CN102453095A

CN102453095A - 含有glp-1的融合蛋白、制备方法及其应用

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Publication number: CN102453095A
Application number: CN2010105264563A
Authority: CN
Inventors: 王玉丽; 龚珉; 徐为人; 付刚; 汤立达; 刘鹏; 郑学敏; 李心
Original assignee: Tianjin Institute of Pharmaceutical Research Co Ltd
Current assignee: Tianjin Institute of Pharmaceutical Research Co Ltd
Priority date: 2010-11-01
Filing date: 2010-11-01
Publication date: 2012-05-16

Abstract

本发明公开了一种新型的GLP-1融合蛋白，所述融合蛋白由以下通式I表示：GLP-1-连接肽-GLP-1-连接肽-GLP-1-连接肽-人源蛋白-连接肽-GLP-1-连接肽-GLP-1-连接肽-GLP-1(I)其中，连接肽为GGGGS；人源蛋白选自HSA或IgG的Fc片段。本GLP-1融合蛋白能够有效增加GLP-1的血液半衰期，克服其因为半衰期短而无法在临床上使用的现状，在糖尿病、肥胖症治疗药物领域较有应用前景。本发明还公开了所述融合蛋白的制备方法及其应用。

Description

含有GLP-1的融合蛋白、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及糖尿病相关的药物领域，具体而言，本发明涉及一种具有延长的胰高血糖素样肽类的体内半衰期的融合蛋白。本发明还涉及该融合蛋白的制备方法以及其在制备糖尿病药物中的应用。

背景技术

本发明涉及的GLP-1(glucagon-likepeptide-1，以下简称：GLP-1)是主要由小肠L细胞分泌的一种37个氨基酸组成的多肽，其活性形式为GLP-1(7-37)OH和GLP-1(7-36)NH2(Mojsov S，J Clin Invest.1987Feb；79(2)：616-9)。GLP-1明显减低人用餐后的血糖，能刺激胰岛素的产生，同时还能起到一定减肥效应，并且不会引起低血糖症(Drucker D J，Diabetes.1998Feb；47(2)：159-69)。近期研究还表明GLP-1有胰腺再生作用(Drucker D J，2003Dec；144(12)：5145-8)。然而，GLP-1(7-37)的血清半衰期仅仅为3-5分钟。针对GLP-1肽的治疗用途，来自蜥蜴唾液的人的GLP-1类似物Exendin-4的合成物Exenatide，2005年在美国作为降糖药上市，血中的半衰期到2.5小时左右，需要每天在早饭及晚饭前注射给药。每天多次注射给药在临床使用中非常不方便，因此，延长GLP-1类似物的体内时间对于方便临床应用具有重要的意义。

目前已经有不少研究采用GLP-1类似物融合蛋白技术解决GLP-1类似物在体内的存留时间(CN90101167.3、CN200710018734.2、CN200410054397.9、CN01820232.2、CN200380110152.7、CN200510039265.3、CN200610127237.1、CN200910009642.7)，然而，现有的技术与临床理想的目标还有很大距离。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种融合蛋白，该融合蛋白具有GLP-1或其类似物Exendin-4的活性，并且在体内的存留时间长，从而克服现有技术中GLP-1或Exendin-4需要每天多次注射给药的缺陷。本发明的另一目的是提供编码该融合蛋白的核酸序列、包含该核酸序列的重组载体以及包含该重组载体的宿主细胞。本发明的再一个目的是提供制备该融合蛋白的方法。本发明的又一个目的是提供该融合蛋白的应用。本发明的还一个目的是提供一种药物组合物，该药物组合物包含所述融合蛋白有效成分以及一种或多种药学上可接受的辅料。

用于实现上述目的的技术方案如下：

一方面，本发明提供一种融合蛋白，所述融合蛋白由以下通式I表示：

GLP-1-连接肽-GLP-1-连接肽-GLP-1-连接肽-人源蛋白-连接

肽-GLP-1-连接肽-GLP-1-连接肽-GLP-1

(I)

