CN104945514A - 一种胰高血糖样素肽-1的融合蛋白、其制备方法及其药物组合物 - Google Patents
一种胰高血糖样素肽-1的融合蛋白、其制备方法及其药物组合物 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种胰高血糖样素肽-1的融合蛋白、其制备方法及其药物组合物。一种胰高血糖样素肽-1的融合蛋白，其特征是，具有通式Ⅰ，GLP-1—SGTPTPTPTPTGEF—融合蛋白 通式Ⅰ其中连接肽为，SGTPTPTPTPTGEF；融合蛋白为：疏水蛋白。其制备方法：首先构建编码疏水蛋白的DNA；然后构建GLP-1的DNA、融合蛋白载体；最后重组表达GLP-1融合蛋白本。胰高血糖样素肽-1的融合蛋白与一种或多种药学上可接受的辅料共同制成药物组合物。GLP-1融合蛋白能够有效增加GLP-1的口服稳定性，并同时增加其血液半衰期，克服其因为半衰期短而无法在临床上使用，尤其是口服使用的现状。
Description
技术领域
本发明涉及糖尿病相关的药物领域，具体而言，本发明涉及具有延长胰高血糖素样肽类体内半衰期的重组蛋白，及其制备方法和药物组合物，以及在制备糖尿病药物方面的应用。
背景技术
本发明涉及的胰高血糖样素肽-1(GLP-1，glucagon-likepeptide-1,以下简称：GLP-1)主要是由小肠L细胞分泌的一种37个氨基酸组成的多肽，其活性形式为GLP-1(7-37)OH和GLP-1(7-36)NH2(Mojsov S,J Clin Invest.1987Feb；79(2):616-9)。GLP-1有明显减低人用餐后的血糖，能刺激胰岛素的产生，同时还能起到一定减肥效应，并且不会引起低血糖症(Drucker D J,Diabetes.1998 Feb；47(2):159-69)。近期研究还表明GLP-1对胰腺再生作用(Drucker D J,2003Dec；144(12):5145-8)。然而，GLP-1(7-37)的血清半衰期仅仅为3-5分钟，涉及GLP-1肽的治疗用途，来自蜥蜴唾液的人的GLP-1类似物Exendin-4的合成物Exenatide，2005年在美国作为降糖药上市，血中的半衰期到2.5小时左右，每天需要在早饭及晚饭前注射给药，每天多次注射给药在临床使用中非常不方便，因此，延长GLP-1类似物的体内时间对于方便临床应用具有重要的意义。
目前已经有不少研究采用GLP-1类似物融合蛋白技术解决GLP-1类似物在体内的存留时间[CN90101167.3、CN200710018734.2、 CN200410054397.9、CN01820232.2、CN200380110152.7、CN200510039265.3、CN200610127237.1、CN200910009642.7]，然而，现有的技术与临床理想的目标还有很大距离。本发明是针对现有技术的不足，采用融合蛋白技术克服了GLP-1半衰期短的问题。
发明内容
本发明的一个目的是针对GLP-1是多肽分子，无法进行口服吸收的缺陷，通过与疏水蛋白的融合表达形成一个具有稳定结构的、稳定的、可口服的治疗2型糖尿病药物。
本发明的另一个目的是提供含有通式Ⅰ结构的GLP-1融合蛋白作为有效成分以及一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的药用组合物，及其在制备糖尿病治疗药物中的应用。
现结合本发明的目的对本发明逐一加以描述。
本发明胰高血糖样素肽-1的融合蛋白如下述所示：具有通式Ⅰ，
GLP-1—[SGTPTPTPTPTGEF]—融合蛋白
通式Ⅰ
