CN1194693C - 麻痹性贝毒毒素作为制备疗治疼痛病症药物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明研究的麻痹性贝毒(PSP)毒素作为制备疗治疼痛病症药物的应用是在20多种该PSP毒素中选择五类：(一)氨基甲酸酯类毒素，(二)N-磺酰氨甲酰基类毒素，(三)脱氨甲酰基类毒素，(四)脱氧脱氨甲酰基类毒素，(五)氨基甲酸酯类的N-羟基衍生物。五类毒素除单用外，还可与麻醉性镇痛药物如：吗啡、可待因、哌替啶、罗通定、纳洛酮、纳曲酮等，选取其中的一种或几种组合，联合应用。该PSP毒素在疗治疼痛病症时，确实能抑制疼痛，作用强度大，作用持续时间长。其与镇痛药联合应用，可延长镇痛作用持续时间，降低镇痛药的用量，从而降低镇痛药的毒副作用。
Description
(一)技术领域：
本发明涉及麻痹性贝毒(Paralytic Shellfish Poisons，PSP)毒素(以下简称：PSP毒素)的药物新用途，具体讲是麻痹性贝毒(PSP)毒素作为制备疗治疼痛病症药物的应用，其属于化学组合物的应用方法技术领域。
(二)技术背景
麻痹性贝毒(PSP)毒素中毒自古就有发生。1928年，Meyer等(J.Prevent.Med.2，365-394)曾著文详述了有关PSP毒素中毒事件的历史。但真正引起人们重视并进行深入研究的中毒事件发生于1927年，美国加州金门南北约50英里范围内的102人因食用贻贝而发病。经调查，Meyer等认为某些甲藻是使贻贝产生毒性的重要因素。此后，人们才逐渐知道PSP毒素有许多类型，其来源各不相同。
经研究得知：PSP毒素是一类四氢嘌呤的衍生物。目前能够产生PSP毒素的主要海洋有毒藻有：非链状亚历山大藻(Alexandrium acatenella)，链状亚历山大藻(A.catenella)，股状亚历山大藻(A.cohorticula)，塔玛亚历山大藻(A.tamarense)，链状裸甲藻(Gymnodinium catenatum)等。此外，细菌、蓝藻、红藻(Jania sp.)中的一些种类也可以产生PSP毒素。在贝类、螺类、蟹类、鱼类中也曾检测到部分PSP毒素。现在已经发现的PSP毒素有20多种(表2)，PSP毒素的基本结构式如下：
表2 PSP毒素种类与名称(于仁诚，周名江，海洋与湖沼3，330-338(1998))
| R1 | R2 | R3 | R4： R4： R4： R4： R4：OH H |
其中R1，R2，R3，R4为结构式中四个取代基团。
PSP毒素呈碱性，水溶性高，可溶于甲醇、乙醇。一般条件下比较稳定，但是其中的一些基团也会发生变化，如C11位羟基磺酸盐基团的空间异构化。有毒藻中大量存在的β异构体可以转变成更加稳定的α异构体。贝组织中也会发生这种异构化，稳定后异构体的比例趋于α∶β＝3∶1。N-磺酰氨甲酰基类毒素在加热、酸性条件下会脱掉磺酰基，生成相应的氨基甲酸酯类毒素；而在稳定的条件下则生成相应的脱氨甲酰基类毒素。PSP毒素属于胍类毒素，其活性部位为7，8，9位的胍基，与电压门控Na+通道位点1的氨基酸残基高度亲和，通过选择性阻断Na+内流，阻碍动作电位的形成而起作用。PSP毒素各衍生物对Na+通道位点1的阻断程度有很大差别，毒性也有一些不同(见表1)。
表1 PSP毒素的毒性
| 毒素 | 毒性(MU/μmol) | 毒性(STX Equal/μmol) | 相对于STX的毒性(％) |
| GTX5(B1) | 150 | 27 | 7 |
| GTX6(B2) | 150 | 27 | 7 |
| C1 | 17 | ＜1 | ＜1 |
| C2 | 258 | 47 | 13 |
| STX | 2100 | 378 | 100 |
| neoSTX | 2300 | 414 | 110 |
| GTX1 | 1900 | 342 | 90 |
| GTX2 | 1000 | 180 | 48 |
| GTX3 | 1600 | 288 | 76 |
| GTX4 | 1900 | 342 | 90 |
| dcSTX | 900 | 162 | 43 |
| dcneoSTX | 900 | 162 | 43 |
| DcGTX1 | 50 | 171 | 45 |
| DcGTX2 | 380 | 68 | 18 |
| DcGTX3 | 380 | 68 | 18 |
| dcGTX4 | 950 | 171 | 45 |
