CN101962413A - 具有透皮能力和白细胞介素-10活性的融合蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了具有透皮能力和白细胞介素-10活性的融合蛋白及其编码基因与应用。本发明提供了一种融合蛋白，是在人白细胞介素10蛋白的羧基末端连接如下任一所述蛋白，且在氨基末端连接转运肽形成的融合蛋白：1)人IgG Fc-γ1或其突变蛋白；2)人IgG Fc-γ2或其突变蛋白；所述人白细胞介素10蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2自氨基末端第12-171位的氨基酸序列；所述转运肽的氨基酸序列为序列表中序列2自氨基末端第1-11位的氨基酸序列。本发明的实验证明，本发明提供了一种同时具有透皮能力和白细胞介素10活性的融合蛋白，在治疗自身免疫性反应特别是银屑病药物的制备领域具有较大的实际意义和广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及融合蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及由具有“转运肽”和人白细胞介素-10活性的融合蛋白及其编码基因，以及该融合蛋白的表达方法和在制备治疗自身免疫性反应特别是银屑病药物中的应用。
背景技术
白细胞介素-10(Interleukin-10，IL-10)是一种多功能的细胞因子，能够抑制T细胞介导的免疫炎症反应，参与体液免疫调节。研究表明，IL-10在组织特异性自身免疫性损伤的启动和发展中起着关键性作用，并已应用于包括I型糖尿病、银屑病、类风湿关节炎、多发性硬化、丙型肝炎等多种免疫性疾病的临床实验研究。其中对银屑病的治疗效果表现最为明显，欧美国家均已完成II期临床观察。
然而细胞因子这样具有生物活性的药物，半衰期太短，例如IL-10在体内的半衰期仅仅2-3h，蛋白很快被清除，无法持续发挥治疗作用，因而需要大剂量地频繁使用才能达到有效的治疗浓度，然而如此频繁用药很不方便且很痛苦，以致某些患者无法忍受该药物治疗。因此，迫切需要疗效显著，半衰期长且毒副作用小的IL-10。
同时在II期临床观察中也发现，IL-10使用剂量小则治疗效果差；而提高剂量则产生明显副作用。其原因主要由于注射给药是目前蛋白质类药物的唯一给药途径，而由于IL-10属强天然免疫抑制剂，系统性注射给药时，可导致全身免疫抑制而出现副作用。
TD-1是最新发现的一个含有11个氨基酸的透皮多肽，可帮助生物大分子(如胰岛素、生长激素和荧光素)透过皮肤，进入血液循环，是目前发现的唯一透皮多肽，被认为具有改变蛋白质药物给药途径的创新性突破。
因此，TD1成为了IL-10改变给药途径治疗银屑病的新切入点。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种融合蛋白及其编码基因。
本发明提供的融合蛋白，命名为TD1-IL10-IgG/Fc-γ1，人工合成，是在人白细胞介素10-蛋白的羧基末端连接如下任一所述蛋白，且在氨基末端连接转运肽形成的融合蛋白：
1)人IgG Fc-γ1或其突变蛋白；
2)人IgG Fc-γ2或其突变蛋白；
所述人白细胞介素-10蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2自氨基末端第12-171位的氨基酸序列；
所述转运肽(TD1)的氨基酸序列为序列表中序列2自氨基末端第1-11位的氨基酸序列。
所述融合蛋白为如下1)或2)的蛋白：
1)序列表中的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白；
2)将序列2的氨基酸序列经过几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有透皮能力和人白细胞介素-10活性的由1)衍生的蛋白。
上述序列表中序列2由403个氨基酸残基组成，自氨基(N)端第1-11位为TD-1的氨基酸残基序列，自氨基端第12-171位为人IL-10的氨基酸残基序列，自氨基端第172-403位为人IgG Fc-γ1的氨基酸残基序列。所述几个氨基酸残基的取代、缺失或添加为不超过10个氨基酸残基的取代、缺失或添加。
编码上述具有透皮能力和白细胞介素-10活性的融合蛋白的基因(TD1-IL10-IgG/Fc-γ1)也属于本发明的保护范围，是下述1)-4)中任一所述基因：
1)序列表中序列1所示的DNA分子；
2)序列表中序列1自5’末端第256-1464位核苷酸所示的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码具有透皮能力和人白细胞介素-10活性蛋白所示的DNA分子；
4)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交的且编码具有透皮能力和人白细胞介素-10活性蛋白所示的DNA分子。
所述严格条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。