其中，连接肽为GGGGS；人源蛋白选自人血清白蛋白(HSA)或IgG的Fc片段。

优选地，所述人源蛋白为HSA。

相应地，本发明还提供了编码上述融合蛋白的核酸序列，包含该核酸序列的重组载体，以及包含该重组载体的宿主细胞。

另一方面，本发明提供一种上述融合蛋白的制备方法，所述制备方法包括在表达可检测量的所述融合蛋白的条件下转录和翻译上述核酸序列的步骤。

具体来说，上述融合蛋白的制备方法包括以下步骤：

1)构建所述融合蛋白的核酸序列；

2)构建包含步骤1)的核酸序列的表达载体；

3)将步骤2)的表达载体用于转染或转化宿主细胞，并使所述核酸序列在宿主细胞中表达。

又一方面，本发明提供了上述的融合蛋白、核酸序列、重组载体或宿主细胞在制备治疗糖尿病，肥胖症，和/或糖尿病、肥胖症相关疾病的药物中的应用。

再一方面，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物包含上述融合蛋白和一种或多种药学上可接受的辅料。优选地，所述药物组合物为液体注射剂或冻干注射剂。

现结合本发明的目的对本发明逐一加以描述。

本发明的通式I的融合蛋白如下述所示：

GLP-1-连接肽-GLP-1-连接肽-GLP-1-连接肽-人源蛋白-连接

肽-GLP-1-连接肽-GLP-1-连接肽-GLP-1

通式I

其中，连接肽优选为含有5个氨基酸残基的肽链，序列为GGGGS(SEQ IDNO 5)；

GLP-1的氨基酸序列(SEQ ID NO 6)为：

⁷-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-³⁶

人源蛋白为：人血清白蛋白或IgG Fc部分。

本发明的通式I的GLP-1融合蛋白是通过下述方法制备的：

构建编码本发明的融合蛋白的DNA：

本发明中的融合蛋白可以从各种来源获得野生型白蛋白和免疫球蛋白，例如这些蛋白可以从由表达野生型白蛋白及免疫球蛋白的mRNA的组织或细胞的cDNA文库获得。本发明采用标准的PCR方法对相关的融合蛋白的mRNA进行筛选，通过公开的白蛋白及免疫球蛋白的DNA、蛋白序列设计引物。

本发明的融合蛋白(白蛋白、免疫球蛋白)优选来源于天然人序列，以减少融合蛋白在人体内潜在的免疫原性危险。本发明中将根据人血清白蛋白的公开序列设计PCR引物，从人血RNA中钓取人血清白蛋白及人免疫球蛋白的mRNA。通过标准的mRNA逆转录技术，将融合的mRNA逆转录为DNA。

构建本发明中GLP-1的DNA：

本发明参考专利CN1363654A中GLP-1中双链DNA全长的合成方法，进行GLP-1双链DNA全长的合成。本发明中GLP-1经过标准的DNA测序进行序列验证。

构建本发明中GLP-1融合蛋白载体：

利用本领域常规的PCR突变技术制备连接有连接短肽的GLP-1用以与蛋白表达质粒的连接。连接技术是本领域常规操作，本发明利用PCR将含有连接肽的GLP-1与蛋白表达质粒通过T4连接酶进行连接，得到本发明中所有融合蛋白的表达载体。一旦产生了编码完整融合蛋白的表达载体，它可以用来转染大肠杆菌，生产融合蛋白。重组DNA载体转化或转染细胞的技术是本领域的常规技术。

用于重组表达本发明的融合蛋白的一般方法：

用本发明中的表达载体转染或转化宿主细胞，用于表达融合蛋白。参考本领域常规的蛋白表达技术优化本发明中各种融合蛋白的表达，用于增加细胞培养物的原则、技术(例如培养基、温度、pH等)可以参见MammalianCell Biotechnology：A Practical Approach，M.Butler。本发明中的GLP-1融合蛋白的表达采用本领域常规的lac启动子大肠杆菌融合蛋白表达技术，使用IPTG启动GLP-1融合蛋白的产生。

本发明融合蛋白的纯化：

一旦本发明的融合蛋白在适当的宿主细胞中表达，可以通过标准的蛋白分离和纯化技术对本发明中的融合蛋白进行纯化。例如根据融合蛋白表达载体内的标签进行融合蛋白的粗提纯。本发明中，纯化后的融合蛋白可以通过超滤方法将其浓缩至药用浓度，融合蛋白经过紫外线的处理用以增加其药用的安全性。

