CN1552728B - 一种生长抑素的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种生长抑素多肽的合成方法，将Wang树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，逐个接上氨基酸，用切肽试剂(TFA/EDT/H 2O/TIS)进行切肽，加入乙醚沉淀粗肽，在pH7.0-10.0，于15-35℃下，通空气氧化，用C18柱进行分离纯化。该方法操作简单，生产成本明显降低，有利于生长抑素的国产化生产。
Description
技术领域
本发明涉及多肽合成方法的改进，具体是指一种生长抑素的合成方法改进。
背景技术
生长抑素的英文名：Somatostatin，Stilamin
结构式：
分子式及分子量：C76H104N18O19S2，1637.9。
生长抑素是下丘脑的正中隆起和胰岛的δ细胞合成的。1973年由Burgus和Brazean等人首先由下丘脑分离得到并阐明其结构。化学结构为分子内带有一对二硫键的十四肽。其生物功能可抑制腺体释放生长激素、抑制促甲状腺和肾上腺皮质激素、抑制胰腺的内分泌与外分泌、抑制胃粘膜释放胃泌素、抑制肠粘膜释放肠促胰激素和肾脏释放肾素，降低门静脉压力、松弛胆道口括约肌、刺激单核巨噬细胞系统而减轻内毒素血症，抑制血小板活化因子的释放，直接或间接调节细胞因子链产生细胞保护作用，并可增强抗癌药物的抗增殖作用。临床常应用于严重急性食管静脉曲张破裂出血，严重急性胃、十二指肠溃疡出血，急性糜烂性胃炎或出血性胃炎，胰、胆和肠屡的辅助治疗，糖尿病酮症酸中毒的辅助治疗。
在国外，合成的生长抑素早已成为商品用于临床，并于1997年收载入欧洲药典。瑞士的Serono公司生产的生长抑素，其商品名为施他宁(Stilamin)，迄今为止也是世界上唯一的生产公司，目前独占我国市场，注册证号为，X930471。
现有合成方法为选用Wang树脂作为起始物，采用片段固相缩合法合成.文献主要有《片段固相缩合法合成生长激素释放抑制素》“生物化学与生物物理学报”17，1，1985，128-137。但该法需预先制备四个片段肽，反应周期较长，操作较繁琐.
国外文献的有关合成方法；Solid phase synthesis of partially protected and freepeptides containing disulphide bonds by simultaneous cysteine oxidation-releasefrom2-chlorotrityl resin(Int.J.Peptide Protein Res.38，1991，562-568)。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供一种生长抑素的合成方法，此方法操作简便，适于工业化生产。
一.采用Wang树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，逐个接上氨基酸的方法。其中：
1.制备Fmoc-Cys(Trt)-Wang树脂
取12-15gWang树脂(1.01mmol/g树脂，12.12mmol)装入反应容器中，用150mlDMF浸泡、洗涤。
加入17.92g(FW：585.7，30.6mmol)Fmoc-Cys(Trt)-OH、9.82g(FW：321，30.6mmol)TBTU、4.68g(FW：153，30.6mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器，25-40℃反应0.5-1小时。滤干，用DMF洗涤三次，滤干。
Kaiser方法检测氨基为阴性。若显阳性加入，则应用上述量的1/2量补接一次。
加入150ml的封头试剂，25-40℃反应0.5-1小时。同上洗涤，滤干。
2.制备Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂
在上述脱帽反应后的树脂中，加入13.50g(FW：383.4，30mmol)Fmoc-Ser(tBu)-OH、9.6g(30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25-40℃反应0.5-1小时。滤干，分别用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干。加入150ml脱帽试剂，25-40℃反应5-10分钟，同上洗涤，滤干。
3.制备Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂
在上述脱帽反应后的树脂中，加11.9-13.9g(FW：397.4，30mmol)Fmoc-Thr(tBu)-OH、9.6-10g(30mmol)TBTU、4.6-5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25-40℃反应0.5-1小时。滤干，分别用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干。加入150ml脱帽试剂，25-40℃反应5-10分钟滤干，用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干。
4.制备Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂
在上述脱帽反应后的树脂中，加11.6-13g(FW：387.4，30mmol)Fmoc-Phe-OH、9.6-10g(30mmol)TBTU、4.6-5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25-40℃反应0.5-1小时。其余操作同上。
5.制备Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂
在上述脱帽反应后的树脂中，加11.9-13.9g(FW：397.4，30mmol)Fmoc-Thr(tBu)-OH、9.6-10g(30mmol)TBTU、4.6-5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25-40℃反应0.5-1小时。其余操作同上。
6.制备Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂
在上述脱帽反应后的树脂中，加13.9-15g(FW：468.6，30mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH、9.6-10g(30mmol)TBTU、4.6-5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入应容器。25-40℃反应0.5-1小时。其余操作同上。
7.制备Fmoc-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)4-Wang树脂
在上述脱帽反应后的树脂中，加12.83-14.83g(FW：427.5，30mmol)Fmoc-Trp(Boc)-OH、9.6-10g(30mmol)TBTU、4.6-5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25-40℃反应0.5-1小时。其余操作同上。
