CN101525386B - Exendin-4串联多肽与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备和用途 - Google Patents

Abstract

本专利涉及Exendin-4串联多肽与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备方法和用途。我们通过基因工程的方法表达了exendin-4串联多肽和人血清白蛋白的融合蛋白，该融合蛋白在体内显示出长效的控制血糖活性，克服了exendin-4多肽在体内半衰期较短的问题，并且制备方便。该融合蛋白可以用于制备糖尿病治疗药物和减肥制品。

Description

Exendin-4串联多肽与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备和用途

技术领域

本发明涉及应用重组DNA技术制备的基因工程蛋白药物，具体说是从毕赤酵母中表达Exendin-4串联多肽与人血清白蛋白的融合蛋白。这种融合蛋白可以作为治疗糖尿病药物的主要成分。

背景技术

Exendin-4是胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物^[1]。其合成类似物Exenatide，已经由Lilly公司开发，2005年通过FDA审批上市，商品名为Byetta，本品用于治疗β细胞机能尚好，暂不需要注射胰岛素，通过口服糖尿病治疗药已无法充分控制血糖水平的糖尿患者^[2]。由于Exendin-4半衰期短，而且糖尿病患者用药几乎是终生的，因此需要多次长期给药(一天两次)。

人血清白蛋白(Human Serum Albumin，HSA)是血液中的一个非常重要的天然蛋白，在人血液循环中可以存在20天以上。研究表明将单个Exendin-4与人血清白蛋白基因融合表达的融合蛋白可降低体内药物的清除速率，延长生物半衰期^[3]。

但是，将多个Exendin-4与人血清白蛋白基因融合表达的融合蛋白，是否能进一步延长其体内的作用时间国内外未见报道。Exendin-4串联多肽与人血清白蛋白的融合蛋白是利用基因工程技术制备而成的长效制剂。与Exendin-4相比，在体内的作用时间明显延长，可以减少给药次数，减轻病人治疗时的痛苦。

发明内容

本发明的目的就是根据糖尿病患者终身用药的特点，进一步地延长Exendin-4在体内的作用时间，提供一种长效的Exendin-4融合蛋白，其结构可以表示成下列结构中的任何一种：

1)E-L1-E-L2-HSA；

2)E-L1-E-L2-E-L3-HSA；

3)E-L1-E-L2-E-L3-E-L4-HSA；

4)E-L1-E-L2-E-L3-E-L4-E-L5-HSA；

5)E-L1-E-L2-E-L3-E-L4-E-L5-E-L6-HSA；

其中，E表示Exendin-4，HSA表示人血清白蛋白，L1-6表示肽接头；添加的肽接头是为了防止潜在的结构域相互作用而影响融合蛋白的生物学功能和稳定性。本发明中肽接头选自具有序列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]_m的多肽，其中m为0，1，2，3，4，5或6；优选为1-2个重复序列。我们最优选的融合蛋白序列见SEQ ID No：1。

为了达到上述目的，我们根据已经公开的Exendin-4氨基酸序列(www.expasy.org，Swiss-pro entryP26349)，采用酵母偏爱的密码子人工合成了含肽接头的exendin-4串联多肽基因。同时在5’端和3’端分别引入XhoI和BamHI的酶切位点。

为得到编码融合蛋白的完整基因，将exendin-4串联多肽基因的pBlueScript SK质粒，经XhoI和BamHI双酶切，经电泳后，切胶回收得到exendin-4串联多肽基因片段，再克隆到含有人血清白蛋白基因的pMD18-T载体中，然后按Invitrogen公司Pichia expression kit的说明将融合基因插入到pPIC9质粒中，转化酵母菌GS115，经过筛选并表达得到高产菌种，经甲醇诱导表达融合蛋白，具体实施方案可以参考实施例1。

收集的表达产物经亲和柱层析、疏水柱层析和凝胶柱层析顺序组合纯化，得到了高纯度的Exendin-4串联多肽与人血清白蛋白的融合蛋白。通过糖耐量实验证明Exendin-4串联多肽与人血清白蛋白的融合蛋白比单个Exendin-4与人血清白蛋白的融合蛋白的作用时间明显延长。

