CN1879888A - 透皮给药增强剂及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于识别具有增强透皮给药能力的多肽的体内噬菌体展示技术。本发明还提供了能够透皮给药增强肽，该多肽能够促进和/或增强任何药物活性制剂或药物的透皮给药。本发明还公开了包含有本发明的透皮给药增强肽的组合物，以及使用透皮给药增强剂以提高药物或者其他药物活性制剂的透皮给药的方法。

Description

透皮给药增强剂及其使用方法

技术领域

本发明主要涉及非扩散的经皮或透皮给药。特别地，本发明是关于一种识别并筛选多肽的方法，该多肽能够增强和/或方便任意治疗性制剂和/或药物的透皮，这些治疗性制剂和/或药物包括任何多肽，蛋白质，多聚核苷酸、寡聚核苷酸(反义寡聚核苷酸制剂)、核酶、双链RNA(dsRNAs)、小干扰RNA(siRNAs)、RNA干扰、基因治疗载体、疫苗和任何常规药物。本发明还涉及增强这些治疗性制剂和药物的经皮或透皮给药的组合物和方法。

背景技术

作为人体最大的器官，皮肤提供了一个无痛并且合适的系统性给药的介体(Prausnitz etal.，2004，Nature Rev.Drug Discov.3：115；Thomas and Finnin，2004，Drug Discov.Today 9：697；and Zaffaroni，1991，Ann.N.Y.Acad.Sci.618：405)。然而，外来的分子，特别是大的亲水分子，通过皮肤的穿透力是非常低的，这主要是由于角质层的阻挡。角质层是皮肤外表面由表皮细胞组成的独特的富脂基质分层结构(Scheuplein and Blank，1971，Physiol.Rev.51：702)。

许多化学渗透增强剂被用来试图打开皮肤屏障，但大多数效果不理想(Williams andBarry，2004，Adv.Drug Deliv.Rev.56：603；Purdon et al.，2004，Crit.Rev.Ther. Drug CarrierSyst.21：97；Kanikkannan et al.，2000，Curr.Med.Chem.7：593；and Finnin and Morgan，1999，J.Pharm.Sci.88：955)。如果没有物理方法的帮助，化学透皮增强剂难以有效地将亲水性药物(特别是分子量＞500Da的药物)透过未破坏的皮肤进入到血液循环，并达到治疗所需的血药水平(Bos and Meinardi，2000，Exp.Dermatol.9：165)。此外现有的化学透皮增强剂容易导致皮肤损伤、发炎、过敏、系统毒性等，在临床上的使用大大受到限制。常用的物理方法有离子电渗(Kalia et al.，2004，Adv.Drug Deliv.Rev.56：619；Hirvonen et al.，1996，Nat.Biotechnol.14：1710)、超声(Lavon and Kost，2004，Drug Discov.Today 9：670；Mitragotri et al.，1995，Science 269：850)、微针(McAllister et al.，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.100：13755；Prausnitz，2004，Adv.Drug Deliv.Rev.56：581)等，已证明对多种药物有增进透皮的效果。但物理方法有许多不足，包括需要特别仪器，成本高，剂型灵活性差，不同程度上有疼痛感，不适合家庭使用等。找到一个新奇的透皮增强物能克服这些限制是具有重大意义的，它能改变透皮给药的现状。

体内噬菌体展示技术的方法已被用来识别并筛选组织和器官的靶向多肽(Pasqualiniand Ruoslahti，1996，Nature 380：364；Arap et al.，1998，Science 279：377；Raffii et al.，2003，Cancer Cell 4：331；Kolonin et al.，2004，Nature Med.10：625)。通常，噬菌体展示技术描述了一种筛选技术，其中有多种(通常＞10⁹)肽或蛋白质表达在噬菌体病毒的外壳上并形成噬菌体文库，噬菌体的遗传物质编码这些多肽或蛋白质的氨基酸残基(Sidhu et al.，2003，Chembiochem.4：14；Ferrer et al.，1999，J.Pept.Res.：54，32；BouHamdan et al.，1998，J.Biol.Chem.273：8009)，从而形成了每个不同的蛋白质序列和编码它的DNA的连接关系。通过体内或体外平板上进行的淘选过程(Whaley et al.，2000，Nature，405，665)，可以快速地找到与某种器官、组织或靶分子(如抗体、酶、细胞表面受体蛋白等)有特异性相互作用的肽或蛋白质。在一个最简单的淘选方式中，将包被了靶向物质的平板(或珠)与噬菌体展示多肽文库一起进行孵育，然后洗去没有结合的噬菌体，并洗脱出特异结合的噬菌体。洗脱出的噬菌体进行扩增，并且通过附加结合/扩增循环，富集沉积池以利于序列结合。在3-4轮筛选后，用DNA测序和ELISA来表征单独的克隆。然而体内噬菌体展示的方法还没有用于筛选有透皮能力的多肽。

已知许多药物分子(Grama and Bouwstra，2002，J.Controlled Release 83：253；Grams etal.，2004，J.Controlled Release 98：367)，微球体(Rolland et al，1993，Pharm.Res.10：1783)和脂质体(Li and Hoffman，1995，Nature Med.1：795；Hoffman，1997，J.Drug Targeting 5：67)可以从毛孔渗入，毛囊逐渐被认为是一个重要的药物透皮通道(Lauer et al.，1995，Pharm.Res.12：179；Agarwal et al.，2000，Methods Find.Exp.Clin.Pharmacol.22：129)。

一类可渗透膜的肽，称为蛋白质转导结构域(PTDs；Joliot and Prochiantz，2004，NatureCell Biol.16：189)，有报道能增进蛋白质和多肽药物分子的表皮输运(Rothbard et al.，2000，Nature Med.6：1253；Schutze-Redelmeier et al.，2004，Vaccine 22：1985；Lopes et al.，2005，Pharm.Res.22：750；Lim et al.，2003，J.Cosmet.Sci.54：483)。然而PTDs只能局部性而不是系统性输运药物，并且需要与被输运药物联系在一起(通常是共价相连)才能达到使药物透过膜或表皮的效果。

因此，很需要开发出新型的能克服上述诸多不足的透皮增强剂，从而有效增强和/或方便药物穿过皮肤，使得进入体循环的药物量增加或者到达靶器官、组织和细胞的药物量增加。此外，新型透皮增强剂应不会导致皮肤损伤、发炎、过敏、系统毒性等，并能用于大分子量药物如多肽、蛋白质和核苷酸的透皮给药。

发明内容

本发明提供了一种方法，通过噬菌体展示文库筛选出具有增强透皮给药能力的多肽。本发明的方法包括如下步骤：(a)在动物或人皮肤上任意区域涂用一个噬菌体展示多肽库；(b)从上述动物或人的循环系统、器官、组织以及细胞中回收噬菌体颗粒；(c)扩增回收的噬菌体用于体内筛选，进行至少两个循环；和(d)随机挑选噬菌体平板、测序，以识别插入的编码表达多肽的核苷酸序列。在一个较佳的实施例中，应用本发明的方法识别出的多肽具有编码一个展示多肽CSSSPSKHC(TD-2，SEQ ID NO：1)的核苷酸序列。携带该展示多肽的噬菌体显示出能持续穿过皮肤屏障并到达血液以及其它组织的能力。

本发明中还提供了多肽及其类似物的化学合成，这些类似物包括体内噬菌体展示技术识别鉴定出的氨基酸序列。包括含有噬菌体展示肽的氨基酸序列的特定多肽及其类似物，显示出增强或方便药物透皮或经皮给药的能力，这些药物包括多肽、蛋白质、多聚核苷酸、寡聚核苷酸(反义寡聚核苷酸制剂)、核酶、双链RNA(dsRNAs)、小干涉RNAs(siRNAs)、基因治疗载体和常规药物。任何本领域的技术人员所熟知的这些多肽或蛋白质的生产技术，包括但不限于通过诸如重组技术等标准的分子生物学技术来表达肽或蛋白质、从自然原料中分离肽或蛋白质、或者化学合成这些肽或蛋白质等，都包括在本发明的保护范围之内。

在一个较佳的实施例中，合成出一个序列为ACSSSPSKHCG(TD-1，SEQ ID NO：2)的多肽。TD-1包括了TD-2的序列，即来源于噬菌体M13外壳蛋白上的TD-2序列加上两个末端氨基酸A和G。在另一个实施例中，TD-1的多肽类似物也被合成出来。这些多肽类似物包括TD-4(ACSSSPSDHCG，SEQ ID NO：3)，它是TD-1的一个单独的氨基酸被替换(K→D)；TD-10(ACSSSSSKHCG，SEQ ID NO：4)有一个在TD-1上的突变点(P→S)和TD-11(SSSPSKH，SEQ ID NO：5)是由TD-1和/或TD-2序列中的7个氨基酸组成。已经证实这些多肽及其类似物具有增强或便于具有代表性的药物的透皮给药功能。在一个较佳的实施例中，本发明证明了TD-1能够提高或便于胰岛素通过毛孔渗透的透皮给药效果。

本发明也提供了编码诸如多肽TD-2(SEQ ID NO：1)、TD-1(SEQ ID NO：2)、TD-10(SEQ ID NO：4)、或者是它们的部分的分离的核苷酸、同系物和类似物，或者在严格条件下杂交为编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或者是它们的部分所示的氨基酸序列的核苷酸序列，都具有透皮给药增强剂的功能。进一步地，本发明还提供了核苷酸、同系物和类似物，包括编码SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4所示氨基酸序列、它们的部分、或者是它们的互补序列的核苷酸序列。

本发明进一步提供了一种透皮给药组合物，包括至少一种可达到治疗疾病有效剂量的药物活性试剂或药物，和至少一种本发明中已识别的透皮给药增强剂。组合物中提供的透皮给药增强剂包括通过体内噬菌体展示识别的氨基酸序列，既可以通过化学合成，也可以用本领域熟知的任何常规方式制备。在一个较佳的实施例中，透皮给药组合物含有一种透皮给药增强剂，所述增强剂具有TD-2(SEQ ID NO：1)，TD-1(SEQ ID NO：2)，TD-10(SEQID NO：4)所示的或其类似物的多肽序列。

本发明的透皮给药组合物可以进一步包含一种或多种药学上可接受的载体或者含有任何可接受的物质的赋形剂，和/或一种或多种本领域熟知的添加剂。本发明的透皮给药组合物也可制成溶液和/或适于局部和/或透皮给药的剂型，和/或透皮贴片方式。

本发明也提供了一种非扩散的方法，用于增强和/或方便一种所需药物活性试剂和/或药物的透皮或者经皮给药。这些方法包括本发明的至少一个透皮给药增强剂与所需用量的至少一种所需的药物活性试剂和/或药物联合给药的步骤。为达到最大透过量，透皮给药增强剂与药物的剂量比例的变化取决于多种因素。在一个特定的较佳实施例中，透皮给药增强剂和药物的剂量比例是1∶1，1.5∶1，2∶1，2.5∶1，3∶1，3.5∶1，4∶1，4.5∶1，5∶1，5.5∶1，6∶1，6.5∶1，7∶1，7.5∶1，8∶1，8.5∶1，9∶1，9.5∶1，10∶1或更大。通过与本发明的透皮给药增强剂联合给药，与没有同透皮给药增强剂联合给药相比，所需活性制剂或药物穿透动物或人的皮肤或者其他身体表面的效果有了极大的增强或便利。在本发明的一个特定实施例中，公开了一种透皮给药组合物，该组合物包括至少一种透皮给药增强剂和至少一种所需的药物活性制剂或药物的混合物溶液，施用于动物预先选好的皮肤表面上。

本发明还提供了一种增强了药物局部给药或者透皮给药的药物给药系统，该药物给药系统包括：(a)至少一个含有一种药物和一种透皮给药增强剂的药库，该透皮给药增强剂的量能够有效增强一定数量的所述药物穿透皮肤或身体表面，以达到治疗效果而不会造成伤害；(b)一个工具，用于维持所述系统中药物和透皮给药增强剂向皮肤或机体表面的输送关系，并且形成机体表面-系统接触面；和(c)一个衬底层，用于在所述工具的使用过程中作为外表面。

通过与本发明的透皮给药增强剂的联合给药，一个很大范围内的药物的透皮给药都可以得到增强和/或变得便利。下面列举了一些实施例。本发明提供了属于能够通过透皮给药方式达到治疗作用的药物，它们能与本发明的透皮增强剂联合给药。

附图说明

图1说明了噬菌体的透皮活性。显示了从每毫升血中回收的噬菌体的平均值和SEM(标准误差)。图1A显示了带有TD-2肽的噬菌体和带有对照肽AP-1的随机噬菌体之间的比较结果。(n＝16.^***，P＜0.001)。图1B显示了TD-1对带有TD-2肽的噬菌体透皮活性的抑制作用。带有展示肽TD-2的噬菌体和不同量的肽之间有局部联合作用。试验中以AP-1为对照(n≥4)。

图2显示了大鼠体内系统的胰岛素透皮给药。图2A显示了¹²⁵I-胰岛素的给药。将¹²⁵I-胰岛素(5,000,000cpm)与不同剂量0，4，8，16微克的TD-1对正常鼠局部联合给药。联合给药后，测量了不同时间点全血的放射量。图2B和2C显示了治疗水平的胰岛素和TD-1的联合给药。猪胰岛素(70μg)分别和500μgTD-1、500μgAP-1、0.5％SLA/PP、或无其他物质对链霉素诱导的糖尿病老鼠进行局部联合给药。附加两组对照样，分别是仅用500μg TD-1局部给药或者皮下注射14μg胰岛素。在给药后的不同时间点，测量血清胰岛素浓度(图2B)和血糖水平(图2C)。血糖水平是与初始水平(0小时)相比而定义的。显示了平均值和SEM(血糖n＝6，胰岛素n≥3)。^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001。图2D和2E是TD-1肽的剂量响应。猪胰岛素(70μg)和不同剂量的TD-1对链霉素诱导的糖尿病老鼠进行局部联合给药。测量了给药前和处理5小时后的血清胰岛素(图2D)和血糖浓度(图2E)。图中显示了平均值和SEM(血糖n＝6，胰岛素n≥3)。图2F和2G显示了胰岛素的剂量响应。TD-1(500μg)和不同剂量的猪胰岛素对链霉素诱导的糖尿病老鼠进行局部联合给药。测量了给药前和处理5小时后的血清胰岛素(图2F)和血糖水平(图2G)。图中显示了平均值和SEM(血糖n＝6，胰岛素n≥3)。

