具体实施方式
以下结合具体实施例,对本发明作进一步说明。应理解,以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或厂商提供的条件进行。
实施例1 TD-1-EGF和TD-1-EGF+ATP透皮药物的比较
TD-1为ACSSSPSKHCG的短肽;EGF为表皮生长因子(本申请中ATP帮助TD-1介导融合透皮蛋白质药物透皮以人表皮生长因子TD-1-huEGF为例,后文中huEGF用EGF表示)。
TD-1-EGF来源于中国科学技术大学纳米生物学实验室自行构建重组质粒,并使用大肠杆菌原核表达系统表达并纯化目的蛋白。简述如下:通过使用pFN18A halotag 7 Flexi vector(Promega公司),构建重组质粒,再转化入KRX competent cells(Promega公司),葡萄糖、鼠李糖(Promega公司)在25℃,220rpm诱导表达目的蛋白,20h后收集菌体,破碎后,使用Halo-Tag纯化系统(Promega公司)纯化出目的蛋白。之后Western-blotting检定TD1-EGF的表达、Western-blotting鉴定融合蛋白是否激活细胞ERK信号通路、MTT法检测TD1-EGF是否促进Balb/c-3T3细胞增殖以及TD1-EGF对Balb/c-3T3细胞迁移的影响验证原核表达出的目的蛋白是否具有生物学活性。再通过融合蛋白在大鼠体内(in vivo)、体外(in vitro)透皮实验、融合蛋白在实验小型猪(in vivo)体内透皮实验以及健康成人皮肤组织体外(in vitro)透皮实验等实验证实表达出的目的蛋白具有透皮功能。(注:TD-1-EGF的构建、表达、生物学活性以及透皮活性鉴定见申请人的另一项专利申请《一种促进蛋白质类药物表皮生长因子透皮给药的方法》,申请号:201110157776.0。)
三磷酸腺苷(ATP)购自加拿大Bio Basic Inc.公司(货号AB0020)。
TD-1-EGF为已被证明的可透皮的融合蛋白质类药物,本实施例在TD-1介导的透皮融合蛋白质药物TD-1-EGF透皮给药过程中同时应用生物直接能量供应物质三磷酸腺苷(ATP),以研究ATP对于透皮融合蛋白质药物TD-1-EGF的透皮效率的影响。
取完整无破损SD大鼠(SPF级,购于安徽医科大学实验动物中心,后述实验用SD大鼠均为此来源)腹部皮肤组织,去毛后置于生理盐水(0.9%Nacl水溶液)中待用。
配制透皮药物:将纯度达到95%以上的融合蛋白TD-1-EGF(储液浓度1mg/mL),用吉尔森移液枪(Gilson,France)吸取50μL(对应融合蛋白质量为50μg),用生理盐水稀释到500μL,即透皮槽上槽100透皮药物给药浓度为100μg/ml,如图1所示,置于透皮槽上槽100作为TD-1-EGF组透皮药物。另将纯度达到95%以上的融合蛋白TD-1-EGF按100μg/ml的浓度,用生理盐水稀释到500μl,再向其中加入20mM的ATP,待ATP充分溶解后,置于Franz透皮槽上槽100作为TD-1-EGF+ATP组透皮药物。
透皮给药:将透皮槽下槽200内注满生理盐水5ml并放入一个磁力搅拌子,透皮上槽与下槽之间蒙上之前准备好的完好无损的大鼠腹部皮肤组织300,上槽内分别加入之前配好的透皮用蛋白质类药物TD-1-EGF与TD-1-EGF+ATP。将透皮槽置于Franz透皮扩散仪中,恒温37℃、磁力搅拌转速300rpm,分别在启动透皮扩散仪的5min、4h和16h从透皮槽下槽200开口处取200μl收集液400,并在5min、4h取样后分别从透皮槽下槽开口处加入200μl生理盐水维持下槽中收集液总体积不变。
检测:将各个时间点从透皮槽下槽中取出的收集液作为待检样品,使用人表皮细胞生长因子ELISA试剂盒(武汉博士德公司,商品编号:EK0325)进行定量检测。计算透皮槽下槽收集液中的huEGF含量,绘制EGF含量标准曲线,由试剂盒自身配备的EGF标准品完成。根据试剂盒说明书完成测试后,各孔OD值在酶标仪下使用450nm波长下测定吸光度值。之后可根据由试剂盒标准品绘制出的标准曲线推算出所测各时间点样品的EGF的浓度,进而推算出透皮槽下槽中的透皮药物的整体绝对透过量。
数据分析:student’s-T test进行数据分析并用Origin做图。
结果显示,对比使用相同EGF量的融合蛋白TD-1-EGF和TD-1-EGF+ATP作为透皮药物的两组,发现在透皮槽下槽中检测到的实际透皮量中,TD-1-EGF+ATP透皮组明显具有更加良好的透皮效果,TD-1-EGF+ATP组透皮药物比TD-1-EGF组透皮药物的透皮量显著增加。透皮量由TD-1-EGF组中的170.3181±45.50218pg上升到TD-1-EGF+ATP组的479.38772±90.75827pg(4小时透皮取样时间点);由398.62239±38.35124pg上升到1337.25643±241.43141pg(16小时透皮取样时间点)。在TD-1-EGF融合蛋白透皮过程中加入20mM ATP与TD-1-EGF融合蛋白透皮对照组比较具有显著性,如图2所示。