本发明的另一个目的是提供一种制备本发明的融合蛋白的方法。

本发明的另一个目的是得到的纯化Exendin-4串联多肽与人血清白蛋白的融合蛋白，在制备治疗糖尿病药物中的应用。

本发明的另外一个目的是得到Exendin-4串联多肽与人血清白蛋白的融合蛋白在制备减肥制品中的应用。

本发明具有的特点是：

1)采用酵母偏爱的密码子，人工合成了Exendin-4串联多肽的基因片断。

2)采用的表达系统是毕赤酵母表达系统，其特点是该表达系统含有特有的强有力的AOX(甲醇氧化酶基因)启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达；外源蛋白基因遗传稳定。一般外源蛋白基因整合到毕赤酵母染色体上，随染色体复制而复制，不易丢失；外源基因表达产物可以直接分泌到发酵液中，有利于分离纯化；发酵工艺成熟，易放大。

本发明中基因工程制备的Exendin-4串联多肽与人血清白蛋白的融合蛋白，经测定其对给药后正常小鼠糖耐量的影响和作用时间，结果表明它具有与单个Exendin-4多肽与人血清白蛋白的融合蛋白相近的作用效果，但其作用时间较单个Exendin-4多肽与人血清白蛋白的融合蛋白至少长1.5倍。比文献报道的Exendin-4的作用时间明显延长^[4]。因融合蛋白具有产量大、易于提取、纯化方便、中间流程少、体内停留的半衰期长等特点，可以开发为新的糖尿病治疗药物。

附图说明

图1是本发明的亲和层析图谱

实线为洗脱曲线，虚线为电导检测。

图2是本发明的SOURCE PHE疏水层析图谱

实线为洗脱曲线，虚线为电导检测。

图3是本发明的Sephadex凝胶层析图谱

实线为洗脱曲线，虚线为电导检测。

图4是融合蛋白的SDS-PAGE电泳分析图谱

1：分子量marker；2：融合蛋白。

图5是融合蛋白的HPLC分析图谱

图6是给药2小时后正常小鼠的糖耐量反应

图7是给药16小时后正常小鼠的糖耐量反应

图8是给药24小时后正常小鼠的糖耐量反应

图9是给药38小时后正常小鼠的糖耐量反应

图10是给药64小时后正常小鼠的糖耐量反应

图11是给药72小时后正常小鼠的糖耐量反应

具体实施方式

以下提供了实施例，以便进一步描述本发明。本发明的范围不是仅仅由以下实施例组成。本领域技术人员将理解，此处描述的特定试剂、设备和程序仅仅是说明性的，并没有以任何方式限制本发明。

实施例1：融合蛋白表达质粒的构建

E-L1-E-L2基因委托上海生物工程技术服务公司合成并克隆于pBluescript SK质粒，其中E为Exendin-4，L1为[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]2，L2为Gly-Gly-Gly-Gly-Ser。序列如下：

5’CTC GAG AAA AGA CAT GGA GAG GGA ACC TTC ACC TCC GAC TTG TCC AAA CAA ATG

GAG GAG GAG GCC GTC CGT CTT TTC ATC GAG TGG CTG AAA AAT GGA GGA CCT TCC

TCC GGA GCC CCT CCT CCT TCC GGT GGT GGT GGA TCT GGT GGT GGT GGA TCT CAT GGT

GAA GGT ACT TTT ACT TCT GAT TTG TCT AAA CAA ATG GAA GAA GAA GCT GTT AGA TTG

TTT ATT GAA TGG TTG AAG AAC GGT GGT CCA TCT TCT GGT GCT CCA CCA CCA TCT GGT

GGT GGT GGA TCC3’

在其5’端和3’端分别存在XhoI酶切位点和BamHI酶切位点。

为了将E-L1-E-L2与HSA以融合蛋白的形式在毕赤酵母中分泌表达，将含E-L1-E-L2的pBluescriptSK质粒用Xho I和BamH I酶切，回收280bp左右的重组片段；将含有人血清白蛋白基因的重组质粒pMD18-T-HSA用Xho I和BamH I酶切，回收2kb的大片段。用T4DNA连接酶连接两个片段，16℃过夜，转化进入DH5α感受态细胞。用含氨苄青霉素的LB琼脂板，37℃培养过夜，筛选转化菌。挑取单克隆菌落，接种于含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃培养过夜，抽提含融合蛋白基因的pMD18-T重组质粒进行酶切鉴定。