其中，
连接肽为SGTPTPTPTPTGEF；
GLP-1的氨基酸序列为：
7-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-36
融合蛋白为：疏水蛋白，其氨基酸序列为QQCTTGQLQCCESTSTANDPATSELLGLIGVVISDVDALVGLTCSPISVIGVGSGSACTANPVCCDSSPIGGLVSIGCVPVNV。
本发明的通式I的GLP-1融合蛋白是通过下述方法制备的：
1.构建编码本发明的融合蛋白的DNA
本发明中的融合蛋白为疏水蛋白，本发明采用标准的PCR(聚合酶链式反应)方法对相关的融合蛋白的mRNA进行扩增，并按照领域内众所周知的方法进行DNA扩增，疏水蛋白的DNA序列SEQ ID NO 1。
2.构建本发明中GLP-1的DNA
本发明参考专利CN1363654A中GLP-1中双链DNA全长的合成方法，进行GLP-1双链DNA全长的合成，本发明中GLP-1经过标准的DNA测序进行序列验证。
3.构建本发明中GLP-1融合蛋白载体
利用本领域常规的PCR突变技术制备连接有连接短肽的GLP-1用以与蛋白表达质粒的连接；连接技术是本领域常规操作，本发明利用PCR将含有连接肽的GLP-1与蛋白表达质粒通过T4连接酶(可以催化粘端或平端双链DNA或RNA的5’-P末端和3’-OH末端之间以磷酸二酯键结合，该催化反应需ATP作为辅助因子)进行连接，得到本发明中所有融合蛋白的表达载体。一旦产生了编码完整融合蛋白的表达载体，它可以用来传染酵母菌株，生产融合蛋白。重组DNA载体转化或转染细胞的技术是本领域的常规技术。
4.用于重组表达本发明的融合蛋白的一般方法
用本发明中的表达载体转染或转化宿主细胞，用于表达融合蛋白。参考本领域常规的蛋白表达技术优化本发明中各种融合蛋白的表达，用于增加细胞培养物的原则、技术(例如培养基、温度、pH等)可以参见 Mammalian Cell Biotechnology:A Practical Approach,M.Butler。本发明中的GLP-1融合蛋白的表达采用装载pPIC9质粒的酵母菌株。
5.本发明融合蛋白的纯化：
一旦本发明的融合蛋白在适当的宿主细胞中表达，可以通过标准的蛋白分离和纯化技术对本发明中的融合蛋白进行纯化。例如根据融合蛋白表达载体内的标签进行融合蛋白的粗提纯。本发明中，纯化后的融合蛋白可以通过超滤方法将其浓缩至药用浓度，融合蛋白经过紫外线的处理用以增加其药用的安全性。
本发明的融合蛋白的表征：
本发明中，可以用许多方法表征本发明的融合蛋白。这些方法中的一些包括：与蛋白染色偶联的SDS-PAGE或免疫印迹技术。本发明中的融合蛋白通过免疫印迹的鉴定，例如使用GLP-1的抗体。
本发明的组合物：
本发明所的GLP-1融合蛋白，可以与一种或多种药学上可接受的辅料共同制成药物组合物，这些辅料包括：水溶性填充剂辅料、PH调节剂、稳定剂、注射用水、滲透压调节剂等等。该药物组合物可以通过肌肉、静脉内、皮下注射途经进行给药，优选的剂型为冻干或溶液注射剂。
本发明所述的水溶性填充剂辅料包括：甘露醇、低分子右旋糖苷、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖、半乳糖等一种或几种的组合。PH调节剂是枸橼酸、磷酸、盐酸等非挥发性的酸以及氢氧化钾、氢氧化钠、或钾或铵、碳酸钠或钾或铵盐、碳酸氢钠或钾或铵盐等生理可接受的有机或无机酸和碱及盐；
