用DMF洗涤产物6次，每次用量200mL,将洗涤液DMF抽干，其后称取10mmol的Fmoc-Asn(trt)-OH、10mmol的TBTU和10mmol的HOBT，将这三种物质用200mL的DMF:DCM＝1:1混合溶剂溶解，溶解完全后向其中加入10mmol的DIEA形成混合液，再次搅拌均匀后将混合液加入到玻璃反应柱内，搅拌2小时，其后抽除液体，用DMF对产物洗涤6次，每次用量200mL，抽干即得到Fmoc-Asn(trt)-Phe-CTC Resin树脂，此后用脱保护剂(体积百分比浓度为1:1:8哌啶/Cl-HOBT/DMF溶液)脱除树脂上的Fmoc保护基，分别加入10mmol的Fmoc-His(trt)-OH、10mmol的COMU和10mmol的DIEA，再次搅拌均匀后将混合液加入到玻璃反应柱内，搅拌2小时。用脱保护剂为体积百分比浓度为1:1:8哌啶/Cl-HOBT/DMF溶液脱除树脂上的Fmoc保护基，将剩余氨基酸顺次偶联与脱保护，操作至最后一个氨基酸偶联完毕，即得到全肽树脂约66.2g。

(3)全肽树脂的切割

裂解液的配制:

取2000mL的圆底烧瓶，向其中加入950mL的TFA，50mL的PhSMe，30mL的PhOH，20mL的EDT，并搅拌混匀得到裂解液。

裂解：

向裂解液中加入全肽树脂66g，搅拌反应2小时，然后用砂芯漏斗进行过滤，滤出的树脂再用300mL的TFA洗涤，重复过滤与洗涤两次后合并滤液，减压浓缩至滤液体积约为原始体积的1/10左右，然后将其加入到体积为浓缩液10倍的预冷的甲基叔丁基醚中，沉降过夜并析出白色固体。缓慢倒出上清液体，并离心5次，每次用甲基叔丁基醚1000mL，得到白色固体粉末，真空干燥10小时，取出称重，即得到粗品肽50.5g(HPLC纯度：61.2％，收率58.1％)。

(4)特立帕肽粗肽的初步纯化

使用反相高效液相色谱法对粗肽进行初步纯化，使用的反相高效液相色谱的组成为：极性流动相：A相：体积百分比浓度为0.1％的三氟乙酸(TFA)溶液；B相：乙腈；

色谱柱：10μm的C18反相色谱柱；

检测波长：220nm

流速：80mL/min(色谱柱放大的情况下，流速可相应的增加)

先以流动相A平衡柱子，然后取粗肽(含肽约21g)4L进样，先用流动相A冲洗20min，然后采用梯度洗脱：洗脱剂为A相与B相的混合，其中B相的体积百分比在45min内由15％上升至40％，密切观察主峰的出现，主峰出现时开始收集，主峰峰顶前、峰顶附近、峰顶后分段收集，无杂峰出现时收集结束。将峰顶出现前、峰顶出现后收集到的液体进行适当浓缩，再加入色谱柱中进行相同的流动相A冲洗与洗脱剂的梯度洗脱，同样收集三段产物，以此重复多次后合并每次收集到的峰顶附近的液体，将其适度地旋转蒸发浓缩，即制得纯化肽的溶液4551mL(含量：3.2mg/mL,HPLC纯度：97.4％)，可将其冷冻暂存。

(5)特立帕肽粗肽的精制及除盐

使用凝胶色谱法对纯化肽进行精制与除盐，使用的凝胶液相色谱的流动相为：极性流动相：流动相A：水；流动相B:乙腈

色谱填料：葡聚糖凝胶G-25

检测波长：220nm

流速：80mL/min(色谱柱放大的情况下，流速可相应的增加)