本发明的融合蛋白的表征：

本发明中，可以用许多方法表征本发明的融合蛋白。这些方法中的一些包括：与蛋白染色偶联的SDS-PAGE或免疫印迹技术。本发明中的融合蛋白通过免疫印迹的鉴定，例如使用GLP-1的抗体。

本发明的组合物：

本发明所的GLP-1融合蛋白，可以与一种或多种药学上可接受的辅料共同制成药物组合物，这些辅料包括：水溶性填充剂、PH调节剂、稳定剂、注射用水、渗透压调节剂等等。该药物组合物可以通过肌肉、静脉内、皮下注射途经进行给药，优选的剂型为冻干或溶液注射剂；

本发明所述的水溶性填充剂辅料包括：甘露醇、低分子右旋糖苷、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖、半乳糖等一种或几种的组合；

PH调节剂包括：枸橼酸、磷酸、盐酸等非挥发性的酸以及氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化铵；碳酸钠、碳酸钾或碳酸铵盐、碳酸氢钠或钾或铵盐等生理可接受的有机或无机酸和碱及盐等一种或几种的组合；

稳定剂包括：EDTA-2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、磷酸氢二钾、碳酸氢钠、碳酸钠、精氨酸、谷氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、十二烷基硫酸钠或三羟甲基氨基甲烷的一种或几种的组合。优选焦亚硫酸钠、磷酸氢二钾、精氨酸、聚乙二醇6000、三羟甲基氨基甲烷的一种或几种的组合。

渗透压调节剂包括：氯化钠、氯化钾的一种或两种的组合。

本发明提供包含所述融合蛋白的注射制剂，所述注射制剂的制备可以示范性参考以下步骤：

(1)冻干剂

取GLP-1融合蛋白和水溶性填充剂、稳定剂、渗透压调节剂等，加入注射用水适量，调节PH值至5-8.5使其溶解，加水至刻度，加入0.1-0.5％活性炭，在10-25℃下搅拌10-20分钟，脱碳，采用微孔滤膜过滤除菌，滤液进行分装，采用冷冻干燥法，制得白色疏松块状物，封口即得。

(2)溶液注射液

取GLP-1融合蛋白和水溶性填充剂、稳定剂、渗透压调节剂等，加入注射用水适量，调节PH值至5-8.5使其溶解，加水至刻度，加入0.1-0.5％活性炭，在10-25℃下搅拌10-20分钟，脱碳，采用微孔滤膜过滤除菌，滤液进行分装，封口即得。

本发明所的GLP-1融合蛋白具有更长的体内存留时间，可作为有效成分制备糖尿病治疗药物。其在相当宽的剂量范围内是有效的，剂量可由医生根据有关的情况来决定，这些情况包括：被治疗者的身体状态、给药途径、年龄、体重、对药物的个体反应，症状的严重程度等。一般来说，本发明活性成分的有效量1×10^-7-20mg/kg/天，可以单剂量给药或分剂量给药。与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：

1、本发明的融合蛋白在体内的存留时间较长，避免了同类产品在用于治疗时需要每天多次注射给药的缺陷，便于临床应用。

2、本发明的融合蛋白优选来源于人的天然序列，减少了融合蛋白在人体内潜在的免疫原性风险。

3、本发明的融合蛋白可以通过浓缩至药用浓度，作为药物有效成分与一种或多种药学上可接受的载体等组分制备成药用组合物，用于糖尿病及肥胖症等疾病和相关病症或疾病的治疗中。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1显示了融合蛋白免疫印迹结果，其中1为GLP-1，2为融合蛋白的GLP-1免疫印迹，3为融合蛋白的HSA免疫印迹；

图2显示了本发明的融合蛋白的降血糖功能；

图3显示了本发明的融合蛋白的克隆载体构建图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

实施例1：人血清白蛋白编码DNA的构建

本发明中将根据人血清白蛋白的公开序列设计PCR引物(SEQ ID NO 1及SEQ ID NO 2)，从人血RNA中钓取人血清白蛋白的mRNA。在进行人血清白蛋白mRNA逆转录实验中，设计PCR引物使人血清白蛋白的编码DNA末端含有适合与载体连接的酶切位点(KPnI-HSA-NotI)。通过标准的mRNA逆转录技术，将融合的mRNA逆转录为DNA。