实施例2 TD-1+IFN-α-2b和TD-1+ATP+IFN-α-2b透皮药物的比较
TD-1为ACSSSPSKHCG的短肽;IFN-α-2b为人α干扰素-2b亚型(本申请中ATP帮助TD-1以混合给药方式帮助蛋白质药物透皮以人α干扰素-2b亚型为例,后文中hu-IFN-α-2b用IFN表示)。
TD-1来源于上海吉尔生化有限公司(GLS),IFN来源于安徽省安科生物工程科技股份有限公司(Anke-Bio),三磷酸腺苷(ATP)购自加拿大BioBasic Inc.公司(货号AB0020)。
IFN为已被证明的抗病毒、蛋白质类药物,本实施例在TD-1介导的透蛋白质药物IFN透皮给药过程中,同时应用生物直接能量供应物质三磷酸腺苷(ATP),以研究ATP对于蛋白质药物IFN在TD-1介导下的透皮效率的影响。
取完整无破损SD大鼠(SPF级,购于安徽医科大学实验动物中心,后述实验用SD大鼠均为此来源)腹部皮肤组织,去毛后置于生理盐水(0.9%Nacl水溶液)中待用。
配制透皮药物:将纯度达到95%以上的IFN(储液浓度1mg/mL),用吉尔森移液枪(Gilson,France)吸取50μL(对应融合蛋白质量为50μg),用生理盐水稀释到500μL,再向其中加入TD-1多肽10μg,即透皮槽上槽100透皮药物给药浓度为100μg/ml,如图1所示,置于透皮槽上槽100作为TD-1+IFN组透皮药物。另将纯度达到95%以上的IFN按100μg/ml的浓度,用生理盐水稀释到500μl,再向其中加入TD-1多肽10μg和20mM的ATP,待ATP充分溶解后,置于Franz透皮槽上槽100作为TD-1+IFN+ATP组透皮药物。
透皮给药:将透皮槽下槽200内注满生理盐水5ml并放入一个磁力搅拌子,透皮上槽100与下槽200之间蒙上之前准备好的完好无损的大鼠腹部皮肤组织300,上槽内分别加入之前配好的透皮用蛋白质类药物TD-1+IFN与TD-1+IFN+ATP。将透皮槽置于Franz透皮扩散仪中,恒温37℃、磁力搅拌转速300rpm,在启动透皮扩散仪的16h从透皮槽下槽200开口处取200μl收集液400。
检测:将各个时间点从透皮槽下槽中取出的收集液作为待检样品,使用人-α干扰素含量ELISA检测试剂盒(苏州卡尔文生物科技有限公司)进行定量检测。计算透皮槽下槽收集液中的IFN含量,绘制IFN含量标准曲线,由试剂盒自身配备的IFN标准品完成。根据试剂盒说明书完成测试后,各孔OD值在酶标仪下使用450nm波长下测定吸光度值。之后可根据由试剂盒标准品绘制出的标准曲线推算出所测各时间点样品的IFN的浓度,进而推算出透皮槽下槽中的透皮药物的整体绝对透过量。
数据分析:student’s-T test进行数据分析并用Origin做图。
结果显示,对比使用相同IFN、TD-1量的TD-1+IFN和TD-1+IFN+ATP作为透皮药物的两组,发现在透皮槽下槽中检测到的实际透皮量中,TD-1+IFN+ATP透皮组明显具有更加良好的透皮效果,TD-1+IFN+ATP组透皮药物比TD-1+IFN组透皮药物的透皮量显著增加。透皮量由TD-1+IFN组中的857.893±198.78945pg上升到TD-1+IFN+ATP组的1987.983±221.43256pg(16小时透皮取样时间点)。在TD-1+IFN蛋白透皮过程中加入20mMATP与TD-1+IFN融合蛋白透皮对照组比较具有显著性,如图3所示。
实施例3 TD-1-EGF的透皮效率与ATP剂量的关系
在TD-1介导的透皮融合蛋白质药物TD-1-EGF透皮给药过程中同时应用不同剂量(0mM-20mM)的生物直接能量供应物质三磷酸腺苷---ATP,以检测透皮融合蛋白质药物TD-1-EGF的透皮效率与ATP剂量的关系。
取完整SD大鼠腹部皮肤组织,去毛后置于生理盐水(0.9%Nacl水溶液)中待用。
配制透皮药物,方法如下:将纯度达到95%以上的融合蛋白TD-1-EGF(储液浓度1mg/mL),用吉尔森移液枪(Gilson,France)吸取50μL(对应融合蛋白质量为50μg),用生理盐水稀释到500μL,即透皮槽上槽100透皮药物给药浓度为100μg/ml,置于透皮槽上槽作为TD-1-EGF组透皮药物。另将纯度达到95%以上的融合蛋白TD-1-EGF按上述同样的方法稀释到给药浓度为100μg/ml,再向其中分别加入5mM、10mM、20mM和30mM的ATP,待ATP充分溶解后,置于Franz透皮槽上槽作为TD-1-EGF+ATP组透皮药物。
透皮给药:将透皮槽下槽内注满生理盐水5ml并放入一个磁力搅拌子,透皮上槽100与下槽200之间蒙上之前准备好的完好无损的大鼠腹部皮肤组织300,上槽内分别加入之前配好的透皮用蛋白质类药物TD-1-EGF与TD-1-EGF+ATP。将透皮槽置于Franz透皮扩散仪中,恒温37℃、磁力搅拌转速300rpm,在启动透皮扩散仪的4h从透皮槽下槽开口处取200μl收集液400。