对PSP毒素活性的初步研究表明，PSP毒素对神经系统有局麻作用，Adams等申请了多项局麻专利。在已有的专利文献CN1192903中，披露了将PSP毒素用作戒毒药。该文献中通过小鼠竖尾试验、小鼠跳跃反应试验、依赖吗啡大鼠的体重减重替代试验、猴成瘾性试验、依赖吗啡、可卡因的小鼠治疗脱毒试验证明PSP毒素无药物依赖性；并将PSP毒素用于戒除阿片、海洛因、吗啡、哌替啶等成瘾性药品的药物依赖性，临床呈现良好效果，在严格规定的剂量范围内，毒、副作用小。此外，还有报道认为，PSP毒素对心血管有降压作用，对肌肉有松弛作用。但至今还未见有将PSP毒素用作镇痛剂的报道。
疼痛是作为炎症、缺血、机械及其它刺激导致的实际的或潜在的伤害或组织损伤的指示现象。疼痛与人类起源几乎同时发生，但至今仍是未能完全解释之谜。自古至今，人们应用了许多减轻疼痛的方法，从应用抚摩、按压、揉擦等初级原始的方法，到使用温泉、热敷，再到使用天然草药外敷镇痛。目前对疼痛的治疗包括使用阻断神经传导，并影响疼痛感的局麻剂和缓解疼痛并可能附带干扰炎症化学信使活性的镇痛药。但是，不可否认仍有一些顽固性疼痛，如癌性痛、神经痛等，即使通过手术方法或内科服药，也不能完全见效。如晚期癌症疼痛，常采用阿片类镇痛药来镇痛，但很容易上瘾，产生耐药性，并伴随便秘、恶心、呕吐等副作用。虽然也有将局部麻醉剂用来减轻疼痛的报道，但因其作用持续时间短，需要经常给药而且毒副作用大等，效果通常不佳。
(三)技术方案：
本发明旨在于克服已有镇痛药(如哌替啶)持续时间不长、容易上瘾等不足，寻找一种疗效高、作用持续时间长的镇痛药物。本发明拟开发含有PSP毒素与镇痛药联合，或与药学上允许的物质形成的组合物。经研究发现，PSP毒素可以单独使用，且镇痛作用强度大，作用持续时间长；还可与镇痛药联合使用，可以延长镇痛作用持续时间，通过降低药物使用量而减少毒副作用。
本发明研究的麻痹性贝毒(PSP)毒素作为制备疗治疼痛病症药物的应用是将20多种该PSP毒素中选择了以下五类，包括有：(一)氨基甲酸酯类毒素(carbamatetoxins)；(二)N-磺酰氨甲酰基类毒素(N-sulfocarbamoyl toxins)；(三)脱氨甲酰基类毒素(decarbamoyl toxins)；(四)脱氧脱氨甲酰基类毒素(deoxydecarbamoyltoxins)；(五)氨基甲酸酯类的N-羟基衍生物(N-hydroxycarbamoyl derivatives)，其中选择一类或几类。
本麻痹性贝毒(PSP)毒素作为制备疗治疼痛病症药物的应用，所述的(一)氨基甲酸酯类毒素(carbamate toxins)，其包括：(1)石房蛤毒素(STX)，(2)新石房蛤毒素(neoSTX)，(3)膝沟藻毒素1(GTX1)，(4)膝沟藻毒素2(GTX2)，(5)膝沟藻毒素3(GTX3)，(6)膝沟藻毒素4(GTX4)；其中选择一种或几种；
所述的(二)N-磺酰氨甲酰基类毒素(N-sulfocarbamoyl toxins)，其包括：(1)膝沟藻毒素5(GTX5)，(2)膝沟藻毒素6(GTX6)，(3)21-N-磺酰氨甲酰基毒素1(C1)，(4)21-N-磺酰氨甲酰基毒素2(C2)，(5)21-N-磺酰氨甲酰基毒素3(C3)，(6)21-N-磺酰氨甲酰基毒素4(C4)；
所述的(三)脱氨甲酰基类毒素(decarbamoyl toxins)，其包括：(1)脱氨甲酰基石房蛤毒素(dcSTX)，(2)脱氨甲酰基新石房蛤毒素(dcneoSTX)，(3)脱氨甲酰基膝沟藻毒素1(dcGTX1)，(4)脱氨甲酰基膝沟藻毒素2(dcGTX2)，(5)脱氨甲酰基膝沟藻毒素3(dcGTX3)，(6)脱氨甲酰基膝沟藻毒素4(dcGTX4)；
所述的(四)脱氧脱氨甲酰基类毒素(deoxydecarbamoyl toxins)，包括：(1)脱氧脱氨甲酰基石房蛤毒素(doSTX)，(2)脱氧脱氨甲酰基膝沟藻毒素2(doGTX2)，(3)脱氧脱氨甲酰基膝沟藻毒素3(doGTX3)；
所述的(五)氨基甲酸酯类的N-羟基衍生物(N-hydroxycarbamoyl derivatives)，其包括：(1)21-N-羟基石房蛤毒素(hySTX)，(2)21-N-羟基新石房蛤毒素(hyneoSTX)。