上述序列表中的序列1由1464个碱基组成，其编码序列为序列1自5’末端第1-1464位碱基，序列1自5’末端第1-255位碱基为具有Kex2单一蛋白酶酶切位点的α-Factor信号肽片段的编码序列，序列1自5’末端第256-288位碱基为转运肽TD1的编码序列，序列1自5’末端第289-768位碱基为人IL-10的编码序列，序列1自5’末端第769-1464位碱基为人IgG Fc-γ1的编码序列。
含有所述融合蛋白的编码基因的重组表达载体、转基因细胞系、表达盒或重组菌均属于本发明的保护范围。
所述重组表达载体为将所述融合蛋白的编码基因插入pPIC9K的BamH I和EcoR I的识别位点间，得到重组表达载体pPIC9K-TD1-IL10-Fc-γ1。
用于构建所述重组表达载体的出发载体为任意一种可在毕赤酵母中表达外源基因的重组表达载体，如pPIC9K、pPIC9、pPIC3、pPICZ α、pHIL-D1、pA0804、pA0815或pPSC3K等。
所述重组菌为将所述的重组表达载体导入宿主菌得到的重组菌，所述宿主菌优选为毕氏酵母，所述毕氏酵母尤其优选为GS115、KM71或SMD1168。
扩增上述融合蛋白编码基因中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
本发明的另一个目的是提供了一种制备所述融合蛋白的方法。
本发明提供的方法包括如下步骤：
1)诱导培养所述重组菌，离心收集上清液；
2)纯化步骤1)获得的上清液，得到融合蛋白；
在步骤1)中，所述诱导培养的温度为30℃，所述诱导所用的培养基为添加有甲醇的培养基，所述甲醇在所述诱导所用的培养基中的浓度为0.5％(体积百分含量)，所述诱导方式为：每隔24h补加甲醇至终浓度为0.5％(体积百分含量)；
在步骤2)中，所述纯化的方式为：依次进行亲和层析和分子筛层析，所述亲和层析的层析柱优选为Mabselect，所述分子筛层析的层析柱优选为S200HR预装柱；
所述亲和层析的洗脱液为浓度为50mM、pH为3.5的醋酸钠水溶液；
所述分子筛层析的洗脱液由17.55g氯化钠和1000ml浓度为20mM、pH为8.0的Tris·HCl缓冲液组成。
所述的融合蛋白在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用；或所述融合蛋白的编码基因在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用；或所述的融合蛋白在制备抑制IFN-γ产生的抑制剂中的应用；或所述融合蛋白的编码基因在制备抑制IFN-γ产生的抑制剂中的应用；上述应用均为本发明保护的范围。
上述应用中，所述自身免疫性疾病为银屑病。
本发明的第三个目的是提供一种治疗自身免疫性疾病药物和一种抑制IFN-γ产生的抑制剂。
本发明提供的治疗自身免疫性疾病药物，其活性成分为所述的融合蛋白、所述融合蛋白的编码基因或所述的重组表达载体。
本发明提供的抑制IFN-γ产生的抑制剂，其活性成分为所述的融合蛋白、所述融合蛋白的编码基因或所述的重组表达载体。
需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、吸收促进剂或吸附载体等。
本发明的药物可以制成涂抹膏剂，可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明为解决上述IL-10治疗银屑病中的问题，设计了TD1-IL10-Fc融合蛋白的方案，希望利用TD-1透皮的运载能力和缓释效果，通过局部透皮给药方式，达到增加局部药物浓度、同时避免系统性免疫抑制剂所致副作用的治疗效果。希望以此这项研究为模型，建立蛋白质药物透皮给药的新途径。
本发明建立了酵母表达体系，获得了纯化的TD1-IL10-Fc融合蛋白；体外透皮实验证实，TD1-IL10-Fc具有良好的免疫抑制活性，并可透过皮肤，进入血液。本发明的实验证明，利用毕赤酵母发酵表达系统，生产出具有透皮能力和白细胞介素10活性的融合蛋白TD1-IL10-IgG/Fc融合蛋白，为下一步临床前研究TD1-IL10-IgG/Fc融合蛋白的治疗作用打好基础。
本发明的实验证明，本发明提供了的具有透皮能力和白细胞介素-10活性的融合蛋白，表达量可达10mg/L，易纯化，生产周期短，生产规模容易放大，制备成本较低的优点。基于上述优点，本发明的融合蛋白及其编码基因在医学和生物制药领域，尤其是在治疗自身免疫性反应特别是银屑病药物的制备领域具有较大的实际意义和广阔的应用前景。
附图说明
图1为具有透皮能力和白细胞介素-10活性的融合蛋白基因的毕赤酵母表达载体的部分物理图谱
图2为pPIC9K-IL10-Fc-γ1和pPIC9K-TD1-IL10-Fc-γ1工程菌培养上清在还原条件下Western Blot检测结果
图3为重组毕赤酵母pPIC9K-IL10-Fc-γ1和pPIC9K-TD1-IL10-Fc-γ1培养上清经Mabselect亲和层析及Superdex200分子筛两步纯化所得蛋白的SDS-PAGE检测结果
