CN103833841A - Exendin-4类似物二聚体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种EXENDIN-4类似物二聚体及其制备方法和应用，所述二聚体由两个相同或不同的EXENDIN-4类似物单体通过半胱氨酸形成单体间二硫键制得，所述EXENDIN-4类似物二聚体的制备，包括采用Fmoc固相多肽合成法合成EXENDIN-4类似物单体，再将单体形成二聚体；及所述EXENDIN-4类似物二聚体在制备用于治疗糖尿病、治疗和/或预防肥胖症或肥胖症相关疾病的药物中的应用。本发明的单体形成的EXENDIN-4类似物二聚体在体内的半衰期可达到14～96小时以上，较单独给药的EXENDIN-4的半衰期（半衰期仅为2.4小时）明显延长，极大地便利了其临床推广和应用。

Description

EXENDIN-4类似物二聚体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及糖尿病相关的药物领域，具体而言，本发明涉及一种多肽复合物，该多肽复合物能够延长的胰高血糖素样肽（EXENDIN-4）的体内半衰期。本发明还涉及该多肽的制备方法及其应用。
背景技术
糖尿病是一种遗传因素和多种环境因素相关联的以慢性高血糖为特征的代谢紊乱综合症。由于糖尿病还伴随着诸多并发症，现已成为仅次于恶性肿瘤和心血管疾病之后的第三大健康杀手。1984年，胰高血糖素样肽(EXENDIN-4)类药物被发现，它是一种具有30个氨基酸的肠降血糖素。EXENDIN-4作为降血糖药物受到限制的主要原因是EXENDIN-4的体内半衰期仅为3-5分钟。
艾塞那肽（Exenatide）是一条39个氨基酸组成的直链多肽，最初由南美巨蜥的唾液分离提取获得。它的氨基酸残基与哺乳动物EXENDIN-4序列有52%的同源性，其与EXENDIN-4的最大不同之处在于N端第2位的甘氨酸耐血液中二肽基肽酶（DPP-Ⅳ）的酶切作用，而EXENDIN-4的相同位置则为极易被DPP-Ⅳ切断的丙氨酸，故Exenatide被吸收入血后的半衰期较长（t1/2=2.4小时）。Exenatide是一种强效EXENDIN-4受体激动剂，能模拟EXENDIN-4这种内源性多肽的糖调控作用，降低空腹和餐后血糖。Exenatide的活性主要通过与人体胰脏EXENDIN-4受体结合而介导，由环腺苷酸（cAMP）依赖和β细胞分化机制引发葡萄糖依赖的胰岛素合成和分泌。因为Exenatide的氨基酸结构及生物活性与EXENDIN-4均具有相关性，故通常它也被视为肠促胰岛素的一种。
由于Exenatide的降糖作用时间较EXENDIN-4长，延缓胃排空和抑制摄食冲动，对肥胖病人体重的有益作用又有别于传统的降糖药物，因此其作为2型糖尿病治疗药物的开发潜力巨大。随着Exenatide为活性单体的药物（艾塞那肽，Lily）于2005年在美国上市，Exenatide作为EXENDIN-4家族中的一员在治疗糖尿病方面引起了广泛的关注。
但是，现在上市的Exenatide药物依然存在着半衰期短的问题，药用的Exenatide（艾塞那肽）一般的半衰期只有2.4小时，每日注射两次，极大地增加的患者的痛苦。因此，目前存在对解决Exenatide药物体内半衰期短的方法的需求。
发明内容
因此，本发明的目的是针对目前Exenatide药物体内半衰期短的不足，提供一种EXENDIN-4类似物二聚体及其制备方法和应用，其在体内的半衰期长，能够更好地治疗糖尿病。
针对上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一方面，本发明提供一种EXENDIN-4类似物单体，所述单体为只含有一个半胱氨酸的EXENDIN-4类似物单体，其序列为下述SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列：
HGEX1T FTSDX2SKQX3E EEAVR X4FIEW LKX5GG PSSX6A PPPS
其中，X1为半胱氨酸或甘氨酸；
X2为半胱氨酸或亮氨酸；
X3为半胱氨酸或甲硫氨酸；
X4为半胱氨酸或亮氨酸；
X5为半胱氨酸或天冬酰胺；
X6为半胱氨酸或甘氨酸。
优选地，所述EXENDIN-4类似物单体选自SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的EXENDIN-4类似物单体。
另一方面，本发明提供一种EXENDIN-4类似物二聚体，所述二聚体由两个相同或不同的上述所述的单体通过半胱氨酸形成单体间二硫键。
再一方面，本法提供一种EXENDIN-4类似物单体或二聚体的制备方法，所述方法包括：采用Fmoc固相多肽合成法合成EXENDIN-4类似物单体；
优选地，当制备EXENDIN-4类似物二聚体时，还包括将制得的EXENDIN-4类似物单体通过碳酸氢铵或其他还原剂来形成单体间二硫键的步骤；