含融合蛋白基因的pMD18-T重组质粒用Xho I和EcoR I酶切，回收目的片段E-L1-E-L2-HSA。将质粒pPIC9用Xho I和Eco R I酶切，回收大片段。用T4DNA连接酶连接两个片段，16℃过夜，转化DH5α感受态细胞。转化菌铺于含氨苄青霉素的LB培养板上，37℃培养过夜。挑取单克隆菌落，接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，抽提含融合蛋白基因的pPIC9表达质粒进行酶切鉴定。重组的表达质粒委托TaKaRa公司测序。经测序分析证明，融合蛋白的基因序列是正确的(见SEQ ID 2)。表达质粒通过电转化毕赤酵母GS115，筛选重组表达融合蛋白的工程菌。

实施例2：融合蛋白的表达

参考Pichia expression kit，将表达融合蛋白工程菌的阳性单克隆接种至100ml BMGY培养液，30℃/230rpm摇床培养过夜使OD₆₀₀达到4-8。采用3000rpm/2分钟离心收集菌体，菌体重悬于50ml BMMY培养液中，置30℃/230rpm摇床培养。每24h加入甲醇至终浓度为0.7％，连续诱导3天，5000rpm/10分钟离心，收获上清液保存于-30℃。

实施例3：融合蛋白的纯化

按实施例2中获得的毕赤酵母发酵液，使用双蒸水进行稀释，使其电导与亲和平衡缓冲液相当，并调节pH为6.0-7.0，将稀释后的发酵液用0.45μm微孔滤膜过滤，再使用截留分子量为10000的超滤系统浓缩至小体积；然后在8ml/分钟流速下，用20mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)作为流动相，通过Blue Sepharose 6 FastFlow柱(GE health)吸附融合蛋白，最后用20mM磷酸钠和2M氯化钠(pH7.0)缓冲液进行洗脱，再收集洗脱峰，检测波长设定为215nm，其中目标峰1为含有融合蛋白的表达产物(图1)。

收集目标峰1样品，加入20mM磷酸钠和2M硫酸铵(pH7.0)，调节电导以及pH与疏水平衡缓冲液相当。用Phenyl Sepharose High Performance柱(GE health)，在20mM磷酸钠和1.6M硫酸铵(pH7.0)缓冲液中吸附融合蛋白，采用20mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)洗脱蛋白，流速为5ml/分钟，检测波长设定为215nm，其中目标峰2为进一步纯化的融合蛋白(图2)。

采用HiTrap Desalting柱(GE health)对上述含融合蛋白的组分进行脱盐处理，检测波长设定为215nm，其中目标峰3为脱盐后的融合蛋白(图3)。并用截流分子量为5000的超滤系统浓缩。

实施例4：融合蛋白的鉴定

实施例4a SDS-PAGE

我们采用SDS-PAGE对融合蛋白进行鉴定，胶浓度为8％，实验结果表明，融合蛋白的分子量与我们预期一致，同时其SDS-PAGE纯度已经＞95％(见图4)，为进一步开发成奠定了基础。

实施例4b HPLC纯度分析：

我们采用HPLC凝胶色谱检测其纯度，条件如下：

色谱柱：    Waters Protein Pak

125A，7.8×300mm，

分子量范围2000-80000

流动相：    100mM磷酸氢二钠-磷

酸二氢钠(pH6.5)

UV检测波长：220nm

流速：      0.5ml/ml

实验结果表明，融合蛋白的纯度已经＞95％(图5)。

实施例5：融合蛋白的活性检测

实施例5a融合蛋白对正常小鼠的糖耐量实验

正常ICR小鼠(购自浙江大学动物实验中心)，体重为18-22g，禁食不禁水12小时，然后皮下分别给予蒸馏水和纯化的融合蛋白，给药后2小时、16小时、24小时、38小时、64小时、72小时后小鼠的糖耐量反应。小鼠的糖耐量反应实验如下：灌服葡萄糖溶液2g/kg(10mg/ml)，使用血糖仪(艾康生物技术有限公司)测定灌服葡萄糖后10分钟、20分钟、30分钟、60分钟、90分钟时血液中的葡萄糖浓度，然后绘制耐糖曲线图。

给药后2小时、16小时、24小时、38小时、64小时和72小时后小鼠糖耐量反应的实验结果分别见图6、图7、图8、图9、图10和图11(其中N1表示单个Exendin-4和人血清白蛋白的融合蛋白，由我们自己实验室表达制备，给予剂量为0.18mg/20g小鼠；N2表示两个Exendin-4串联多肽与人血清白蛋白的融合蛋白，给予剂量为0.2mg/20g小鼠)。