8.制备Fmoc-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂
在上述脱帽反应后的树脂中，加11.6-13.6g(FW：387.4，30mmol)Fmoc-Phe-OH、9.6-10g(30mmol)TBTU、4.6-5.0g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25-40℃反应0.5-1小时。其余操作同上。
9.制备Fmoc-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂
在上述脱帽反应后的树脂中，加11.6-13.6g(FW：387.4，30mmol)Fmoc-Phe-OH、9.6-10g(30mmol)TBTU、4.6-5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25-40℃反应0.5-1小时。其余操作同上。
10.制备Fmoc-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂
在上述脱帽反应后的树脂中，加17.90-19.0g(FW：596.7，30mmol)Fmoc-Asn(Trt)-OH、9.6-10g(30mmol)TBTU、4.6-5.0g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25-40℃反应0.5-1小时。其余操作同上。
11.制备Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂
在上述脱帽反应后的树脂中，加13.9-15.0g(FW：468.6，30mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH、9.6-10g(30mmol)TBTU、4.6-5.0g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25-40℃反应0.5-1小时。其余操作同上。
12.制备Fmoc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂
在上述脱帽反应后的树脂中，加17.6-19.6(FW：585.7，30mmol)Fmoc-Cys(Trt)-OH、9.6-10g(30mmol)TBTU、4.6-5.0g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25-40℃反应0.5-1小时。其余操作同上。
13.制备Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂
在上述脱帽反应后的树脂中，加8.92-9.92g(FW：297.3，30mmol)Fmoc-Gly-OH、9.6-10g(30mmol)TBTU、4.6-5.0g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25-40℃反应1小时。其余操作同上。
14.制备Fmoc-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂
在上述脱帽反应后的树脂中，加9.34-10.34g(FW：311.3，30mmol)Fmoc-Ala-OH、9.6-10g(30mmol)TBTU、4.6-5.0g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25-40℃反应0.5-1小时。其余操作同上。
接肽反应结束后用DCM、DMF、无水乙醇分别洗涤三次。滤干后，放入真空干燥器中干燥，称重，得保护的十四肽树脂约26-30g(8.372mmol)，接肽总收率约为86.13％-87％，每步接肽收率在98％-99％。
二.采用切肽试剂(TFA/EDT/H2O/TIS＝94：2.5：2.5：1)进行切肽，加入乙醚沉淀粗品的方法。其中：
取26-30g保护十四肽树脂转移到500ml茄形瓶中，加入切肽试剂(TFA/EDT/H，O/TIS＝170.1ml/4.5ml/4.5ml/0.9ml)180-185ml，25-35℃搅拌1.5-2小时。滤去树脂，树脂用20％TFA的DCM溶液洗3次，合并滤液及洗涤液，加入1000ml乙醚沉淀，离心收集，用无水乙醚洗后，P2O5真空干燥，得还原型生长抑肽粗品11.5-13g(FW：1640，7.02mmol)。收率72.3％-74.5％(以Fmoc-Cys(Trt)-Wang树脂的9.72mmol计)。
三.采用在pH7.0-10.0，于15-35℃下，通空气氧化的方法(二硫键的形成)。
将粗肽溶于10％冰醋酸100ml，加4800ml水，在搅拌下慢慢滴加1.5M NaOH至pH7.8，于15-20℃下，通空气氧化24小时。用50％冰醋酸调至pH4.5-5.0，加活性碳搅拌30分钟，过滤。
四.采用C18柱进行分离纯化，流动相为：0.1MNH4Ac：乙腈(6-8：2-4)；检测波长为：280nm的方法。
滤液分批经C18柱(50×250mm)纯化，流动相：0.1MNH4Ac：乙腈(7.5：2.5)；流速为50ml/min；检测波长为：280nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，样品峰合并后冻干，约得3.5-4.5g白色疏松块状物成品。
后处理收率：30.5％-31.2％，总收率约为：22.1％～22.9％。
本发明虽然总收率较低，但是操作简单，生产成本降低明显，有利于本品的国产化生产。
附图说明
附图为Wang树脂制备生长抑素的合成路线工艺流程图。
具体实施方式
实施例1
(1).制备Fmoc-Cys(Trt)-Wang树脂
取12.0gWang树脂(1.01mmol/g树脂，12.12mmol)装入反应容器中，用150mlDMF浸泡、洗涤。加入17.92g(FW：585.7，30.6mmol)Fmoc-Cys(Trt)-OH、9.82g(FW：321，30.6mmol)TBTU、4.68g(FW：153，30.6mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器，25℃反应1小时。滤干，用DMF洗涤三次，滤干。Kaiser方法检测氨基为阴性。若显阳性加入，则应用上述量的1/2量补接一次。加入150ml的封头试剂，25℃反应1小时。同上洗涤，滤干。
(2).制备Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂
在上述脱帽反应后的树脂中，加入11.50g(FW：383.4，30mmol)Fmoc-Ser(tBu)-OH、9.6g(30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25℃反应1小时。滤干，分别用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干。加入150ml脱帽试剂，25℃反应10分钟，同上洗涤，滤干。