优选地，所述采用Fmoc固相多肽合成法是以固相载体树脂为载体，从C端即羧基端向N端即氨基端逐渐添加氨基酸的过程。
本发明中优选树脂：Fmoc-wang树脂、2-cl-trt树脂，树脂取代度0.10~0.34。
本发明所使用的保护氨基酸为：Fmoc-Tyr（tBu）-OH，Fmoc-Ile-OHFmoc-leu（tBu）-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Lys（Boc）-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Arg（pbf）-OH，Fmoc-Ser（tBu）-OH，Fmoc-Trp-OH，Fmoc-Cys（Trt）-OH，Fmoc-Gln（Trt）-OH，Fmoc-Asn（trt）-OH，Fmoc-Trp（tBu）-OH，Fmoc-Asp-OH和Fmoc-His(Trt)-OH，Fmoc-Gly-OH，反应过程中保护氨基酸3~5倍过量。
本发明所使用的脱保护试剂为：哌啶/N,N-二甲基甲酰胺，比例为10:90~30:70。
本发明所使用的偶联试剂为：①苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐/1-羟基苯并三唑(HOBT)，②2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯/1-羟基苯并三唑(HOBT),③N,N'-二异丙基碳二亚胺。
本发明中，若使用第①或者第②种偶联试剂，那么反应中过程中应添加缚酸剂：DIEA/NMP。
本发明中所使用的切割试剂为：TFA/茴香硫醚/水/苯酚/1,2-乙二硫醇，比例为：82.5:5:5:5:2.5。
本发明中使用MS-IT-TOF确定分子量，使用HPLC纯化粗肽。
还一方面，本发明一种用于治疗糖尿病、治疗和/或预防肥胖症或肥胖症相关疾病的药物组合物，所述药物组合物含有上述所述的EXENDIN-4类似物二聚体和药学上可接受的辅料。
优选地，所述辅料选自水溶性填充剂、PH调节剂、稳定剂、注射用水和渗透压调节剂。
优选地，所述药物组合物为注射剂。
优选地，所述药物组合物注射剂为冻干粉针或溶液注射剂。
又一方面，本发明提供一种上述EXENDIN-4类似物单体或二聚体在制备用于治疗糖尿病、治疗和/或预防肥胖症或肥胖症相关疾病药物中的应用。
还一方面，本发明提供一种上述药物组合物在制备用于治疗糖尿病、治疗和/或预防肥胖症或肥胖症相关疾病的药物中的应用。
优选地，本发明上述所述的药物的用药剂量为5μg～1mg/人/次。
以下是本发明的详细描述：
（1）含有半胱氨酸的EXENDIN-4单体
本发明所述的EXENDIN-4类似物二聚体，该二聚体由两个均含有一个半胱氨酸的EXENDIN-4类似物单体通过半胱氨酸二硫键形成，所述EXENDIN-4类似物单体的序列为下述SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列：
SEQ ID NO:1：HGEX1T FTSDX2SKQX3E EEAVR X4FIEW LKX5GGPSSX6A PPPS
上述SEQ ID NO:1的EXENDIN-4单体为人工序列，分别及仅在第4、10、14、21、28或34位氨基酸上进行了修饰，由半胱氨酸取代了原有的氨基酸。形成如下含有半胱氨酸的EXENDIN-4单体，序列如下：
SEQ ID NO:2:HGECT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGGPSSGA PPPS
SEQ ID NO:3:HGEGT FTSDC SKQME EEAVR LFIEW LKNGGPSSGA PPPS
SEQ ID NO:4:HGEGT FTSDL SKQCE EEAVR LFIEW LKNGGPSSGA PPPS
SEQ ID NO:5:HGEGT FTSDL SKQME EEAVR CFIEW LKNGGPSSGA PPPS
SEQ ID NO:6:HGEGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKCGGPSSGA PPPS
SEQ ID NO:7:HGEGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGGPSSCA PPPS
于上述氨基酸序列中选择一个作为类似物二聚体的其中一条单体，与另一条同样的序列单体,通过二硫键的连接，从而形成类似物二聚体。
（2）本发明的药用组合物
本发明的含有EXENDIN-4类似物二聚体可以与一种或多种药学上可接受的辅料共同制成药用组合物，这些辅料包括：水溶性填充剂、PH调节剂、稳定剂、注射用水和渗透压调节剂等等。