本麻痹性贝毒(PSP)毒素作为制备疗治疼痛病症药物的应用，所述的(一)氨基甲酸酯类毒素(carbamate toxins)，其中的(1)石房蛤毒素(STX)，(2)新石房蛤毒素(neoSTX)的应用范围在：0.01-10μg/kg；(3)膝沟藻毒素1(GTX1)，(6)膝沟藻毒素4(GTX4)的应用范围在；0.01-15μg/kg；(4)膝沟藻毒素2(GTX2)，(5)膝沟藻毒素3(GTX3)的应用范围在：0.01-20μg/kg。
本麻痹性贝毒(PSP)毒素作为制备疗治疼痛病症药物的应用，所述的(二)N-磺酰氨甲酰基类毒素(N-sulfocarbamoyl toxins)，其中的
(1)膝沟藻毒素5(GTX5)，
(2)膝沟藻毒素6(GTX6)，
(3)21-N-磺酰氨甲酰基毒素1(C1)，
(4)21-N-磺酰氨甲酰基毒素2(C2)的应用范围都在：0.1-100.0μg/kg。
本麻痹性贝毒(PSP)毒素作为制备疗治疼痛病症药物的应用，所述的(三)脱氨甲酰基类毒素(decarbamoyl toxins)，其中的
(1)脱氨甲酰基石房蛤毒素(dcSTX)，
(2)脱氨甲酰基新石房蛤毒素(dcneoSTX)，
(3)脱氨甲酰基膝沟藻毒素1(dcGTX1)，
(6)脱氨甲酰基膝沟藻毒素4(dcGTX4)的应用范围都在：0.02-20μg/kg；
(4)脱氨甲酰基膝沟藻毒素2(dcGTX2)，
(5)脱氨甲酰基膝沟藻毒素3(dcGTX3)的应用范围都在：0.05-50μg/kg。
本麻痹性贝毒(PSP)毒素作为制备疗治疼痛病症药物的应用，所述的(一)氨基甲酸酯类毒素(carbamate toxins)；(二)N-磺酰氨甲酰基类毒素(N-sulfocarbamoyltoxins)；(三)脱氨甲酰基类毒素(decarbamoyl toxins)；(四)脱氧脱氨甲酰基类毒素(deoxydecarbamoyl toxins)；(五)氨基甲酸酯类的N-羟基衍生物(N-hydroxycarbamoyl derivatives)，其中选择一类或几类，或/和其中的一种或几种还可以与麻醉性镇痛药物联合应用；
其中麻醉性镇痛药物有：吗啡、可待因、哌替啶、安那度、芬太尼、美沙酮、喷他佐辛、二氢埃托啡、曲马朵、强痛定、延胡索乙素、罗通定、纳洛酮、纳曲酮，选取其中的一种或几种与上述(一)——(五)类毒素中的一类或几类，或/和一种或几种相混合而组成组合物。
本麻痹性贝毒(PSP)毒素作为制备疗治疼痛病症药物的应用，所述的(一)氨基甲酸酯类毒素(carbamate toxins)，其中优选的(4)膝沟藻毒素2(GTX2)，(5)膝沟藻毒素3(GTX3)与镇痛药物联合应用的配合比例为：(重量比)
PSP毒素品名： 镇痛药物药品名：
膝沟藻毒素2(GTX2)
或膝沟藻毒素3(GTX3)：1.0-7.5μg/kg， 哌替啶：1-20mg/kg。
本发明的麻痹性贝毒(PSP)毒素作为制备疗治疼痛病症药物的应用，可以按有效剂量与药物学上可接受的载体、赋形剂、辅料、稀释剂、缓释剂、控释剂混合形成组合物，用于制备镇痛剂。
本麻痹性贝毒(PSP)毒素作为制备疗治疼痛病症药物的应用，可根据现有技术制成各种剂型，如制成注射剂，包括皮下、肌肉、静脉注射以及口服剂，包括舌下含服剂和通过呼吸道吸入剂，包括气雾剂和微胶囊剂等。但口服的有效剂量要高于注射和吸入的有效剂量，前者约为后者的5-100倍，故优选注射剂。本发明研究还发现可以通过将该PSP毒素和镇痛药溶解在一起的方式或分开的方式。
本发明的PSP毒素作为治疗疼痛病症药物经临床试验应用证明：确实能抑制疼痛，作用强度大，作用持续时间长。该PSP毒素与镇痛药联合应用，可延长镇痛作用持续时间，降低镇痛药的用量，从而降低镇痛药的毒副作用。
(四)实施例及其附图：
本发明的实施例结合附图说明如下。
本发明的保护范围不仅局限于下述实施例。
图1为：PSP毒素对小鼠运动神经末梢钠流的可逆性抑制；
图2为：PSP毒素对NG108-15细胞钠流的可逆性抑制；
图3为：痛阈随药后时间的变化
实施例1
本实施例测定PSP毒素对小鼠运动神经末梢和NG108-15细胞的钠流和钾流的作用。
(1)材料和方法
1.1 PSP毒素对小鼠运动神经末梢钠流的影响
样品溶液配制：用0.1mol/L的盐酸溶液将PSP毒素配成230nmol/L的样品。
1.1.1样本的制备及保养