图3显示了人生长激素的透皮给药结果。重组人生长激素(500μg，纯度＞95％)，分别和100μg TD-1，500μg TD-1，100μg AP-1，或者生理盐水对经地塞米松处理的老鼠进行局部联合给药。给药后，用酶联免疫试剂盒来检测不同的时间点血清中生长激素水平。图中显示了平均值和SEM(n≥3)。^*P＜0.05。

图4说明了与TD-1一起局部联合给药能促进阿朴吗啡(APO)的透皮给药。APO(0.8mg/kg)和TD-1(2.0mg/kg)以及AP-1(2.0mg/kg)联合给药。^*P＜0.05^***P＜0.0005(n≥3)。

图5显示了APO和TD-1透皮给药分段分析结果。APO(0.8mg/kg)与TD-1(2.0mg/kg)联合给药。测量下面不同时间间隔APO诱导的阴茎勃起的次数：0-30min，30-60min，60-90min and 90-120min。平均值和SEM如图所示。(n＝32)，^**P＜0.005，^***P＜0.0005。结果表明APO诱导的阴茎勃起大部分是发生在APO透皮给药后的第2个小时内。

图6显示TD-1对APO的剂量响应。APO(0.8mg/kg)分别与剂量为0mg/kg、0.4mg/kg、0.8mg/kg、2.0mg/kg和3.2mg/kg的TD-1联合给药给。测量给药后上述剂量配比下APO诱导的阴茎勃起次数。平均次数和SEM如图所示(n＝32)，^*P＜0.05。

图7表明了APO与TD-1联合给药时的剂量响应。TD-1(0.8mg/kg)分别与不同剂量：0mg/kg、0.08mg/kg、0.2mg/kg、0.4mg/kg、0.8mg/kg和1.6mg/kg的APO联合给药。测量给药后上述剂量配比下APO诱导的阴茎勃起次数。平均值和SEM如图所示(n＝14)，^*P＜0.05。

图8说明了TD-1促进PT-141的透皮给药结果。PT-141(160μg/kg)分别与TD-1(240μg/kg)和AP-1(240μg/kg)联合给药。分别测量在观察的1小时内PT-141诱导的阴茎勃起、追逐和骑跨次数。平均数和SEM如图所示(n＝6)，^*P＜0.001。

图9显示了促进透皮给药的TD-1的序列特异性。TD-1的多肽类似物TD-4、TD-10和TD-11都是用传统的化学方法合成。TD-1(500μg)和它的类似肽TD-4(500μg)、TD-10(500μg)和TD-11(500μg)分别与胰岛素(70μg)共同溶解在100μl生理盐水中联合给药。检测了联合给药前和给药5小时后血清中胰岛素和全血中血糖水平，分别如图9A和9B所示。图中显示了平均值和SEM(血糖水平n＝6，血清胰岛素水平n≥3)。

图10显示了TD-1的随时间衰减的影响，说明了TD-1促进蛋白类药物透皮给药的可能机制。TD-1(500μg)溶解在100μl生理盐水中，局部给药并停留5分钟。然后用过量的生理盐水仔细清洗皮肤。在延迟0分钟，5分钟，15分钟和60分钟后，用猪胰岛素(70μg溶解在100μl生理盐水)处理同样的皮肤区域。检测TD-1处理前和胰岛素给药后5小时的血清中胰岛素水平和全血中血糖水平。以TD-1(500μg)与胰岛素(70μg)联合给药为对照。图中显示了平均值和SEM(血糖n＝6，胰岛素n≥3)。

图11A到11H显示了TD-1促进胰岛素-FITC从毛囊中渗透的情况。一前一后地显示了可见光和荧光显微图。图11A和11E显示了胰岛素-FITC(10μg)和TD-1(100μg)联合给药时的渗透情况。图11B和11F展示的是胰岛素-FITC(10μg)和AP-1(100μg)联合给药时的渗透情况。图11D和11H展示的是胰岛素-FITC(10μg)和0.5％SLA/PP溶解在生理盐水中联合给药时的渗透情况。图11C和11G展示的是胰岛素-FITC(10μg)单独溶解在生理盐水中给药时的渗透情况。图中显示了联合给药两小时后皮肤纵切(图A-D)和横切(图E-H)部分的显微照片。图11I到11L说明了TD-1对胰岛素-FITC从毛孔渗透的随时间衰减的影响。TD-1(100μg)局部给药5分钟，然后用过量的生理盐水清洗。等待一段时间，即0(I)、5(J)、15(K)或60(L)分钟后，再用胰岛素-FITC(10μg)在同样的皮肤位置给药。图中显示了皮肤的横切图。放大倍数为×200。(横杠间隔＝100μm)。

图12显示了胰岛素-FITC从毛孔渗透的情况。胰岛素-FITC(10μg)和TD-1(100μg)在SD-处理后的老鼠的裸露腹部皮肤上联合给药。0分钟(A)、30分钟(B)、60分钟(C)、2小时(D)、5小时(E)和24小时(F)后，用可见光和荧光显微镜观察皮肤横向切片(大约在皮肤表面以下600μm处)。放大倍数为×200。(横杠间隔＝100μm)。

图13显示了用可见光和荧光显微镜观察到的FITC标记的TD-1(TD-1-FITC)从毛囊渗透的情况。A和C分别用皮肤横切和纵切切片显示了TD-1-FITC从毛囊渗透的情况，而B和D分别用皮肤横切和纵切切片显示了对照肽SC-1-FITC从毛囊渗透的情况。

具体实施方式

本发明有以下关于其首选设备的详细描述以及包含在其中的例子作为参考，将更易于理解。然而，在揭露和描述本发明中涉及的多肽、化合物、合成物及方法之前，有必要了解本发明并不仅仅适用于某一种核酸、多肽或蛋白质，也不仅仅只适用于某一种细胞类型、宿主细胞，条件和方法等，当然，照那样的话，可能会有所改变，且此中大量的修改变化将会在此项成熟的艺术中显现出来。另外，也要了解仅用于此处描述专门设备的术语，这些限制并不是有意的。还要了解用在说明和要求中的“一”可以一个或者更多，这取决于用该词的上下文。因此，例如，涉及到的“一个细胞”可以指至少有一个细胞被利用。

本发明描述的是这样一种方法，即应用试管内的噬菌体展示库筛选来识别能提高透皮传输能力的展示肽。正如此处所用，“噬菌体展示库”是指经过基因工程化的噬菌体集合体通过表达一系列的多肽在其表面展示出来。“展示肽”由一个氨基酸连续序列组成，它包括在噬菌体表面展示的蛋白质。而术语“多肽”是指至少由三个氨基酸用肽键连接起来的链，此链可以是线型的，有分支的，环形的或结合物。

本发明也供应增强透皮治疗剂运送的化合物，它包括一种展示肽和与之对应的治疗方法组成。正如此处所用，这些展示肽通常都是由大约3到100个氨基酸残基，应该说是3到20个氨基酸残基，更确切的说是由8到12个氨基酸残基组成。在此，“氨基酸残基”包含任何天然氨基酸，氨基酸衍生物或材料中已知氨基酸的模拟物。因此，噬菌体展示肽包含的氨基酸序列至少含有发现于天然蛋白中的20种氨基酸中的一种，或至少一种修饰过的或材料中已知的特殊氨基酸或以后要得到的氨基酸。

噬菌体库的研究对象是用基因工程的方法表达不同氨基酸的大量展示肽，在使用该对象之后，是收集和鉴定该研究对象中的噬菌体颗粒。此处，“研究对象”是指哺乳动物，如老鼠，兔子，人。噬菌体颗粒通常是从一个或多个器官组织，细胞，血液，尿，或其他各种体液中收集而来，在其中的一个首选方案中，噬菌体颗粒往往从一个或多个器官、组织、细胞、血液、尿液，或其他不同的体液中收集。在其中的一个首选方案中，在动物皮肤噬菌体库的论题制定之后，从血液循环中收集噬菌体颗粒，正是了那些包含多肽的噬菌体颗粒可以穿过动物皮肤进入血液循环系统。

从实验动物身上收集到的噬菌体颗粒表面表达的肽序列，能通过“平板生物技术”分离(Pasqualini and Ruoslahti，1996，Mol Psychiatry.1(6)：423；Pasqualini，1999，J Nucl Med.40(5)：883-8)，即在纤毛阳性菌中，噬菌体颗粒能在生物平板上进行体外繁殖。细菌不会被噬菌体所溶解，反而会分泌多拷贝的噬菌体以展示插入肽。执行多轮的生物倒平板。插入展示肽的氨基酸序列是由噬菌体基因组中插入肽相对应的DNA序列决定。通过标准蛋白化学技术，识别肽可生产成为合成肽(Arap et al.，1998，Science 279(5349)：377-80)。

某些肽库包含编码肽的DNA序列，这些序列被插入到编码噬菌体蛋白质的基因中，其余的肽序列所给的某些部分由20种氨基酸随机组合，另一部分则不是随机组合。此处所描述的能增强透皮给药的多肽的鉴定方法，是指噬菌体展示库的体内分配。以前，体内筛选研究主要是小鼠的随机肽库，它与FUSE5载体中的基因III膜蛋白一起表达为融合蛋白(Pasqualini and Ruoslahti，1996，Mol Psychiatry.1(6)：423)。在已知库中给出的单克隆的数量和多样性对于体内成功筛选是一个有意义的因素。人们都更愿意用初始库，这样更不会表达过多的有缺陷的噬菌体克隆(Koivunen et al.，1999，J Nucl Med.140(5)：883-8)。

在首选方案中，用到了一个Ph.D.^TM-C7C噬菌体展示肽库，该库是新英格兰生物实验室(Mass，MA)提供的预制随机肽库之一。预制随机肽库，即Ph.D.库，已用于无数应用软件，包括抗原决定部位的绘制(Ph.D.^TM-C7C噬菌体展示肽库工具箱[online]，[2005-09-01，重新得到]。重获于网络<URL:http://www.neb.com/nebecomm/products/productE8120.asp>)，蛋白质-蛋白质接触鉴定(Rozinov and Nolan，1998，Chem.Biol.5：713-28)，酶抑制剂(Rodi et al.，1999，J.Mol.Biol.285：197-203)和GroEL GroEL(Kraft etal.，1999，J.Boil.Chem.274：1970-85)，HIV(Koolpe et al.，2002，J.Biol.Chem.277：46974-79；Mummert et al.，2000，J.Exp.Med.192：769-79；Hetian et al.，2002，J.Biol.Chem.277：43137-142；White et al，2001，Hypertension 37：449-55)，半导体表面(Azzazy and Highsmith，2002，Clin.Biochem.35：425-45)和小分子荧光团(Binetruy-Tournaire et al.，2000，EMBO J.19：1525-33)以及药物(Kragler et al.，2000，EMBO J.19：2856-68)肽配基的发现。生物活性受体配基已被平板抗纯化受体(Gazouli et al.，2002，J.Pharmacol.Exp.Ther.303：627-32；Romanczuk et al.，1999，Hum.Gene Ther.10：2615-26；Nicklin et al.，2000，Circulation 102：231-37；Jost et al.，2001，FEBS Lett.489：263-69)和逆完整细胞(Rasmussen et al.，2002，Cancer Gene Ther.9：606-12；Tinoco et al.，2002，J.Biol.Chem.277：36351-356；Stratmann etal.，2002，J.Clin.Microbiol.40：4244-50；Mourez et al.，2001，Nat.Biotechnol.19：958-61)。针对专一细胞型的多肽已被体外倒平板分离，并用于特定细胞基因转运(Rodi et al.，2002，Curr.Opin.Chem.Biol.6：92-96；Lee et al.，2002，Arthritis Rheum.46：2109-20；Duerr et al.，2004，J.Virol.Methods 116：177-80；Parmley et al.，1988，Gene 73：305-18)。孢子模型的配基(Berggard et al.，2002，J.Biol.Chem.277：41954-59)和细菌细胞也被这个系统所识别，包括在体内和体外都可专门抑制炭疽热的肽(Chen and Sigler，1999，Cell 99：757-68)。组织特异性肽已经通过体内平板技术分离了，即将噬菌体注入动物活体，获得的相应器官和从每种组织中分离出来的噬菌体(Biorn et al.，2004，Biochemistry 43：1928-38；Ferrer andHarrison，1999，J.Virol.73：5795-5802)。

Ph.D.-C7C库的随机片断与一对Cys残基侧面相接，它在用二硫键进行噬菌体装配的过程中被氧化，导致展示肽以环状呈现。该库比较复杂，有多达20亿的单克隆，该库中的随机肽序列在小衣壳蛋白PIII的N端表达，结果每个病毒有5个拷贝的展示肽。Ph.D.-C7C库中的第一个随机位置由Ala-Cys领先，该库在展示肽和pIII之间还包含了一个短序列(Gly-Gly-Gly-Ser)(Ph.D.^TM-C7C展示肽库工具箱[online]，[重获于2005-09-01]，获于网络< http://www.neb.com/nebecomm/products/productE8120.asp>)。

在某个配置中，本发明提供了通过小鼠体内噬菌体展示可以增强任何药物和/或药物活性剂的透皮给药的多肽鉴定。在本发明中，其他的哺乳动物包括人类，也可作为体内噬菌体展示的研究对象，在首选配置中，多肽鉴定包括噬菌体展示肽库的应用，如PH.D.^TM-C7C噬菌体展示库，位于小鼠腹部皮肤。噬菌体颗粒在小鼠的血液循环中复原，并通过至少两轮体内筛选扩大。筛选出的噬菌体斑再被随机检出，并测序，以识别首选方案中展示与噬菌体表面的多肽片段的编码核苷酸序列。应该指出的是，这里所用的噬菌体文库能够被用于动物和人的任何皮肤，并且透皮的噬菌体能够从动物或人的身体循环、器官、组织、细胞中重新获得恢复，如果噬菌体能穿越皮肤屏障到达这些组织。在首选方案中，证实了展示肽中包含了CSSSPSKHC(TD-2，SEQ ID NO：1)。在论题制定之后，载有这种肽的噬菌体显示出一直穿过皮肤障碍到达血液的能力。