本发明所述的水溶性填充剂辅料为选自以下的一种或多种：甘露醇、低分子右旋糖苷、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖和半乳糖等。
PH调节剂为选自以下的一种或多种：枸橼酸、磷酸、乳酸、酒石酸、盐酸等非挥发性的酸以及氢氧化钾、氢氧化钠或氢氧化钾或氢氧化铵、碳酸钠或碳酸钾或碳酸铵盐、碳酸氢钠或碳酸氢钾或碳酸氢铵盐等生理可接受的有机或无机酸和碱及盐等。
稳定剂为选自以下的一种或多种：EDTA-2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、磷酸氢二钾、碳酸氢钠、碳酸钠、精氨酸、谷氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、十二烷基硫酸钠或三羟甲基氨基甲烷等。优选焦亚硫酸钠、磷酸氢二钾、精氨酸、聚乙二醇6000和三羟甲基氨基甲烷。
渗透压调节剂是氯化钠、氯化钾的一种或两种的组合。
（3）注射剂的制备方法
本发明的药用组合物可以通过肌肉、静脉内、皮下注射途经进行给药，优选的剂型为冻干粉或溶液注射剂。
冷冻干燥注射剂的制备方法：取EXENDIN-4类似物二聚体溶液适量，加入水溶性填充剂、稳定剂、渗透压调节剂等，加入注射用水适量，调节PH值至6～8使其溶解，加水稀释至适当浓度，加入0.1～0.5%活性炭，在0～10℃下搅拌10～20分钟，脱碳，采用微孔滤膜过滤除菌，滤液进行分装，采用冷冻干燥法，制得白色疏松块状物，封口即得，每个规格含有EXENDIN-4类似物在5μg～1mg之间。
注射液的制备方法：取EXENDIN-4类似物二聚体溶液或冻干粉适量，加入水溶性填充剂、稳定剂和渗透压调节剂等，加入注射用水适量，调节PH值至4～8使其溶解，加水稀释至适当浓度，加入0.1～0.5%活性炭，在0～10℃下搅拌10～20分钟，脱碳，采用微孔滤膜过滤除菌，滤液进行分装，封口即得，每个规格含有EXENDIN-4类似物二聚体在5μg～1mg之间。
（4）药用组合物的用途
本发明的EXENDIN-4类似物二聚体可以用在制备糖尿病治疗药物方面。具体地，本发明的组合物可以静脉、肌肉或皮下注射剂形式给药。虽然剂量依治疗对象、给药方式、症状及其它因素而改变，本发明的EXENDIN-4类似物二聚体在相当宽的剂量范围内是有效的。在成人的治疗中，剂量范围在5μg/人～1mg/人，每日一次或每几日一次给药。实际剂量应该由医生根据有关的情况来决定，这些情况包括被治疗者的身体状态、给药途径、年龄、体重、患者对药物的个体反应，患者症状的严重程度等等，因此上述剂量范围并不是以任何方式限制本发明的范围。
本发明的单体形成的EXENDIN-4类似物二聚体克服了EXENDIN-4半衰期短的问题，所提供的EXENDIN-4类似物二聚体在体内的半衰期可达到14～96小时以上，较单独给药的EXENDIN-4的半衰期（如EXENDIN-4的醋酸盐Exenatide的半衰期仅为2.4小时）明显延长，较现有技术中存在的从而可以减少其摄入量和摄入次数，极大地便利了其临床推广和应用。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为EXENDIN-4类似物二聚体（SEQ ID NO：2-7）的降血糖实验的结果，其中，从左到右依次为：SEQ2/2代表由SEQ ID NO:2及SEQ IDNO:2形成的EXENDIN-4类似物二聚体，SEQ2/3代表由SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:3形成的EXENDIN-4类似物二聚体，SEQ2/5代表由SEQ IDNO:2及SEQ ID NO:5形成的EXENDIN-4类似物二聚体，SEQ2/6代表由SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:6形成的EXENDIN-4类似物二聚体，SEQ2/7代表由SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:7形成的EXENDIN-4类似物二聚体，SEQ3/3代表由SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:3形成的EXENDIN-4类似物二聚体，SEQ3/4代表由SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:4形成的EXENDIN-4类似物二聚体，SEQ3/5代表由SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:5形成的EXENDIN-4类似物二聚体；