检测:将4h时从透皮槽下槽中取出的收集液作为待检样品,使用人表皮细胞生长因子ELISA试剂盒(武汉博士德公司,商品编号:EK0325)进行定量检测。计算透皮槽下槽收集液中的huEGF含量,绘制EGF含量标准曲线,由试剂盒自身配备的EGF标准品完成。根据试剂盒说明书完成测试后,各孔OD值在酶标仪下使用450nm波长下测定吸光度值。之后可根据由试剂盒标准品绘制出的标准曲线推算出所测各时间点样品的EGF的浓度,进而推算出透皮槽下槽中的透皮药物的整体绝对透过量。
数据分析:student’s-T test进行数据分析并用Origin做图。
结果显示,对比使用不同剂量的ATP与融合蛋白TD-1-EGF作为透皮药物的两组,发现在透皮槽下槽中检测到的实际透皮量中,TD-1-EGF的透皮量与ATP的量呈正相关,EGF透皮绝对量由0mM ATP时的93.07573±32.33889pg,上升到5mM ATP时的150.45118±81.30506pg,上升到10mM ATP时的306.69786±50.76858pg,20mM ATP时的450.77399±69.43009pg,30mMATP时的662.6217±72.94506pg。在TD-1-EGF融合蛋白透皮过程中加入不同剂量的ATP与TD-1-EGF融合蛋白透皮对照组(不加入ATP透皮组)比较具有不同置信区间的显著性,如图4所示。
实施例4 TD-1介导IFN的透皮效率与ATP剂量的关系
在TD-1介导的蛋白质药物IFN透皮给药过程中同时应用不同剂量(0mM-20mM)的生物直接能量供应物质三磷酸腺苷---ATP,以检测TD-1介导的蛋白质药物IFN的透皮效率与ATP剂量的关系。
取完整无破损SD大鼠(SPF级,购于安徽医科大学实验动物中心,后述实验用SD大鼠均为此来源)腹部皮肤组织,去毛后置于生理盐水(0.9%Nacl水溶液)中待用。
配制透皮药物:将纯度达到95%以上的IFN(储液浓度1mg/mL),用吉尔森移液枪(Gilson,France)吸取50μL(对应融合蛋白质量为50μg),用生理盐水稀释到500μL,再向其中加入TD-1多肽10μg,即透皮槽上槽100透皮药物给药浓度为100μg/ml,如图1所示,置于透皮槽上槽100作为TD-1+IFN组透皮药物。另将纯度达到95%以上的IFN按100μg/ml的浓度,用生理盐水稀释到500μl,再向其中加入TD-1多肽10μg和2mM、5mM、10mM和20mM的ATP,待ATP充分溶解后,置于Franz透皮槽上槽100作为TD-1+IFN+ATP组透皮药物。
透皮给药:将透皮槽下槽200内注满生理盐水5ml并放入一个磁力搅拌子,透皮上槽与下槽之间蒙上之前准备好的完好无损的大鼠腹部皮肤组织300,上槽内分别加入之前配好的透皮用蛋白质类药物TD-1+IFN与TD-1+IFN+ATP。将透皮槽置于Franz透皮扩散仪中,恒温37℃、磁力搅拌转速300rpm,在启动透皮扩散仪的16h从透皮槽下槽200开口处取200μl收集液400。
检测:将各个时间点从透皮槽下槽中取出的收集液作为待检样品,使用人-α干扰素含量ELISA检测试剂盒(苏州卡尔文生物科技有限公司)进行定量检测。计算透皮槽下槽收集液中的IFN含量,绘制IFN含量标准曲线,由试剂盒自身配备的IFN标准品完成。根据试剂盒说明书完成测试后,各孔OD值在酶标仪下使用450nm波长下测定吸光度值。之后可根据由试剂盒标准品绘制出的标准曲线推算出所测各时间点样品的EGF的浓度,进而推算出透皮槽下槽中的透皮药物的整体绝对透过量。
数据分析:student’s-T test进行数据分析并用Origin做图。
结果显示,对比使用相同IFN、TD-1量的TD-1+IFN和TD-1+IFN+ATP作为透皮药物的两组,发现在透皮槽下槽中检测到的实际透皮量中,TD-1+IFN+ATP透皮组明显具有更加良好的透皮效果,透皮绝对量由2mMATP时的837.321±138.3355pg上升到5mMATP时的1287.983±201.2656pg,10mM ATP时的1887.983401.265pg上升到450.77399±69.43009pg,20mMATP时的2098.983±311.256pg。在TD-1介导的IFN透皮过程中加入不同剂量的ATP与TD-1单独介导IFN透皮对照组(不加入ATP透皮组)比较具有不同置信区间的显著性,如图5所示。
实施例5 融合蛋白透过人类皮肤组织过程中TD-1-EGF和TD-1-EGF+ATP的比较
在TD-1介导的透皮融合蛋白质药物TD-1-EGF穿透人类皮肤组织给药过程中同时应用生物直接能量供应物质三磷酸腺苷(ATP),以提高透皮融合蛋白质药物TD-1-EGF的透皮效率。
健康的成年男性3人,取外科手术后腋窝皮肤组织置于生理盐水(0.9%Nacl水溶液)中待用。
