CN1257871A - 生长抑素多肽类似物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生长抑素多肽类似物及其在阿片依赖无痛苦戒断治疗或阿片依赖预防方面的应用。这种多肽类似物的结构为aal-D-Cys-aa3-aa4-aa5-aa6-Pen-aa8,其中aa1代表Phe、CH3-Phe或Tyr,aa3代表Tyr或Phe,aa4代表Trp或His,aa5代表Ala、Arg或Gly,aa6代表Thr或Ser,aa8代表Thr或Ser。
Description
本发明涉及生长抑素多肽类似物及其在阿片依赖无痛苦戒断治疗和阿片依赖预防方面的应用。
近年来，随着多种吗啡受体的发现，吗啡激动剂和拮抗剂的问世，吗啡类依赖性治疗和预防的研究取得了很大进展。目前，临床上戒毒主要采取美沙酮等弱激动剂进行替代疗法。这种替代疗法治疗周期长，痛苦大，患者不易接受，而且，美沙酮也是我国药政部门规定的毒品之一。近几年，我国多家单位采用了中药戒毒法，该法治疗吗啡躯体依赖病人有一定的疗效，但也有副作用大、病人戒毒时由于痛苦大而难以接受等缺点。近几年研究发现，阿片产生依赖不但是直接通过mu阿片受体起作用，而且间接影响到神经系统的多个环节。正在基础研究阶段的应用谷氨酸等兴奋性氨基酸来进行吗啡戒断的研究，据称业已取得可喜的药效。但这些从非mu阿片受体入手，进行吗啡戒断治疗，只能是从侧面缓解依赖发作时的症状，不能根本解决问题。
生长抑素(Somatostatin.SOM)是机体内一种重要的神经内分泌活性物质，具有重要的生理功能。1986年，Gulya K.Pelton J等(Gulya K.Pelton J，HrubyVJ，Yamamura HI.Cyclic somatostatin octapeptide analogues with high affinityand selectivity toward mu opiod receptor.Life Science 1986，38(24)：2221-2229)对生长抑素的化学结构进行了改造，发现用一个非氨基酸成分Penicillianin替代生长抑素肽链第6位氨基酸Cys后所得到的多肽类似物能选择性地与mu阿片受体结合，而与其他阿片受体不结合。90年代，在Gulya K.Pelton J研究的基础上，人们对生长抑素类似物进行了进一步的改造，先后又出现多种能与mu阿片受体结合的类似物(Bonner G.G.et al Opioid peptides：Simultaneousδagonism and μ antagonism in somatostatin analogues.Peptides 18：93-100，1997，Perez J et al. Neuroscience 65：1087-1097，1995，Hofland LJ.Et alBiochemical Pharmacology 50：287-297，1995)。上述文献在此合并一起作为本发明的参考文献。这些文献仅公开它们作为实验室鉴别mu阿片受体工具的应用和用于抗伤害性刺激的研究，未报道任何有关用于阿片依赖戒断治疗研究的内容。
本发明的目的在于提供一类新的生长抑素多肽类似物。
本发明的另一个目的在于提供本发明的生长抑素多肽类似物在阿片依赖无痛苦戒断治疗和阿片依赖预防方面的应用。
为实现上述目的，我们在现有技术的基础上对一些生长抑素多肽类似物进行了系统的结构改造和功能研究，发现了结构为
的多肽类似物，其中，aa1代表Phe、CH3-Phe或Tyr，aa3代表Tyr或Phe，aa4代表Trp或His，aa5代表Ala、Arg或Gly，aa6代表Thr或Ser，aa8代表Thr或Ser。
优选aa1为D-Phe、CH3-Phe或D-Tyr，aa3代表D-Tyr或D-Phe，aa4代表D-Trp或D-His，aa5代表D-Ala、D-Arg或D-Gly，aa6代表D-Thr或D-Ser，aa8代表D-Thr或D-Ser。
符合式(I)的多肽类似物例子有： 
其中，结构E与1977年Hurby报告的结构相同，但未有相关功能的报告。
本发明的多肽类似物可与本领域中的常用无机酸或有机酸，如盐酸、枸橼酸，形成盐加以应用。
本发明的多肽类似物可用合成仪自动合成，亦可用手工固相或液相方法合成。本发明采用Fmoc保护氨基酸，连接在Rink酰胺化树脂上，手工方法合成。