实验在成年小鼠(昆明小鼠，体重18-20g，雌雄皆用)的离体肋间神经胸三角肌标本上进行。标本按McArdle等(Mcardle，J.J.et al.，J.Neurosci.Methods.，1981，4：109-115.)方法制备，由通气(95％O2和5％CO2的混合气体)的改良Krebs标准溶液持续灌流，灌流速度为2-4ml/min。标准溶液组成为(mmol/L)：NaCl138；KCl5；CaCl22；MgCl21；NaH2PO41；NaHCO312；glucose 10，pH7.2-7.4。为防止肌肉收缩，在整个实验过程中，灌流液始终保持一定浓度(50-100μmol/L)的筒箭毒。该浓度范围内，筒箭毒对钠、钾流均不产生可见影响。实验在室温(18-25℃)条件下进行。
1.1.2末梢膜电流的诱发和记录
用一自制的玻璃毛细管吸附电极刺激肋间神经，参数为波宽100μs阈上刺激，频率一般为0.1Hz(除非特别指明)。记录电极系用GG-17硬质玻璃管拉制的玻璃微电极，内充灌1mol/L NaCl溶液，电阻在5-10MΩ间，用Ag/AgCl丝引导，参考电极为嵌入标本槽内的Ag/AgCl片，借助手水浸物镜(×40，Zeiss)，在放大400倍的Zeiss显微镜下，将记录电极插至表层细神经束近终板的神经周膜下间隙。记录到的神经周膜下信号(perineurial signal)经微电极放大器(MEZ-8201 Nikon-kohden，Tokyo)，一路显示于双线记忆示波器(Tektronix 5113A)，另一路经AD/DA转换板(Digidata 1200，Axon)由计算机采样存储信号，用Axoscope，CoralDraw 8.0软件绘图。
1.2PSP毒素对NG108-15细胞的钠流和钾流的作用
1.2.1 NG108-15细胞的培养
NG108-15细胞由日本国生理学研究所惠赠。维持细胞于分裂生长状态的标准培养液为含10％小牛血清、100μmol/Lhypoxanthine、1μmol/Laminopterin、16μmol/Lthymidine的DMEM溶液，维持细胞于分裂生长状态。将细胞接种于细胞培养瓶中，在37℃的5％CO2、95％空气细胞培养箱中培养，每隔2-3天换一次培养液。待培养瓶中的细胞长满后，便可用于传代或分化。在标准培养液的基础上，将小牛血清的浓度降为5％，并增加1 mmol/L dEcAMP(N6O2-dibutyryl adenosine 3’，5-cyclic monophosphate)于培养液中，促使细胞分化，将用于分化的细胞按1-4×104细胞/培养皿的密度接种于35mm塑料培养皿中，在37℃的5％CO2、95％空气细胞培养箱中培养，每隔2-3天换一次培养液。通常用于实验的是分化了5-9天的细胞。
1.2.2全细胞记录
实验在全细胞电压箝下进行。实验系统由倒置相差显微镜、微操纵器、灌流系统、电脑、A/D、D/A数据输入/输出系统(Scientific Solutions，Inc.)、膜片箝放大器(CBZ2300 Nikon-kohden，Tokyo)等组成，所有实验在pClamp 5.51控制下进行。
灌流系统为自制的Y型灌流装置，Y型管的一个端口为直径约100μm的塑料毛细管，Y型管的另两个端口，一个浸在烧杯中的灌流溶液中，另一个联通一阀门控制的负压瓶。打开阀门可更换Y型管中的溶液，灌流液靠溶液的位差从毛细管中涌出，流速约为0.2ml/min。用于实验的玻璃微电极由上海生理所生产的外径为1.5mm的料玻璃微电极毛坯经NARISHIGE PP-83电极拉制器两次拉制而成，以高钾为电极内液后，电极阻抗为2-5MΩ。
实验在室温(18-25℃)下进行，将记录槽固定于倒置相差显微镜的平台上，在标准的细胞外液灌流下，使灌有电极内液的电极与细胞表面接触、轻吸，使电极与细胞膜形成高阻抗封接，再吸，将细胞膜吸破，形成全细胞记录模式。观察钠流和钾流，使用高钾电极内液(mmol/L KCl5；NaCl145；MgCl20.8；CaCl21.8；glucose 30；HEPES 20)。实验在pClamp 5.51程序控制下，通过计算机控制膜片箝放大器将细胞箝位于实验所需的箝位电压(holding potential)，给予细胞以所需的测试电压(testing potential)，可观察测试电压诱发的细胞跨膜电流。
(2)结果
2.1可逆性地抑制小鼠运动神经末梢的钠流
当在Krebs溶液中记录到双负峰信号并等信号稳定后，用含50μl/10ml Krebs液的PSP粗毒素(浓度为1.18nmol/L STXeq)和STX标准毒素(浓度为3.94nmol/L)分别灌流标本，都发现记录的波形有明显变化，第一个负峰明显降低，表明钠电流被明显抑制。两样品的作用是可逆的，用不含样品的溶液冲洗，抑制可以被部分解除，信号逐渐有所恢复。