先在室温下，将葡聚糖凝胶干粉分别用乙醇、无盐水、盐酸浸泡后用水洗至中性，并将溶胀好的凝胶根据装柱要求一次性置入柱内；然后取纯化肽的溶液4551mL进样，上样控制在1～4％的柱体积，脱盐时高径比为5:1；然后流动相A与流动相B等度洗脱，以时间为节点收集，对于中间时间段的产物合并收集，将其适度地旋转浓缩，即得到所述无盐形式的特立帕肽精制液800mL(含量15.3mg/mL,HPLC纯度：99.3％)，可冷冻暂存。

(6)冻干、包装

取特立帕肽的精制液800mL，以0.22μm的滤膜进行过滤，将滤得的固体分装于适当容器中进行冻干，冻干粉用洁净的容器密封包装，经检测合格后入库，即制得特立帕肽成品9.2g(HPLC纯度99.87％，收率45.1％，D-His32-特立帕肽含量为0.01％)

实施例2

1)取3.3g取代度为0.3mmol/gFmoc-Phe-wang-Resin树脂中加20mL配置好的体积浓度为20％的哌啶的DMF溶液，搅拌使其反应30min，之后抽除液体，用DMF洗涤产物6次，每次用量20mL,将洗涤液DMF抽干，其后称取1mmol的Fmoc-Asn(trt)-OH、1mmol的TBTU和1mmol的HOBT，将这三种物质用20mL的DMF:DCM＝1:1混合溶剂溶解，溶解完全后向其中加入10mmol的DIEA形成混合液，再次搅拌均匀后将混合液加入到玻璃反应柱内，搅拌2小时，其后抽除液体，用DMF对产物洗涤6次，每次用量20mL，抽干即得到5.1g Fmoc-Asn(trt)-Phe-wang Resin树脂。

2)将上述树脂取一半，加入体积比为1:4哌啶/DMF溶液脱除树脂上的Fmoc保护基，反应30min，加入1mmol的Fmoc-His(trt)-OH、1mmol的COMU和1mmol的DIEA，再次搅拌均匀后将混合液加入到玻璃反应柱内，搅拌2小时此后加入体积比为1:4哌啶/DMF溶液脱除树脂上的Fmoc保护基，反应时间为30min，将剩余氨基酸顺次偶联与脱保护，操作至最后一个氨基酸偶联完毕，即得到全肽树脂。

3)全肽树脂加入裂解液，搅拌反应2小时，然后用砂芯漏斗进行过滤，滤出的树脂再用30mL的TFA洗涤，重复过滤与洗涤两次后合并滤液，减压浓缩至滤液体积约为原始体积的1/10左右，然后将其加入到体积为浓缩液10倍的预冷的甲基叔丁基醚中，沉降过夜并析出白色固体。缓慢倒出上清液体，并离心5次，每次用甲基叔丁基醚100mL，得到白色固体粉末，真空干燥10小时，取出称重。

实验结果：特立帕肽粗肽2.3g，HPLC纯度为58.1％，粗肽纯化、除盐、冻干后分别得特立帕肽精肽0.65g,HPLC纯度为99.62％，D-His32-特立帕肽含量为0.03％，总收率为48.45％。

实施例3

1)取3.3g取代度为0.3mmol/gFmoc-Phe-wang-Resin树脂中加20mL配置好的体积浓度为20％的哌啶的DMF溶液，搅拌使其反应30min，之后抽除液体，用DMF洗涤产物6次，每次用量20mL,将洗涤液DMF抽干，其后称取1mmol的Fmoc-Asn(trt)-OH、1mmol的TBTU和1mmol的HOBT，将这三种物质用20mL的DMF:DCM＝1:1混合溶剂溶解，溶解完全后向其中加入10mmol的DIEA形成混合液，再次搅拌均匀后将混合液加入到玻璃反应柱内，搅拌2小时，其后抽除液体，用DMF对产物洗涤6次，每次用量20mL，抽干即得到5.1g Fmoc-Asn(trt)-Phe-wang-Resin树脂。