图4具有透皮能力和白细胞介素-10活性的融合蛋白抑制PHA诱导PBMC产生IFN-γ的活性
图5为具有透皮能力和白细胞介素-10活性的融合蛋白在大鼠体内的血药浓度曲线
图6具有透皮能力和白细胞介素-10活性的融合蛋白的透皮能力检测
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的所有引物合成和测序工作均由上海生工完成。
实施例1、具有透皮能力和白细胞介素-10活性的融合蛋白编码基因的获得
用PCR法扩增本发明具有透皮能力和白细胞介素-10活性的融合蛋白的编码基因，具体过程包括以下步骤：
一、pPIC9K的α-Factor信号肽片段扩增
1)3’端连接具有人IL-10基因序列，具有Kex2单一蛋白酶酶切位点的α-因子(α-Factor)信号肽片段编码序列的扩增
以pPIC9K质粒(购自invitrogen公司)为模板，在引物P3(5’-ATGGATCCAAACGATGAGATTTC-3’)和引物P4(5’-TGCCCTGGCCTGGGCTTCTTTTCTCGAGAGATACCC-3’)的引导下PCR扩增具有Kex2单一蛋白酶酶切位点的α-因子信号肽片段的编码序列，PCR反应条件为：先94℃2分钟；然后94℃30秒，55℃40秒，72℃30秒，共32个循环；最后72℃10分钟。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条大小约250bp的条带，与预期结果相符。用BBI公司的PCR产物回收试剂盒回收目的条带，该片段命名为“a-factor”。
2)3’端连接具有透皮肽TD-1序列，具有Kex2单一蛋白酶酶切位点的α-因子(α-Factor)信号肽片段编码序列的扩增
以pPIC9K质粒(购自invitrogen公司)为模板，在引物P3(5’-ATGGATCCAAACGATGAGATTTC-3’)和引物P7(5’-CAATGCTTAGAAGGACTAGAAGAACAAGCTCTTTTCTCGAGAGATACCC-3’)的引导下PCR扩增3’端连接具有转运肽TD-1序列，并具有Kex2单一蛋白酶酶切位点的α-因子信号肽片段的编码序列，PCR反应条件为：先94℃2分钟；然后94℃30秒，55℃40秒，72℃30秒，共32个循环；最后72℃10分钟。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条大小约255bp的条带，与预期结果相符。用BBI PCR产物回收试剂盒回收目的条带，该片段命名为“a-factor/TD-1”。
二、人IL-10基因的扩增
1)3’端连接具有人IgG Fc-γ1基因序列，并连接具有Kex2单一蛋白酶切位点的a-因子的人IL-10基因的扩增
使用TRIzol(购自invitrogen公司，货号15596-018)并按其说明书抽取离体的健康人外周血(购自合肥血站)单核细胞的总RNA，在Turbo Reverse Transcriptase(购自北京原平皓公司，货号PC108)的作用下，以oligo dT(购自上海生工，货号B0181)为引物合成人cDNA，以合成的cDNA为模板，在正向引物5’-ATGCACAGCTCAGCACTGCTCTG-3’和反向引物5’-GTTTCGTATCTTCATTGTCATG-3’的引导下进行PCR，将PCR产物插入到载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO(购自Invitrogen公司，货号K4800-01)TA克隆位点得到质粒pcDNA3.1-IL-10。
以质粒pcDNA3.1-IL-10为模板，在上游引物P1(5’-CTCGAGAAAAGAAGCCCAGGCCAGGGCACCCAGTC-3’)和下游引物P2(5’-GTTTTGTCACAAGATTTGGGCTCGTTTCGTATCTTCATTGTCATG-3’)的引导下PCR扩增人的IL-10基因，PCR反应条件为：先94℃2分钟；然后94℃30秒，55℃40秒，72℃1分钟，共30个循环；最后72℃10分钟。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条大小约540bp的条带，与预期结果相符。用BBI公司的PCR产物回收试剂盒回收目的条带，该片段命名为“IL-10/γ1”。
2)3’端连接具有人IgG Fc-γ1基因序列，并连接具有Kex2单一蛋白酶切位点的a-因子并含有转运肽TD1序列的人IL-10基因的扩增
以质粒pcDNA3.1-IL10为模板，在上游引物P8(5’-CTTCTAGTCCTTCTAAGCATTGCGGTAGCCCAGGCCAGGGCACCCAG-3’)和下游引物P9(5’-CAAGATTTGGGCTCGTTTCGTATCTTCATTGTC-3’)的引导下PCR扩增人含有TD1的IL-10基因，PCR反应条件为：先94℃2分钟；然后94℃30秒，55℃40秒，72℃1分钟，共30个循环；最后72℃10分钟。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条大小约540bp的条带，与预期结果相符。用BBI公司的PCR产物回收试剂盒回收目的条带，该片段命名为“TD1-IL10/γ1”。