用STX标准毒素(浓度为3.94nmol/L)灌流标本，在2分钟内记录的波形有明显变化，第一个负峰明显降低，表明钠电流被明显抑制(图1 Sample A 2min)，第二个负峰也明显降低，表明钾电流也被明显抑制。立即用Krebs标准溶液冲洗15分钟，抑制可以被部分解除，信号逐渐有所恢复(图1 Wash 15min)。用PSP粗毒素(浓度为1.18nmol/L STXeq)灌流标本，在2分钟内记录的波形有明显变化，第一个负峰明显降低，表明钠电流被明显抑制(图1 Sample B 2min)，第二个负峰也明显降低，表明钾电流也被明显抑制；在6分钟内记录的第一个负峰已很低，表明钠电流已大部分被抑制(图1 Sample B 6min)；在7分钟(图1 Sample B 7min)、8分钟(图1 Sample B 8min)钠电流已逐渐被完全抑制。相应于2、6、7、8分钟钠电流受到的抑制，钾电流受到的抑制幅度也越来越大，直至完全受抑制。
2.2可逆性地抑制NG108-15细胞的钠流
在得到全细胞记录构型后，用标准细胞外液持续灌流细胞，然后用含200μl/10ml细胞外液的PSP粗毒素(浓度为4.70nmol/L STXeq)和STX标准毒素(浓度为15.74nmol/L)分别灌流细胞，均观察到细胞的钠电流明显被抑制，而钾电流的变化不大。这种抑制作用是可逆的，用不含样品的溶液灌流可以观察到钠电流有所恢复。图2记录了用STX标准溶液灌流细胞的一例结果。用STX标准毒素(浓度为15.74nmol/L)灌流细胞，观察到细胞的钠电流明显被抑制，而钾电流的变化不大。用不含样品的溶液灌流可以观察到钠电流有所恢复。
(3)结论
PSP毒素能可逆性地抑制小鼠运动神经末梢和NG108-15细胞的钠流。
实施例2
本实施例采用小鼠扭体试验来测定PSP毒素的镇痛效果。
(1).材料和方法
阿斯匹林肠溶片，0.3g/片，批号9804292，江苏淮阴制药厂生产。昆明种小鼠，清洁级，由青岛市实验动物和动物实验中心提供，动物生产合格证：鲁动质字970209号。
样品溶液配制：取PSP毒素样品(26μg STX equivalent/ml)适量，用蒸馏水配成3.2μg STX equivalent/ml、1.6μg STX equivalent/ml、0.4μg STX equivalent/ml、0.2μg STX equivalent/ml和0.1μg STX equivalent/ml的溶液，分别用于PSP毒素80μg STX equivalent/kg组、40μg STX equivalent/kg组、10μg STX equivalent/kg组、5μg STX equivalent/kg组和2.5μg STX equivalent/kg组。
溶媒溶液配制：取溶媒1ml，加蒸馏水64ml，用于阴性对照组。
阿司匹林溶液配制：取阿斯匹林肠溶片适量按阿司匹林含量用蒸馏水配成8mg/ml的溶液，用于阳性对照组。
取18-22g小鼠870只，随机分为PSP毒素80μg STX equivalent/kg组、40μgSTX equivalent/kg组、10μg STX equivalent/kg组、5μg STX equivalent/kg组和2.5μgSTX equivalent/kg组、阳性对照组(阿斯匹林0.2g/kg)、阴性对照组(溶媒)、空白对照组(生理盐水)共8组。药物各组分分别用PSP毒素80μg STXequivalent/kg组、40μg STX equivalent/kg组、10μg STX equivalent/kg组、5μg STXequivalent/kg组和2.5μg STX equivalent/kg组给予小鼠灌胃，阳性对照组用阿司匹林按200mg/kg给予小鼠灌胃，阴性对照组用所配溶媒溶液按25ml/kg给予小鼠灌胃，空白对照组用生理盐水按25ml/kg给予小鼠灌胃，于给药后30分钟腹腔注射0.6％冰醋酸0.2ml/只。观察15分钟内动物扭体次数。
(2).结果：见表3。
表3 PSP毒素对小鼠的镇痛作用(扭体法)
动物数 扭体次数
组别 P
(只) (％±SD)
空白对照组 10 53.1±11.9
阴性对照组 10 50.8±10.1
阳性对照组 10 22.2±8.8 ＜0.01
PSP毒素
80μg STX equivalent/kg组 10 26.0±4.7 ＜0.01