本发明也提供了通过体内噬菌体展示方法识别的氨基酸序列组成的多肽和类似物。这种肽及类似物显示出提高和/或方便任何药物，包括多肽、蛋白质、多聚核苷酸、寡聚核苷酸(反义寡聚核苷酸制剂)、核酶、双链RNA(dsRNAs)、小干涉RNAs(siRNAs)、RNA干涉、基因治疗载体和常规药物的透皮或经皮转运。在此处，术语“类似物”是指两个有相同或相似功能的氨基酸，但它们是从不同的生物个体中发展而来。术语“类似物”也指不同生物体功能相似的器官或结构而进化起源各异。此外，此处的术语“类似物”还指母体化合物的结构衍生物，它们通常只有单个元素的差异。在这里，“类似物”这个词指的是文章中基于对筛选的透皮肽的任何修改所得到得肽，包括不止是对一个或多个氨基酸侧链的改变，或是一个或多个氨基酸被另外的氨基酸替代。

菌体展示方法鉴定展示肽是以氨基酸序列位基础，任何多肽以及他们的类似物，他们的序列可以通过任何已知的技术合成，但这些技术包括不限制于通过标准分子生物技术的表达重组，常规的肽或蛋白净化和分离方法，或者是化学合成方法。与核苷及多肽的序列相应的多种基因可通过计算机数据库查到，如国际生物技术信息基因银行中心和由基因银行翻译得到的蛋白质序列数据库(国际生物技术信息中心[网上]，.[查看2005-09-01]。也可查看这个网页， URL:http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)。另外，为商业准备的蛋白多肽也可以利用这个技术的得知。

因本发现鉴定的展示肽都相当短，故鉴定的展示肽的插入片段的多肽及其类似物的氨基酸序列可用化学合成法或常规的方法合成。各种自动合成器也可用各种商业用途并与众所周知的草案一致。短的多肽，如6到35或50个氨基酸的多肽，都能用这些方法合成。另外，现在发现的核苷酸编码的蛋白及其类似物用DNA重组技术合成后，能插入表达的载体，并能进入和转染适合的宿主细胞，在适当的培养条件下能表达。

也许可以用模拟肽为多肽和本发明类似物的合成做准备。模拟物是组成肽的分子，这些分子是组成肽二级结构的模拟元素(Johnson等人在1993年生物工艺学和药剂学报道，Pezzuto等人，Eds，Chapman和Hall在纽约也提到)。希望用这个模拟肽分子之间的交互作用类似与普通的分子，并且可以用于产生二级肽分子结构，这些二级肽不仅具有许多正常功能而且还拥有一些改变的甚至是改进的特性。

在一个优化的设备装置中，具有ACSSSPSKHCG(TD-1，SEQ ID NO：2)结构肽的合成依赖与PH-1的序列，与其连接的A和G来源与M13的外壳蛋白。在另一个优化装置中Ttd-1的类似肽也在合成。这些肽包括TD-1有一个单独的氨基酸发生(K--D)的突变从而成为TD-4(ACSSSPSDHCG，SEQ ID NO：3)，TD-10(ACSSSSSKHCG，SEQ ID NO：4)是由TD-1发生一个特有位点的突变(P→S)形成，另外TD-11(SSSPSKH，SEQ ID NO：5)也是由TD-1内部的第七个氨基酸发生突变形成。具有增强或者有利于透过皮肤转运功能的代表肽药物也有提供。

本发明同时提供包含氨基酸序列的融合肽，下面来加以介绍。被用于此的熔接肽包括对应与TD-2(SEQ ID NO：1)，TD-1(SEQ ID NO：2)，TD-10(SEQ ID NO：10)的氨基酸序列，对于全部或者大部分具有二级结构的肽或者蛋白来说，其中的类似物在N或者C终点更有利于连接。在这里二级结构的肽或者蛋白是指具有一定氨基酸序列并且不是完全等同于TD-2(SEQ ID NO：1)，TD-1(SEQ ID NO：2)，TD-10(SEQ ID NO：10)，或者里面的类似物，例如，肽或者蛋白不同于TD-2(SEQ ID NO：1)，TD-1(SEQ ID NO：2)，TD-10(SEQ ID NO：10)，或者说这里的类似物来源于相同的或者不同的生物体。至于熔接肽，实施连接目的是表明组成PH-1(SEQ ID NO：1)，TD-1(SEQ ID NO：2)，TD-10(SEQ IDNO：10)氨基酸，其中的氨基酸以及二级肽和蛋白被一一合成，从而每一个序列都有预期的功能再而形成有用的序列。

例如，融合也许可以利用从其它种类得来的前导序列准许异源宿主中蛋白的重组表达。融合的另一个作用包括免疫活性区的增加，如抗体的抗原决定簇，这有利于融合肽的纯化。在融合连接处或其附近的分裂部位的包含物便于纯化后外来肽的移除。其他的有用融合包括功能区域的连接，如酶的活性部位，糖基化区域，细胞目标信号，或跨膜区域。在首选方案中，本发明中的融合蛋白由肽和/或类似物组成，这些类似物是由从体内噬菌体展示中识别得到的展示肽的氨基酸序列组成，它与治疗蛋白或肽相连接。蛋白或肽的例子可能会将融合肽并入，包括细胞生长抑制蛋白，细胞杀伤蛋白，前细胞凋亡剂，抗血管收缩剂，激素，细胞因子，生长因子，多肽药剂，抗体，Fab片段抗体，抗原，蛋白受体，酶，外源凝集素，MHC蛋白，细胞粘着蛋白和结合蛋白。这些例子并不意味着受限制，我们预想，事实上在本发明的范围内任何蛋白或肽都能并入由本发明中的肽或类似物组成的融合肽。此外，在某些方案中，与没有与肽和类似物相融合的非融合蛋白或肽相比，本发明中的融合蛋白显示出增强透皮渗透的能力，这正如此处所揭露。

在本申请中，合成融合肽/蛋白质的方法对这些技术都是熟悉的。这种肽/蛋白可以被制成，如使用双功能交叉连接试剂的化学联结法，完全混合肽/蛋白的全基因组蛋白合成法，或标准DNA重组技术，它涉及到本发明中的一个DNA序列编码的肽，正如此处所透露，与DNA序列编码的第二个多肽或蛋白质相结合，表达出可用的完整的肽/蛋白。如，编码TD-2(SEQ ID NO：1)，TD-1(SEQ ID NO：2)，TD-10(SEQ ID NO：10)多肽序列的DNA片段，或按传统技术将其类似物联结在一起，如用平端或粘端作为联结的终止点，酶的消化作用可以提供适宜的终止点，适当的填充粘端，碱性磷酸酶处理可以避免不合需求的联结和酶的联结。在另一项配置中，通过传统技术包括DNA自动合成器可以合成融合基因。可作为选择的，基因片段的PCR扩增可以使用引物来进行，那样可引起悬于两段保守及基因片段间的互补，然后经过退火和再扩增产生空想出来的基因序列(如，见于Current Protocols in Molecular Biology，Eds.Ausubel et al.，1992，John Wiley & Sons)。再者，许多表达载体都已用于商业用途，并已经编码了融合部分(如GST polypeptide)。TD-2(SEQID NO：1)，TD-1(SEQ ID NO：2)，TD-10(SEQ ID NO：10)的核苷酸编码肽，或其类似物可被克隆为这样一个载体，即将融合部分与TD-2(SEQ ID NO：1)，TD-1(SEQ ID NO：2)，TD-10(SEQ ID NO：10)编码肽联结，或就是类似物本身。

在一个首选方案中，本发明中的多肽和类似物可被分离或纯化。蛋白质纯化技术在该材料中介绍得十分详细。在同一水平上，这些技术涉及到细胞均质化和初级分馏，组织或器官中的肽和非肽片断。用层析和电泳技术可进一步纯化肽/蛋白质，以达到部分或全部纯化(或同质纯化)。特别适用于预制纯肽分析方法是离子交换层析，凝胶排阻层析，亲和层析，免疫亲和层析和等电聚焦。纯化多肽的一个特效方法是快速蛋白液相色谱(FPLC)或高效液相色谱(HPLC)。

一种纯化的多肽是指从其他组分中分离出来的化合物，肽或蛋白质纯化的程度与其可获得的天然状态有关。肽的分离纯化也指从某天然环境中释放出来，一般说来，“纯化”是指一种多肽组分经过分馏除去其他成分，而且这种多肽能够充分地保持其天然生物活性。此处用到了术语“纯化完全”，这个名称是指这种肽在混合物中在很大比例，如占到约50％，60％，70％，80％，90％，95％，或更多。

对多肽的纯化程度定量的诸多方法已为学术界所知。如，决定活性片段的具体活性，或用SDS/PAGE分析估计片段中的多肽数量。许多适用于肽/蛋白纯化的技术在我们这个领域都是十分成熟的技术。这些包括，硫酸铵沉淀，PEG，相似抗体，或热变性，接下来是：离心；色谱，如离子交换，凝胶过滤，反相，羟基磷灰石和亲和色谱；等电聚焦；凝胶电泳；以及这些技术与其他技术的结合。正如学术界一般所知，大家都相信各种纯化步骤的顺序是可改变的，或某个步骤是可省略的，它依然是制备纯化肽/蛋白的适宜方法。

一般，我们不要求肽和其类似物总是要在纯化状态。事实上，人们都在思考，充分纯化的蛋白产品在某些方案中用得较少。而在重组中通过使用较少的纯化步骤得到的部分纯品就可达到要求，或采用相同纯化方案的不同形式。展示相对而言纯化率较低的方法可能对蛋白产品的总体恢复或保持表达蛋白的活力有利。本发明企图得到由多肽和药物可携带载体组成的合成物。

在某些方案中，本发明的肽和其类似物可能与成像制剂结合，这种制剂含有但不受限于荧光，或/和放射性同位技术结合，它同样包含但不受限于¹²⁵I，这样都可用于成像，诊断和/或治疗目的。许多合适的成像制剂和放射性同位素已为学术界所知，正如使它们联结上多肽的方法。

本发明也通过体内噬菌体展示法鉴定了单核苷酸/核苷，同源物和由编码肽序列的核苷酸序列组成的类似物。在此处，“核苷酸/核苷”可能来源于基因组DNA，互补DNA(cDNA)或合成DNA。术语“核苷酸/核苷”还包括线形或分支形，单链或双链，化学修饰过的RNA/DNA，或RNA/DNA的杂交链。我们预想，在本发明范围内可能由长达3-100或更多的核苷残基组成，确切的说是9-60个核苷残基，更确切的说，是24-36个核苷残基。它需要结合一个表达载体，核苷酸也可能由天然内显子或来源于其他基因的内显子组成。稀有碱基，如肌苷，5-甲基胞嘧啶，6-甲基胞嘧啶，次黄嘌呤等也可用到。

“单”核苷酸分子是指从其他现有的天然核酸分子(如编码其他多肽的序列)中充分分离出来的个体。确切的说，“单”核酸是与复制子中天然核酸侧面相接的一些序列的释放(如，定位于核酸5’和3’末端的序列)。如，一个克隆的核酸被看成是分离出来的。如果一个核酸被人为的选择，或定位于它的非天然部位，或把它通过农杆菌感染法导入细胞，则认为该核苷酸是被分离了。另外，“单”核酸分子，如一个cDNA分子，可以从与它有着天然联系的细胞材料中释放出来，或用重组技术生产的培养基，或化学合成时的化学前体或其他化学物质。

在此处，“同源体”被定义为有相似或完全相同核酸序列或氨基酸序列的两个核酸或肽。更进一步说，术语“同源体”包括由于基因编码退化因此编码相同氨基酸序列而与核苷序列不同的核酸分子。在一个首先方案中，同源物包括等位基因变量，orthologs，paralogs，agonists，和编码TD-2(SEQ ID NO：1)。

在本专利中，这个“orthologs”引用了两个来自不同物种的核苷酸，但是它们又是由同一个古老的基因演化来的物种进化而来的。一般说来orthologs编码的肽能发挥相同或相似的作用。更特别的是专利中的orthologs表达的一般可以展示至少80-85％，更多适宜的是85-90％，或者是90-95％，并且大多适宜在95％，96％，97％，98％，其中99％是一致的，甚至100％顺序是一致的，TD-2(SEQ ID NO：1)，TD-1(SEQ ID NO：2)，TD-10(SEQ IDNO：4)会表达所有的或部分的的氨基酸序列而其中的analogs将会表达这些肽的功能。确切的说，此项发明中的orthologs是透皮增强剂。更确切的说，现在的ortholog能够提高或便于任何药物的透皮。同样的在这里，“paralogs”涉及了两种核苷酸，它们与内部的一个基因组的复制是有关系的。Paralogs通常有不同的功能，但是这些功能是有一定联系的(Tatusov et al.，1997，Science 278(5338)：631-637)。

正如上面规定的，此专利包括TD-2(SEQ ID NO：1)，TD-1(SEQ ID NO：2)，TD-10(SEQ ID NO：4)，和它们的同源体与类似物。为了确定两个氨基酸的序列的同源序列的百分比(例如一个SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、或SEQ ID NO：4的序列和它的一个突变异种)，这些序列排列在一起以便于进行最佳的比较目的(例如能在一段多肽序列中引进一些缺口以和其他的多肽或者核苷酸进行结合)。这时在相应位置上的氨基酸残基片段就能进行对比。当一段序列上的一个氨基酸片段的位置(例如一段序列是SEQ ID NO：1、SEQID NO：2或SEQ ID NO：4)被另一段其它序列中相应位置的相同氨基酸残基占据后(例如一个由多肽序列选择出来的突变异种SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4)，这时在那个位置上的分子就被确定了。同样类型的对比也能在两个核苷酸序列中进行。