稳定剂是EDTA-2Na(乙二胺四乙酸二钠)、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、磷酸氢二钾、碳酸氢钠、碳酸钠、精氨酸、谷氨酸、聚乙 二醇6000、聚乙二醇4000、十二烷基硫酸钠或三羟甲基氨基甲烷的一种或几种的组合。优选焦亚硫酸钠、磷酸氢二钾、精氨酸、聚乙二醇6000、三羟甲基氨基甲烷的一种或几种的组合。
滲透压调节剂，是氯化钠、氯化钾的一种或两种的组合。
所述注射制剂的制备方法包括以下步骤：
(1)冻干剂
取GLP-1融合蛋白和水溶性填充剂、稳定剂、滲透压剂等，加入注射用水适量，调节PH值至5-8.5使其溶解，加水至刻度，加入0.1-0.5％活性炭，在10-25℃下搅拌10-20分钟，脱碳，采用微孔滤膜过滤除菌，滤液进行分装，采用冷冻干燥法，制得白色疏松块状物，封口即得。
(2)溶液注射液
取GLP-1融合蛋白和水溶性填充剂、稳定剂、滲透压剂等，加入注射用水适量，调节PH值至5-8.5使其溶解，加水至刻度，加入0.1-0.5％活性炭，在10-25℃下搅拌10-20分钟，脱碳，采用微孔滤膜过滤除菌，滤液进行分装，封口即得。
(3)口服制剂
本发明提供的GLP-1融合蛋白也可直接作为口服药物用于治疗2型糖尿病。
本发明所的GLP-1融合蛋白具有更长的体内存留时间，可作为有效成分制备糖尿病治疗药物。相当宽的剂量范围内是有效的，剂量可由医生根据有关的情况来决定，这些情况包括：被治疗者的身体状态、给药途径、年龄、体重、对药物的个体反应，症状的严重程度等。一般来说，本发明活性成分的有效量1×10-7-20mg/kg/天，可以单剂量给药或成分剂量给药。
附图说明
图1是GLP-1融合蛋白的免疫印迹结果；
图2是GLP-1与GLP-1融合蛋白对小鼠耐糖能力的曲线图；
图3是GLP-1与GLP-1融合蛋白对小鼠降血糖功能的对比图。
具体实施方式
下列实施利用以帮助描述如何实施本发明的各种实施方案。这些实施例是为了举例说明，而不是以任何方式限定本发明的范围。
实施例1：疏水蛋白编码DNA的构建
本发明中将根据疏水蛋白的公开序列设计PCR引物，从灰树花中钓取疏水蛋白的mRNA。通过标准的mRNA逆转录技术，将融合的mRNA逆转录为DNA(SEQ ID NO 1)。
实施例2：GLP-1融合蛋白DNA构建
本专利采用全基因合成制备GLP-1及连接肽的DNA，并通过T4连接酶方式与疏水蛋白DNA进行连接，连接后DNA序列为(SEQ ID NO2)SEQ ID NO 2：
实施例3：构建本发明中GLP-1融合蛋白表达载体及融合蛋白的纯化
将表达质粒pPIC9进行双酶切，然后与实施例2中的产物通过T4连接酶进行连接。一旦产生了编码完整融合蛋白的表达载体，它可以用来转染酵母菌，生产融合蛋白。重组DNA载体转化或转染细胞的技术是本领域的常规技术。将构建完毕质粒以热击转化的方法转入酵母菌，热击转化方法为本领域常规的技术。融合蛋白表达16h后，将菌液离心，收集后，超声波破碎菌体，操作程序为：10cycles，15秒/cycle。将破碎后的菌液高速离心，上清液被注入镍柱。用镍柱去捕获含6×HIS标签的融合蛋白，并利用咪唑的浓度梯度对融合蛋白进行洗脱。将洗脱的蛋白收集，利用具有10 kDa半透膜的离心管对收集的蛋白进行透析及浓缩。利用RP-HPLC柱进行反应混合物的分离，同时对目标融合蛋白进行精纯。上述纯化后的融合蛋白经10K过滤膜过滤浓缩后，紫外线灭菌处理。
实施例4：GLP-1融合蛋白的免疫印迹鉴定