2)将上述树脂取一半，用脱保护剂为体积百分比浓度为1:1:8哌啶/Cl-HOBT/DMF溶液脱除树脂上的Fmoc保护基，分别加入1mmol的Fmoc-His(trt)-OH、1mmol的COMU和1mmol的DIEA，再次搅拌均匀后将混合液加入到玻璃反应柱内，搅拌2小时，用脱保护剂为体积百分比浓度为1:1:8哌啶/Cl-HOBT/DMF溶液脱除树脂上的Fmoc保护基，将剩余氨基酸顺次偶联与脱保护，操作至最后一个氨基酸偶联完毕，即得到全肽树脂。

实验结果：得到特立帕肽粗肽2.0g，HPLC纯度分别为63.2％；粗肽纯化、除盐、冻干后得特立帕肽精肽0.70g,HPLC纯度为99.68％，D-His32-特立帕肽含量分别为0.15％，总收率为55.20％。

实施例4

步骤1和3同实施例3，仅将步骤2改为以下操作：

将上述树脂取一半，用脱保护剂为体积百分比浓度为1:4哌啶/DMF溶液脱除树脂上的Fmoc保护基保护基反应30min，分别加入1mmol的Fmoc-His(trt)-OH、1mmol的COMU和1mmol的DIEA，再次搅拌均匀后将混合液加入到玻璃反应柱内，搅拌2小时，用脱保护剂为体积百分比浓度为1：4哌啶/DMF溶液脱除树脂上的Fmoc保护基将剩余氨基酸顺次偶联与脱保护，操作至最后一个氨基酸偶联完毕，即得到全肽树。

实验结果：分别得到特立帕肽粗肽2.2g，HPLC纯度分别为60.1％；粗肽纯化、除盐、冻干后得特立帕肽精肽0.69g,HPLC纯度为99.62％，D-His32-特立帕肽含量为0.03％，总收率为51.98％。

实施例5

1)取3.3g取代度为0.3mmol/gFmoc-Phe-CTC-Resin树脂中加20mL配置好的体积浓度为20％的哌啶的DMF溶液，搅拌使其反应30min，之后抽除液体，用DMF洗涤产物6次，每次用量20mL,将洗涤液DMF抽干，其后称取1mmol的Fmoc-Asn(trt)-OH、1mmol的TBTU和1mmol的HOBT，将这三种物质用20mL的DMF:DCM＝1:1混合溶剂溶解，溶解完全后向其中加入10mmol的DIEA形成混合液，再次搅拌均匀后将混合液加入到玻璃反应柱内，搅拌2小时，其后抽除液体，用DMF对产物洗涤6次，每次用量20mL，抽干即得到5.1g Fmoc-Asn(trt)-Phe-CTCResin树脂。

2)将上述树脂取一半，加入体积比为1:4哌啶/DMF溶液脱除树脂上的Fmoc保护基反应30min,加入1mmol的Fmoc-His(trt)-OH、1mmol的COMU和1mmol的DIEA，再次搅拌均匀后将混合液加入到玻璃反应柱内，搅拌2小时此后加入百分比浓度为1:4哌啶/DMF溶液脱除树脂上的Fmoc保护基反应30min，将剩余氨基酸顺次偶联与脱保护，操作至最后一个氨基酸偶联完毕，即得到全肽树脂。

实验结果：得到特立帕肽粗肽2.3g，HPLC纯度为68.1％；粗肽纯化、除盐、冻干后得特立帕肽精肽0.65g,HPLC纯度为99.72％，D-His32-特立帕肽含量别为0.02％，总收率为41.38％。

实施例6

1)取3.3g取代度为0.3mmol/g Fmoc-Phe-CTC-Resin树脂中加20mL配置好的体积浓度为20％的哌啶的DMF溶液，搅拌使其反应30min，之后抽除液体，用DMF洗涤产物6次，每次用量20mL,将洗涤液DMF抽干，其后称取1mmol的Fmoc-Asn(trt)-OH、1mmol的TBTU和1mmol的HOBT，将这三种物质用20mL的DMF:DCM＝1:1混合溶剂溶解，溶解完全后向其中加入10mmol的DIEA形成混合液，再次搅拌均匀后将混合液加入到玻璃反应柱内，搅拌2小时，其后抽除液体，用DMF对产物洗涤6次，每次用量20mL，抽干即得到5.1g Fmoc-Asn(trt)-Phe-CTC Resin树脂。