三、5’端连接α-Factor信号肽片段编码序列的人白细胞介素10的基因的扩增
1)5’端连接具有Kex2单一蛋白酶酶切位点的α-Factor信号肽片段编码序列的人白细胞介素10基因的扩增
以步骤二获得的人IL-10编码基因“IL-10/γ1”和步骤一获得的“a-factor”基因为模板，在引物P3(5’-ATGGATCCAAACGATGAGATTTC-3’)和引物P2(5’-GTTTTGTCACAAGATTTGGGCTCGTTTCGTATCTTCATTGTCATG-3’)的引导下PCR扩增5’端连接具有Kex2单一蛋白酶酶切位点的α-Factor信号肽片段编码序列的人白细胞介素10基因，PCR反应条件为：94℃2分钟；94℃45秒，55℃45秒，72℃1.0分钟，循环32次；最后72℃10分钟。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条大小约为750bp的条带，与预期结果相符。用BBI公司的PCR产物回收试剂盒回收目的条带，命名为“α-Factor-IL10/γ1”。
2)5’端连接具有Kex2单一蛋白酶酶切位点的α-Factor信号肽片段编码序列和透皮肽TD1编码序列的人白细胞介素10基因的扩增
以步骤二获得的人IL-10编码基因“TD1-IL10/γ1”和步骤一获得的“a-factor/TD-1”基因为模板，在引物P3(5’-ATGGATCCAAACGATGAGATTTC-3’)和引物P2(5’-GTTTTGTCACAAGATTTGGGCTCGTTTCGTATCTTCATTGTCATG-3’)的引导下PCR扩增5’端连接具有Kex2单一蛋白酶酶切位点的α-Factor信号肽片段编码序列的人白细胞介素10基因，PCR反应条件为：94℃2分钟；94℃45秒，55℃45秒，72℃1.0分钟，循环32次；最后72℃10分钟。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条大小约为750bp的条带，与预期结果相符。用BBI公司的PCR产物回收试剂盒回收目的条带，命名为“α-Factor-TD1-IL10/γ1”。
四、5’端连接具有人IL-10基因序列人IgG Fc-γ1的扩增。
以含有人IgG Fc-γ1基因的质粒pEF6/V5-His-TOPO-IGH7为模板，在引物P5(5’-GACAATGAAGATACGAAACGAGCCCAAATCTTG-3’)和P6(5’-CTGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGG-3’)的引导下进行PCR扩增。PCR反应条件为：先94℃2分钟；然后94℃30秒，55℃40秒，72℃1分钟，共32个循环；最后72℃10分钟。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果得到一条大小约700bp的条带，与预期结果相符，用BBI PCR产物回收试剂盒回收目的条带，该片段命名为“-IgG Fc-γ1”。
五、具有透皮能力和白细胞介素10活性的融合蛋白编码基因的获得
1)3’端连接具有IgG Fc-γ1序列，5’端连接具有Kex2单一蛋白酶切位点的a-因子的人IL-10基因的扩增
以步骤四扩增的“-IgG Fc-γ1”基因和步骤三扩增的“α-Factor-IL10/γ1”基因为模板，在引物P3(5’-ATGGATCCAAACGATGAGATTTC-3’)和引物P6(5’-CTGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGG-3’)的引导下进行PCR扩增。PCR反应条件为：先94℃2分钟；然后94℃30秒，55℃40秒，72℃2分钟，共30个循环；最后72℃10分钟。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果得到一条大小约1200bp的条带，与预期结果相符。用BBI PCR产物回收试剂盒回收目的条带，经过测序，该PCR产物具有序列3的核苷酸，将该PCR产物的基因命名为“α-Factor-IL10-Fc-γ1”，该基因的蛋白命名为α-Factor-IL10-Fc-γ1，该蛋白的氨基酸为序列表中的序列4。
序列表中的序列3由1431个碱基组成，其编码序列为序列3自5’末端第1-1431位碱基，序列3自5’末端第256-735位碱基为人IL-10的编码序列，序列3自5’末端第736-1431位碱基为人IgG Fc-γ1的编码序列，序列3自5’末端第1-255位碱基为具有Kex2单一蛋白酶酶切位点的α-Factor信号肽片段的编码序列。
序列表中序列4由392个氨基酸残基组成，自氨基(N)端第1-160位为人IL-10的氨基酸残基序列，自氨基端第161-392位为人IgG Fc-γ1的氨基酸残基序列。