两个序列的同一性的百分比能确定序列中的同一位置上的数量(例如序列的相似度＝相似位置的数量/所有的位置的数量×100)。适宜的情况是，本文中包括单独的氨基酸同源体至少在大约50-60％，适宜的至少在大约60-70％，更加适宜的至少在大约70-75％，75-80％，80-85％，85-90％或90-95％，最适宜的至少在大约96％、97％、98％、99％或者在整个SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4序列中展示的氨基酸序列。在其他的具体情况下，同源体的氨基酸序列至少有5个相近的氨基酸片段，更适宜的情况是有8个相近的氨基酸片段，更适宜的情况是在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4序列中有至少11个相近的氨基酸片段。在另外一种具体情况下，氨基酸同族体有至少5，6，7，8，9，10，11邻近的氨基酸残基的序列相似性，更适宜的是8，9，10，11邻近的氨基酸残基的序列相似，最好是11邻近的氨基酸残基的序列相似，这些氨基酸残基是SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中的序列。

在另外一个首选的具体情况下，本专利中一个单独的核苷酸同源体包含了一个核苷序列，这个核苷序列至少有大约在40-60％，适宜的至少大约在60-70％，更适宜的至少大约在70-75％，75-80％，80-85％，85-90％或90-95％，甚至有些至少在大约95％、96％、97％、98％、99％或者更多的核苷序列编码的氨基酸序列，它们是在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中的。

本专利中编码氨基酸序列TD-2、TD-1或TD-10的单独氨基酸的同源体在SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中展示出来了，分别地，它的一部分，至少有90％，更适宜的是，和SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的氨基酸序列有大约95％相同，它们的作用是作为透皮增强剂。

两个核苷酸序列或者多肽序列的相似百分比在本文章中都是已表明。例如，Vector NTI6.0(PC)软件包(InforMax，7600 Wisconsin Ave.，Bethesda，MD 20814)可以用来确定两个核苷酸或者多肽序列的相似度。在这种方法中，一个15个残基的缺口和一个有6.66的缺口延伸被用来确定两个核苷酸之间的相似度。一个10个氨基酸残基的缺口和一个有0.1的缺口延伸被用来确定两个多肽之间的相似度。所有其他的参数都是默认的设置。对于多重排列来说(Clustal W algorithm)，需要10个氨基的缺口，缺口延伸是0.05with blosum62matrix。当比较一个DNA序列和一个RNA序列的时候，序列相似性的作用就发挥了，胸腺嘧啶核苷相当于一个尿嘧啶核苷。

在另一方面，本专利中提供了一个单独的的核苷酸与一个核苷序列的比较，此核苷能和SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中的编码氨基酸序列的核苷杂交，并且是分别在剧烈的条件下进行。更显著的是，本专利中一个单独的核苷酸分子要至少有15个核苷的长度，在剧烈条件下和一个核酸分子杂交，此核苷酸分子由SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：4.中编码的氨基酸序列的一个核苷序列组成。在其他的具体情况下，核酸长度至少要有15，18，21，24，30，33，或者更多的核苷。更适宜的是，本专利中的一个单独的核酸同源体由一个核苷序列组成，次核苷序列时在剧烈条件下与SEQ ID NO：1、SEQID NO：2或SEQ ID NO：4中编码氨基酸序列的核苷进行杂交，其功能是作为透皮增强剂。

在这里，关于DNA杂交形成DNA点，“剧烈条件“这个词涉及在10×Denhart’s溶液，6×SSC，0.5％SDS，和100μg/ml变性salmon sperm DNA中60℃过夜杂交，DNA点不断地在62℃用3×SSC/0.1％SDS每次洗涤30分钟，接着用1×SSC/0.1％SDS洗涤，最后用0.1×SSC/0.1％SDS洗涤。此专利中，在一个具体情况下，“剧烈条件”这个词组涉及65℃在6×SSC溶液中杂交。在另一个条件下，“极度剧烈条件”涉及在10×Denhart’s溶液，6×SSC，0.5％SDS，and 100μg/ml变性salmon sperm DNA中65℃过夜杂交。DNA点不断地在65℃用3×SSC/0.1％SDS每次洗涤30分钟，接着用1×SSC/0.1％SDS洗涤，最后用0.1×SSC/0.1％SDS洗涤。核苷酸杂交的方法在Meinkoth and Wahl，1984，Anal.Biochem.138：267-284；Current Protocols in Molecular Biology，Chapter 2，Ausubel et al.，eds.，Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York，1995；and Tijssen，1993，LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology：Hybridization with Nucleic Acid Probes，Part I，Chapter 2，Elsevier，New York，1993.中有描述。

用以上描述的方法，和文章中其它已知的技术，文章中一个常用的技术分离透皮增强剂的一个同源物，此透皮增强剂由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中展示的氨基酸序列组成。这些同源物的一些是等位基因的变化体。在这里，“等位基因突变体”涉及包含多态性的核苷序列，这些核苷序列不用改变功能活性就能导致SEQ ID NO：1、SEQID NO：2或SEQ ID NO：4中氨基酸序列的改变。这些等位基因突变体可以导致SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4编码的核苷酸中的1-5％变异。

此外，使核苷酸序列中发生突变来进一步鉴定此项技术，这些核苷酸序列编码SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4，或它们的类似物中的氨基酸序列。例如，在非必要的氨基酸残基中，一个序列可以编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4，或它们的类似物中的氨基酸序列，这个序列核苷替代导致的氨基酸的替代。非必要的氨基酸残基可以在不改变它形成的肽的活性的条件下，发生替代或改变。相反，一个“必需”氨基酸残基是这些肽活性所必需的，例如，这些能提高或方便药物透皮的肽。

因此，本专利的另一方面是关于编码透皮增强剂的核酸分子的。透皮增强剂中包含透皮增强活性非必需的氨基酸，这些氨基酸发生变化不会影响其活性。改变SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4，或它们的类似物中的氨基酸序列，可以得到一系列透皮增强肽的衍生物，它们只是有氨基酸序列的差别。然而，改变以后仍有透皮活性的衍生物会在这里阐述。在一项具体的研究中，单独的核酸分子由编码肽的核苷酸序列组成，其中肽由至少与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4，或它们的类似物的氨基酸序列50％相同的氨基酸组成。肽由与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4，或它们的类似物的氨基酸序列至少50％相同是很适宜的。至少有60-70％相似更有效了，70-75％，75-80％，80-85％，85-90％或90-95％相似也更有效，与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4，或它们的类似物的氨基酸序列有96％，97％，98％或99％相同是最有效的。本专利中，透皮增强剂类似物揭示它们也参与透皮给药的增强。

编码透皮增强剂的核苷酸与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4，或它们的类似物的氨基酸序列有序列相似性。通过替代、插入、或删除编码SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2或SEQ ID NO：4，或它们的类似物的肽序列的核苷酸可以产生这些透皮增强剂的衍生物。这些衍生物中，都是一个或更多的氨基酸发生替代、插入、或删除，这些变化引入编码的多肽和(或)氨基酸侧链被替代的多肽。编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQID NO：4，或它们的类似物的肽序列的核苷酸通过常用技术使其发生变异，例如位置变异和PCR介导的变异。一个或多个推测的非必需氨基酸残基中有保守氨基酸的替代。“保守氨基酸替代”是一个氨基酸残基被另一个侧链相似的氨基酸残基替代。

含有相似氨基酸侧链的氨基酸家族在文章中有定义。这些氨基酸家族包括碱性侧链(如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(如，天氡氨酸、谷氨酸)，极性侧链(如，甘氨酸、天氡酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非极性侧链(如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)，β分支侧链(如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)，和芳香族侧链(酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸)。因此，在透皮增强肽中的一个推测的非必需氨基酸残基被相同的侧链家族中的另一个氨基酸残基替代。在另一项具体研究中，透皮增强剂的整个或部分肽序列中随机发生突变，例如浸透突变和合成突变，合成突变通过对增强透皮给药的活性来筛选，鉴定突变体保持提高透皮活性。接下来的编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4中肽序列的核苷酸序列的变异，重组表达的肽和肽活性能通过分析药物透皮活性来确定。

本专利中的核苷可通过很多方法产生，如基因预备，cDNA预备，体外合成，RT-PCR，和体外或体内转录。这些肽包含噬菌体展示的肽，它们的变种和变异，或融合肽/蛋白。编码适当氨基酸序列的核苷酸序列编码这些肽。编码一个需要的氨基酸序列的核苷酸的设计和产生，在文章中是基于标准的密码子的方法来进行。编码每个氨基酸的密码子的筛选可能被改变，使宿主细胞核苷酸的表达最佳化。不同种类的宿主细胞的密码子的参数选择在文章中已提到。

本专利进一步提供了透皮给药合成物使至少一种制剂或药物在有效剂量上有药物疗效，不论是在局部或系统上，并且至少在足够剂量的透皮增强剂可以提高或便于药物制剂和药物经皮肤或人和动物的其它体表给药。如上述，透皮增强剂是体内噬菌体展示得到肽序列组成的合成物。在一个适宜的情况下，透皮给药合成物是由含有TD-2(SEQ ID NO：1)，TD-1(SEQ ID NO：2)，TD-10(SEQ ID NO：4)或它们类似物的肽序列的肽组成。

在这里我们习惯使用一些术语药学活性制剂，治疗制剂，活性制剂，或药物交替的使用指的是化学材料或复合物能够导致理想的药理学与生理学效应和那些治疗效果，预防效果与美容效果制剂。术语也包含可以接受，活性的药理学衍生物和在这里特别提到这些活性制剂的类似物，包括盐类，脂类，胺类，原料药，主动代谢物，复合物的配体，类似物与其它。当我们使用一些术语药学活性制剂，活性制剂，药物，可以被理解为申请者想要包括可以接受，活性的药理学盐类，脂类，胺类，原料药，主动代谢物，复合物，类似物与其它，在这里这些被共同理解为可以接受药理学衍生物。术语活性制剂倾向于指的是那些没有毒性有药学或类似药物的特性的美容活性制剂，当应用于皮肤表面时有益的改善了皮肤的生物学功能。

在这里当我们习惯使用药学活性制剂可以是适合局部或透皮释放的一些能够导致理想的局部或系统的效果复合物或传统药物。一些物质包括许多复合物或药物能够正常的通过包括皮肤在内的身体表面和其它膜系统。而令我们感兴趣是活性制剂可以包括更多的种类与可以仿效的得到有趣的种类：老年痴呆药物；止痛制剂如镇静剂；麻醉剂；抗粉刺剂；抗忧虑药；抗风湿药；抗心律失常药；平喘药和其它呼吸系统药物；抗生素包括抗细菌制剂；抗癌制剂，包括抗肿瘤药；副交感神经拮抗剂；抗惊厥药；抗糖尿病药(如胰岛素)；抗痢疾药；止吐药；抗真菌药；青光眼治疗制剂；驱虫药；抗组胺制剂；抗高血脂药；抗高血压药；抗感染药如抗生素和抗病毒药；抗炎药；治疗偏头痛制剂；抗呕吐药；抗肿瘤药，镇静剂；治疗帕金森氏制剂；止氧药；安定药；退热药；抗风湿制剂；抗惊厥药；抗结核药；止吐药；抗溃疡药；抗病毒剂；抗忧虑药；促进饮食药与抑制饮食药；注意力不集中或不高度集中药；良性前列腺肥大药；b受体阻滞药；抗心律失常药；骨密度调制剂；心血管药包括钙离子拮抗剂；中枢神经药；中枢神经药刺激药；降脂药；咳嗽与感冒制剂；包括抗充血药；利尿药；性功能障碍药；脂肪酸；胃肠制剂；基因药物；补血药；止血药；中草药；细胞溶解酶；催眠药；骨钙化不全药；血糖过低药；免疫抑制剂；白三烯抑制剂；有丝分裂抑制剂；肌肉松弛药，抗成瘾药，尼古丁，营养制剂，例如，维生素，微量元素，必需氨基酸和脂肪酸，运动病药，镇痛促进药，副交感神经阻滞药，肽类药物，前列腺素，生理心理制激药，镇静药，复合胺拮抗物，组胺受体拮抗剂与激动剂，类固醇和其他代谢制剂：例如，生衰激素；拟交感神经药；甲状腺素制剂；催产药；催产拮抗药；Tourette’s综合症制剂；镇定剂；血管扩张素包括冠状动脉，外周与脑血管扩张药；疣制剂和其类似物和调节剂/药物。

在这里提到的药学活性制剂也指的是一些寡聚核苷酸(反义核苷酸制剂)多聚核苷酸(如治疗DNA)，核酶、双链RNA(dsRNAs)、小干涉RNAs(siRNAs)、RNA干涉，基因治疗载体，使用的疫苗。术语“反义寡聚核苷酸制剂”指的是短的合成的DNA或RNA片断，通常指的是寡聚核苷酸，特定的mRNA的互补链通过结合到mRNA特定序列阻止目标mRNA的翻译。反义寡聚核苷酸用于反义技术的使用与发展。术语“反义技术”药物的发现与建立技术涉及到设计与使用目标mRNA的互补链抑制特异的疾病蛋白质的产生。事实上所有的疾病与蛋白质产生不足或过量表达有关。传统的小分字药物设计是与疾病相关蛋白相互作用并且抑制其功能，相比而言反义技术设计的药物称谓反义核苷酸在基因水平干涉并且抑制疾病相关蛋白的产生。反义核苷酸制剂建立在基因信息水平。