2)将上述树脂取一半，分别加入1mmol的Fmoc-His(trt)-OH、1mmol的COMU和1mmol的DIEA，再次搅拌均匀后将混合液加入到玻璃反应柱内，搅拌2小时，用脱保护剂为体积百分比浓度为1:1:8哌啶/Cl-HOBT/DMF溶液脱除树脂上的Fmoc保护基将剩余氨基酸顺次偶联与脱保护，操作至最后一个氨基酸偶联完毕，即得到全肽树脂。

实验结果：得到特立帕肽粗肽2.5g，HPLC纯度为73.2％；粗肽纯化、除盐、冻干后得特立帕肽精肽0.91g,HPLC纯度为99.88％，D-His32-特立帕肽含量为0.01％，总收率为49.66％。

实施例7

步骤1和3同实施例8，仅将步骤2改为以下操作：

将上述树脂取一半，分别加入1mmol的Fmoc-His(trt)-OH、1mmol的COMU和1mmol的DIEA，再次搅拌均匀后将混合液加入到玻璃反应柱内，搅拌2小时，(条件8)用脱保护剂为体积百分比浓度为2：8哌啶/DMF溶液脱除树脂上的Fmoc保护基将剩余氨基酸顺次偶联与脱保护，操作至最后一个氨基酸偶联完毕，即得到全肽树脂。

实验结果：得到特立帕肽粗肽2.2g，HPLC纯度为68.1％；粗肽纯化、除盐、冻干后得特立帕肽精肽0.69g,HPLC纯度为99.52％，D-His32-特立帕肽含量为0.03％，总收率为45.83％。

试验例1

步骤1和3同实施例2，仅将步骤2改为以下操作：

将上述树脂取一半，加入体积比为1:4哌啶/DMF溶液脱除树脂上的Fmoc保护基反应30min，加入1mmol的Fmoc-His(trt)-OH、1mmol的TBTU和1mmol的HOBT，将这三种物质用20mL的DMF:DCM＝1:1混合溶剂溶解，溶解完全后向其中加入10mmol的DIEA形成混合液，再次搅拌均匀后将混合液加入到玻璃反应柱内，搅拌2小时后加入体积比为1:4哌啶/DMF溶液脱除树脂上的Fmoc保护基反应30min，将剩余氨基酸顺次偶联与脱保护，操作至最后一个氨基酸偶联完毕，即得到全肽树脂。

实验结果：特立帕肽粗肽2.1g。HPLC纯度为61.2％，粗肽纯化、除盐、冻干后分别得特立帕肽精肽0.68g,HPLC纯度为99.07％，D-His32-特立帕肽含量为0.15％，总收率分别为52.41％。

试验例2

步骤1和3同实施例5，仅将步骤2改为以下操作：

将上述树脂取一半，加入体积比为1:4哌啶/DMF溶液脱除树脂上的Fmoc保护基反应30min，加入1mmol的Fmoc-His(trt)-OH、1mmol的TBTU和1mmol的HOBT，将这三种物质用20mL的DMF:DCM＝1:1混合溶剂溶解，溶解完全后向其中加入10mmol的DIEA形成混合液，再次搅拌均匀后将混合液加入到玻璃反应柱内，搅拌2小时此后加入脱保护试剂，将剩余氨基酸顺次偶联与脱保护，操作至最后一个氨基酸偶联完毕，即得到全肽树脂。

实验结果：得到特立帕肽粗肽2.1g，HPLC纯度为67.2％；粗肽纯化、除盐、冻干后得特立帕肽精肽0.68g,HPLC纯度为99.67％，D-His32-特立帕肽含量为0.03％，总收率为48.02％。