配制透皮药物:将纯度达到95%以上的融合蛋白TD-1-EGF(储液浓度1mg/mL),用吉尔森移液枪(Gilson,France)吸取50μL(对应融合蛋白质量为50μg),用生理盐水稀释到500μL,即透皮槽上槽100透皮药物给药浓度为100μg/ml,置于透皮槽上槽作为TD-1-EGF组透皮药物。另将纯度达到95%以上的融合蛋白TD-1-EGF按上述同样方法稀释到给药浓度为100μg/ml,再向其中加入20mM的ATP,待ATP充分溶解后,置于Franz透皮槽上槽作为TD-1-EGF+ATP组透皮药物。
透皮给药:将透皮槽下槽内注满生理盐水5ml并放入一个磁力搅拌子,透皮上槽100与下槽200之间蒙上之前准备好的完好无损的健康成年男性皮肤组织300,上槽内分别加入之前配好的透皮用蛋白质类药物TD-1-EGF与TD-1-EGF+ATP。将透皮槽置于Franz透皮扩散仪中,恒温37℃、磁力搅拌转速300rpm,在启动透皮扩散仪的16h从透皮槽下槽开口处取200μl收集液400。
检测:将各个时间点从透皮槽下槽中取出的收集液作为待检样品,使用人表皮细胞生长因子ELISA试剂盒(武汉博士德公司,商品编号:EK0325)进行定量检测。计算透皮槽下槽收集液中的huEGF含量,绘制EGF含量标准曲线,由试剂盒自身配备的EGF标准品完成。根据试剂盒说明书完成测试后,各孔OD值在酶标仪下使用450nm波长下测定吸光度值。之后可根据由试剂盒标准品绘制出的标准曲线推算出所测各时间点样品的EGF的浓度,进而推算出透皮槽下槽中的透皮药物的整体绝对透过量。
数据分析:student’s-T test进行数据分析并用Origin做图。
结果显示,对比使用相同EGF量的融合蛋白TD-1-EGF和TD-1-EGF+ATP作为人类皮肤组织透皮药物的两组,发现在透皮槽下槽中检测到的实际透皮量中,TD-1-EGF+ATP透皮组明显具有更加良好的透皮效果,TD-1-EGF+ATP组透皮药物比TD-1-EGF组透皮药物的透皮量显著增加。透皮16小时后,透皮量由TD-1-EGF组中的30.88033±19.55883pg上升到TD-1-EGF+ATP组的101.59833±2.92836pg。在TD-1-EGF融合蛋白透皮过程中加入20mM ATP与TD-1-EGF融合蛋白透皮对照组比较具有显著性,如图6所示。
实施例6 TD-1介导IFN穿透人类皮肤组织过程中添加ATP与不添加ATP的透皮效果比较
在TD-1介导的蛋白质药物IFN透皮给药过程中同时应用不同剂量(0mM-20mM)的生物直接能量供应物质三磷酸腺苷---ATP,以检测TD-1介导的蛋白质药物IFN的透皮效率与ATP剂量的关系。
健康的成年男性3人,取外科手术后腋窝皮肤组织置于生理盐水(0.9%Nacl水溶液)中待用。
配制透皮药物:将纯度达到95%以上的IFN(储液浓度1mg/mL),用吉尔森移液枪(Gilson,France)吸取50μL(对应融合蛋白质量为50μg),用生理盐水稀释到500μL,再向其中加入TD-1多肽10μg,即透皮槽上槽100透皮药物给药浓度为100μg/ml,如图1所示,置于透皮槽上槽100作为TD-1+IFN组透皮药物。另将纯度达到95%以上的IFN按100μg/ml的浓度,用生理盐水稀释到500μl,再向其中加入TD-1多肽10μg和20mM的ATP,待ATP充分溶解后,置于Franz透皮槽上槽100作为TD-1+IFN+ATP组透皮药物。
透皮给药:透皮给药:将透皮槽下槽200内注满生理盐水5ml并放入一个磁力搅拌子,透皮上槽与下槽之间蒙上之前准备好的完好无损的大鼠腹部皮肤组织300,上槽内分别加入之前配好的透皮用蛋白质类药物TD-1+IFN与TD-1+IFN+ATP。将透皮槽置于Franz透皮扩散仪中,恒温37℃、磁力搅拌转速300rpm,在启动透皮扩散仪的4h从透皮槽下槽200开口处取200μl收集液400。
检测:将各个时间点从透皮槽下槽中取出的收集液作为待检样品,使用人-α干扰素含量ELISA检测试剂盒(苏州卡尔文生物科技有限公司)进行定量检测。计算透皮槽下槽收集液中的IFN含量,绘制IFN含量标准曲线,由试剂盒自身配备的IFN标准品完成。根据试剂盒说明书完成测试后,各孔OD值在酶标仪下使用450nm波长下测定吸光度值。之后可根据由试剂盒标准品绘制出的标准曲线推算出所测各时间点样品的EGF的浓度,进而推算出透皮槽下槽中的透皮药物的整体绝对透过量。
数据分析:student’s-T test进行数据分析并用Origin做图。
结果显示,对比使用相同IFN、TD-1量的TD-1+IFN和TD-1+IFN+ATP作为透皮药物的两组,发现在透皮槽下槽中检测到的实际透皮量中,TD-1+IFN+ATP透皮组明显具有更加良好的透皮效果,透皮绝对量由不添加ATP时的138.893±56.78392pg上升到添加ATP时的388.356±122.6756pg。在TD-1介导的IFN透皮过程中加入ATP与TD-1单独介导IFN透皮对照组(不加入ATP透皮组)比较具有不同置信区间的显著性,如图7所示。