作为反义核苷酸制的替代，核糖体酶或双链RNA(dsRNA)，干涉RNA(RNAi)和/或小干涉RNA(siRNA)，也能够作为透皮释放的药学活性制剂。在这里提到的术语“核糖体酶”指的是具有核糖核酸酶活性能够分解RNA底物，具有剪切单链核苷酸的能力例如mRNA，核糖体酶能够用来剪切mRNA的转录从而抑制mRNA的翻译。这里提到的术语双链RNA含有两条链的杂和RNA。双链RNA在结构上可以是线形的也可以是环形的，双链RNA可以含有核糖核苷酸，双核糖核苷酸类似物如2’-甲氧核糖核苷酸，或其类似物。术语“干涉RNAi”指的是RNA干涉或转录后基因沉默(PTGS)。术语“小干涉RNA”指的是小的双链RNA分子(例如21-23核苷)是干涉RNA中调节子。干涉RNA被诱导产生通过导入体外转录产生长的双链RNA片断(1-2kb)成功的用于减少许多组织器官的基因表达，在哺乳动物细胞，干涉RNA作为小干涉RNA(例如22个长的核苷酸)结合到RNA诱导的沉默基因复合体(RISC)，因此能够结合任何可以匹备mRNA序列导致了mRNA降解，因而沉默了基因。

在这里提到药学活性制剂也包括基因治疗中使用的载体或病毒。术语“基因治疗”指的是纠正疾病相关缺陷基因的技术。这种技术可以包括插入一个正常基因片断到基因组非特殊位点取代非正常基因；通过同源重组用正常基因交换非正常基因修复非正常基因恢复其功能并且改变或调节基因表达和特别的基因功能。在许多基因治疗中插入正常基因到基因组中取代非正常基因或致病基因。在这里提到的术语“载体/病毒”指的是一个载体分子携带与释放“正常”治疗基因到病人的目标细胞。因为病毒在发病机制上已进化成压缩并释放它们的基因进入人类的细胞，许多普通的基因治疗载体是病毒在遗传上作了改变携带人类DNA。在这里基因治疗病毒/载体包括逆转录酶病毒，腺病毒，腺病毒相关病毒，与单纯疱疹病毒。逆转录酶病毒指的是一类病毒家族从RNA基因组形成双链DNA并且插入宿主染色体中，例如人类免疫缺陷病毒是逆转录酶病毒。腺病毒指的是一类双链DNA病毒家族能够引起人类呼吸道、肠道、眼的感染一类病毒，例如导致普通感冒的是腺病毒。腺病毒相关病毒指的是一类小的、单链DNA病毒它们能够插入遗传物质在19号染色体上。单纯疱疹病毒指的是一类双链DNA病毒家族感染特殊的细胞，神经元细胞。单纯疱疹病毒I是导致疱疹普通人类病原体。

在这里药学活性制剂也指疫苗含有削弱或杀死的微生物(如细菌、病毒等)应用于预防、改善、治疗传染病。在这里提到的“疫苗”产生免疫力防止躯体感染疾病。当前疫苗是通过注射、口服、气雾剂应用。在这里提到的一些普遍应用的疫苗和正在研究范围的疫苗。有趣的疫苗但也不局限于止流感疫苗，甲、乙、丙肝炎病毒疫苗，麻疹—腮腺炎—风疹疫苗，破伤风—白喉疫苗，水痘疫苗，鼠疫疫苗，和其它疫苗。

应用活性制剂也可能是化妆品或美容效果。例如包括一些制剂，复合物减少皮肤化与化学损伤，例如，α-羟自由基，α-酮类，多羟基增湿剂，胶原，海产提取物和抗氧化剂，如抗坏血酸(维生素C)，α-生育酚(维生素E)，β-维生素E，γ-维生素E，δ-维生素E，ε维生素E，θ¹-维生素E，θ²-维生素E，σ-维生素E和视黄醇(维生素A)，和/或可以接受化妆品上的盐类，酯类，氨基化合物类，或其他衍生类似物。另外化妆品制剂包括一些能够提高皮肤组织的供氧。

在这里应用药学活性剂“效应量”或“治疗效应量”术语指的是自己能够提供有效治疗作用但没有毒副作用。特别的活性剂或制剂与其类似物的有效粮食可以刻变得从一个个体到另一个个体，依赖于年龄和个体的一般条件。因此不可能是有详细说明准确的有效量。然而，一个合适的在个体中的有效量是能够被决定常规实验。而且，准确的活性剂效量应结合本发明成分与剂型在这里不评论。只要应用已准备好的溶液或制剂足够的浓度，目的是释放活性剂在有效的范围内。

在这里提到，“足够地增加释放量”术语指的是：无毒性，无损伤，但是足够地增强物能提供理想皮肤通透性和足够透皮深度，应用比率与足够地药物释放，在这里提到“增强皮肤释放”术语，指的是已选择药理学活性剂增加了皮肤或粘膜组织的通透性，因此药物制剂通透皮肤或身体表层屏障的量/率增加相对于在没有适度增强及协助下的量/率。通过使用铜皮增强剂增加药理学活性剂的头皮效果可以通过观察药物通过动物活人皮肤的量或在病历中达到有效的治疗效果。

在这里提到，“预先确定的面积”皮肤或粘膜组织指的是药物增强溶液或制剂通过皮肤或粘膜组织释放的区域。是一个限定的完整的活性皮肤或粘膜组织区。这些区域经常在5-200cm²比在5-100cm²范围更常见，尤其在20-60cm²区。然而，令人感兴趣的是药物通过皮肤或粘膜组织释放区域(面积)显著地改变依赖于贴剂构造，剂量及其他。

在这里提到，“局部应用”术语是传统的认为释放药物或活性制剂到皮肤或粘膜。例如，治疗皮肤失调疾病。一般，局部应用提供了一个局部效应，在这里提到“透皮释放”术语意味着应用药物在屁股或其他身体表面或个体屏障以便药物通过皮肤或其他组织进入到血液循环，因此提供了系统治疗。“透皮”术语也意味着包括“透粘膜”药物应用，如应用药物(如，舌下粘膜，颠粘膜，阴道，直肠粘膜)在个体粘膜表面一边药物通过粘膜组织进入到血循环。

药物活性剂，如果要获得理想的效果，可能是以盐、酯、胺前体，衍生物或其他形式。因此提供盐、酯、胺、前体或衍生物是合适的药理学形式。活性剂盐、酯、胺、前体和其他衍生物可以用标准程序如有机合成和其他描述去准备，例如，March’s高级有机化学反应、机制与结拼，5th ed(Wiley-Inter science，2001)。盐、酯、胺、前体要制剂得到按相关文献描述。

本发明的透皮释放成分是通过简单的在溶液中混合。本发明透皮增强子与其它一些活性药物成分。在这提到溶液是通过溶解一伙多个化学物质(溶质)在另外的液体中形成的均质混和物及溶解的物质分子打散在这些溶剂中。溶液可以含有在制药学上能够被接受的化学成分，如缓冲液，稳定剂或保存溶质，通常在溶液中使用的溶剂有生理盐水，水，乙醇，丙二醇或其他制药学可以接受的载体。尤其是透辟增强剂和活性药物在溶液中按一定比例足够地增强药物透皮达到局部或系统的理想效果。含有透皮增强者与药物的溶液应用在人或动物皮肤或其他表示一定区一段时间后达到足够的理想效果。

本发明的透皮释放成分可以用一些制剂的形式制作适合于局部和/或透皮应用。本发明具体化是含有一个通过身体表面增强药物释放的成分。制剂由下面组成：(a)有效的药物治疗量(b)不损伤皮肤的透皮增强剂能够有效的促进药物通过皮肤表面。本发明合适的制剂也包括药膏，油膏，胶状体，洗液，贴剂和其他膏剂，是常规的一种药理学制剂。半固定制剂基于石油或其他石油衍生物局部应用，特别油膏应用是被认同的方法，提供了一个合适药物释放并且尤其提供其他想得到的特性。例如，皮肤润滑剂与其他。一般，油膏制剂可能有四组：油状的，乳状的，乳剂的和水溶的。油状的油膏包括如：植物油，来源于动物的脂肪，来源于石油半固体碳水化合物。成为乳状油膏被认为是可以吸收的油膏，含有少量的或无水。包括如硬脂酸盐，无水羊毛脂和亲水矿脂。乳状液油膏是水—油乳剂或油—水乳剂，包括如十六(烷)醇，单硬脂酸甘油，羊油脂和硬脂酸。

霜，被认为是粘性液体或半固体乳液，或油—水或水—油。霜剂是可以被水洗掉的，并且含有油相，乳化剂和水相。油相，也叫内在相。一般被认为含有矿脂和脂肪醇，例如十六(烷)基或硬脂酸醇。通常的水相，虽然有时不必要，超过油相在体积方面，一般含有润滑剂。乳化剂在霜制剂中通常是非离子，阴性离子，阳性离子或两性分子。

这些工作在制药学上令人欣赏的是，胶是半固定悬浮性系统。单一的胶含有有机大分子，充分的均以地散布于整个载体溶液，典型的是水溶液。但也有酒精和随机的油。胶凝剂是交联的丙烯酸联合体，例如碳水化合物多聚体家族。碳水化合物多聚亚烃基可以获得通过商业途径。也包括亲水多聚物，例如聚环氧乙烷，多聚氧乙醚多聚体，多聚乙烯醇，纤维素聚合体，羟—丙基—纤维素，羟基纤维素，羟甲基纤维素，丙基甲基纤维素，邻苯二甲酸盐和甲苯纤维素。树脂，例如黄茋胶和黄原树酯，藻酸钠，凝胶是首先胶，目的是准备一致的胶，分散剂如加入乙醇或甘油，或凝胶剂通过研碎，机械搅拌与混合可以扩散。

洗液(洗剂)是优先应用释放化妆品制剂，制剂没有摩擦力应用于皮肤表面，使含有固定的典型半固体或液体制剂，以水或酒精为基质的含有活性成份。洗液通常悬浮固体状含有液油乳状液组成油—水类型。洗液(洗剂)对于治疗大面积区是优先选择制剂，由于他有更多液体成分更容易被应用。一般的是有必要的不溶性物质在洗液中产生于有用的复合物一样更好的扩散效果是活性剂药物更好的在皮肤表面接触与维持，例如甲基维生素，羟甲基纤维素盐，或其他。

贴剂是半固体制剂形式在贴剂中活性成分被悬浮在一个合适的基质中。根据基质的自然特性，贴剂在脂肪贴剂或由单一水凝胶相之间分配。脂肪贴剂的基质是矿脂或亲水性矿脂或其他。由单一水凝胶组成的贴剂通常与羟甲基纤维素结合或其他相结合作为其机制。制剂也可用于脂质体，微体，微球束准备。脂质体是精微的束状结拼，含有油脂质双分子层组成的脂质外壳。在这里可以用来作为药物释放系统，一般，脂质体是优先作为微溶或不溶药物载体。脂质体制剂可以及时地用包括阳离子(正电荷)，阴离子(负电荷)，中性成分来制作。阳离子脂质体与阴离子，中性脂质体一样容易地可用到的来自Avant：polarlipids(Birmingham，Ala)或能够被容易制作使用容易获得的材料，这些材料包括卵磷脂，胆固醇，磷脂酰乙醇胺，二油酸磷脂酰，二油酸磷脂酰甘油，二油酸磷脂酰乙醇胺。包括其他，这些材料也可以适当的比率与DOTMA混合，用这些材料来制作脂质体的方法是已经知道的。

微囊众所周知并且由两性分子以合适的安排组成以便他们极性头组成一个球型外壳，而疏水区，碳链区超两球的中央组成内核。在水溶液中组成形式含有高浓度的表面活性剂以便微球自然产生。有用的表面活性剂形成微球包括但不局限于月桂酸酯钾，辛烷磺酸钠，癸烷磺酸钠，十二烷磺酸钠，月桂醇硫酸钠，溴化二环三甲基色氨酸胺，溴代三环三甲基色氨酸胺，氯化三环三甲基溴化胺，多羟8-十二烷基酯，多羟12-十二烷基酯，或作为局部反应或皮肤释放系统贮存池或作用身体表面应用制剂。

微滴，同样地，可以作为一个制剂和药物释放系统，像脂质体和微体一样，微滴在本质上是含有药物的胶本或包含药物的制剂。它们一般，虽然有时不必要，由油脂组成，有现代电荷脂质如磷脂。油脂微滴制剂是众所周知的，并且在操作流程方面被相关教科书和文献描述。

本发明的透皮释放成分含有可以令人接受材料和/或一个或多个佐剂制成的一个或多个药理学上令人接受的载体。术语“载体”指的是携带一些合适物质透皮或局部的药物应用，在这里，提到的有用的载体包括在技术上一致的没有毒性和不与其他成分以毒性方式相互作用的材料。

对于已成熟的技术，许多添加剂可能包括在制剂中。例如，容积包括使用相对少量的酒精可能增加某些药物的溶解度。其他一些可供选择的添加剂包括遮光剂，抗氧化剂，香味剂，着色剂，胶凝集，增稠剂，稳定剂，表面活性剂和其他。另外在制剂中有可能也包括其他成分，例如抗菌剂，阻止制剂的损坏及抑制酵母和包子等微生物的生长。合适的抗菌剂可以从羟苯甲酸甲酯和羟苯甲酸丙酯，苯甲酸钠，山梨酸及其他相互结合选择。

由于一些药物穿透皮肤或粘膜组织的能力显著的低，虽然优先在没有其他透皮渗透剂帮助下使用透皮增强剂，有可能是值得需要得出在这里揭露透皮增强子外还需要一个次要的透皮增强剂。任何其他透皮渗透剂应和本发明中提到的透皮释放增强剂一样，将对皮肤的损伤，炎症和循环系统毒性极可能降到最少。合适的二级增强剂(协同增强剂)包括许多族但不局限于此。例如：脂肪酸，包括饱和和不饱和脂肪酸；胆汁酸；脂质醇；非离子表面活性剂，包括脂肪酸酯，羟基脂肪酸酯，羟基脂肪质醇，二醇，多羟基化合物，二醇和多羟基可以被酯化用脂肪酸和被取代用聚乙二醇，聚乙二醇脂肪酸酯，聚乙醇脂肪醚和丙三基脂肪酸酯；胺；氨基化合物；N-烷基-azacycloalkanones和N-烷基-azacycloalkenones；碳氢化合物溶剂；萜(烃)；低烷基酯；环糊精；含氮杂环；亚砜和尿素和其他衍生物。其他一些协同增强剂包括醚和二甘醇3，4-乙基醚(从通过商业途径得到Transcutolg，Gattefosse SA)，表面活性剂如月桂酸酯钠，十二烷醇硫酸钠，十六烷基三甲基色氨酸溴化氨盐，氯化苯甲烷铵，Poloxamer(231，182，184)，土温(20，40，60，80)和卵磷脂。醇如乙醇，丙醇，辛醇，苄醇，与其他醇等；脂肪酸如月桂酸，油酸和戊酸；脂肪酸酯如乙丙基十四(烷)酸盐，异丙基棕榈酸盐。甲醛丙酸盐(酯)，和乙烷基油酸盐；多醇和酯类似物如聚乙二醇，单月桂酸酯聚乙二醇；氨基化合物和其他含氮化合物如尿素，而甲基乙酰胺，2-pyrrolidone，吡咯烷酮，1-甲基-2-吡咯烷酮，胆胺，二乙醇胺和三乙醇胺；萜(烃)；alkanones和有机酸，特别柠檬酸和琥珀酸。AZON^R和亚砜类如二甲亚砜与乙酸二甲亚砜也有被使用，但不是首选。