SEQ ID NO 1：⁵TTATA GGT ACC A AG TGG GTA ACC TTT ATT TCCCTT³

SEQ ID NO 2：⁵AATTAT GCG GCC GC TAA GCC TAA GGC AGC TTGACT³

将PCR产物进行KpnI/NotI双酶切，产物进行纯化以去除内切酶。

实施例2：“GLP-1-GGGGS-GLP-1-GGGGS- GLP-1-GGGGS-”编码DNA的构建

本专利采用全基因合成方法制备编码“GLP-1-GGGGS-GLP-1-GGGGS-GLP-1-GGGGS-”的双链DNA，基因序列为SEQ ID NO3。本实施例中合成的编码DNA具有以下特征：1、5’端具有NdeI酶切位点，其用于与表达载体pET15b连接；2、3’端具有KpnI酶切酶切位点，其用于与HSA的5’端连接。

SEQ ID NO 3：

⁵TATATCATATGCATGCGGAAGGCACCTTTACCAGCGATGTGAGCAGCTA

TCTGGAAGGCCAGGCGGCGAAAGAATTTATTGCGTGGCTGGTGAAAG

GCCGCGGCGGCGGCGGCTCCCATGCGGAAGGCACCTTTACCAGCGATG

TGAGCAGCTATCTGGAAGGCCAGGCGGCGAAAGAATTTATTGCGTGGC

TGGTGAAAGGCCGCGGCGGCGGCGGCTCCCATGCGGAAGGCACCTTT

ACCAGCGATGTGAGCAGCTATCTGGAAGGCCAGGCGGCGAAAGAATTT

ATTGCGTGGCTGGTGAAAGGCCGCGGCGGCGGCGGCTCCGGTACCATA

TT³

将产物进行(NdeI/KpnI)双酶切，并进行纯化。纯化后的DNA与实例例1中的HSA(KpnI/NotI酶切后)利用T4连接酶进行连接，由此构建完毕GLP-1-GGGGS-GLP-1-GGGGS-GLP-1-GGGGS-HSA。

实施例3：“-GGGGS-GLP-1-GGGGS- GLP-1-GGGGS-GLP-1”编码DNA的构建

本专利采用全基因合成方法制备编码“-GGGGS-GLP-1-GGGGS-GLP-1-GGGGS-GLP-1”的双链DNA，基因序列为SEQ ID NO 4。本实施例中合成的编码DNA具有以下特征：1、5’端具有NotI酶切位点，其用于与HSA的3’端连接端；2、3’具有BamHI酶切位点，其用于与表达载体pET15b连接。

SEQ ID NO 4：

⁵TAATTTAGCGGCCGCGGCGGCGGCGGCTCCCATGCGGAAGGCACCTTT

ACCAGCGATGTGAGCAGCTATCTGGAAGGCCAGGCGGCGAAAGAATTT

ATTGCGTGGCTGGTGAAAGGCCGCGGCGGCGGCGGCTCCCATGCGGA

AGGCACCTTTACCAGCGATGTGAGCAGCTATCTGGAAGGCCAGGCGGC

GAAAGAATTTATTGCGTGGCTGGTGAAAGGCCGCGGCGGCGGCGGCT

CCCATGCGGAAGGCACCTTTACCAGCGATGTGAGCAGCTATCTGGAAG

GCCAGGCGGCGAAAGAATTTATTGCGTGGCTGGTGAAAGGCCGCTAAT

AAGGATCCATTGATT³

将产物进行(NotI/BamHI)双酶切，并进行纯化。纯化后的DNA与实施例2中的GLP-1-GGGGS-GLP-1-GGGGS-GLP-1-GGGGS-HSA利用T4连接酶进行连接。