经研究发现，本发明的多肽类似物能用于医疗或非医疗因素引起的机体对吗啡、海洛因、可待因等依赖的无痛苦戒断治疗；与吗啡及其他强镇痛药伍用于临床顽固性痛疼的治疗，可减低或完全阻断吗啡等强镇痛药造成的躯体依赖。
下面结合附图，用实施例对本发明作进一步的阐述，但这些实施例并不限制本发明。
图1为合成多肽类似物HPLC分析举例1。
图2为合成多肽类似物质谱分析举例1。
图3为合成多肽类似物HPLC分析举例2。
图4为合成多肽类似物质谱分析举例2。
图5为合成多肽类似物HPLC分析举例3。
图6为合成多肽类似物质谱分析举例3。
图7为合成多肽类似物HPLC分析举例4。
图8为合成多肽类似物质谱分析举例4。
实施例1.多肽类似物的合成和确认
本发明所用多肽采用Fmoc保护氨基酸，连接在Rink酰胺化树脂上，手工方法合成。合成方法参照文献Cai et al.Proc.Natl Acad Sci USA.83：1896-
1900，1986。常规脱盐方法脱盐，用高压液相(HPLC)和质谱检测确认。
冷冻干燥。
实施例2.多肽类似物的筛选
方法：筛选主要在小鼠(三次)和大鼠(一次)上进行。筛选主要采用在体方法。
动物吗啡依赖模型的建立：小鼠采用皮下注射盐酸吗啡，剂量为50μg/只/次，每天两次，连续5天。大鼠采用梯度增量法皮下注射盐酸吗啡。第一天为1mg/只，第二天2mg/只，第三天4mg/只，第四天8mg/只，第五天15mg/只，第六天30mg/只。
根据上述方法建立吗啡依赖动物，在末次用药后2-4小时之间给药组动物皮下(小鼠，20μg/只)或尾静脉(大鼠，100μg/只)注射合成类似物，20分钟后皮下注射纳络酮促断，观察动物的症状表现。并参照Peachey、李密等报告的CINA量表及动物戒断症状评价量表，对动物表现的：跳跃、湿狗运动、扭体、摇头、扫尾、打哈欠、激惹、齿颤、咀嚼、流泪、流涎、眼睑下垂、竖毛、腹泻及1小时后体重下降情况，进行记录、评估、记分，统计学处理。根据评分情况(小鼠主要参照其跳跃次数)决定所合成类似物阻断纳络酮对吗啡依赖动物的促断效果。
结果：根据上述方法记录结果如下表。
表1.几种类似物阻断纳络酮促断吗啡依赖性效果组别 例数 平均值 标准差A 10 3.460000** 3.20685324B 10 4.460000** 2.85643325C 10 4.4200000** 2.28764436D 10 6.320000* 2.26785433E 10 1.6000000*** 2.25864517F 10 5.780000** 3.46332456G 10 5.540000** 3.36578423H 10 5.640000** 2.78654332I 10 6.680000* 3.14657732J 10 1.4000000*** 1.83787317K 10 1.7400000*** 2.24457821L 10 2.4600000*** 2.44654321Control 10 8.7000000 2.49666444上述A-L分别代表合成的类似物。表中平均值越大，代表戒断症状越明显。*，代表差别明显，P＜0.05；**，代表差别非常明显，p＜0.01；***代表p＜0.0001以上。
J＞E＞K＞L＞A＞C＞B＞G＞H＞F＞D＞I
实施例3：药理药效作用研究
经过前述筛选，对其中三种类似物(e，j，k)进行药理学研究。除特殊说明外，下述每项指标均是在大鼠和小鼠两种动物上完成的，每项指标重复研究三次。在下述研究结果中，仅列出其中一次结果。
1：类似物能阻断或减缓纳络酮对吗啡依赖动物的促断反应
方法：首先按标准给药方法连续5天注射吗啡制造动物吗啡依赖模型。在用纳络酮促断前5分钟(静脉)或30分钟(皮下)，分别经静脉或皮下注射这些种多肽类似物，然后按常规方法给大剂量的纳络酮(4-5mg)。记录动物的症状，量化处理。选取一次实验结果。结果：记录动物各种戒断症状，按照前述的Peachey、李密等报告的CINA量表及动物戒断症状评价。结论：这些种多肽类似物能明显地阻断纳络酮对吗啡依赖动物造成的的促断反应，并且大部分动物表现出安静状态；而对照组则表现明显的吗啡成瘾症状。动物症状评分方差分析，实验组与对照组差别明显。P＜0.001。
表2： 纳络酮引起的各组动物促断反应症状量化表组别 例数 平均值 标准差1 10 1.6000000*** 2.458545192 10 1.4000000*** 1.837873173 10 2.7000000*** 2.21359436Control 10 8.7000000 2.49666444
表中1，2，3分别代表上述序列中的E，J，K.