40μg STX equivalent/kg组 10 26.6±6.4 ＜0.01
10μg STX equivalent/kg组 10 35.6±8.8 ＜0.01
5μg STX equivalent/kg组 10 39.3±6.3 ＜0.01
2.5μg STX equivalent/kg组 10 45.7±12.6 ＞0.05
t检验：各试验组与阴性对照组比较
(3).结论
根据实验结果的统计分析，PSP毒素按剂量5μg STX equivalent/kg给予小鼠灌胃时，即可显著减少由醋酸引起的小鼠疼痛反应次数，具有明显的镇痛作用。
实施例3
本实施例采用小鼠热板试验来测定镇痛效果。
(1).方法
筛选：取19-21g体重雌性小鼠若干只，放于事先加热到55℃的烧杯内，用秒表记录自小鼠投入至出现舔后足的反应时间(潜伏期)，以此作为痛阈指标，将反应过于敏感、迟钝或喜跳者剔除，反应潜伏期在10-30s范围内的小鼠用于实验。
分组：将经筛选合格的小鼠72只按体重随机均分八组：0.1mol/L乙酸溶媒阴性对照组、根据预实验结果确定的GTX2，3高剂量(7.49μg STX equivalent/kg)、中剂量(5.99μg STX equivalent/kg)和低剂量(4.79μg STX equivalent/kg)三试药组、盐酸哌替啶高剂量(10mg/kg)和低剂量(5mg/kg)两阳性对照组、及低剂量GTX2，3(4.79μg STX equivalent/kg)+低剂量盐酸哌替啶(5mg/kg)(联合用药低剂量组)、低剂量GTX2，3(4.79μg STX equivalent/kg)+高剂量盐酸哌替啶(10mg/kg)(联合用药高剂量组)两联合用药组。
各组均i.m给予相应药物，依上述方法于药前、药后不同时间测反应潜伏期。
统计方法：用t检验进行给药前后的自身比较和各组间比较。
(2).结果：GTX2，3有一定的镇痛作用，且与盐酸哌替啶联合应用，具有镇痛协同作用。见图3和表4。
表4 GTX2，3对小鼠的镇痛作用
药前痛阈值 药后痛阈时(s)
组别 (s) 5’ 10’ 15’ 20’ 30’ 40’ 60’ 90’ 120’ 150’ 180’ 210’ 240’
阴性对照组 mol/L乙酸
0.1 20.30 21.89 22.67 20.89 20.56 18.78 22.11 21.11 21.22 23.44 21.56 22.32 21.00 21.22
±4.95 ±6.41 ±6.73 ±7.74 ±7.54 ±5.19 ±7.79 ±9.17 ±6.32 ±6.17 ±3.54 ±5.98 ±5.24 ±5.49
哌替啶 mg/kg
10 23.22 53.22 48.11 45.44 42.00 39.44 27.30 27.40 25.20
±3.63 ±8.29** ±12.63**±13.60**±13.57**±16.50**±14.9 ±13.80 ±4.89
5 22.00 25.00 27.11 24.33 25.33 25.78 25.11 25.22 22.44
±5.05 ±6.80 ±9.29 ±7.21 ±6.65 ±10.44 ±5.25 ±3.49 ±5.81
GTX2，3 μg STX equivalent/kg
7.49 20.56 41.56 55.44 57.67 59.56 59.67 ＞60** 59.11 55.67 47.11 43.67 35.78 22.00
±3.39 ±13.99**±9.21** ±4.95** ±1.33** ±1.00** ±2.67** ±11.25**±16.37** ±16.36**±15.93**±2.52*
5.99 21.78 39.33 50.78 55.22 57.00 52.00 47.56 35.22 36.56 35.56 25.33
±4.79 ±14.59**±11.74**±6.53** ±7.31** ±10.34**±12.77**±13.83**±15.07** ±14.22* ±6.30
4.79 21.56 25.22 31.67 26.78 30.11 31.89 30.89 24.22 23.67
±6.29 ±6.50 ±10.51* ±8.79 ±9.35* ±8.02** ±10.97 ±4.92 ±4.69
联合用药