制剂中有可能也含有一些减轻炎症的添加剂将药物、透皮增强剂和其他成分对皮肤的炎症与损伤降到最低。合适的减轻炎症的添加剂包括：α-维生素E，单胺氧化酶抑制剂，特别是苯醛醇如2-苯基-1-乙醇；丙三醇；水杨酸和水杨酸盐；抗坏血酸维生素C和抗坏血酸盐；离子型载体如monensin；两性分子胺；氯化胺；N-乙酰半胱氨酸；cis-urocanic acid；辣椒素和氯喹；减轻炎症添加剂以合适有效浓度加入制剂中减轻皮肤炎症与损伤，在制剂中添加剂浓度大多数不超过20ut％，更常见的不超过5ut％。

在制剂中活性药物浓度依赖于许多因素，包括疾病或治疗的条件，或形剂的自然展性与活度，理性的治疗效果，可能存在的副作用，活性剂到达预定靶位能力与速度，和在病人与医生所具有的知识中的一些其他因素，透皮增强剂与药物首选的某些具体比率为：1∶1，1.5∶1，2.5∶1，3∶1，3.5∶1，4∶1，4.5∶1，5∶1，5.5∶1，6∶1，6.5∶1，7∶1，7.5∶1，8∶1，8.5∶1，9∶1，9.5∶1，10∶1或更多。

涉及到使用的药物释放系统可供选择和优先使用的方法，如局部或透皮“贴片”，含有透皮增强剂与活性药物混合的片层结构固定在皮肤上面。在这种结构中，药物含在片层结构或贮存库中，在使用过程中作为一个外层表面装置的衬底层。片层结构可能含有一层或多层药物蓄库。

另外，本发明的另外一个具体化体现在一个增强局部或透皮药物应用的系统包含有：(a)至少含有一个药物与透皮增强剂有效浓度使药物能够通透皮肤或身体表面达到足量但不引起皮肤的损伤的蓄库。(b)至少一个手段/方法含有药物与透皮增强剂和皮肤或者身体表面相关性和组成一个系统-机体表面相互作用的系统方式。(c)含有一个衬底层结构作为在使用过程中的外层装置。

另外一个具体实施例中，药物蓄池含有一个在药理学上被接受的粘性材料的多聚物基质在药物释放的过程中固定系统到皮肤表面；典型地，粘性材料式一个压力敏感性粘合剂，适合于皮肤表面长期接触，而且在物理和化学上应该是与本发明中的药物，透支增强剂和载体，媒质和其他添加剂相容。这里包括一些合适的粘性材料但不局限于此，例如：聚乙烯，聚硅醚，聚异丁烯，丙烯酸脂(盐)，聚丙稀酰胺，聚胺酯，可塑性乙烯—乙烯基醋酸盐二聚体和粘性橡胶如聚乙烯，聚丁二烯，聚苯乙烯-橡胶共聚体，聚苯乙烯—丁二烯共聚体，氯丁(二烯)橡胶(聚氯丁烯)。首选的粘附剂是聚异丁烯。

衬底层作为透皮系统中可行的，适宜的装置，它的功能是作为透皮系统中的基本结构元件，制作衬底层的材料在本发明中应该是惰性的，对药物与透支增强剂和制剂中含有的其它成分无吸收作用，衬底层应优先选择含有柔韧性，弹性材料作为覆盖剂防止药物的损失和/或作为载体从贴片上层传送药物，并且给予给药系统一定的封闭性。用来做衬底层的材料应该允许按照皮肤的轮廓及皮肤的一些区域和关节皮肤褶皱而改变，防止出现一些机械的拉伤和防止由于皮肤与装置的柔韧性与弹性的差异而从皮肤上脱离，作为衬底层的材料像上面提到一样不具有咬合性与渗透性，虽然咬合性衬底层提到过，一般来源于合成多聚物(例如：聚酯，聚乙烯，聚丙稀，聚亚胺酯，聚乙烯氯化物合聚氨醚)，天然聚合物(如纤维材料)或有大孔性纺织或非纺织材料。

在贮芷毓使用前期间，层状结构适宜于含有一个可以撕脱的衬底层，在使用前立即将衬底层从装置上撕脱下来以便给药系统能贴附到皮肤上。可以撕脱的衬底层应有药物与载体不能渗透的材料组成，并且可以随意的使用一些元件，仅仅在应用前保护装置，典型的，可以撕脱的衬底层又在本发明中的药理活性剂与透皮增强剂不能渗透的材料组成并且在使用前可以很容易得从贴片上撕脱下来。

另外具体体现在，含有药物的蓄池和与皮肤接触的粘合剂作为独立的，明确的分层出现。粘合剂在需要苦的下方。按照这样，蓄药库可能是上面提到的多聚物基质。另外，蓄药库有可能是由含有封闭的室或袋的液体或半固体制剂组成，或有可能是水凝胶池及其他形式。在工艺上这些技术是被认同的。水凝胶是吸水膨胀但不溶于水的大分子网络，也就是，水凝胶含有亲水功能基团提供了水的吸收，但水凝胶是由胶联的多聚物组成附于水凝胶的水不溶性。一般的，水凝胶由胶联的含亲水基团的多聚物组成，如聚亚胺酯，聚乙烯醇，聚丙烯酸，聚氧乙烯，聚乙烯吡咯烷酮，聚(羟甲基丙烯酸盐)(poly(HEMA))或其他类似的多聚物，特别是已提到的亲水多聚物是HEMA和聚乙烯吡咯烷酮。

另外一层，如中间过渡构造层(织物层)和/或控制释放率的膜可能出现在任何药物释放系统中。织物层可以用来使装置更容易制作，控制释放膜可以用来控制外层装置层中的成分释放。这些成分在本发明中可以是药物、透皮增强剂、其它的增强剂，或者药物释放系统中含有的其它成分。

控制释放膜应在一个或多个蓄药池的皮肤侧，用来制造控制释放膜材料的选择，目的是限制药物制剂中一个或多个成分的流量。控制释放膜有用的代表性材料包括聚烯烃如聚乙烯和聚丙烯、聚酰胺、聚酯、乙烯-丙烯酸盐多聚物、乙烯基-乙烯醋酸盐多聚物、乙烯基-乙烯甲基醋酸盐多聚物、乙烯基-乙烯乙烷基醋酸盐多聚物、乙烯基-乙烯丙基醋酸盐多聚物、聚异戊二烯、聚丙烯腈，乙烯-丙烯多聚物及其他。

一般的，在透皮装置的下层，如皮肤接触区面积，选择面积范围约5-200cm²，更适宜选择5-100cm²，最好的是选择20-60cm²，当然，接触面积是可以改变的，根据释放药物量及透过身体表面所需量，大的贴片适应于大量药物供给，而小的贴剂适应于小量药物供给，展示一个相对高的渗透率。

这样的药物释放系统可以使用工艺上已知的传统常用的衣料和层压术来制造。例如，粘合基质系统可以通过铸造流动性的粘合剂混合物、药物和载体黏附于衬底层上，随后形成片层结构。同样的，粘合剂复合物可以铸造到撕脱的衬底层上，跟随片层结构衬底层，另外，蓄药池可以在没有药物或赋形剂的前提下事先准备，然后浸泡在含药物/载体的混合物中，具体到在本发明中，透皮系统是通过溶剂蒸发，薄膜铸塑，熔体挤出，薄膜迭层，冲切或其他方法制作，透皮增强剂一般地在制作贴剂的过程中加入装置胜过准备好装置后在加。

在首选的药物释放系统中，粘合覆盖层可以作为衬底层保护药物释放装置与皮肤触面。这种覆盖层大小估计超过蓄药池以便整个区域接触到身体表面，覆盖层是有用的。由于粘合剂/蓄药池衬底层可能损失其黏附性，在应用数小时后由于水和作用，通过结合一个黏附覆盖层，药物释放系统可维持*在适当的位置满足长时间的需要。

其他类型或构型的透皮释放系统可以结合使用本发明中提到的在透皮药物释放工艺这些技术被认同的方法。

本发明中局部应用的制剂，皮层结构蓄药池中含有药物及透皮增强剂，也可以含有许多另外的成分。在某些事例上，缺乏另外的液体，药物及透皮增强剂可以灵巧的释放；在另外一些事例上，药物及透皮增强剂可以溶解、扩散或悬浮在合适的在药学上被接受的载体中，典型的是生理盐水、溶剂或胶另外的成分包括防腐剂、稳定剂、表面活性剂、助溶剂、其他的增强剂和其他成分等可能出现。

本发明提供了一个非侵入性方法增强了任何药理学活性剂和/或药物透皮，具体地说，应用理想的药理学活性剂和/或药物到选择好的皮肤区达到治疗疾病的有效药理剂量，至少通过噬菌体体内展示技术得到一个透皮增强剂能够促进药理学活性剂/或药物有足够的量透过皮肤进入血循环。在这里提到“治疗”这个术语，指的是降低了疾病症状发生的次数及程度，消除了症状和/或潜在病因，阻止症状/或它们的潜在病因的发生，改善或纠正了疾病的损伤。“治疗”术语也包括了阻止易感人群代谢失调和治疗出现临床症状代谢失调个体。

而释放药学活性剂的方法是可变的，这些方法典型地涉及到应用的溶液、制剂或含有本发明中的透皮增强剂的药物释放系统和预先应用到皮肤或身体其他表面足够的时间提供理想的局部或系统治疗效果的药理学活性剂和/或药。方法可以涉及到作为溶液、药膏、胶、霜膏及其他的成分，以提供涉及到药物释放装置。

应用活性剂的量将依赖许多因素，从一个个体到另一个个体和依赖于应用的药物、治疗特别状态与条件、症状的程度、个体的年龄、重量和一般条件和处方医生的判断而改变。其他一些因素，特别是对于透皮药物释放包括药物溶解度与载体渗透能力和在药物释放装置中的粘合剂层，如果在使用中，还包括系统黏附到皮肤或其他表面的时间。药物的最小量是由填充在装置中药物足够的量或其他成分在应用的一段时间后达到理想的释放率决定。最大安全量是由不引起机体毒性反应的不超过一定水平的<最大？>药物释放率决定。药物最大浓度是由载体容纳药物数量不能产生组织学副作用如炎症、身体无法接受脉冲式释放、或释放装置副作用如黏度散失或其他性质变质等决定

因此，本发明提供新颖的、高效的方法增加了药理学活性剂和/或药物通过人或动物的身体表面(如皮肤、粘膜组织)。在这里揭露的透皮增强剂，在制剂或蓄药池中具有一定的量是许多药物和药物原型渗透性增强，包括自由酸、自由碱基、acid addition salts ofbasic drugs、basic addition salts of acidic drugs、非离子药物、肽和蛋白质。下面提到了许多例子，特别是一些属于治疗药物与本发明中提到的透皮增强剂合用时能够透皮释放，令人惊讶的是：增加渗透性不伴随一些显著的组织损伤、炎症或致敏。本发明在药物释放领域提供了一个重要方向。

在整个申请中，许多出版物被引用，提到的所有出版物和其中应用的文献，因此，应用这些相关文献更能理解这份申请。

本发明前文详细的呈现应该被理解并且在没有变动发明的前提下有许多改变。本发明更能被下文的例子所阐明。有些没有说明的地方，相反地，很容易理解的是，它可能求助于多种具体的条件、修饰物和它的相似物。

实施例1、体内噬菌体展示技术筛选具有透皮增强功能的肽

用来筛选具有透皮增强功能的肽的文库，是由New England Biolabs(Mass，MA)提供的，三个随机肽文库中含有二硫键的七肽的文库(Ph.D.-C7C)。这个文库中的随机片段的两侧是半胱氨酸残基，它们可以在噬菌体组装过程中被氧化形成二硫键的连接，这样就形成一个环肽和靶对象相互作用。(Ph.D.^TM-C7C噬菌体肽展示试剂盒[online]，[在2005-09-01购买].是在网络上获知信息的<URL: http://www.neb.com/nebecomm/products/productE8120.asp>)。这个文库含有超过二十亿个克隆数。文库中随机肽在小外壳蛋白pIII的氨基端，所以每个噬菌体颗粒都表达五个拷贝。Ph.D.-C7C文库中噬菌体表达随机序列的位置之前是丙氨酸-半胱氨酸。在随机肽和pIII蛋白间含有短的连接序列(甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸)。(Ph.D.^TM-C7C噬菌体肽展示试剂盒[online]，[在2005-09-01购买].是在网络上获知信息的<URL:http://www.neb.com/nebecomm/products/productE8120.asp>)。

Balb/c裸小鼠(斯莱克斯，上海，中国)在无菌的动物房中饲养。裸鼠用乌拉坦麻醉，用枪头侧面将100微升共含有10¹²个噬菌体(New England Biolabs，Mass.，MA)涂布在其腹部大约3.0厘米×3.0厘米的区域。从血液循环中回收噬菌体颗粒，扩增，用于再次筛选。噬菌体处理一个小时后，从心脏中抽取1毫升血，和0.5毫升快速生长的大肠杆菌ER 2738。孵育半个小时后，倒入20毫升的培养基中扩增6个小时。扩增的噬菌体在磷酸缓冲液中重悬，并用来做第二轮的筛选。第一轮大约回收了150个噬菌体，第一轮后扩增的噬菌体透皮效率比图书馆噬菌体要高两个数量级。