2)3’端连接具有IgG Fc-γ1序列，5’端连接具有Kex2单一蛋白酶切位点的a-因子并含有转运肽TD1序列的人IL-10基因的扩增
以步骤四扩增的“-IgG Fc-γ1”基因和步骤三扩增的“α-Factor-TD1-IL-10/γ1”基因为模板，在引物P3(5’-ATGGATCCAAACGATGAGATTTC-3’)和引物P6(5’-CTGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGG-3’)的引导下进行PCR扩增。PCR反应条件为：先94℃2分钟；然后94℃30秒，55℃40秒，72℃2分钟，共30个循环；最后72℃10分钟。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果得到一条大小约1200bp的条带，与预期结果相符。用BBI PCR产物回收试剂盒回收目的条带，经过测序，该PCR产物具有序列1的核苷酸，将该PCR产物的基因命名为“α-Factor-TD1-IL10-Fc-γ1”，该基因的蛋白命名为α-Factor-TD1-IL10-Fc-γ1，该蛋白的氨基酸为序列表中的序列2。
序列表中的序列1由1464个碱基组成，其编码序列为序列1自5’末端第1-1464位碱基，序列1自5’末端第1-255位碱基为具有Kex2单一蛋白酶酶切位点的α-Factor信号肽片段的编码序列，序列1自5’末端第256-288位碱基为转运肽TD1的编码序列，序列1自5’末端第289-768位碱基为人IL-10的编码序列，序列1自5’末端第769-1464位碱基为人IgG Fc-γ1的编码序列。
序列表中序列2由403个氨基酸残基组成，自氨基(N)端第1-11位为转运肽TD1的氨基酸残基序列，自氨基(N)端第12-171位为人IL-10的氨基酸残基序列，自氨基端第172-403位为人IgG Fc-γ1的氨基酸残基序列。
实施例2、具有透皮能力和白细胞介素10活性的融合蛋白基因在毕赤酵母中的表达及表达产物的纯化
一、具有白细胞介素-10活性融合蛋白基因的毕赤酵母表达载体的构建
构建具有白细胞介素-10活性的融合蛋白基因的毕赤酵母表达载体的具体方法为：用限制性内切酶BamHI(购自Promega，货号R6021)和EcoRI(购自Promega，货号R6011)对由实施例1获得的PCR产物“α-Factor-IL10-Fc-γ1”和“α-Factor-TD1-IL10-Fc-γ1”分别进行双酶切，再将酶切片段分别与经相同酶双酶切的质粒pPIC9K用T4DNA连接酶(购自上海生工，货号EL0015)进行连接，将连接产物分别转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，分别筛选阳性重组子，分别提质粒，测序，结果为一种质粒为将序列1插入pPIC9K的BamHI和EcoR I的识别位点间构成的重组载体，将质粒命名为pPIC9K-TD1-IL10-Fc-γ1(图1为载体的部分结构示意图。)，另一种为将序列3插入pPIC9K的BamHI和EcoR I的识别位点间构成的重组载体，将质粒命名为pPIC9K-IL10-Fc-γ1。
二、具有透皮能力和白细胞介素-10活性融合蛋白基因在毕赤酵母中的表达
1、电转化毕赤酵母GS115菌株
用限制性内切酶SalI(购自Promega，货号：R6051)分别对步骤一获得的pPIC9K-IL10-Fc-γ1和pPIC9K-TD1-IL10-Fc-γ1进行单酶切使其线性化，再按每100ul毕赤酵母GS115感受态细胞(购自invitrogen公司，货号：C18100)分别各加入20ul两种线性化质粒(约10ug)的比例，用0.2cm电转化杯(购自invitrogen，货号650031)进行电转化(参数设定：电压1500V、电容25uF、电阻200欧姆、放电时间4-5ms)，用MD平板(培养基配方参见invi trogen公司的产品说明书-A Manual of Methods forExpression of Recombinant Proteins in Pichia pastoris，以下简称“invitrogen公司的产品说明书”)和含1mg/L G418(购自Amresco，货号E859-1G)的γPD平板(培养基配方参见invitrogen公司的产品说明书)筛选阳性克隆，分别得到两种转化子，将两种转化子分别提取质粒，测序验证，结果为一种质粒为pPIC9K-IL10-Fc-γ1，将含有该质粒的阳性克隆命名为GS115/pPIC9K-IL10-Fc-γ1；另一种质粒为pPIC9K-TD1-IL10-Fc-γ1，将含有该质粒的阳性克隆命名为GS115/pPIC9K-TD1-IL10-Fc-γ1。
采用同样的方法将空载体pPIC9K转染毕赤酵母GS115菌株，获得重组菌GS115/pPIC9K，将重组菌提取质粒测序验证，结果为既不含有α-Factor-IL10-Fc-γ1的序列(序列3)，也不含有α-Factor-TD1-IL10-Fc-γ1(序列1)。
2、具有白细胞介素-10活性的融合蛋白的诱导表达