由此“GLP-1-GGGGS-GLP-1-GGGGS-GLP-1-GGGGS-HSA-GGGGS-GLP-1-GGGGS-GLP-1-GGGGS-GLP-1”构建完毕。

实施例4：构建本发明中GLP-1融合蛋白表达载体及融合蛋白的纯化

将表达质粒pET15b进行双酶切(NdeI/BamHI)，然后与实施例4中的产物通过NdeI/BamHI酶切位点进行连接。一旦产生了编码完整融合蛋白的表达载体，它可以用来传染大肠杆菌，生产融合蛋白。重组DNA载体转化或转染细胞的技术是本领域的常规技术。将构建完毕的pET15b[GLP-1-GGGGS-GLP-1-GGGGS-GLP-1-GGGGS-HSA-GGGGS-GLP-1-GGGGS-GLP-1-GGGGS-GLP-1](命名为pET15b6GLP1HSA，示意图见图3)以热击转化的方法转入BL21(DE3)感受态细胞，热击转化方法为本领域常规的技术。将转化后的融合蛋白表达载体在含有氨苄青霉素抗生素的LB培养平皿上培养筛选具有氨苄青霉素抗性的细胞。将得到的具有氨苄青霉素抗性的细菌细胞扩大培养后，进行质粒提取及纯化，质粒进行序列鉴定完全正确。

将过夜的菌液1∶100比例以LB新鲜培养基稀释，37℃培养菌液直至OD600达到0.6，使用IPTG启动融合蛋白的表达，并将体系温度降至25℃。融合蛋白表达16小时后，将菌液离心，收集后，超声波破碎菌体，操作程序为：10cycles，15秒/cycle。将破碎后的菌液高速离心，上清液被注入镍柱。用镍柱捕获含6×HIS标签的融合蛋白，并利用咪唑的浓度梯度对融合蛋白进行洗脱。将洗脱的蛋白收集，利用具有10kDa半透膜的离心管对收集的蛋白进行透析及浓缩。凝血酶处理纯化后的融合蛋白用来切除N末端的6×HIS标签，凝血酶的酶切技术参考Invitrogen公司的实验手册。利用GelFiltration S-200蛋白纯化柱进行反应混合物的分离，同时对目标融合蛋白进行精纯。上述纯化后的融合蛋白经10K过滤膜过滤浓缩后，紫外线灭菌处理。

实施例5：GLP-1融合蛋白的免疫印迹鉴定

用含1％SDS和2mg溴酚蓝的PBS稀释纯化后的融合蛋白。煮沸变性后，取20μl样品置SDS-PAGA胶上，电泳后，将蛋白转至硝酸纤维膜上。用5％脱脂奶粉温室封闭2小时，加入鼠抗人GLP-1的单抗(SantaCruz，USA)室温下孵育1小时，然后用HRP标记的兔抗鼠的多抗进行二抗结合，用ECL试剂盒发光显色(Amersham Pharmacia Biotech，USA)。结果如图1所示本发明的融合蛋白得到了较好的表达。

实施例6：含融合蛋白的药物组合物冻干制剂的制备

取实施例5的融合蛋白10mg，稳定剂精氨酸0.2g，聚乙二醇60000.05g置于容器中，加注射用水80ml，搅拌使溶解，再加入甘露醇8g、山梨醇2g，搅拌使溶解，以0.1mol/L的氢氧化钠调节PH至6.0-8.0，补加水至100ml。加入0.3g活性碳，在10-25℃下搅拌20分钟，脱碳，采用微孔滤膜过滤除菌，滤液按每支1ml进行分装。预冻2小时后，冷冻下减压干燥18小时，至样品温度到15-20℃后，再干燥5小时，制得白色疏松块状物，封口即得白色冻干粉针，规格100ug/支。

实施例7：含融合蛋白的药物组合物冻干制剂的制备

取实施例5的融合蛋白25mg，加稳定剂磷酸氢二钾0.05g，氯化钠0.9g，置于容器中，加注射用水70ml搅拌使溶解，再加甘露醇12g，乳糖7g搅拌使溶解，用0.1mol/L的氢氧化钠调节PH至6.5-8.5，补加水至100ml，加入0.25g活性碳，在10-20℃下搅拌20分钟，脱碳，采用微孔滤膜过滤除菌，滤液按每支2ml进行分装，预冻2小时后，冷冻下减压干燥15小时，至样品温度到15-20℃后，再干燥5小时，制得白色疏松块状物，封口即得白色冻干粉针，规格500ug/支。