图2为EXENDIN-4类似物二聚体（SEQ ID NO：3-7）的降血糖实验的结果，其中，从左到右依次为：SEQ3/6代表由SEQ ID NO:3及SEQ IDNO:6形成的EXENDIN-4类似物二聚体，SEQ3/7代表由SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:7形成的EXENDIN-4类似物二聚体，SEQ4/5代表由SEQ IDNO:4及SEQ ID NO:5形成的EXENDIN-4类似物二聚体，SEQ4/7代表由SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:7形成的EXENDIN-4类似物二聚体，SEQ5/6代表由SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:6形成的EXENDIN-4类似物二聚体，SEQ6/7代表由SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:7形成的EXENDIN-4类似物二聚体；
图3为EXENDIN-4类似物二聚体能够减轻体重实验的结果，其中，从左到右依次为：对照代表注射生理盐水的大鼠，SEQ2/2代表由SEQ IDNO:2及SEQ ID NO:2形成的EXENDIN-4类似物二聚体，SEQ3/3代表由SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:3形成的EXENDIN-4类似物二聚体，SEQ4/4代表由SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:4形成的EXENDIN-4类似物二聚体，SEQ5/5代表由SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:5形成的EXENDIN-4类似物二聚体，SEQ6/6代表由SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:6形成的EXENDIN-4类似物二聚体，SEQ7/7代表由SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:7形成的EXENDIN-4类似物二聚体；
图4为EXENDIN-4类似物二聚体在体内的稳定性实验的结果，其中，SEQ2/2代表由SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:2形成的EXENDIN-4类似物二聚体，SEQ3/3代表由SEQ ID NO:3及SEQ ID NO:3形成的EXENDIN-4类似物二聚体，SEQ4/4代表由SEQ ID NO:4及SEQ ID NO:4形成的EXENDIN-4类似物二聚体，SEQ5/5代表由SEQ ID NO:5及SEQ ID NO:5形成的EXENDIN-4类似物二聚体，SEQ6/6代表由SEQ ID NO:6及SEQ IDNO:6形成的EXENDIN-4类似物二聚体，SEQ7/7代表由SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:7形成的EXENDIN-4类似物二聚体。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
除非特别指明，以下试剂均为分析纯级试剂，且可从正规渠道商购获得。
实施例1:多肽的固相合成
使用Fmoc策略的固相多肽合成方法（使用的氨基酸购自上海吉尔公司），使用CSBio公司生产的CS336X型仪器进行本发明的EXENDIN-4类似物单体的合成。合成的方法按照生产商的仪器说明书进行。
具体的，所述采用Fmoc固相多肽合成法是以固相载体树脂为载体，从C端即羧基端向N端即氨基端逐渐添加氨基酸的过程。
本发明中树脂为Fmoc-wang树脂（还可以为2-cl-trt树脂），树脂取代度0.10~0.34。
所使用的保护氨基酸为：Fmoc-Tyr（tBu）-OH，Fmoc-Ile-OH Fmoc-leu（tBu）-OH，Fmoc-Ala-OH，Fmoc-Thr(tBu)-OH，Fmoc-Val-OH，Fmoc-Lys（Boc）-OH，Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Arg（pbf）-OH，Fmoc-Ser（tBu）-OH，Fmoc-Trp-OH，Fmoc-Cys（Trt）-OH，Fmoc-Gln（Trt）-OH，Fmoc-Asn（trt）-OH，Fmoc-Trp（tBu）-OH，Fmoc-Asp-OH和Fmoc-His(Trt)-OH，Fmoc-Gly-OH，反应过程中保护氨基酸3~5倍过量。
本发明所使用的脱保护试剂为：哌啶/N,N-二甲基甲酰胺，比例为10:90~30:70。