分别挑取步骤1获得的GS115/pPIC9K-IL10-Fc-γ1和GS115/pPIC9K-TD1-IL10-Fc-γ1，将分别接种于MGY液体培养基(培养基配方参见invitrogen公司的产品说明书)中，以GS115/pPIC9K为对照，在30℃、250rpm下培养至OD600约为2-6，分别离心收集细胞，用含体积百分浓度0.5％甲醇的BMMY(培养基配方参见invitrogen公司的产品说明书)进行诱导，每隔24h补加0.5％甲醇(体积百分含量，甲醇占初始发酵培养基体积的百分含量。)，第4天停止诱导，将离心收集的菌体细胞加入含体积百分浓度0.5％甲醇的BMMY的当天记作第0天。将发酵容器中所有物质记作培养物。
培养结束后，10000g离心10分钟，分别收集上清液，分别得到融合蛋白，命名为IL10-IgG/Fc-γ1和TD1-IL10-IgG/Fc-γ1。将发酵容器中的所有产物记作培养物。
采用同样的方法对重组菌GS115/pPIC9K进行诱导表达、收集上清液得到对照蛋白。
3、阳性克隆表达产物的鉴定
1)用ELISA法测定培养上清中融合蛋白的表达量
采用Bender公司的人IL-10ELISA试剂盒(购自Bender公司，货号BSM215/MST)并参照试剂盒说明书对步骤2得到的融合蛋白IL10-IgG/Fc-γ1和TD1-IL10-IgG/Fc-γ1进行筛选，并对融合蛋白的分泌量进行检测。以上述对照蛋白为对照。结果融合蛋白IL10-IgG/Fc-γ1和TD1-IL10-IgG/Fc-γ1的检测结果呈阳性，表明融合蛋白均得到了正确表达，且融合蛋白表达量均为10mg/L以上清液。
2)Western Blot鉴定
将步骤2得到的融合蛋白IL10-IgG/Fc-γ1和TD1-IL10-IgG/Fc-γ1先进行还原SDS-PAGE电泳，再进行Western blot检测，Western blot检测时所用的一抗为anti-IL-10mAb(购自Santa Cruz，货号：sc8438)、anti-TD-1以及HRP-conjugatedgoat anti HuIgG(H+L)抗体(购自广州中杉，货号ZB2304)二抗为anti-mouselgG-HRP(购自Bio Legend，货号405306)、anti-rabbit lgG-HRP(购自santa cruz，货号sc-2004)。检测结果如图2所示，从图中可以看出，融合蛋白IL10-IgG/Fc-γ1(IL10-Fc-γ1)和TD1-IL10-IgG/Fc-γ1(TD1-IL10-Fc-γ1)均得到了正确的表达。
三、融合蛋白的浓缩及纯化
1、用Mabselect对表达本发明融合蛋白表达上清进行浓缩和纯化
先用Mabselect(购自GE，货号：17-5199-01)对步骤2得到的融合蛋白pPIC9K-IL10-Fc-γ1和pPIC9K-TD1-IL10-Fc-γ1分别进行浓缩和纯化，包括以下步骤：
1)分别取300mL上述步骤二中的2获得的培养物，10000g离心10min，离心上清再过0.45um滤膜(上海半岛)，并用50Kd超滤管(购自millipore，货号：UFC905096)对其经行超滤浓缩至30ml；
2)浓缩液再经0.45um滤膜(上海半岛)过滤后，通过经Binding buffer(由17.55gNaCl和1000ml浓度为20mM、pH为8.0的Tris·HCl组成)平衡后的Mabselect层析柱；经过5-10个柱体积的Binding buffer冲洗之后，与Mabselect结合的融合蛋白经醋酸钠缓冲液(NaAc 50mM，pH 3.5)洗脱。然后加入中和buffer(1.5M Tris·HCl，pH 8.0)调节pH至中性，分别获得Mabselect纯化的融合蛋白IL10-IgG/Fc-γ1和TD1-IL10-IgG/Fc-γ1。
3)融合蛋白的纯度可以用SDS-PAGE检测
将上述2)获得的Mab-select纯化的融合蛋白融合蛋白IL10-IgG/Fc-γ1(IL10-Fc-γ1)和TD1-IL10-IgG/Fc-γ1(TD1-IL10-Fc-γ1)分别使用非还原凝胶电泳(Non-reduced)，如图3A所示，目的产物在110Kd附件，比理论值(约90kd)偏大，可能由于酵母具有一定程度的糖基化所致。经过Mabselect一步纯化，使目的蛋白得到进一步富集，获得Mabselect纯化的融合蛋白IL10-IgG/Fc-γ1和TD1-IL10-IgG/Fc-γ1，并且纯度均达到70％。
2、S200分子筛层析纯化
将经步骤1获得Mabselect纯化的融合蛋白IL10-IgG/Fc-γ1和TD1-IL10-IgG/Fc-γ1分别用S200预装柱(购自GE，货号：17121104)做进一步纯化，用洗脱液(由17.55g NaCl和1000ml浓度为20mM、pH为8.0的Tris·HCl组成)进行洗脱，分别收集洗脱液得到S200HR分子筛层析纯化的融合蛋白IL10-IgG/Fc-γ1和TD1-IL10-IgG/Fc-γ1。