实施例8：含融合蛋白的药物组合物溶液制剂的制备

取实施例5的融合蛋白50mg，加入稳定剂三羟甲基氨基甲烷0.2g，焦亚硫酸钠0.1g、氯化钠0.9g至容器中，加注射用水80ml中搅拌溶解，加入碳酸氢钠调节PH为6-8，补加水至100ml，加入0.2g活性炭，在10-25℃搅拌吸附20分钟，除炭，采用微孔滤膜过滤除菌，以每支2ml灌封，即得融合蛋白注射液，规格1000ug/支。

实施例9：含融合蛋白的药物组合物溶液制剂的制备

取实施例5的融合蛋白5mg，稳定剂谷氨酸0.01g、氯化钾0.09g至容器中，加注射用水70ml搅拌使溶解，加入葡萄糖2g、半乳糖1g搅拌溶解。加氢氧化钠调节PH为7.0-8.5，补加水至100ml，加入0.05g活性炭，在10-25℃搅拌吸附20分钟，除炭，采用微孔滤膜过滤除菌，以每支1ml灌封、即得融合蛋白注射液，规格50ug/支。

实施例10：融合蛋白的体内药代动力学

给大鼠注射GLP-1及其融合蛋白(折合含GLP-1为0.5mg/kg)，分别于注射前及注射后0.5、1、3、6、9、12、24、36和48小时后于眼丛静脉取血约0.2ml，制备血清备用。

GLP-1浓度测定方法：采用酶联免疫吸附方法(ELISA)检测小鼠血清中融合蛋白的浓度，操作如下：4℃离心分离血浆。用羊抗鼠的GLP-1浓度测定试剂盒(R&D System Co.，Ltd)对鼠血浆中的GLP-1融合蛋白的浓度进行测定。将1∶1稀释后的鼠血浆样品加入96孔板，加入同体积的GLP-1抗体后，37℃孵育1小时。使用洗液清洗96孔板3次，加入HRP后孵育30分钟。同样的方法对96孔板进行清洗，然后加入50μl底物A及底物B，37℃孵育10分钟。用硫酸中止反应后测定450-570nm值，并与标准浓度的GLP-1进行比对及根据ELISA结果计算药代动力学参数。

融合蛋白的体内药代动力学结果见表1，结果显示本发明的融合蛋白在体内的半衰期较单独的GLP-1明显延长，具有长效特性。

表1融合蛋白在大鼠体内的末相半衰期

样品来源	半衰期(小时)
		GLP-1	0.1
GLP-1融合蛋白	8.3

实施例11：融合蛋白的降血糖实验

给小鼠分别注射GLP-1及融合蛋白(折合含GLP-1为100μg/kg)，分别于给药后0.5、1、3、6、9、12、24、36和48小时注射葡萄糖并于尾端测定血糖含量，结果显示GLP-1在0.5小时后基本丧失其降血糖功能，但是融合蛋白药物却在给药24小时后依然存在降血糖功能，结果见图2。

Claims

1.一种融合蛋白，所述融合蛋白由以下通式I表示：

GLP-1-连接肽-GLP-1-连接肽-GLP-1-连接肽-人源蛋白-连接

肽-GLP-1-连接肽-GLP-1-连接肽-GLP-1

(I)

其中，连接肽为GGGGS；人源蛋白选自HSA或IgG的Fc片段。

2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述人源蛋白为HSA。

3.编码根据权利要求1或2所述的融合蛋白的核酸序列。

4.包含根据权利要求3所述的核酸序列的重组载体。

5.包含根据权利要求4所述的重组载体的宿主细胞。

6.一种根据权利要求1或2所述的融合蛋白的制备方法，所述制备方法包括在表达可检测量的所述融合蛋白的条件下转录和翻译权利要求3所述的核酸序列的步骤。

7.一种根据权利要求1或2中所述的融合蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

1)构建根据权利要求1或2所述的融合蛋白的核酸序列；

2)构建包含步骤1)的核酸序列的表达载体；

8.根据权利要求1或2所述的融合蛋白、权利要求3所述的核酸序列、权利要求4所述的重组载体或权利要求5所述的宿主细胞在制备治疗糖尿病，肥胖症，和/或糖尿病、肥胖症相关疾病的药物中的应用。

9.一种药物组合物，该药物组合物包含根据权利要求1或2所述的融合蛋白和一种或多种药学上可接受的辅料。

10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为液体注射剂或冻干注射剂。