实施例7 乌本苷对透皮效率的影响
在TD-1介导的透皮融合蛋白质药物TD-1-EGF以及IFN透皮给药过程中同时应用生物体水解ATP的ATP酶抑制剂---乌本苷(Ouabain),以检测ATP水解受到抑制,即ATP实际可利用量较少后,透皮融合蛋白质药物TD-1-EGF以及IFN的透皮效率是否受到影响。
取完整SD大鼠腹部皮肤组织,去毛后置于生理盐水(0.9%Nacl水溶液)中待用。
配制透皮药物:将纯度达到95%以上的融合蛋白TD-1-EGF(储液浓度1mg/mL),用吉尔森移液枪(Gilson,France)吸取50μL(对应融合蛋白质量为50μg),用生理盐水稀释到500μL,即透皮槽上槽100透皮药物给药浓度为100μg/ml,置于透皮槽上槽作为TD-1-EGF组透皮药物。另将纯度达到95%以上的融合蛋白TD-1-EGF按上述同样方法稀释到给药浓度为100μg/ml,再向其中加入50mM的乌本苷,待乌本苷充分溶解后,置于Franz透皮槽上槽100作为TD-1-EGF+ouabain组透皮药物。
将纯度达到95%以上的IFN(储液浓度1mg/mL),用吉尔森移液枪(Gilson,France)吸取50μL(对应融合蛋白质量为50μg),用生理盐水稀释到500μL,再向其中加入TD-1多肽10μg,置于Franz透皮槽上槽100作为TD-1+IFN组透皮药物。另将纯度达到95%以上的IFN、TD-1按上述同样方法稀释到给药浓度,再向其中加入50mM的乌本苷,待乌本苷充分溶解后,置于Franz透皮槽上槽100作为TD-1+IFN+ouabain组透皮药物。
透皮给药:将透皮槽下槽内注满生理盐水5ml并放入一个磁力搅拌子,透皮上槽100与下槽200之间蒙上之前准备好的完好无损的大鼠腹部皮肤组织300,上槽内分别加入之前配好的透皮用蛋白质类药物TD-1-EGF与TD-1-EGF+Ouabain、TD-1+IFN和TD-1+IFN+Ouabain。将透皮槽置于Franz透皮扩散仪中,恒温37℃、磁力搅拌转速300rpm,在启动透皮扩散仪的4h从透皮槽下槽开口处取200μl收集液400。
检测:将各个时间点从透皮槽下槽中取出的收集液作为待检样品,使用人表皮细胞生长因子ELISA试剂盒(武汉博士德公司,商品编号:EK0325)和人-α干扰素含量ELISA检测试剂盒(苏州卡尔文生物科技有限公司)进行定量检测。计算透皮槽下槽收集液中的huEGF、IFN含量,绘制EGF、IFN含量标准曲线,分别由试剂盒自身配备的EGF及IFN标准品完成。根据试剂盒说明书完成测试后,各孔OD值在酶标仪下使用450nm波长下测定吸光度值。之后可根据由试剂盒标准品绘制出的标准曲线推算出所测各时间点样品的EGF和IFN的浓度,进而推算出透皮槽下槽中的透皮药物的整体绝对透过量。
数据分析:student’s-T test进行数据分析并用Origin做图。
结果显示,对比使用相同EGF量的融合蛋白TD-1-EGF和TD-1-EGF+Ouabain作为透皮药物的两组,发现在透皮槽下槽中检测到的实际透皮量中,TD-1-EGF+ouabain透皮组的透皮效果受到明显抑制,透皮量由TD-1-EGF组中的152.05±56.7109pg下降到TD-1-EGF+Ouabain组的28.06233±6.4581pg。在TD-1-EGF融合蛋白透皮过程中加入50mM Ouabain与TD-1-EGF融合蛋白透皮对照组比较具有显著性。对比使用相同IFN、TD-1量的TD-1+IFN和TD-1+IFN+Ouabain作为透皮药物的两组,发现在透皮槽下槽中检测到的实际透皮量中,TD-1+IFN透皮组明显具有更加良好的透皮效果,透皮绝对量由不添加Ouabain时的1987.983pg±568.38692pg下降到添加Ouabain时的588.356±282.6668pg。在TD-1介导、ATP增强的IFN透皮过程中加入Ouabain与TD-1介导、ATP增强的IFN透皮过程中不加入Ouabain比较具有不同置信区间的显著性,如图8、9所示。
实施例8原核表达Na+,K+ATPaseβsubunit(ATP1B1)对透皮效率的影响
在TD-1介导的透皮融合蛋白质药物TD-1-EGF及TD-1介导的蛋白质药物IFN透皮给药过程中同时应用生物直接能量供应物质三磷酸腺苷(ATP),并在透皮过程中添加原核表达的Na+,K+ATPaseβsubunit(ATP1B1),以检测外源Na+,K+ATPaseβsubunit是否对ATP促透效率有影响,从而评估大鼠皮肤内源性Na+,K+ATPaseβsubunit在ATP增强、TD-1介导的蛋白质药物透皮给药是否具有重要的作用。
取完整SD大鼠腹部皮肤组织,去毛后置于生理盐水(0.9%Nacl水溶液)中待用。