对S200HR分子筛层析纯化的融合蛋白IL10-IgG/Fc-γ1和TD1-IL10-IgG/Fc-γ1分别进行非还原凝胶电泳(Non-reduced)和还原凝胶电泳(reduced)，结果如图3B所示，从图中看出，经过S200分子筛纯化后，获得纯度为95％的S200分子筛层析纯化的融合蛋白IL10-IgG/Fc-γ1和95％的S200分子筛层析纯化的融合蛋白TD1-IL10-IgG/Fc-γ1。
实施例3、融合蛋白的IL-10活性检测
外周血淋巴细胞(PBMC)的培养基RPMI-1640(购自HyClone，货号SH30809.01B)；
取一个单位的健康人外周血(购自合肥血站)，使用Ficoll(购自天津灏洋生物制品科技有限公司，货号：LTS1077)并按照其使用说明分离外周血淋巴细胞(PBMC)。于96孔板中加入0.1ml人PBMC(2×105细胞)，分别加入不同稀释浓度的由实施例2得到的S200分子筛层析纯化的融合蛋白IL10-IgG/Fc-γ1、S200分子筛层析纯化的融合蛋白TD1-IL10-IgG/Fc-γ1以及商品化的rhIL-10(购自Rochy Hill公司，货号：200-10)，每个稀释度设置三个复孔，于37℃5％的CO2培养24h后，再加入终浓度为0.1ug/ml的PHA-P(购自sigma，货号：L8754)，空白对照孔(加的是等体积的培养基)不加PHA-P。以实施例2获得的纯化的对照蛋白作为阴性对照。于37℃5％的CO2继续培养24h后，收集每孔上清，使用人IFN-γELISA试剂盒(购自Bender Medsystems公司，货号BSM228TEN)并参照试剂盒说明书对各样品中人IFN-γ表达水平，实验重复三次，结果取平均值。
实验结果如图4所示，
TD1-IL10-IgG/Fc-γ1(TD1-IL10-Fc)在0.05、0.1、0.2、0.5、1、10、20ng/ml浓度下，产生IFN-γ的量分别为39.76、26.54、19.74、15.85、15.26、7.91、7.12pg/ml；
IL10-IgG/Fc-γ1(IL10-Fc)在0.05、0.1、0.2、0.5、1、10、20ng/ml浓度下，产生IFN-γ的量分别为60.68、23.54、23.80、18.11、17.41、10.06、18.70pg/ml；
rhIL-10(IL-10)在0.05、0.1、0.2、0.5、1、10、20ng/ml浓度下，产生IFN-γ的量分别为74.68、38.97、37.53、28.01、23.70、20.33、17.26pg/ml；
从图中看出，融合蛋白TD1-IL10-IgG/Fc-γ1(TD1-IL10-Fc)与作对照的商品化rhIL-10(IL-10)相比，具有更高的IL-10抑制活性，与另一对照融合蛋白IL10-IgG/Fc-γ1(IL10-Fc)相比，活性相当，均能够显著的抑制人PBMC细胞在PHA-P的诱导下产生IFN-γ。空白对照孔和阴性对照均无活性。
实施例4、具有透皮能力和白细胞介素10活性的融合蛋白在大鼠体内的半衰期测定
通过尾静脉注射，将商品化的rhIL-10(购自Rochy Hi1l公司，货号：200-10)和由实施例2获得的S200分子筛层析纯化的融合蛋白IL-10-IgG/Fc-γ1和S200分子筛层析纯化的融合蛋白TD1-IL10-IgG/Fc-γ1分别注入平均体重约200g的SD大鼠(注射剂量：200ng/Kg体重)。注射后，在不同时间点(0、1、2、4、6、8、12、24、36、48、60、72、96小时)通过剪尾取血法收集血样(每个时间点用4只大鼠)，肝素钠抗凝，将采集的血样12000g离心5min，收集血清，-70℃冷冻保藏。将血样用人IL-10ELISA试剂盒(购自Bender Medsystem公司，货号BSM215/MST)并参照说明书检测血清中本发明具有白细胞介素-10活性的融合蛋白的含量，并根据结果绘制出反映蛋白含量变化的曲线图。实验重复三次，结果取平均值，如图5所示。
从图中看出，融合蛋白TD1-IL10-IgG/Fc-γ1(TD1-IL10-Fc)消除半衰期约为24小时，而用作对照的商品化rhIL-10(IL-10)经尾静脉注射后，消除半衰期不到4小时，表明融合蛋白TD1-IL10-IgG/Fc-γ1的半衰期较之rhIL-10对照品具有很大程度的提高，与另一对照融合蛋白IL10-IgG/Fc-γ1(IL10-Fc)消除半衰期相近。
实施例5、具有透皮能力和白细胞介素10活性的融合蛋白在大鼠体内透皮能力的测定
将实施例2得到获得的S200分子筛层析纯化的融合蛋白IL-10-IgG/Fc-γ1和S200分子筛层析纯化的融合蛋白TD1-IL10-IgG/Fc-γ1分别取200ul(0.1ug/ul)涂抹到平均体重约200g的SD大鼠腹部皮肤上，每个样品涂抹3只大鼠。5小时后心脏取血收集血样，肝素钠抗凝，将采集的血样12000g离心5min，收集血清，-70℃冷冻保藏。将血样用人IL-10ELISA试剂盒(购自Bender Medsystem公司，货号BSM215/MST)并参照说明书检测血清中本发明具有透皮能力和白细胞介素10活性的融合蛋白的含量，并根据结果绘制出反映蛋白含量变化的柱状图。以实施例2获得的纯化的对照蛋白作为阴性对照。