我们从图6-11中可以观察到：灌服葡萄糖后，血糖浓度的峰值时间在10-20分钟，90分钟后基本上恢复到初始水平。

从图6中，我们可以观察到N1在2小时时，已有降血糖作用，但是与对照组比较，没有统计学意义(p＞0.05)；从图7中可以看出，在16小时时出现了明显的降血糖作用(p＜0.05)，然后在24小时后，已经没有明显的控制血糖作用(p＞0.05)，因此其作用时间约为24小时。

从图6-11中，我们可以观察到N2起效较快，在2小时时，与对照组比较，已经出现明显的控制血糖作用。然后，在16小时、24小时、38小时、64小时时仍然有明显的控制血糖峰浓度的作用，但是在72小时时，已经没有控制血糖峰浓度的作用；因此，N2的作用时间持续64小时以上，其反应时间延长了至少1.5倍。

因此，我们可以看出，Exendin-4串联多肽和人血清白蛋白的融合蛋白体内作用时间明显延长。

实施例6：融合蛋白在制备减肥制品中的应用

从文献中^[4]，我们可以看到Exendin-4能够明显降低食欲，从而控制动物的体重。我们在实施例5a的小鼠实验中，也观察到Exendin-4串联多肽和人血清白蛋白的融合蛋白有明显的食欲抑制作用。控制体重需要长时间达到目的，因此，我们制备的Exendin-4串联多肽和人血清白蛋白的融合蛋白，适合于用来制备减肥制品。

本发明涉及的部分参考文献：

1.J Eng，WA Kleinman，L Singh et al.Isolation and characterization of exendin-4，an exendin-3analogue，from Heloderma suspectum venom.Further evidence for an exendin receptor ondispersed acini from guinea pig pancreas.J.Biol.Chem.1992，267(11)：7402-7405.

2.John B.Buse，Robert R.Henry，Jenny Han et al.Effects of exenatide(exendin-4)on glycemiccontrol over 30 weeks in sulfonylurea-treated patients with type 2 diabetes.Diabetes Care 2004，27：2628-2635.

3.Yanshan Huang，Zhi Chen，Yiqiong Chen et al.Preparation and characterization of a novalexendin-4 human serum albumin fusion protein expressed in Pichia pastoris.J.peptide science.2007 Nov 12.PMID17994612.[Epub ahead of print]

4.AA Young，BR Gedulin，S Bhavsar et al.Glucose-lowering and insulin-sensitizing actions ofexendin-4：studies in obese diabetic(ob/ob，db/db)mice，diabetic fatty Zucker rats，and diabeticrhesus monkeys(Macaca mulatta).Diabetes.1999，48：1026-1034.

序列表SEQUENCE LISTING

Claims (4)

1.一种Exendin-4串联多肽与人血清白蛋白的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白可以表示成E-L1-E-L2-HSA，E表示Eexendin-4，L1为[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]₂，L2为Gly-Gly-Gly-Gly-Ser，所述融合蛋白氨基酸序列如下所示；

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu

Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly

Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

Gly Gly Gly Ser His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser

Lys Gln Met Glu Glu Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu

Lys Asn Gly Gly Pro Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Gly

Gly Gly Ser Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys

Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe

Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu

Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu

Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp

Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met

Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe

Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg

Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu

Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro

Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys

Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys

Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser

Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly

Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg

Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp

Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu

Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn

Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro

Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu

Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser

Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu

Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser

Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu

Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys

Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu

Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys

Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln

Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys

Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro

Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val

Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys

Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu

Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe

Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln

Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro

Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala

Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys

Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala

Leu Gly Leu。

2.一种制备权利要求1所述融合蛋白的方法，其特征在于包含以下步骤：

(1)将编码权利要求1所述融合蛋白的基因序列通过表达载体pPIC9，导入毕赤酵母GS115中表达；

(2)随后将含有权利要求1所述融合蛋白的发酵液通过亲和柱层析、疏水层析、和凝胶柱层析顺序组合纯化，制备得到融合蛋白，所述亲和层析柱填料为Blue Sepharose，所述疏水层析柱填料为Phenyl Sepharose。

3.如权利要求1所述融合蛋白在制备用于糖尿病治疗药物中的用途。

4.如权利要求1所述融合蛋白在制备减肥制品中的用途。

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