2：类似物能减缓纳络酮引起的吗啡依赖动物体重的减轻
方法：方法同实施例1.所述。结果：记录吗啡依赖动注射纳络酮前及注射后一小时时，动物体重减轻百分比(％)。结论：类似物能明显阻断纳络酮对吗啡依赖动物的促断反应。
表3.：纳络酮引起的各组动物体重减轻情况表
组别 例数 平均值 标准差
1 10 3.428000*** 2.42307335
2 10 3.948000*** 1.54206067
3 10 3.461000*** 1.78090146
4 10 16.712000 4.85950340
5 8 5.1775000** 1.55208385
***P＜0.001
其中1，2，3，分别代表上述序列中的E，J，K组，4代表生理盐水组，5为空白对照组。
3：类似物能缩短机体对阿片依赖的解除时间
方法：用昆明种小鼠200只。首先制造吗啡依赖动物模型。造模方法同实施例4.1.。造模动物又分为四组：每组50只。第一组：注射类似物J；第二组，注射类似物E；第三组，注射类似物K；第四组，注射生理盐水。用不作任何处理的正常动物40只。上述各组动物又等量分为五组。将分别在造模后的第二天，第三天，第四天，第五天，第六天注射纳络酮，观察并记录促断症状，量化处理。各组每天戒断症状量化结果记录见表4-8结果。
结论：与自然戒断相比，类似物能明显缩短吗啡依赖动物的脱依赖时间，动物又不表现任何痛苦。
表4.第二天纳络酮引起的各组动物戒断症状量化表组别 例数 平均值 标准差
1 10 1.700000*** 0.82327260
2 10 2.000000*** 1.05409255
3 10 1.800000*** 1.31656118
4 10 7.000000 0.66666667组别 例数 平均值 标准差
1 10 1.700000** 0.82327260
2 10 2.000000** 1.05409255
3 10 1.800000** 1.31656118
5 8 1.222222 0.66666667组别 例数 平均值 标准差
1 10 7.000000*** 0.66666667
5 8 1.222222 0.66666667
表5.第三天纳络酮引起的各组动物戒断症状量化表组别 例数 平均值 标准差1 10 1.800000*** 0.632455532 10 1.700000*** 0.483045893 10 1.800000*** 0.632455534 10 5.100000 1.10050493组别 例数 平均值 标准差1 10 1.800000** 0.632455532 10 1.700000** 0.483045893 10 1.800000** 0.632455535 8 1.222222 0.44095855组别 例数 平均值 标准差4 10 5.100000 1.100504935 8 1.222222*** 0.44095855
表6.第四天纳络酮引起的各组动物戒断症状量化表组别 例数 平均值 标准差1 10 1.700000*** 0.823272602 10 1.500000*** 0.707106783 10 1.700000*** 0.483045894 10 4.800000 1.22927259组别 例数 平均值 标准差1 10 1.700000** 0.823272602 10 1.500000** 0.707106783 10 1.700000** 0.483045895 8 1.111111 0.6009222521组别 例数 平均值 标准差4 10 4.800000 1.229272595 8 1.111111*** 0.6009222521
表7.第五天纳络酮引起的各组动物戒断症状量化表组别 例数 平均值 标准差1 10 1.5000*** 1.178511302 10 2.0000*** 1.054092553 10 1.70000*** 0.674948564 10 4.90000 1.10050493 组别 例数 平均值 标准差
1 10 1.5000* 1.17851130
2 10 2.0000* 1.05409255
3 10 1.70000* 0.67494856
5 8 1.00000 0.70710678组别 例数 平均值 标准差
4 10 4.90000 1.10050493
5 8 1.00000*** 0.70710678
表8.第六天纳络酮引起的各组动物戒断症状量化表组别 例数 平均值 标准差
1 10 0.900000*** 0.73786479
2 10 1.100000*** 0.73786479
3 10 1.500000*** 0.70710678
4 10 3.900000 0.99442893组别 例数 平均值 标准差
1 10 0.900000 0.73786479
2 10 1.100000 0.73786479
3 10 1.500000* 0.70710678
5 8 1.000000 0.70710678组别 例数 平均值 标准差