结果见图6所示，
融合蛋白TD1-IL10-IgG/Fc-γ1(TD1-IL10-Fc)进入血液的量为8.3pg/ml；
融合蛋白IL10-IgG/Fc-γ1(IL10-Fc)进入血液的量为1.5pg/ml；
可以看出，融合蛋白TD1-IL10-IgG/Fc-γ1进入血液的量要明显高于对照融合蛋白IL10-IgG/Fc-γ1，显示TD1-IL10-IgG/Fc-γ1具有一定的透皮能力。
Claims (10)
1.一种融合蛋白，是在人白细胞介素10蛋白的羧基末端连接如下任一所述蛋白，且在氨基末端连接转运肽形成的融合蛋白：
1)人IgG Fc-γ1或其突变蛋白；
2)人IgG Fc-γ2或其突变蛋白；
所述人白细胞介素10蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2自氨基末端第12-171位的氨基酸序列；
所述转运肽的氨基酸序列为序列表中序列2自氨基末端第1-11位的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白为如下1)或2)的蛋白：
1)序列表中的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白；
2)将序列2的氨基酸序列经过几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有透皮能力和人白细胞介素10活性的由1)衍生的蛋白。
3.权利要求1或2所述融合蛋白的编码基因。
4.根据权利要求3所述融合蛋白的编码基因，其特征在于：所述融合蛋白的编码基因是下述1)-4)中任一所述基因：
1)序列表中序列1所示的DNA分子；
2)序列表中序列1自5’末端第256-1464位核苷酸所示的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码具有透皮能力和人白细胞介素-10活性蛋白所示的DNA分子；
4)在严格条件下与1)或2)限定的DNA分子杂交的且编码具有透皮能力和人白细胞介素-10活性蛋白所示的DNA分子。
5.含有权利要求3或4所述融合蛋白的编码基因的重组表达载体、转基因细胞系、表达盒或重组菌。
6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于：
所述重组表达载体为将权利要求3或4所述融合蛋白的编码基因插入如下任一出发载体的多克隆位点得到的载体：pPIC9K、pPIC9、pPIC3、pPICZα、pHIL-D1、pA0804、pA0815或pPSC3K。
7.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为将权利要求5或6所述的重组表达载体导入宿主菌得到的重组菌，所述宿主菌优选为毕氏酵母，所述毕氏酵母尤其优选为GS115、KM71或SMD1168。
8.一种制备权利要求1或2所述融合蛋白的方法，包括如下步骤：
1)诱导培养权利要求5或7所述重组菌，离心收集上清液；
2)纯化步骤1)获得的上清液，得到融合蛋白；
在步骤1)中，所述诱导培养的温度为30℃，所述诱导所用的培养基为添加有甲醇的培养基，所述甲醇在所述诱导所用的培养基中的浓度为0.5％(体积百分含量)，所述诱导方式为：每隔24h补加甲醇至终浓度为0.5％(体积百分含量)；
在步骤2)中，所述纯化的方式为：依次进行亲和层析和分子筛层析，所述亲和层析的层析柱优选为Mabselect，所述分子筛层析的层析柱优选为S200HR预装柱；
所述亲和层析的洗脱液为浓度为50mM、pH为3.5的醋酸钠水溶液；
所述分子筛层析的洗脱液由17.55g氯化钠和1000ml浓度为20mM、pH为8.0的Tris·HCl缓冲液组成。
9.权利要求1或2所述的融合蛋白在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用；或权利要求3或4所述融合蛋白的编码基因在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用；或权利要求1或2所述的融合蛋白在制备抑制IFN-γ产生的抑制剂中的应用；或权利要求3或4所述融合蛋白的编码基因在制备抑制IFN-γ产生的抑制剂中的应用；
所述自身免疫性疾病优选为银屑病。
10.一种治疗自身免疫性疾病药物，其活性成分为权利要求1或2所述的融合蛋白、权利要求3或4所述融合蛋白的编码基因或权利要求5或6所述的重组表达载体；
一种抑制IFN-γ产生的抑制剂，其活性成分为权利要求1或2所述的融合蛋白、权利要求3或4所述融合蛋白的编码基因或权利要求5或6所述的重组表达载体。
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| C10 | Entry into substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130313 Termination date: 20180921 |