配制透皮药物:将纯度达到95%以上的融合蛋白TD-1-EGF(储液浓度1mg/mL),用吉尔森移液枪(Gilson,France)吸取50μL(对应融合蛋白质量为50μg),用生理盐水稀释到500μL,即透皮槽上槽100透皮药物给药浓度为100μg/ml,再向其中加入原核表达产物GST蛋白20μg(表达载体为pGex-6P-1,Pharmacia,USA,Cat.No.27-4597-01,诱导剂为IPTG,BBI,Canada.Cat.No.IB0168,诱导过程如下:转化pGex-6p-1质粒于BL-21-DE3感受态细胞,Transgen,China,Cat.No.CB305,接种至LB培养基,待OD值达到0.6-0.8之间,加入1mM IPTG,25℃诱导5小时,高压破碎细菌后收集蛋白,使用BCA试剂盒Beyotime,China,Cat.No.P0010S定量蛋白浓度),置于透皮槽上槽100作为TD-1-EGF+GST组透皮药物。另将纯度达到95%以上的融合蛋白TD-1-EGF按上述同样方法稀释到给药浓度为100μg/ml,再向其中加入原核表达产物GST-ATP1B1蛋白20μg(表达载体为pGex-6P-1,Pharmacia,USA,Cat.No.27-4597-01,诱导剂为IPTG,BBI,Canada.Cat.No.IB0168,诱导过程如下:转化pGex-6p-1-ATP1B1质粒于BL-21-DE3感受态细胞,Transgen,China,Cat.No.CB305,接种至LB培养基,待OD值达到0.6-0.8之间,加入1mM IPTG,25℃诱导5小时,高压破碎细菌后收集蛋白,使用BCA试剂盒Beyotime,China,Cat.No.P0010S定量蛋白浓度),置于透皮槽上槽100作为TD-1-EGF+GST-ATP1B1组透皮药物。。
将纯度达到95%以上的蛋白IFN(储液浓度1mg/mL),用吉尔森移液枪(Gilson,France)吸取50μL(对应融合蛋白质量为50μg),用生理盐水稀释到500μL,即透皮槽上槽100透皮药物给药浓度为100μg/ml,向其中加入TD-1多肽10μg后再向其中加入原核表达产物GST蛋白20μg(表达载体为pGex-6P-1,Pharmacia,USA,Cat.No.27-4597-01,诱导剂为IPTG,BBI,Canada.Cat.No.IB0168,诱导过程如下:转化pGex-6p-1质粒于BL-21-DE3感受态细胞,Transgen,China,Cat.No.CB305,接种至LB培养基,待OD值达到0.6-0.8之间,加入1mM IPTG,25℃诱导5小时,高压破碎细菌后收集蛋白,使用BCA试剂盒Beyotime,China,Cat.No.P0010S定量蛋白浓度),置于透皮槽上槽100作为TD-1+IFN+GST组透皮药物。另将纯度达到95%以上的蛋白IFN按上述同样方法稀释到给药浓度为100μg/ml,向其中加入TD-1多肽10μg后再向其中加入原核表达产物GST-ATP1B1蛋白20μg(表达载体为pGex-6P-1,Pharmacia,USA,Cat.No.27-4597-01,诱导剂为IPTG,BBI,Canada.Cat.No.IB0168),诱导过程如下:转化pGex-6p-1-ATP1B1质粒于BL-21-DE3感受态细胞,Transgen,China,Cat.No.CB305,接种至LB培养基,待OD值达到0.6-0.8之间,加入1mM IPTG,25℃诱导5小时,高压破碎细菌后收集蛋白,使用BCA试剂盒Beyotime,China,Cat.No.P0010S定量蛋白浓度),置于透皮槽上槽100作为TD-1+IFN+GST-ATP1B1组透皮药物。
透皮给药:将透皮槽下槽内注满生理盐水5ml并放入一个磁力搅拌子,透皮上槽100与下槽200之间蒙上之前准备好的完好无损的大鼠腹部皮肤组织300,上槽内分别加入之前配好的透皮用蛋白质类药物TD-1-EGF+GST与TD-1-EGF+GST-ATP1B1、TD-1+IFN+GST和TD-1+IFN+GST-ATP1B1。将透皮槽置于Franz透皮扩散仪中,恒温37℃、磁力搅拌转速300rpm,在启动透皮扩散仪的4h从透皮槽下槽开口处取200μl收集液400。
检测:将各个时间点从透皮槽下槽中取出的收集液作为待检样品,使用人表皮细胞生长因子ELISA试剂盒(武汉博士德公司,商品编号:EK0325)和人-α干扰素含量ELISA检测试剂盒(苏州卡尔文生物科技有限公司)进行定量检测。计算透皮槽下槽收集液中的huEGF、IFN含量,绘制EGF、IFN含量标准曲线,分别由试剂盒自身配备的EGF及IFN标准品完成。根据试剂盒说明书完成测试后,各孔OD值在酶标仪下使用450nm波长下测定吸光度值。之后可根据由试剂盒标准品绘制出的标准曲线推算出所测各时间点样品的EGF和IFN的浓度,进而推算出透皮槽下槽中的透皮药物的整体绝对透过量。
数据分析:student’s-T test进行数据分析并用Origin做图。