本发明所使用的偶联试剂为：①苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐/1-羟基苯并三唑(HOBT)（还可为：②2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯/1-羟基苯并三唑(HOBT),③N,N'-二异丙基碳二亚胺），并且添加了缚酸剂：DIEA/NMP。
所使用的切割试剂为：TFA/茴香硫醚/水/苯酚/1,2-乙二硫醇，比例为：82.5:5:5:5:2.5。
将制得的多肽使用MS-IT-TOF确定分子量，并使用HPLC C18半制备柱（购自Phenomenex公司）进行纯化，流动相为乙腈。经脱盐及冷冻干燥得到多肽冻干粉，制得SEQ ID NO:2。再将制得的单体通过碳酸氢铵或其他还原剂来形成单体间二硫键，制得EXENDIN-4类似物二聚体。
再按与上述相同的方法制得SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的EXENDIN-4类似物单体，并按与上述相同的方法将制得的单体通过形成单体间二硫键，制得EXENDIN-4类似物二聚体。
并且将上述合成的序列送由上海生工测序，测序结果表明与目标序列相同。
实施例2：EXENDIN-4类似物二聚体的降血糖功能
本实施例中，采用的Exendin-4类似物单体如下：SEQ ID NO:2与SEQID NO:2；SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:6与SEQ ID NO:6；SEQ IDNO:7与SEQ ID7。
本实施例中，还可将采用由不同序列的Exendin-4类似物单体(含有1个半胱氨酸)形成的二聚体，例如SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:2与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:3与SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:4与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:2与SEQ IDNO:8。
将上述二聚体中的9种或8种，各取1mg溶于1mL生理盐水，皮下注射于小鼠（200μL/只，6只/组，购自中科院上海实验动物中心，昆明种小鼠），给药30分钟后将400mg葡萄糖注射于每只小鼠，并以注射生理盐水的小鼠作为对照。分别于葡萄糖注射后2小时、24小时、48小时、72小时及96小时测定小鼠的血糖（注：每次测血糖前两个小时再次给相同剂量的葡萄糖），结果见图1-2。
实施例3：EXENDIN-4类似物二聚体对大鼠的减轻体重的作用
本实施例中，采用的Exendin-4类似物单体多肽如下：SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:4与SEQ IDNO:4；SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:6与SEQ ID NO:6；SEQID NO:7与SEQ ID7。
本实施例中，还可将采用由不同序列的Exendin-4类似物单体(含有1个半胱氨酸)形成的二聚体，例如SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:2与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:3与SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:6、SEQID NO:3与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:4与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:5与SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:5与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:2与SEQ ID NO:8。
SD大鼠（200±20g，购自中国科学院SLAC动物实验室），每组6只，使用STZ方法造模，成模后血糖浓度30mmol/l左右，记录每只大鼠的体重。
取上述二聚体中的6种，分别为SEQ ID NO:2/2；SEQ ID NO:3/3；SEQ ID NO:4/4；SEQ ID NO:5/5；SEQ ID NO:6/6；SEQ ID7/7，将其溶解为1mg/ml，生理盐水溶解，皮下注射，每日两次，两周后再次称量大鼠体重，并以皮下注射生理盐水的大鼠作为对照，结果见图3。
实施例4：EXENDIN-4类似物在体内的稳定性作用