高剂量 23.44 43.67 49.00 55.33 56.67 58.00 55.11 44.89 39.22 39.11 35.78
±3.78 ±16.03** ±13.51**±9.59** ±6.73** ±3.50** ±10.02**±12.81**±12.33** ±13.04**±14.45**
低剂量 20.00 31.78 35.78 38.56 35.22 33.67 31.33 23.78 23.00
±5.24 ±10.86* ±12.01**±10.99**±12.16**±9.73** ±9.67* ±5.91 ±4.61
* ** 与阴性对照组比较p＜0.05 p＜0.01
从起效时间看，除盐酸哌替啶低剂量组作用不明显和GTX2，3低剂量组10min起效外，其它各给药组均于药后5min起效，此时的作用强度由强到弱依次为：盐酸哌替啶高剂量(10mg/kg)的痛阈时最高，即反应潜伏期最长，为53.22秒；联合用药高剂量、GTX2，3高剂量、中剂量、联合用药低剂量，痛阈时分别为43.67秒、41.56秒、39.33秒和31.78秒，与阴性对照组比较均有显著或极显著意义(p＜0.05 orp＜0.01)。
从作用达峰时间看，盐酸哌替啶高剂量组，药后5min时作用最强，其它各用药组在药后15-40min不等。痛阈时达峰值由强到弱依次为：GTX2，3高剂量(60min)、联合用药阳性(58min)、GTX2，3中剂量(57min)、盐酸哌替啶高剂量(53.22min)、联合用药低剂量(38.56min)和GTX2，3低剂量(31.89min)，与阴性对照组最高值比较，均有极显著意义(P＜0.01)。
从作用维持时间看：盐酸哌替啶阳性对照剂量组于药后10min即开始恢复，40min时完全恢复(自身对比)GTX2，3高、中剂量组和联合用药高剂量组动物多数于药后2-3h恢复，少数可延长到4-5.5h，GTX2，3低剂量和联合用药低剂量组动物的痛阈时于药后60min内完全恢复。
总之：无论是从起效时间、作用强度、还是作用维持时间，当单用GTX2，3或盐酸哌替啶或联合用药时，均显示剂量依赖性提前、增强和延长。
值得注意的是，当联合用药后，与单方用药同剂量比较镇痛作用起效时间提前，作用强度增加，作用持续时间延长。且单方药量的降低意味着毒性减小。
实施例4
各种PSP毒素的镇痛效果列于表5。
表5 各种PSP毒素的镇痛效果
| 编号 | 毒素名称 | 剂量μg/kg | 镇痛效果 | 剂量μg/kg | 镇痛效果 | 剂量μg/kg | 镇痛效果 | 剂量μg/kg | 镇痛效果 | 剂量μg/kg | 镇痛效果 |
| 1 | STX | 0.01 | + | 0.1 | + | 0.5 | + | 2 | ++ | 10 | +++ |
| 2 | neoSTX | 0.01 | + | 0.1 | + | 0.5 | + | 2 | ++ | 10 | +++ |
| 3 | GTX1 | 0.01 | + | 0.1 | + | 0.5 | + | 2 | ++ | 15 | +++ |
| 4 | GTX4 | 0.01 | + | 0.1 | + | 0.5 | + | 2 | ++ | 15 | +++ |
| 5 | GTX2 | 0.01 | + | 0.1 | + | 0.5 | + | 2 | ++ | 20 | +++ |
| 6 | GTX3 | 0.01 | + | 0.1 | + | 0.5 | + | 2 | ++ | 20 | +++ |
| 7 | GTX5 | 0.1 | + | 1 | + | 10 | + | 50 | ++ | 100 | +++ |
| 8 | GTX6 | 0.1 | + | 1 | + | 10 | + | 50 | ++ | 100 | +++ |
| 9 | C1 | 0.1 | + | 1 | + | 10 | + | 50 | ++ | 100 | +++ |
| 10 | C2 | 0.1 | + | 1 | + | 10 | + | 50 | ++ | 100 | +++ |
| 11 | dcSTX | 0.02 | + | 0.1 | + | 0.5 | + | 1 | ++ | 20 | +++ |
| 12 | dcneoSTX | 0.02 | + | 0.1 | + | 0.5 | + | 1 | ++ | 20 | +++ |