4 10 3.900000 0.99442893
5 8 1.000000*** 0.70710678
4：多肽类似物能明显地降低或防止动物对吗啡的依赖性
方法：动物使用昆明种小鼠和Wister大鼠各49只。动物分为5组：1.SOMa1+吗啡组，2.SOMa2+吗啡组；3.SOMa3+吗啡组；4.单纯吗啡组；5.正常对照组。先将这些类似物分别按10ug/只皮下(小鼠和大鼠)或静脉(大鼠)分别注射于1，2，3组动物；等量盐水注射于4，5，组动物。20分钟后再注射吗啡给1-4组动物注射吗啡剂量按制造依赖模型剂量注射盐酸吗啡(见实施例4.1.)。六天后，各组动物分别注射纳络酮进行依赖促断，观察动物反应。并记录戒断症状，量化结果见表9。
结论：类似物能明显降低动物对吗啡的依赖性。
表9.类似物与吗啡伍用后，纳络酮引起动物戒断症状量化表组别 例数 平均值 标准差
1 10 1.6000*** 1.89736660
2 10 1.9000*** 2.13177026
3 10 1.0000*** 1.05409255
4 10 7.7000 2.66874919组别 例数 平均值 标准差
1 10 1.6000** 1.89736660
2 10 1.9000** 2.13177026
3 10 1.0000** 1.05409255
5 9 0.2222 0.44095855组别 例数 平均值 标准差
4 10 7.7000 2.66874919
5 9 0.2222*** 0.44095855
5：躯体依赖性研究
方法：小鼠大鼠各48只。动物分为5组：1.SOMa1组；2.SOMa2组；3.SOMa3；4.吗啡组；5.生理盐水组。这些种多肽类似物按每天两次皮下大剂量(30ug/次)注射于1，2，3组动物体内，连续使用超过三星期。第4，5组动物在注射纳络酮前6天，每天分别注射盐酸吗啡和生理盐水。用盐酸吗啡剂量同实施例吗啡模型建立所述。然后用纳络酮(5mg/kg小鼠，4mg/kg大鼠)作促断实验。
结论：全部类似物处理组动物均不表现任何吗啡依赖的戒断症状。分析其原因，可能和这些种多肽类似物的化学结构有关。结果：观察其症状并进行量化记录。
表10.纳络酮对各组动物戒断症状量化表组别 例数 平均值 标准差
1 10 1.0000 0.2456432
2 10 1.0000 0.3422134
3 10 1.2000 0.1563246
4 10 8.2000 2.6789423
5 8 1.1000 0.3287432
6：镇痛作用
方法：实验用昆明种小鼠48只。动物分为5组：1.SOMa1组；2.SOMa2组；3.SOMa3组；4.吗啡组；5.生理盐水组。先将类似物1.2.3.分别注射于动物1-3组，吗啡注射于第五组，第四组事先不做任何处理。20分钟后，动物分别腹腔注射稀醋酸(0.6％)1ml，观察记录动物在5分钟内扭体次数，并记录。结果如表11。
表11.醋酸疼痛实验动物扭体次数组别 例数 平均值 标准差
1 10 8.2.00000** 1.94280904
2 10 6..000000** 1.26666667
3 10 6.740000** 1.82327260
4 10 0.32000 0.46822564
5 8 18.50000 4.53452248
结论：这些多肽类似物的镇痛作用明显弱于吗啡，其中以类似物j最弱。
Claims (11)
1.具有下式结构的多肽类似物或其与酸形成的盐，
其中，aa1代表Phe、CH3-Phe或Tyr，aa3代表Tyr或Phe，aa4代表Trp或His，aa5代表Ala、Arg或Gly，aa6代表Thr或Ser，aa8代表Thr或Ser，D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Arg-Thr-Pen-Thr-NH2除外。
2.按照权利要求1所述的多肽类似物或其与酸形成的盐，其特征在于aa1代表D-Phe、CH3-D-Phe或D-Tyr，aa3代表D-Tyr或D-Phe，aa4代表D-Trp或D-His，aa5代表D-Ala、D-Arg或D-Gly，aa6代表D-Thr或D-Ser，aa8代表D-Thr或D-Ser。
3.按照权利要求1所述的多肽类似物或其与酸形成的盐，结构为
4.按照权利要求1所述的多肽类似物或其与酸形成的盐，结构为
5.按照权利要求1所述的多肽类似物或其与酸形成的盐，结构为
6.按照权利要求1所述的多肽类似物或其与酸形成的盐，结构为
7.按照权利要求1所述的多肽类似物或其与酸形成的盐，结构为
8.按照权利要求1所述的多肽类似物或其与酸形成的盐，结构为
9.按照权利要求1所述的多肽类似物或其与酸形成的盐，结构为
10.按照权利求1所述的多肽类似物或其与酸形成的盐，结构为
11.权利要求1所述的多肽类似物在制备预防或治疗阿片类物质依赖药物中的应用。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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