将第二轮从血液中回收的噬菌体铺在含有x-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside)和IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactoside)的LB平板上。从板上随机挑取12个蓝色的噬菌斑，用DNA自动测序仪(ABI3730)进行DNA测序。它们其中的8个都含有同样的插入序列，编码的肽序列是CSSSPSKHC(PH-1，序列号：1)。

实施例2、透皮增强剂及其类似物的化学合成

本专利中的多肽都由上海吉尔生化公司利用标准的FMOC固相合成法在多肽自动合成仪(CS536-1381，CS Bio Co.，Menlo Park，CA)中合成，并用HPLC纯化使其纯度大于95％，利用质谱仪(BIFLEX^TM III，Bruker，Germany)鉴定分子量。

序列ACSSSPSKHCG(TD-1，SEQ ID NO：2)的肽合成步骤如下。末端氨基酸丙氨酸和甘氨酸来源于M13表面蛋白。TD-1的使用标准的FMOC固相合成法，一般的手动合成步骤如下：大约0.2mmol Fmoc-Gly-Wang resin加到手动反应试管(Peptides International)，加入DMF使其膨胀2小时。然后加入20％哌啶/DMF反应2min以除去Fmoc保护基团，重复一次去保护基的步骤并反应20min。阳性的Kaiser检测结果表明树脂上有自由氨基。氨基酸残疾按照如下的循环方法加到树脂上：按照TD-1的序列将三倍过量的Fmoc保护氨基酸、三倍过量的HOBT和三倍过量的DIPEA/DMF加到反应试管中。在N₂流中偶联反应2小时，反应试管用真空泵抽干。N端保护的肽用DMF(5×1min)洗涤以除去过量的反应物，然后如前方法用20％的哌啶/DMF去Fmoc保护基。反应试管用DMF洗涤以除去哌啶，重复的步骤偶联下序列中的一个氨基酸。合成好有侧链保护的N^a-Fmoc-Ala-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Pro-Ser(tBu)-Lys(Boc)-His(Trt)-Cys(Trt)-Gly-resin结合物后，肽树脂结合物用DMF(4×1min)洗涤，并用真空抽干。氨基末端Fmoc保护基用20％哌啶/DMF除去。侧链的去保护以及肽树脂键的断裂用10ml的裂解液(95％三氟乙酸、2.5％水和2.5％三异丙基硅烷)在500rpm振荡下反应3小时。将反应物转移到预称重的锥形瓶重，用冰的无水乙醚沉淀。粗产物真空干燥48小时。70-100mg的粗产物用反相高效液相色谱(RPHPLC)纯化并冻干成粉末。肽的纯度用分析型RP-HPLC鉴定，其分子量用质谱仪鉴定。

使用相同的方法合成对照肽ACNATLPHQCG(AP-1，SEQ ID NO：6)和HPGARPVFPWPG(SC-1，SEQ ID NO：7)。AP-1是一个有相同末端氨基酸而包含不相干的内部序列的11肽。FITC通过Acp偶联到TD-1和SC-1的氨基端。

实施例3、TD-1抑制PH-1的透皮活性

雄性的Wistar大鼠(180克到220克)饲养在动物房中，有恒温(22℃)，恒定的相对湿度(60％)，并且有固定的12小时光照/黑暗的循环，它们可以自由取食和饮水。用乌来糖(5毫克/千克，浓度为20％)麻醉老鼠，然后用剪刀地将老鼠腹部面积约3厘米×厘米的毛发剪干净，要很小心不损伤皮肤(有任何可见伤痕的老鼠均丢弃不用)。展示TD-2肽(SEQ ID NO：1)10¹²PH-1噬菌体或对照噬菌体，对照噬菌体是随机从文库中挑取的，并且编码序列AP-1(序列号：6)，被置于剪毛区域中，并用枪头侧面将其涂布于整个区域。一个小时后，从尾静脉取血，并按照厂商的使用手册做滴度。

在Wistar大鼠中检验，表明表达TD-1肽的噬菌体能穿过皮肤并到达血液中，局部处理后一小时，滴度可达到每毫升4556个噬菌体(图1A)。与此相比，展示肽AP-1的对照噬菌体所具有的透皮能力还不到PH-1的0.2％，在血液中没有回收到有活性的噬菌体(图1A)。

当TD-1和PH-1共同处理老鼠，TD-1会随着剂量的增加对PH-1的透皮有抑制作用。在总量超过5微克时，TD-1就完全抑制了PH-1透皮的能力(图1B)，说明PH-1的透皮能力是由于它展示的肽和皮肤的一些成分特异的相互作用。

TD-1对PH-1有竞争抑制作用，TD-1能增强对照噬菌体AP-2噬菌体的透皮，但活性相对较低并且不一致(陈等，未发表)。

实施例4、TD-1增强胰岛素的透皮释放

¹²⁵I标记的胰岛素(170微居/微克)是由北京原子高科(北京，中国)用Bolton-Hunter过程生产的，并经过快速液相色谱纯化。五百万cpm的¹²⁵I标记的胰岛素溶解在100微升的生理盐水中，和三种不同剂量的TD-1以及16ugAP-1共同处理Wistar大鼠剪过毛的腹部。在不同的时间点从老鼠的尾静脉取血，并用γ计数仪(GC-911，中科创新有限公司，合肥，中国)测量放射量。

特殊的是，对雄性的Wistar大鼠腹腔注射链脲酶素(60毫克/千克；Sigma-Aldrich，St.Louis，MI)使这些老鼠患糖尿病。注射后7到10天，用One-Touch血糖仪(LifeScan，Milpitas，CA)测量血糖。选择血糖高于20mmol/l(正常的老鼠在4-6mmol/l之间)的老鼠，随机分组进行不同的处理，每组6只。为了估算TD-1帮助胰岛素透皮的能力，¹²⁵I标记的胰岛素与三种不同剂量的TD-1混合，共同处理剪过毛的老鼠裸露的腹部，再测量血液中的放射量。为了测试TD-1是否能帮助胰岛素透皮达到治疗的浓度，将70微克药物级的猪胰岛素(＞98％，30IU/mg)(徐州万邦制药厂，徐州，中国)和500微克TD-1混合在100微升的生理盐水中(胰岛素：TD-1为7∶50(约1∶7.5))局部处理老鼠裸露的皮肤。作为对照，化学增强剂组中，在100微升1∶1 PBS∶乙醇溶液中，溶有70微克胰岛素，0.35％(质量/体积)sodium laureth sulfate(SLA；Sigma)和0.15％(质量/体积)phenyl piperazine(PP；Sigma)用此溶液100微升处理老鼠裸露的皮肤。SLA/PP化学增强剂的配方来自高通量筛选(Karande et al.，1994，Nature Biotech.22：192)。此外，在其它透皮处理组，用100微升生理盐水处理老鼠。皮下注射组，每只老鼠注射14微克胰岛素。

在不同时间点进行剂量研究，处理前及局部处理后2，5，8，11小时，皮下注射组是测量处理前及处理后1，2，3，5小时时间点。在这些时间点，从老鼠尾静脉取血，测量血糖浓度和用放射免疫试剂盒(Immunotech，Czech)测胰岛素含量。对于胰岛素和TD-1量的研究，按照如上所述的方法，只测处理前和处理后5小时的血糖和血清的胰岛素含量。

当没有TD-1，例如TD-1为0克(图2A中图标□)，¹²⁵I标记的胰岛素就不能透皮进血液中。然而，当和不同剂量4微克，8微克，或16微克的TD-1混合，共同处理老鼠剪过毛的区域，两小时后就能检测的全血中的碘的放射量，在持续的全过程中，放射量不断增加(图2A中的图标■，○和)，说明TD-1能帮助胰岛素透皮释放。这些研究表明这三个剂量都是有效的。

另外，以500微克/70微克的比率将TD-1和胰岛素混合溶解在生理盐水中，然后处理链霉菌素诱发的糖尿病鼠，表明能达到治疗水平。在这些研究中，两个小时后，就能检测到胰岛素浓度增加，5小时达到峰值，在11小时回到初始水平(图2B中图标■)。相对的，处理两小时后，血糖水平下降了，在8小时达到最低水平(＜初始水平的25％)血糖降低至少持续11小时(图2C中图标■)。相对的，对照噬菌体表达的肽，AP-1没有提高血清中胰岛素浓度和降低血糖的作用。(图2B和2C中的图标□)。化学增强剂的混合物sodium laureth sulfate and phenyl piperazine(SLA/PP)，对于提高血清中胰岛素浓度和降低血糖，也没有作用(图2B和2C中的▲)。

然而，研究显示，在没有胰岛素的情况下，TD-1不能提高血清中的胰岛素浓度，也不能降低血糖，说明TD-1和胰岛素的共同处理导致的血糖降低是由于透进了外源胰岛素，而不是由于TD-1引起的一些不明原因的生理作用(图2B和2C中的图标●)。作为对照，皮下注射胰岛素，引起快速而短暂的胰岛素浓度提高和血糖降低，其峰值作用大约在处理后2到3小时之间，持续时间不超过5个小时(图2B和2C中图标○)。

此外，研究表明，TD-1可以促进胰岛素透皮是有量的要求的。研究显示少于20微克的TD-1和70微克的胰岛素混合，不能显著提升血清中的胰岛素含量和降低血糖。而大于500微克的TD-1和70微克胰岛素混合，局部处理老鼠，此时，TD-1的促透能力达到最大(图2D和2E)。还有研究表明，胰岛素也有剂量要求。和TD-1的量为500微克，与之混合的胰岛素量为35微克时就足够升高胰岛素浓度和降低血糖了，但要达到最好效果，就需要胰岛素70微克或更多(图2F和2E)。

胰岛素的透皮释放中，除了皮下注射组，都是在不同的时间点和只有TD-1处理组相比较，应用的是独立样本T检验。而皮下注射组，每个时间点都是和其处理前0点相比，应用配对T检验。

实施例5、TD-1增强生长激素的透皮释放

为了测试TD-1能否帮助其他蛋白药物透皮释放，将500微克的重组生长激素和两个不同剂量的TD-1混合，共同涂抹在连续两天用地塞米松(12.5毫克/公斤，Sigama)封闭垂体的Wistar大鼠的裸露皮肤。特别是，雄性的Wistar大鼠每天皮下注射地塞米松(12.5毫克/公斤，Sigama)。两天后，将它们随机分组，每组3到4只，进行不同的处理。其中的一组，每只老鼠给500微克重组生长激素，生长激素是在大肠杆菌中表达的全长为21.5kd的蛋白，纯度＞95％，其生物效价为2.5微克/毫克(瑞生技术公司，上海，中国)。另外，将生长激素和100微克或500微克的TD-1混合(相对的生长激素和TD-1的比例为5∶1和1∶1)，总体积100微升，共同涂抹在老鼠裸露的皮肤上。处理后，分别在0，2，5，8时间点，从老鼠的尾静脉取血，血清中的生长激素总量用酶联免疫试剂盒测知(DiagnosticSystems Laboratories，Webster，TX)。在各个时间点，各组都和生理盐水和生长激素混合组比较，应用独立样本T检验。

如前所述，由于高剂量的地塞米松可有效地将内源的生长激素浓度降低到不能检测的水平(Kolonin et al.，2004，Nature Med.10：625，and Karande et al.，2004，Nature Biotech.22：192)，所以在这些用地塞米松处理的老鼠体内，就能很容易的检测到透皮释放的外源生长激素。研究表明，100微克(△)和500微克(○)的TD-1都能帮助生长激素进入血液循环，共处理两小时后浓度到达最大(图3)。并且100微克TD-1比500微克TD-1更有效，说明TD-1和生长激素的比例对生长激素的透皮释放很重要。相对的，当将生长激素和对照噬菌体表达的肽AP-1混合，处理老鼠后，没在血清中检测到生长激素增加，说明AP-1不能帮助生长激素透皮。

实施例6、TD-1对APO透皮释放的增强作用

国内外文献显示，阿朴吗啡(APO)能够用于治疗帕金森病和性功能障碍(Hagell et al，2001，J.Neutosci.Nur.33：37；Francesco Montorsi，2002，European Urology Supplements1(3)：4)。它是一种多巴胺受体激动剂，在下丘脑和脊髓部位通过促进多巴胺的释放起作用(Anden et al，1967，J.Pharm.Pharmacol.19(9)：627)。研究证明APO能引起快感和勃起反应。APO的分子式为C₁₇H₁₇NO₂.HCl.1/2H₂O，分子量为321.8KD。

在本实验中，选用200-250g的SD雄性大鼠，适应性喂养一周，光照12h，黑暗12h，给予充足的食物和水。所有行为学实验都在上午9:00到下午4:00中进行，环境温度恒温在24±1℃。大鼠用乌拉坦麻醉后，用剪刀小心的剪去肩胛间区的毛，面积大约为3.0cm×3.0cm，小心剪破大鼠的皮层(皮肤有可见的破损的大鼠将不被使用)。大鼠在经过至少24h的恢复苏醒后才开始实验。包含指定量APO的100ul乳膏涂在去毛的皮肤上，并用移液枪头的一段将其均匀的分布开。乳膏的成分包含：单硬脂酸甘油酯(7.5％重量比)、羟丙基甲基纤维素(0.5％重量比)、异丙基(肉)豆蔻酸酯(10％重量比)、尼泊金甲酯(0.5％重量比)、尼泊金丙酯(0.5％重量比)、聚二甲苯-40-硬脂酸酯(11％重量比)、生理盐水(70％重量比)以及随同给药的各种剂量的APO和TD-1。

涂药之后立即将大鼠放进各自的聚苯乙烯笼子里(长32cm，宽30cm，高30cm)以便观察，由两位观察者记录大鼠在2h内阴茎勃起(PE)的次数。按照Berendsen and Broekkamp(1987，Eur.J.Pharmacol.135(3)：279-87)的描述，勃起的标准为：骨盆前推并且跟随直立姿态露出阴茎头，包皮后退，阴茎膨大，大鼠舔其阴茎而站立不稳。