| 13 | dcGTX1 | 0.02 | + | 0.1 | + | 0.5 | + | 1 | ++ | 20 | +++ |
| 14 | dcGTX4 | 0.02 | + | 0.1 | + | 0.5 | + | 1 | ++ | 20 | +++ |
| 15 | dcGTX2 | 0.05 | + | 0.1 | + | 1 | + | 10 | ++ | 50 | +++ |
| 16 | dcGTX3 | 0.05 | + | 0.1 | + | 1 | + | 10 | ++ | 50 | +++ |
+、++、+++分别表示镇痛效果弱、中、强。
Claims (11)
1、一种麻痹性贝毒的毒素在制备疗治疼痛病症药物中的应用，其特征在于：该毒素包括有：(一)氨基甲酸酯类毒素，(二)N-磺酰氨甲酰基类毒素，(三)脱氨甲酰基类毒素，(四)脱氧脱氨甲酰基类毒素，(五)氨基甲酸酯类的N-羟基衍生物；其中选择一类或几类。
2、一种麻痹性贝毒毒素在制备疗治疼痛病症药物中的应用，该毒素包括有：(一)氨基甲酸酯类毒素，其特征在于：还包括有：(二)N-磺酰氨甲酰基类毒素，(三)脱氨甲酰基类毒素，(四)脱氧脱氨甲酰基类毒素，(五)氨基甲酸酯类的N-羟基衍生物；其中选择一类或几类。
3、根据权利要求1或2所述麻痹性贝毒毒素在制备疗治疼痛病症药物中的应用，其特征在于：所述的(一)氨基甲酸酯类毒素有：(1)石房蛤毒素，(2)新石房蛤毒素，(3)膝沟藻毒素1，(4)膝沟藻毒素2，(5)膝沟藻毒素3，(6)膝沟藻毒素4。
4、根据权利要求1或2所述麻痹性贝毒毒素在制备疗治疼痛病症药物中的应用，其特征在于：所述的(二)N-磺酰氨甲酰基类毒素，其包括：(1)膝沟藻毒素5，(2)膝沟藻毒素6，(3)21-N-磺酰氨甲酰基毒素1，(4)21-N-磺酰氨甲酰基毒素2，(5)21-N-磺酰氨甲酰基毒素3，(6)21-N-磺酰氨甲酰基毒素4；其中选择一种或几种。
5、根据权利要求1或2所述麻痹性贝毒毒素在制备疗治疼痛病症药物中的应用，其特征在于：所述的(三)脱氨甲酰基类毒素，其包括：(1)脱氨甲酰基石房蛤毒素，(2)脱氨甲酰基新石房蛤毒素，(3)脱氨甲酰基膝沟藻毒素1，(4)脱氨甲酰基膝沟藻毒素2，(5)脱氨甲酰基膝沟藻毒素3，(6)脱氨甲酰基膝沟藻毒素4；其中选择一种或几种。
6、根据权利要求1或2所述麻痹性贝毒毒素在制备疗治疼痛病症药物中的应用，其特征在于：所述的(四)脱氧脱氨甲酰基类毒素，其包括：(1)脱氧脱氨甲酰基石房蛤毒素，(2)脱氧脱氨甲酰基膝沟藻毒素2，(3)脱氧脱氨甲酰基膝沟藻毒素3；其中选择一种或几种。
7、根据权利要求1或2所述麻痹性贝毒毒素在制备疗治疼痛病症药物中的应用，其特征在于：所述的(五)氨基甲酸酯类的N-羟基衍生物，其为：N-羟基新石房蛤毒素。
8、根据权利要求1或2所述麻痹性贝毒毒素在制备疗治疼痛病症药物中的应用，其特征在于：所述的(一)氨基甲酸酯类毒素、(二)N-磺酰氨甲酰基类毒素、(三)脱氨甲酰基类毒素、(四)脱氧脱氨甲酰基类毒素、(五)氨基甲酸酯类的N-羟基衍生物，选取其中的一类或几类，和/或其中的一种或几种与麻醉性镇痛药物联合应用。
9、根据权利要求3——7中的任一项所述麻痹性贝毒毒素在制备疗治疼痛病症药物中的应用，其特征在于：所述的(一)氨基甲酸酯类毒素、(二)N-磺酰氨甲酰基类毒素、(三)脱氨甲酰基类毒素、(四)脱氧脱氨甲酰基类毒素、(五)氨基甲酸酯类的N-羟基衍生物，选取其中的一类或几类，和/或其中的一种或几种与麻醉性镇痛药物联合应用。
10、根据权利要求8所述麻痹性贝毒毒素在制备疗治疼痛病症药物中的应用，其特征在于：所述的麻醉性镇痛药物有：吗啡、可待因、哌替啶、安那度、芬太尼、美沙酮、喷他佐辛、二氢埃托啡、曲马朵、强痛定、延胡索乙素、罗通定、纳洛酮、纳曲酮，选取其中的一种或几种与上述(一)——(五)类毒素中一类或几类，和/或其中的一种或几种相混合而组成组合物。
11、根据权利要求9所述麻痹性贝毒毒素在制备疗治疼痛病症药物中的应用，其特征在于：所述的麻醉性镇痛药物有：吗啡、可待因、哌替啶、安那度、芬太尼、美沙酮、喷他佐辛、二氢埃托啡、曲马朵、强痛定、延胡索乙素、罗通定、纳洛酮、纳曲酮，选取其中的一种或几种与上述(一)——(五)类毒素中一类或几类，和/或其中的一种或几种相混合而组成组合物。
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