(3).制备Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂
在上述脱帽反应后的树脂中，加11.9g(FW：397.4，30mmol)Fmoc-Thr(tBu)-OH、9.6g(30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25℃反应1小时。滤干，分别用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干。加入150ml脱帽试剂，25℃反应10分钟滤干，用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干。
(4).制备Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂
在上述脱帽反应后的树脂中，加11.6g(FW：387.4，30mmol)Fmoc-Phe-OH、9.6g(30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25℃反应1小时。其余操作同上。
(5).制备Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂
在上述脱帽反应后的树脂中，加11.9g(FW：397.4，30mmol)Fmoc-Thr(tBu)-OH、9.6g(30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25℃反应1小时。其余操作同上。
(6).制备Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂
在上述脱帽反应后的树脂中，加13.9g(FW：468.6，30mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH、9.6g(30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25℃反应1小时。其余操作同上。
(7).制备Fmoc-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂
在上述脱帽反应后的树脂中，加12.83g(FW：427.5，30mmol)Fmoc-Trp(Boc)-OH、9.6g(30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25℃反应1小时。其余操作同上。
(8).制备Fmoc-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂
在上述脱帽反应后的树脂中，加11.6g(FW：387.4，30mmol)Fmoc-Phe-OH、9.6g(30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25℃反应1小时。其余操作同上。
(9).制备Fmoc-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂
在上述脱帽反应后的树脂中，加11.6g(FW：387.4，30mmol)Fmoc-Phe-OH、9.6g(30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25℃反应1小时。其余操作同上。
(10).制备Fmoc-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂
在上述脱帽反应后的树脂中，加17.90g(FW：596.7，30mmol)Fmoc-Asn(Trt)-OH、9.6g(30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25℃反应1小时。其余操作同上。
(11).制备Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂
在上述脱帽反应后的树脂中，加13.9g(FW：468.6，30mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH、9.6g(30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25℃反应1小时。其余操作同上。
(12).制备Fmoc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂
在上述脱帽反应后的树脂中，加17.6(FW：585.7，30mmol)Fmoc-Cys(Trt)-OH、9.6g(30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25℃反应1小时。其余操作同上。
(13).制备Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂
在上述脱帽反应后的树脂中，加8.92g(FW：297.3，30mmol)Fmoc-Gly-OH、9.6g(30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25℃反应1小时。其余操作同上。
(14).制备Fmoc-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂
在上述脱帽反应后的树脂中，加9.34g(FW：311.3，30mmol)Fmoc-Ala-OH、9.6g(30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25℃反应1小时。其余操作同上。
接肽反应结束后用DCM、DMF、无水乙醇分别洗涤三次。滤干后，放入真空干燥器中干燥，称重，得保护的十四肽树脂约26g(8.372mmol)，接肽总收率约为86.13％，每步接肽收率在98％。
取26g保护十四肽树脂转移到500ml茄形瓶中，加入切肽试剂(TFA/EDT/H2O/TIS＝170.1ml/4.5ml/4.5ml/0.9ml)180ml，25℃搅拌2小时。滤去树脂，树脂用20％TFA的DCM溶液洗3次，合并滤液及洗涤液，加入1000ml乙醚沉淀，离心收集，用无水乙醚洗后，P2O5真空干燥，得还原型生长抑肽粗品11.5g(FW：1640，7.02mmol)。收率72.3％(以Fmoc-Cys(Trt)-Wang树脂的9.72mmol计)。
将粗肽溶于10％冰醋酸100ml，加4800ml水，在搅拌下慢慢滴加1.5M NaOH至pH7.8，于15℃下，通空气氧化24小时。用50％冰醋酸调至pH5.0，加活性碳搅拌30分钟，过滤滤液分批经C18柱(50×250mm)纯化，流动相：0.1MNH4Ac∶乙腈(7.5∶2.5)；流速为50ml/min；检测波长为：280nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，样品峰合并后冻干，约得3.5g白色疏松块状物成品。3.5÷1638＝2.14mmol
后处理收率：30.5％，总收率约为：22.1％。