本实施例中采用的单二聚体为SEQ ID NO:2/2；SEQ ID NO:3/3；SEQID NO:4/4；SEQ ID NO:5/5；SEQ ID NO:6/6；SEQ ID7/7，采用在市面上购买的EXENDIN-4（购自上海生工）作为对照。
将上述EXENDIN-4类似物二聚体及EXENDIN-4（共计6种）各1mg溶于1mL生理盐水，皮下注射于Wistar大鼠体内（300μg/kg，6只/组，Wistar大鼠购自中国科学院SLAC动物实验室），给药30分钟后将400mg葡萄糖注射于每只大鼠，分别于葡萄糖注射后2小时、24小时、48小时、72小时及96小时取血，处理得血清或者血浆，经ELISA试剂盒测量大鼠体内的药物剩余量，结果见图4，表明本发明的Exendin-4类似物二聚体在体内的保留时间大大提高，可保留长至96小时，即其半衰期长至96小时，比市面上购买的Exendin-4的半衰期大大延长。
Figure IDA00002474543300031

Claims (10)

1.一种EXENDIN-4类似物单体，所述单体为只含有一个半胱氨酸的EXENDIN-4类似物单体，其序列为下述SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列：
HGEX1T FTSDX2SKQX3E EEAVR X4FIEW LKX5GG PSSX6A PPPS
其中，X1为半胱氨酸或甘氨酸；
X2为半胱氨酸或亮氨酸；
X3为半胱氨酸或甲硫氨酸；
X4为半胱氨酸或亮氨酸；
X5为半胱氨酸或天冬酰胺；
X6为半胱氨酸或甘氨酸。
2.根据权利要求1所述的EXENDIN-4类似物单体，其特征在于，所述EXENDIN-4类似物单体选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的EXENDIN-4单体。
3.一种EXENDIN-4类似物二聚体，所述二聚体由两个相同或不同的权利要求1或2所述的单体通过半胱氨酸形成单体间二硫键制得。
4.一种制备根据权利要求1或2所述的单体和/或根据权利要求3所述的EXENDIN-4类似物二聚体的制备方法，所述方法包括：采用Fmoc固相多肽合成法合成EXENDIN-4类似物单体；
优选地，当制备EXENDIN-4类似物二聚体时，还包括将制得的EXENDIN-4类似物单体通过碳酸氢铵或其他还原剂来形成单体间二硫键的步骤；
还优选地，所述固相合成是以固相载体树脂为载体，从C端即羧基端向N端即氨基端逐渐添加氨基酸的过程，所述树脂优选为Fmoc-wang树脂或2-cl-trt树脂，更优选地，所述固相合成中使用的脱保护试剂为：哌啶/N,N-二甲基甲酰胺，其比例为10:90~30:70；或更优选地，所述固相合成中使用的偶联试剂为苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐/1-羟基苯并三唑(HOBT)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯/1-羟基苯并三唑(HOBT)或N,N'-二异丙基碳二亚胺；
最优选地，当使用苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐/1-羟基苯并三唑(HOBT)或2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯/1-羟基苯并三唑(HOBT)时，所述反应中过程中还添加缚酸剂：DIEA/NMP；
进一步优选地，所述反应中所使用的切割试剂为：TFA/茴香硫醚/水/苯酚/1,2-乙二硫醇，其比例为：82.5:5:5:5:2.5。
5.一种用于治疗糖尿病、治疗和/或预防肥胖症或肥胖症相关疾病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有根据权利要求3所述的EXENDIN-4类似物二聚体和药学上可接受的辅料。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述辅料选自水溶性填充剂、PH调节剂、稳定剂、注射用水和渗透压调节剂。
7.根据权利要求5或6所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为注射剂。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述注射剂为冻干粉针或溶液注射剂。
9.根据权利要求1或2所述的单体或根据权利要求3所述的EXENDIN-4类似物二聚体在制备用于治疗糖尿病、治疗和/或预防肥胖症或肥胖症相关疾病的药物中的应用。
10.根据权利要求5至8中任一项所述的药物组合物在制备用于治疗糖尿病、治疗和/或预防肥胖症或肥胖症相关疾病的药物中的应用。
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