用含质量百分比1％SDS和2mg溴酚蓝的PBS稀释纯化后的融合蛋白。煮沸变性后，取20μl样品置SDS-PAGA胶上，电泳后，将蛋白转至硝酸纤维膜上。用5％脱脂奶粉温室封闭2小时，加入鼠抗人GLP-1的单抗(SantaCruz,USA)室温下孵育1小时,然后用HRP标记的兔抗鼠的多抗进行二抗结合，用ECL试剂盒发光显色(Amersham Pharmacia Biotech,USA)。结果如图1所示本发明的融合蛋白得到了较好的表达，其中GLP-1是1，融合蛋白的GLP-1免疫印迹是2。
实施例5
取实施例3的融合蛋白10mg，稳定剂精氨酸0.2g，聚乙二醇60000.05g置于容器中，加注射用水80ml，搅拌使溶解，再加入甘露醇8g、山梨醇2g，搅拌使溶解，以0.1mol/L的氢氧化钠调节PH至6.0－8.0，补加水至100ml。加入0.3g活性炭，在10-25℃下搅拌20分钟，脱碳，采用微孔滤膜过滤除菌，滤液按每支1ml进行分装。预冻2小时后，冷冻下减压干燥18小时,至样品温度到15-20℃后，再干燥5小时，制得白色疏松块状物，封口即得白色冻干粉针,规格100ug/支。
实施例6
取实施例3的融合蛋白25mg，加稳定剂磷酸氢二钾0.05g，氯化钠0.9g，置于容器中，加注射用水70ml搅拌使溶解，再加甘露醇12g，乳糖7g搅拌使溶解，用0.1mol/L的氢氧化钠调节PH至6.5－8.5，补加水至100ml，加入0.25g活性炭，在10-20℃下搅拌20分钟，脱碳，采用微孔滤 膜过滤除菌，滤液按每支2ml进行分装，预冻2小时后，冷冻下减压干燥15小时,至样品温度到15-20℃后，再干燥5小时，制得白色疏松块状物，封口即得白色冻干粉针，规格500ug/支。
实施例7
取实施例3的融合蛋白50mg，加入稳定剂三羟甲基氨基甲烷0.2g，焦亚硫酸钠0.1g、氯化钠0.9g至容器中，加注射用水80ml中搅拌溶解，加入碳酸氢钠调节PH为6－8，补加水至100ml，加入0.2g活性炭，在10-25℃搅拌吸附20分钟，除炭，采用微孔滤膜过滤除菌，以每支2ml灌封，即得融合蛋白注射液，规格1000ug/支。
实施例8
取实施例3的融合蛋白5mg，稳定剂谷氨酸0.01g、氯化钾0.09g至容器中，加注射用水70ml搅拌使溶解，加入葡萄糖2g、半乳糖1g搅拌溶解。加氢氧化钠调节PH为7.0－8.5，补加水至100ml，加入0.05g活性炭，在10-25℃搅拌吸附20分钟，除炭，采用微孔滤膜过滤除菌,以每支1ml灌封、即得融合蛋白注射液，规格50ug/支。
实施例9融合蛋白的体内药代动力学
给大鼠注射GLP-1及其融合蛋白(折合含GLP-1为0.5mg/kg),分别于注射前及注射后0.5、1、3、6、9、12、24、36和48小时后于眼丛静脉取血约0.2ml，制备血清备用。
GLP-1浓度测定方法：采用酶联免疫吸附方法(ELISA)检测小鼠血清中融合蛋白的浓度，操作如下：4℃离心分离血浆。用羊抗鼠的GLP-1浓度测定试剂盒(R&D System Co.,Ltd)对鼠血浆中的GLP-1融合蛋白的浓度进行测定。将1：1稀释后的鼠血浆样品加入96孔板，加入同体积的GLP-1抗体后，37℃孵育1小时。使用洗液清洗96孔板3次，加入HRP后孵育 30分钟。同样的方法对96孔板进行清洗，然后加入50μl底物A及底物B，37℃孵育10分钟。用硫酸中止反应后测定450-570nm值，并与标准浓度的GLP-1进行比对及根据ELISA结果计算药代动力学参数。
融合蛋白的体内药代动力学结果见表1，结果显示本发明的融合蛋白在体内的半衰期较单独的GLP-1明显延长，具有长效特性。
表1融合蛋白在大鼠体内的末相半衰期
| 样品来源 | 半衰期(小时) |
| GLP-1 | 0.1 |
| GLP-1融合蛋白 | 12 |
实施例10融合蛋白的降血糖实验