实施例2
(1).制备Fmoc-Cys(Trt)-Wang树脂
取15.0gWang树脂(1.01mmol/g树脂，12.12mmol)装入反应容器中，用150mlDMF浸泡、洗涤。加入17.92g(FW：585.7，30.6mmol)Fmoc-Cys(Trt)-OH、9.82g(FW：321，30.6mmol)TBTU、4.68g(FW：153，30.6mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器，40℃反应0.5小时。滤干，用DMF洗涤三次，滤干。Kaiser方法检测氨基为阴性。若显阳性加入，则应用上述量的1/2量补接一次。加入150ml的封头试剂，40℃反应0.5小时。同上洗涤，滤干。
(2).制备Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂
在上述脱帽反应后的树脂中，加入13.50g(FW：383.4，30mmol)Fmoc-er(tBu)-OH、9.6g(30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。40℃反应0.5小时。滤干，分别用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干。加入150ml脱帽试剂，40℃反应5分钟，同上洗涤，滤干。
(3).制备Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂
在上述脱帽反应后的树脂中，加13.9g(FW：397.4，30mmol)Fmoc-Thr(tBu)-OH、10g(30mmol)TBTU、5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。40℃反应0.5小时。滤干，分别用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干。加入150ml脱帽试剂，40℃反应5分钟滤干，用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干。
(4).制备Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂
在上述脱帽反应后的树脂中，加13.6g(FW：387.4，30mmol)Fmoc-Phe-OH、10g(30mmol)TBTU、5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。40℃反应0.5小时。其余操作同上。
(5).制备Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂
在上述脱帽反应后的树脂中，加13.9g(FW：397.4，30mmol)Fmoc-Thr(tBu)-OH、10g(30mmol)TBTU、5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。40℃反应0.5小时。其余操作同上。
(6).制备Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂
在上述脱帽反应后的树脂中，加15g(FW：468.6，30mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH、10g(30mmol)TBTU、5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。40℃反应0.5小时。其余操作同上。
(7).制备Fmoc-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂
在上述脱帽反应后的树脂中，加14.83g(FW：427.5，30mmol)Fmoc-Trp(Boc)-OH、10g(30mmol)TBTU、5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。40℃反应0.5小时。其余操作同上。
(8).制备Fmoc-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂
在上述脱帽反应后的树脂中，加13.6g(FW：387.4，30mmol)Fmoc-Phe-OH、10g(30mmol)TBTU、5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。40℃反应0.5小时。其余操作同上。
(9).制备Fmoc-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂
在上述脱帽反应后的树脂中，加13.6g(FW：387.4，30mmol)Fmoc-Phe-OH、10g(30mmol)TBTU、5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。40℃反应0.5小时。其余操作同上。
(10)-制备Fmoc-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂
在上述脱帽反应后的树脂中，加19.0g(FW：596.7，30mmol)Fmoc-Asn(Trt)-OH、10g(30mmol)TBTU、5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。40℃反应0.5小时。其余操作同上。
(11).制备Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂
在上述脱帽反应后的树脂中，加15g(FW：468.6，30mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH、10.0g(30mmol)TBTU、5.0g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。40℃反应0.5小时。其余操作同上。
(12).制备Fmoc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂
在上述脱帽反应后的树脂中，加19.6(FW：585.7，30mmol)Fmoc-Cys(Trt)-OH、10g(30mmol)TBTU、5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。40℃反应0.5小时。其余操作同上。
(13).制备Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂
在上述脱帽反应后的树脂中，加9.92g(FW：297.3，30mmol)Fmoc-Gly-OH、10g(30mmol)TBTU、5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。40℃反应0.5小时。其余操作同上。
(14).制备Fmoc-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂
在上述脱帽反应后的树脂中，加10.34g(FW：311.3，30mmol)Fmoc-Ala-OH、10g(30mmol)TBTU、5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。40℃反应0.5小时。其余操作同上。
接肽反应结束后用DCM、DMF、无水乙醇分别洗涤三次。滤干后，放入真空干燥器中干燥，称重，得保护的十四肽树脂约30g(8.372mmol)，接肽总收率约为87％，每步接肽收率在98.5％。
取30g保护十四肽树脂转移到500ml茄形瓶中，加入切肽试剂(TFA/EDT/H2O/TIS＝170.1ml/4.5ml/4.5ml/0.9ml)185ml，35℃搅拌1.5小时。滤去树脂，树脂用20％TFA的DCM溶液洗3次，合并滤液及洗涤液，加入1000ml乙醚沉淀，离心收集，用无水乙醚洗后，P2O5真空干燥，得还原型生长抑肽粗品13.5g(FW：1640，7.02mmol)。收率74.5％(以Fmoc-Cys(Trt)-Wang树脂的9.72mmol计)。
将粗肽溶于10％冰醋酸100ml，加4800ml水，在搅拌下慢慢滴加1.5M NaOH至pH10.0，于20℃下，通空气氧化24小时。用50％冰醋酸调至pH4.5，加活性碳搅拌30分钟，过滤滤液分批经C18柱(50×250mm)纯化，流动相：0.1MNH4Ac∶乙腈(7.5∶2.5)；流速为50ml/min；检测波长为：280nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，样品峰合并后冻干，约得4.5g白色疏松块状物成品。后处理收率：31.2％，总收率约为：22.9％。
Claims (19)
1.一种生长抑素的合成方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：
(1)将Wang树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，逐个接上氨基酸；
(2)用切肽试剂进行切肽，加入乙醚沉淀粗肽；
(3)在pH7.0-10.0，于15-35℃下，通空气氧化；
(4)用C18柱进行分离纯化。
2.根据权利要求1所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，制备Fmoc-Cys(Trt)-Wang树脂；将Wang树脂装入反应容器中，用DMF浸泡、洗涤，加Fmoc-Cys(Trt)-OH、TBTU、HOBT，用接肽试剂溶解，加入反应容器，25-40℃反应0.5-1小时，滤干，用DMF洗涤三次，滤干，加入封头试剂，25-40～C反应0.5-1小时，同上洗涤，滤干。
3.根据权利要求1或2所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，制备Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂；在上述脱帽反应后的树脂中，加入Fmoc-Ser(tBu)-OH、TBTU、HOBT，用接肽试剂溶解，加入反应容器，25-40℃反应0.5-1小时，滤干，分别用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干，加入脱帽试剂，25-40℃反应5-10分钟，同上洗涤，滤干。
4.根据权利要3所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，制备Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂；在上述脱帽反应后的树脂中，加Fmoc-Thr(tBu)-OH、TBTU、HOBT，用接肽试剂溶解，加入反应容器25-40℃反应0.5-1小时，滤干，分别用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干，加入脱帽试剂，25-40℃反应5-10分钟滤干，用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干。
5.根据权利要求4所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，制备 Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂；在上述脱帽反应后的树脂中，加Fmoc-Phe-OH、TBTU、HOBT，用接肽试剂溶解，加入反应容器，25-40℃反应0.5-1小时，滤干，分别用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干，加入脱帽试剂，25-40℃反应5-10分钟滤干，用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干。
6.根据权利要求5所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，制备Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂；在上述脱帽反应后的树脂中，加Fmoc-Thr(tBu)-OH、TBTU、HOBT，用接肽试剂溶解，加入反应容器，25-40℃反应0.5-1小时，滤干，分别用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干，加入脱帽试剂，25-40℃反应5-10分钟滤干，用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干。
7.根据权利要求6所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，制备Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂；在上述脱帽反应后的树脂中，加Fmoc-Lys(Boc)-OH、TBTU、HOBT，用接肽试剂溶解，加入反应容器，25-40℃反应0.5-1小时，滤干，分别用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干，加入脱帽试剂，25-40℃反应5-10分钟滤干，用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干。
8.根据权利要求7所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，制备Fmoc-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂；在上述脱帽反应后的树脂中，加Fmoc-Trp(Boc)-OH、TBTU、HOBT，用接肽试剂溶解，加入反应容器，25-40℃反应0.5-1小时，滤干，分别用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干，加入脱帽试剂，25-40℃反应5-10分钟滤干，用DMF、 无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干。