表1.本发明实施例和试验例实验条件和结果对比

从表1数据可以看出，本发明在32号具有N端Fmoc保护的氨基酸缩合的缩合剂为COMU，制备的特立帕肽中D-His32-特立帕肽含量低，且特立帕肽纯度和收率均较高，特别是进行放大生产时，其收率尤其高，如实施例1。

Claims

1.一种特立帕肽的固相合成方法，其特征在于：

所述特立帕肽的氨基酸序列为：

H-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-OH；

所述方法包括如下步骤：

（1）在活化剂的存在下，树脂固相载体和Fmoc-Phe-OH偶联反应，得到Fmoc-Phe-树脂；所述树脂固相载体为2-CTC树脂；

（2）通过固相合成法，在缩合剂存下在，按特立帕肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护的氨基酸得到全肽树脂，且每偶联上一个具有N端Fmoc保护的氨基酸后，采用脱保护剂脱除Fmoc基团，再偶联下一个具有N端Fmoc保护的氨基酸；

其中，在连接第32号氨基酸时，氨基酸缩合的缩合剂为COMU，其余的缩合剂为DIC/Cl-HOBT、TBTU/HOBT/DIEA、TBTU/Cl-HOBt/DIEA组合中的一种或多种；

所述的脱保护剂为哌啶/Cl-HOBt的DMF溶液；

（3）采用含有PhSMe/PhOH/EDT体系的裂解液裂解2小时，将肽链从肽树脂上脱下，经过初步纯化、精制即得特立帕肽。

2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于：所述步骤（2）包括如下步骤：

a. 将Fmoc-Phe-树脂在脱保护剂中反应30min，脱除Fmoc基团，得到H-Phe-树脂；

b. 在缩合剂存在下，H-Phe-树脂与Fmoc-Asn(Trt)-OH反应2h，偶联得到Fmoc-Asn(Trt)-Phe-树脂；

c. 重复a、b步骤，按照特立帕肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护的氨基酸。

3.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于：步骤（1）所述反应的时间是1h。

4.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于：步骤（1）中所述的活化剂为DIEA、TEA或者DBU，活化剂与Fmoc-Phe-OH的摩尔比范围为(4~8):1。

5.根据权利要求4所述的合成方法，其特征在于：所述活化剂与Fmoc-Phe-OH的摩尔比为6:1。

6.根据权利要求1或2所述的合成方法，其特征在于：步骤（1）中树脂固相载体与Fmoc-Phe-OH的摩尔比为（1~4）：1。

7.根据权利要求6所述的合成方法，其特征在于：步骤（1）中树脂固相载体与Fmoc-Phe-OH的摩尔比为2.8:1。

8.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于：步骤（2）中，TBTU/HOBT/DIEA或TBTU/Cl-HOBT/DIEA中三种化合物的摩尔比为1:1:1。

9.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于：步骤（2）中，缩合剂中Cl-HOBT或HOBT或COMU与步骤（1）中树脂固相载体的摩尔比为（1~4）:1；每个具有N端Fmoc保护的氨基酸与步骤（1）中树脂固相载体的摩尔比为1：（1~4）。

10.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于：步骤（2）中所述的哌啶、Cl-HOBT、DMF体积比为1:1:8；所述脱保护剂与树脂固相载体的体积摩尔比为100ml：（5~20）mmol。

11.根据权利要求10所述的合成方法，其特征在于：所述脱保护剂与树脂固相载体的体积摩尔比为100ml：7mmol。

12.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于：步骤（3）中所述的裂解液为体积比为PhSMe：PhOH：EDT：溶剂=5:3:2:95的溶液；所述溶剂选自TFA、苯甲硫醚、苯酚、乙二硫醇、三异丙基硅烷、二甲硫醚一种或多种。

13.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于：步骤（3）中所述的纯化为采用C18反向色谱柱；和/或，所述的精制为用凝胶色谱法精制，填料为葡聚糖凝胶G-25。