图4显示2.0mg/Kg TD-1和0.8mg/kg APO的剂量给药可增加APO的透皮效果，而AP-1在相同剂量(2.0mg/kg)下对APO的透皮释放没有增强作用。对作用时间段的效果分析显示，在透皮给药APO(0.8mg/kg)和TD-1(2.0mg/kg)后，大部分勃起现象在后一个小时内观察到(如图5)。

另外，此次实验研究显示TD-1对APO的透皮作用是剂量依赖性的。在APO的剂量固定为0.8mg/kg的情况下，当TD-1的剂量为0.4mg/kg时，大鼠阴茎勃起的次数没有显著的增加，而当TD-1的剂量为0.8mg/kg、2.0mg/kg或3.2mg/kg时，其透皮增强效果达到最大(如图6)。同样，我们也观察到APO的剂量依赖性效应。在TD-1的剂量固定为0.8mg/kg的情况下，APO至少要达到0.8mg/kg的剂量才能观察到显著的效果，而剂量为0.4mg/kg或更少时大鼠的阴茎勃起次数没有显著性的增加(如图7)。

实施例7、TD-1对PT-141透皮释放的增强作用

Palatin技术公司(Cranbury，NJ)研发的PT-141是由七个氨基酸组成的多肽：Ac-Nle-Asp-His-D-Phe-Arg-Trp-Lys-OH。作为α-MSH的类似物，PT-141结合并激活中枢黑皮质素受体，选择性的刺激雌鼠的引诱行为(Pfaus et al.，2004，Proc.Nat.Acad.Sci.101(27)：10201-204)。早期的临床研究显示PT-141在治疗勃起功能障碍和女性性功能障碍的病人方面是个非常有效的药物(Diamond et al.，2005，Urology 65(4)：755-59；或http://www.palatin.com/pdfs/pt141.pdf)。

在研究TD-1对PT-141透皮释放的增强作用实验中，也是选用200-250g的SD雄性大鼠，适应性喂养一周，光照12h，黑暗12h，给予充足的食物和水。所有行为学实验都在上午9:00到下午4:00中进行，环境温度恒温在24±1℃。大鼠用乌拉坦麻醉后，用剪刀小心的剪去肩胛间区的毛，面积大约为3.0cm×3.0cm，小心剪破大鼠的皮层(皮肤有可见的破损的大鼠将不被使用)。大鼠在经过至少24h的恢复苏醒后才开始实验。包含指定量PT-141的100μl乳膏涂在去毛的皮肤上，并用移液枪头的一段将其均匀的分布开。乳膏的成分包含：单硬脂酸甘油酯(7.5％重量比)、羟丙基甲基纤维素(0.5％重量比)、异丙基(肉)豆蔻酸酯(10％重量比)、尼泊金甲酯(0.5％重量比)、尼泊金丙酯(0.5％重量比)、聚二甲苯-40-硬脂酸酯(11％重量比)、生理盐水(70％重量比)以及随同给药的各种剂量的PT-141和TD-1。

实验大鼠被分成两组，每组6只。第一组大鼠所涂乳膏仅加生理盐水；第二组大鼠所涂乳膏仅加160μg/kg的PT-141；第三组大鼠所涂乳膏加入240ug/kg的对照肽AP-1(SEQID NO：6)和160μg/kg的PT-141(AP-1与PT-141的质量比为3∶2)，第四组大鼠所涂乳膏中加入240μg/kg的TD-1和160μg/kg的PT-141(TD-1与PT-141的质量比为3∶2)。

涂药之后立即将大鼠放进各自的聚苯乙烯笼子里(长32cm，宽30cm，高30cm)以便观察，由两位观察者记录大鼠在2h内阴茎勃起(PE)的次数。按照Berendsen and Broekkamp(1987，Eur.J.Pharmacol.135(3)：279-87)的描述，勃起的标准为：骨盆前推并且跟随直立姿态露出阴茎头，包皮后退，阴茎膨大，大鼠舔其阴茎而站立不稳。另外，参考文献(Nybyet al，1992，Horm.Behav.26：24 or Randy et al，1995，Nature 378(23)：383)，追逐描述为雄鼠紧跟雌鼠并用嘴舔雌鼠的生殖器部位；骑跨描述为雄鼠的两条前脚离开地面，并将其跨到雌鼠的臀部而没有射精。

图8显示了透皮增强剂TD-1促进PT-141的透皮释放效果。PT-141单独给药以及和对照肽AP-1随同给药，都未增加阴茎勃起、追逐和骑跨的次数，这表明PT-141本身以及和AP-1随同给药都不能透过皮肤组织。而当PT-141和TD-1共同给药时，阴茎勃起、追逐和骑跨的次数都有显著的增加，这表明TD-1能促进PT-141穿透皮肤组织，达到生理学效果。

实施例8、TD-1类似肽的合成以及它们帮助胰岛素透皮释放的效果

为了估测TD-1的序列特异性，化学合成了几种TD-1肽的类似物，包括TD-4，TD-10和TD-11，并用和前面同样的方法测试它们帮助胰岛素透皮的效果。这三个合成肽中的TD-10(ACSSS SSKHCG，SEQ ID NO：4)，只将TD-1种一个位点改变了(P→S)，仍具有TD-1帮助胰岛素透皮释放效率的80％。然而，TD-4(ACSSSPS DHCG，SEQ ID NO：3)和TD-1相比只有一个氨基酸改变了，在用TD-4和胰岛素混合处理老鼠后，血清中胰岛素含量和血糖水平都没有明显变化，说明其帮助胰岛素透皮效率就显著降低了(图9A和9B)。相似的，TD-11，只含有TD-1中间的七个氨基酸SSSPSKH(SEQ ID NO：5)，在用TD-11和胰岛素混合处理老鼠后，血清中胰岛素含量和血糖水平都没有变化，说明它没有帮助胰岛素透皮的活性。TD-11没有帮助胰岛素透皮的活性说明二硫键对TD-1透皮活性很重要。

实施例9、TD-1的延时对胰岛素透皮释放的作用

为了寻求TD-1的作用机理，进行了时间延迟实验，就是在糖尿病鼠皮肤上用TD-1处理5分钟。然后洗净TD-1，等待一段时间，再在同样的位置涂抹胰岛素。由血清中胰岛素水平(图10A)可知，当不等待时(洗净的过程需要2分钟)，胰岛素的透皮效率与TD-1和胰岛素共处理时几乎一样。当等待5分钟后，仍能显著的帮助胰岛素透皮进入血液循环。但是，当等待15分钟或更久时，胰岛素的透皮效率就显著降低了。在测量血糖时有同样的趋势(图10B)。这些结果表明，TD-1可能在皮肤屏障上形成一个穿透通道，使得胰岛素可以通过并且到达血液循环。

实施例10、TD-1促进FITC标记的胰岛素从毛孔透皮

为了研究TD-1帮助肽类药物透皮的途径，在用TD-1和FITC标记的胰岛素混合共同处理皮肤后，制作皮肤切片，可用荧光显微镜观察。需说明，FITC标记的胰岛素(西安华辰，西安，中国)是溶解在很少量的DMF中，随后用生理盐水稀释，再局部处理老鼠(终溶液中DMF浓度＜0.2％)。FITC标记的胰岛素(10微克)和TD-1(100微克)混合涂抹在老鼠裸露的皮肤上，终体积为100微升，对照不加TD-1。另外，还有SLA/PP处理组为对照，PBS∶乙醇为1∶1的100微升混合溶液中，含有10微克FITC标记的胰岛素，0.35％SLA和0.15％PP，将这100微升溶液涂抹在老鼠裸露的皮肤上。两个小时后，用70％的异丙醇仔细的擦干净，再剪下来。分离的皮肤用含4％多聚甲醛的0.1M磷酸缓冲溶液(PH7.4)固定过夜。用磷酸缓冲液(PH7.4)清洗几遍后，将皮肤样品浸没在含4.5％蔗糖的PBS中24小时，然后将皮肤再放入放入含30％蔗糖的10毫升的PBS中脱水，直至其沉淀。用冷冻切片机(CM1900 LEICA，Heidelberger，Nussloch，Germany)，以20微米厚度做横切和纵切。将冷冻切片黏附在多聚赖氨酸包被的载玻片上，放在室温下干燥并用10微升VECTASHIELD Mounting Medium(Vector Laboratories，Burlingame，CA)封片。用OLYMPUS IX-70显微镜(OLYMPUS，Tokyo，Japan)观察切片，激发波长为490-495纳米，发射波长为520-530纳米，并且拍摄荧光显微照片。观察TD-1-FITC和SC-1-FITC的透皮效果也用同样的方法。

纵切(切面垂直于皮肤表面)表明FITC标记的胰岛素进入了毛囊深处。(图11A)。毛囊外面几乎没有荧光。当没有TD-1的作用时，就没有FITC标记的胰岛素进入毛囊深处的现象(图4)。作为比较的是，SLA/PP帮助FITC标记的胰岛素透皮既通过毛囊也通过皮肤组织，但是总量和深度都没有用TD-1和FITC标记的胰岛素共同作用的效果好(图11D)。这些结果都通过在600微米深处的横切(切面和皮肤表面平行)验证了(图11E，G和H)。时间曲线研究表明处理后30分钟FITC标记的胰岛素在TD-1的帮助下就已经进入毛囊了，两个小时就到达最深处了，并持续24小时(图12A到F)。胰岛素进入毛囊深处和胰岛素进入血液循环有一定的关系。和对照肽AP-1混合共同作用，不能帮助胰岛素透皮，也不能使得FITC标记的胰岛素进入毛囊(图11，B和F)。时间延迟研究更加支持了这一观点。等待的时间和渗透进毛囊的FITC标记的胰岛素以及进入血液循环的胰岛素成反比(图11，I到L)。

为了检测TD-1能否进入毛囊，FITC标记的TD-1局部处理老鼠后，取皮做荧光显微切片。观察切片，FITC标记的TD-1在毛囊中的渗透和TD-1与FITC标记的胰岛素共同作用时的情形相似，但对照肽(SC-1-FITC)就不能进入毛囊(图13，A到D)。

研究表明，TD-1能有效释放进体循环，但它不需要和所促透药物连接，促从而促进其透皮。研究更证明了，噬菌体展示技术对于筛选促进透皮肽是有效的，是有力的分子生物技术，TD-1和类似物在透皮和局部药物特别是亲水性大分子药物的释放中有广泛的应用。

                              序列表

<110>上海诺美医药技术有限公司

<120>透皮给药增强剂及其使用方法

<130>061024C

<160>5

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>9

<212>PRT

<213>phage

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(9)

<400>1

Cys Ser Ser Ser Pro Ser Lys His Cys

1               5

<210>2

<211>11

<212>PRT

<213>phage

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(11)

<400>2

Ala Cys Ser Ser Ser Pro Ser Lys His Cys Gly

1               5                   10

<210>3

<211>11

<212>PRT

<213>phage

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(11)

<400>3

Ala Cys Ser Ser Ser Pro Ser Asp His Cys Gly

1               5                   10

<210>4

<211>11

<212>PRT

<213>phage

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(11)

<400>4

Ala Cys Ser Ser Ser Ser Ser Lys His Cys Gly

1               5                   10

<210>5

<211>7

<212>PRT

<213>phage

<220>

<221>PEPTIDE

<222>(1)..(7)

<400>5

Ser Ser Ser Pro Ser Lys His

1               5

Claims (8)

1、一种识别并筛选具有增强透皮给药能力的多肽的方法，包括体内噬菌体展示技术，其特征在于该方法包括：

(a)在动物体或人体皮肤的适当区域涂以噬菌体展示多肽库；

(b)从所述动物或人的循环系统、器官、组织以及细胞中回收噬菌体颗粒；

(c)扩增回收的噬菌体用于下一轮体内筛选；

(d)重复上述(a)到(c)的步骤至少一次；

(e)对回收的噬菌体挑取单克隆，验证其透皮能力后测序，获得所编码的展示多肽。

2、一种透皮给药增强剂，其特征在于，含有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4所示的多肽序列或其类似物。

3、一种核苷酸序列，其特征在于，该核苷酸序列含有编码一种含有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4所示的多肽序列或其类似物的核苷酸序列。

4、一种透皮给药组合物，其特征在于，包括至少一种治疗某疾病的有效剂量的药物活性试剂或药物，和至少一种透皮给药增强剂，所述透皮给药增强剂含有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4所示的多肽序列或其类似物。

5、一种增强药物透皮给药的方法，其特征在于包括将至少一种透皮给药增强剂与至少一种药物活性制剂或药物联合给药，所述透皮给药增强剂含有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4所示的多肽序列或其类似物，相比未将所述活性试剂或药物与所述透皮给药增强剂结合的给药，所述活性试剂或药物通过动物或人的皮肤或者身体表面的给药得到增强或促进。

6、一种增强药物局部或者透皮给药的药物给药系统，其特征在于包括：

(a)至少一个含有一种药物和一种透皮给药增强剂的药库，该透皮给药增强剂的量能够有效增强一定数量的所述药物穿透皮肤或身体表面，以达到治疗效果而不会造成伤害；

(b)一个工具，用于维持所述系统中药物和透皮给药增强剂向皮肤或机体表面的输送关系，并且形成机体表面-系统接触面；和

(c)一个衬底层，用于在所述工具的使用过程中作为外表面。

7、一种美容制剂，其特征在于包括至少一种透皮给药增强剂，和零至多种皮肤护养、皮肤机能改善或皮肤色泽调节的有效成份，所述透皮给药增强剂含有SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4所示的多肽序列或其类似物。

8、一种美发制剂，其特征在于包括至少一种透皮给药增强剂，与至少一种美发活性制剂或药物联合给药；所述美发活性制剂或药物包括任何具有促进毛发生长、防止毛发脱落、改变毛发结构、成份或色泽功效的化合物，天然提取物或生物制剂；所述透皮给药增强剂含有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4所示的多肽序列或其类似物。

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