给小鼠分别注射GLP-1及融合蛋白(折合含GLP-1为100μg/kg),分别于给药后0.5、1、3、6、9、12、24、36和48小时注射葡萄糖并于尾端测定血糖含量，结果显示GLP-1在0.5小时后基本丧失其降血糖功能，但是融合蛋白药物却在给药24小时后依然存在降血糖功能，见图2。
实施例11融合蛋白的口服降血糖功能试验
给小鼠分别口服GLP-1及融合蛋白(折合含GLP-1为100μg/kg),给药后4小时注射葡萄糖，然后给糖后0.5小时测定血糖含量，结果显示GLP-1在0.5小时后基本丧失其降血糖功能，但是融合蛋白药物却在给药4小时后依然存在降血糖功能，见图3。
1.从灰树花中钓取疏水蛋白的mRNA逆转录的DNA序列
2.通过T4连接酶方式与疏水蛋白DNA进行连接，连接后DNA序列
Claims (9)
1.一种胰高血糖样素肽-1的融合蛋白，其特征是，具有通式Ⅰ，
GLP-1—SGTPTPTPTPTGEF—融合蛋白
通式Ⅰ
其中连接肽为，SGTPTPTPTPTGEF；融合蛋白为：疏水蛋白。
2.一种胰高血糖样素肽-1的融合蛋白的制备方法，其特征是，按照下述步骤进行：
a.构建编码疏水蛋白的DNA:采用标准的PCR方法对疏水蛋白mRNA进行扩增，并进行DNA扩增，疏水蛋白的DNA序列SEQ IDNO 1；
b.构建GLP-1的DNA：进行GLP-1双链DNA全长的合成；
c.构建GLP-1融合蛋白载体：利用PCR将含有连接肽的GLP-1与蛋白表达质粒通过T4连接酶进行连接，得到GLP-1融合蛋白的表达载体；
d.重组表达GLP-1融合蛋白：采用装载pPIC9质粒的酵母菌株进行表达；
e.GLP-1融合蛋白的纯化：通过标准的蛋白分离和纯化技术对GLP-1融合蛋白进行纯化。
3.一种用于治疗糖尿病的药物组合物，其特征是，胰高血糖样素肽-1的融合蛋白与一种或多种药学上可接受的辅料共同制成药物组合物，所述辅料包括：水溶性填充剂辅料、PH调节剂、稳定剂、注射用水、滲透压调节剂，胰高血糖样素肽-1的融合蛋白的有效量1×10-7——20mg/kg/天。
4.根据权利要求3所述的用于治疗糖尿病的药物组合物，其特征是，所述的水溶性填充剂辅料是：甘露醇、低分子右旋糖苷、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖、半乳糖的一种或几种的组合。
5.根据权利要求3所述的用于治疗糖尿病的药物组合物，其特征是，PH调节剂是：枸橼酸、磷酸、盐酸、氢氧化钾、氢氧化钠、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铵、碳酸氢钠、碳酸氢钾或碳酸氢铵。
6.根据权利要求3所述的用于治疗糖尿病的药物组合物，其特征是，所述稳定剂是EDTA-2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、磷酸氢二钾、碳酸氢钠、碳酸钠、精氨酸、谷氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、十二烷基硫酸钠或三羟甲基氨基甲烷的一种或几种的组合。
7.根据权利要求6所述的用于治疗糖尿病的药物组合物，其特征是，所述稳定剂是：焦亚硫酸钠、磷酸氢二钾、精氨酸、聚乙二醇6000、三羟甲基氨基甲烷的一种或几种的组合。
8.根据权利要求3所述的用于治疗糖尿病的药物组合物，其特征是，所述滲透压调节剂是：氯化钠、氯化钾的一种或两种的组合。
9.根据权利要求3所述的用于治疗糖尿病的药物组合物，其特征是，所述的组合物为液体注射剂或冻干注射剂。
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