结果显示,对比使用相同EGF量的融合蛋白TD-1-EGF和TD-1-EGF+Ouabain作为透皮药物的两组,发现在透皮槽下槽中检测到的实际透皮量中,TD-1-EGF+GST-ATP1B1透皮组的透皮效果受到明显抑制,透皮量由TD-1-EGF+GST组中的225.45216±38.8978pg下降到TD-1-EGFTD-1-EGF+GST-ATP1B1组的71.81568±17.3321pg。在TD-1-EGF+GST融合蛋白透皮过程组与TD-1-EGF+GST-ATP1B1融合蛋白透皮对照组比较具有显著性。对比使用相同IFN、TD-1量的TD-1+IFN+GST和TD-1+IFN+GST-ATP1B1作为透皮药物的两组,发现在透皮槽下槽中检测到的实际透皮量中,TD-1+IFN+GST透皮组明显具有更加良好的透皮效果,透皮绝对量由267.987pg±89.89843pg下降到添加GST-ATP1B1时的78.8989±33.8987pg。在TD-1介导的IFN透皮过程中加入GST与TD-1介导的IFN透皮过程中加入GST-ATP1B1比较具有不同置信区间的显著性,如图10所示。
实施例9不同能量形式作为透皮药物的对比
在TD-1介导的透皮融合蛋白质药物TD-1-EGF透皮给药过程中同时应用生物直接能量供应物质三磷酸腺苷(ATP),以及各种ATP结构类似能量供应物,如ADP、AMP、ATP-γ-S、GTP、AMP-PNP等,以检测诸多ATP结构类似物型能量供应物对透皮融合蛋白质药物TD-1-EGF、IFN的透皮效率是否有影响。
取完整SD大鼠腹部皮肤组织,去毛后置于生理盐水(0.9%Nacl水溶液)中待用。
配制透皮药物:将纯度达到95%以上的融合蛋白TD-1-EGF(储液浓度1mg/mL),用吉尔森移液枪(Gilson,France)吸取60μL(对应融合蛋白质量为60μg),用生理盐水稀释到500μL,即透皮槽上槽100透皮药物给药浓度为120μg/ml,置于透皮槽上槽100作为TD-1-EGF组透皮药物。另将纯度达到95%以上的融合蛋白TD-1-EGF按上述同样方法稀释到给药浓度为120μg/ml,再向其中加入10mM的ATP、ADP(BBI,AD0016D)以及AMP(BBI,AD0016M)。将纯度达到95%以上的蛋白IFN(储液浓度1mg/mL),用吉尔森移液枪(Gilson,France)吸取50μL(对应蛋白质量为50μg),加入TD-1多肽10μg,用生理盐水稀释到500μL,即透皮槽上槽100透皮药物给药浓度为100μg/ml,置于透皮槽上槽100作为TD-1+IFN组透皮药物。另将纯度达到95%以上的蛋白IFN和10μg TD-1按上述同样方法稀释到给药浓度为100μg/ml,再向其中加入10mM的ATP、GTP(BBI,GD0250T)、ATP-γ-S(Sigma-Aldrich,A1388)、AMP-PNP(Sigma-Aldrich,A2647)。待各个能量形式化合物充分溶解后,置于Franz透皮槽上槽100作为TD-1-EGF+不同能量形式组(ATP、ADP、AMP)和TD-1+IFN+不同能量形式组(GTP、ATP-γ-S、AMP-PNP)透皮药物。
透皮给药:将透皮槽下槽内注满生理盐水5ml并放入一个磁力搅拌子,透皮上槽100与下槽200之间蒙上之前准备好的完好无损的大鼠腹部皮肤组织300,上槽内分别加入之前配好的透皮用蛋白质类药物TD-1-EGF与TD-1-EGF+不同能量形式组(ATP、ADP、AMP)以及TD-1+IFN与TD-1+IFN+不同能量形式组(GTP、ATP-γ-S、AMP-PNP)。将透皮槽置于Franz透皮扩散仪中,恒温37℃、磁力搅拌转速300rpm,分别在启动透皮扩散仪的4h和16h从透皮槽下槽开口处取200μl收集液400,并在4h取样后分别从透皮槽下槽开口处加入200μl生理盐水维持下槽中收集液总体积不变(IFN仅检测4小时时间点)。
检测:将各个时间点从透皮槽下槽中取出的收集液作为待检样品,使用人表皮细胞生长因子ELISA试剂盒(武汉博士德公司,商品编号:EK0325)和人-α干扰素含量ELISA检测试剂盒(苏州卡尔文生物科技有限公司)进行定量检测。计算透皮槽下槽收集液中的huEGF、IFN含量,绘制EGF、IFN含量标准曲线,由试剂盒自身配备的EGF标准品完成。根据试剂盒说明书完成测试后,各孔OD值在酶标仪下使用450nm波长下测定吸光度值。之后可根据由试剂盒标准品绘制出的标准曲线推算出所测各时间点样品的EGF、IFN的浓度,进而推算出透皮槽下槽中的透皮药物的整体绝对透过量。
数据分析:student’s-T test进行数据分析并用Origin做图。