9.根据权利要求8所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，制备Fmoc-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂；在上述脱帽反应后的树脂中，加Fmoc-Phe-OH、TBTU、HOBT，用接肽试剂溶解，加入反应容器 ，25-40℃反应0.5-1小时，滤干，分别用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干，加入脱帽试剂，25-40℃反应5-10分钟滤干，用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干。
10.根据权利要求9所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，制备Fmoc-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang 树脂；在上述脱帽反应后的树脂中，加Fmoc-Phe-OH、TBTU、HOBT，用接肽试剂溶解，加入反应容器，25-40℃反应0.5-1小时，滤干，分别用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干，加入脱帽试剂，25-40℃反应5-10分钟滤干，用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干。
11.根据权利要求10所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，制备Fmoc-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Bot)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂；在上述脱帽反应后的树脂中，加Fmoc-Asn(Trt)-OH、TBTU、HOBT，用接肽试剂溶解，加入反应容器，25-40～C反应0.5-1小时，滤干，分别用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干，加入脱帽试剂，25-40℃反应5-10分钟滤干，用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干。
12.根据权利要求11所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，制备Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂；在上述脱帽反应后的树脂中，加Fmoc-Lys(Boc)-OH、TBTU、HOBT，用接肽试剂溶解，加入反应容器，25-40℃反应0.5-1小时，滤干分别用DMF、 无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干，加入脱帽试剂，25-40℃反应5-10分钟滤干，用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干。
13.根据权利要求12所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，制备Fmoc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂；在上述脱帽反应后的树脂中，加Fmoc-Cys(Trt)-OH、TBTU、HOBT，用接肽试剂溶解，加入反应容器，25-40℃反应0.5-1小时，滤干，分别用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干，加入脱帽试剂，25-40～C反应5-10分钟滤干，用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干。
14.根据权利要求13所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，制备Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂；在上述脱帽反应后的树脂中，加Fmoc-Gly-OH、TBTU、HOBT，用接肽试剂溶解，加入反应容器，25-40～C反应1小时，滤干，分别用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干，加入脱帽试剂，25-40℃反应5-10分钟滤干，用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干。
15.根据权利要求14所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，制备Fmoc-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂；在上述脱帽反应后的树脂中，加Fmoc-Ala-OH、TBTU、HOBT，用接肽试剂溶解，加入反应容器，25-40～C反应0.5-1小时，滤干，分别用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干，加入脱帽试剂，25-40℃反应5-10分钟滤干，用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干。
16.根据权利要求1所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，接肽反应结束后用DCM、DMF、无水乙醇分别洗涤三次，滤干后，放入真空干燥器中干燥。
17.根据权利要求1所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，切肽方法是将保护十四肽树脂转移到500ml茄形瓶中，加入切肽试剂TFA/EDT/H2O/TIS；25-35℃搅拌1.5-2小时，滤去树脂，树脂用20％TFA的DCM溶液洗3次，合并滤液及洗涤液，加入适量乙醚沉淀，离心收集，用无水乙醚洗后，P2O5真空干燥，得还原型生长抑肽粗品。
18.根据权利要求1所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，将粗肽溶于10％冰醋酸，加一定量水，在搅拌下慢慢滴加1.5M NaOH至pH7.0-10.0，于15-20℃下，通空气氧化12-24小时，用50％冰醋酸调至pH4.5-5.0，加活性碳搅拌30-60分钟，过滤。
19.根据权利要求1所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，用C18柱进行分离纯化，流动相为6-8∶2-4的0.1M NH4Ac∶乙腈；检测波长为：280nm，用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，样品峰合并后冻干。
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