结果显示,对比使用相同EGF量的融合蛋白TD-1-EGF和TD-1-EGF+不同能量形式(ATP、ADP、AMP等)作为透皮药物的两组,如图11所示,发现在透皮槽下槽中检测到的实际透皮量中,TD-1-EGF+ATP透皮组明显具有更加良好的透皮效果,透皮量由409.3749±96.35405pg上升到752.08325±31.77075pg,而TD-1-EGF+ADP组是376.5625±58.33335pg,TD-1-EGF+AMP组则是240.625±97.39585pg(4小时透皮取样时间点);由TD-1-EGF组中的458.85425±104.16675pg上升到TD-1-EGF+ATP组的1294.7915±214.0625pg,而TD-1-EGF+ADP组是490.625±10.9375pg,TD-1-EGF+AMP组则是397.3958±113.5417pg(16小时透皮取样时间点)。在TD-1-EGF融合蛋白透皮过程中加入10mMATP与加入ADP、AMP以及TD-1-EGF融合蛋白透皮对照组比较具有显著性。
对比使用相同IFN量的融合蛋白TD-1+IFN和TD-1+IFN+不同能量形式(GTP、ATP-γ-S、AMP-PNP等)作为透皮药物的两组,如图12所示,发现在透皮槽下槽中检测到的实际透皮量中,TD-1+IFN+ATP透皮组明显具有更加良好的透皮效果,透皮量由256.3767±66.35405pg上升到732.05375±109.77565pg,而TD-1+IFN+ATP-γ-S组是387.2317±85.367pg,TD-1+IFN+ATP-γ-S组是356.5625±125.3565pg,TD-1+IFN+AMP-PNP组则是220.525±103.56pg(4小时透皮取样时间点)。在TD-1介导IFN蛋白透皮过程中加入10mM ATP与加入ATP-γ-S、AMP-PNP以及TD-1单独介导IFN蛋白透皮对照组比较具有显著性。
本发明的方法是通过在蛋白质药物经TD-1透皮输运的系统中,引入三磷酸腺苷(ATP),以达到显著提高蛋白质药物在TD-1介导下经皮肤运输的能力,同时由于ATP是人体内各个器官的直接供能以及储能物质,生物安全性优于任何一种物理、化学促透装置或试剂,所以具有良好的增强透皮药物运输的临床应用前景。
根据本发明公开的上述实施例,本发明的至少两种透皮给药增强剂以及三磷酸腺苷(ATP)的组合可以与常规经皮方式给药的药物联合使用,以提高药物的透皮效果,这里的药物活性制剂可以是适合局部或透皮释放的一些能够导致理想的局部或系统的效果符合物和传统药物。一些物质包括许多复合物或者药物能够正常地通过包括皮肤在内的皮肤表面和其它膜系统。活性制剂包括更多的种类与可以仿效的得到的种类:老年痴呆药物;止痛制剂如镇静剂;麻醉剂;抗抗粉刺剂;抗忧虑药;抗风湿药;抗心律失常药;平喘药和其它呼吸系统药物;抗生素包括细菌制剂;抗癌制剂包括抗肿瘤药;抗糖尿病药(胰岛素等);抗代谢异常药(生长激素等);抗痛风药;解热止痛抗炎药;抗性功能障碍药;中草药;催产药;催产拮抗药;短、长效避孕药;节育药;麻醉药;全身骨骼肌松弛药;皮肤病治疗药;抗寄生虫药;抗病毒药;角质促成剂;抗青光眼药;散瞳用药;中枢神经兴奋、抑制药;抗癫痫药;抗震颤麻痹药;植物神经及神经肌内接药;心脑血管病治疗药;镇痛药;镇静催眠药;利尿药;助消化类药;止泻药等一切含有蛋白质类药物的有形成分的中药、西药物。这对于本领域的技术人员来说是显而易见的,因此同样属于本发明的范围。另外需要指出的是本发明的至少两种透皮给药增强剂以及三磷酸腺苷(ATP)的组合可以与常规经皮方式给药的药物联合使用,以提高药物的透皮效果,这里的药物活性制剂可以是适合局部或透皮释放的一些能够导致理想的局部或系统的效果符合物和传统药物,也可以是导致理想的局部或系统的效果符合物和新定义下的“药物”,如各种在化妆品和护肤品中应用广泛的具有一定生物学药理学“药用”功能的“药物”,包括但不限于实施例中优选的蛋白---人表皮生长因子(EGF),EGF收缩毛孔、抗皱作用十分显著,原因是EGF能促进表皮细胞组织内多种细胞的生长分裂,使表皮细胞变得饱满、恢复年轻状态,它还可以促使胶原蛋白生长能力,修复老化断裂的胶原弹性纤维,所以被众多科学家誉为“美丽因子”,此外还可以作为药物帮助伤口的愈合和修复。此外,成纤维细胞生长因子(FGF),包括碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)均属于本发明涵盖的“为透皮给药增强剂以及三磷酸腺苷(ATP)组合所增强的常规经皮方式给药的药物”,即不仅限于增强经皮给药药物的临床利用率,增强一些重要的蛋白质类生长因子的透皮吸收途径等也属于本发明的发明内容范围之内。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,如本发明包括但不限于实施例中优选的透皮增强剂(TD-1)、三磷酸腺苷(ATP)、经皮给药药物的药物比例,同样包括但不限于实施例中优选的透皮增强剂(TD-1)、三磷酸腺苷(ATP)、经皮给药药物的药物剂型,各种药物可以是液体形式、胶剂、膏剂、洗剂、贴剂等以及各种药物剂型的不同组合。即本发明的透皮释放成分含有可以令人接受材料和/或一个或多个佐剂组成的一个或多个药理学上令人接受的药物载体。上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。