CN104645317B - 一种多肽复合物作为多肽或蛋白质药物载体的应用、方法及其融合蛋白复合物 - Google Patents

一种多肽复合物作为多肽或蛋白质药物载体的应用、方法及其融合蛋白复合物 Download PDF

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Abstract

本发明创造提供了基于Titin‑Telethoninβ‑折叠片结构的多肽复合物作为多肽或蛋白质药物载体的应用、方法及其融合蛋白复合物，能够使多肽或者蛋白质类药物在保持活性的同时，有效延长半衰期，更好地在临床上得到应用。

Description

一种多肽复合物作为多肽或蛋白质药物载体的应用、方法及 其融合蛋白复合物
技术领域
本发明创造属于生物技术领域，涉及一种基于Titin–Telethoninβ-折叠片结构的多肽复合物作为多肽及蛋白质药物的载体，延长多肽或者蛋白质类药物半衰期的应用及方法，同时经过这种多肽复合物对多肽或者蛋白质类药物的设计和改造，获得了具有药用作用的融合蛋白复合物。
背景技术
目前，绝大多数肽类和其类似物药物为激素或具有激素作用的肽衍生物，具有生物活性和特异性较高，可溶性强，低毒性等优点，现已成为药物研发的热点领域。肽类或蛋白质类药物虽然具有较强的生物学活性，但在体内发挥药理学作用时，也具有以下限制因素：1)口服利用度低，给药方式通常选用注射；2)亲水性强，不易通过生理屏障；3)较高的构象灵活性，有时与受体和靶标进行结合时缺乏特异选择性，易导致副作用。除以上的因素，还有一个最为主要的限制因素为其在体内半衰期较短。一些肽或蛋白质类药物的体内半衰期仅有几分钟，从而导致到达靶组织的药物浓度过低，不能发挥足够的药效，严重限制了临床应用。
半衰期较短一般有两方面原因造成，一是在血浆、肝脏和肾脏中存在着大量的肽酶(Peptidase)和蛋白酶(Protease)，肽或蛋白质在酶的作用下迅速降解；二是在血浆中分子量较小的肽类或蛋白质类药物(低于50kDa)，由于肾脏的过滤作用而被快速排出。延长肽类或蛋白质类药物的半衰期，不但可以改善药物的药代动力学和药效学特征，而且可以减少用药量和用药次数，而这也是现在肽类或蛋白质类药物临床应用上的难题。
目前，已经开发出一系列的延长肽类或蛋白质类药物半衰期的方法，如提高肽类或蛋白质类药物对酶的稳定性来减少酶的降解；或者通过增加肽类或蛋白质类药物的流体力学体积(Hydrodynamic Volume)和FcRn介导的再生作用来减少肾脏过滤排出。另外，将较小的多肽或者蛋白质类药物与大分子物质通过基因融合或者化学偶联的方式连接在一起，不仅可以增大其分子量，使其超过肾脏过滤的临界值(40-50kDa)，减少肾脏的过滤排出；而且可以依靠大分子量物质的空间位阻效应，减少蛋白质酶等对多肽或者蛋白质药物的降解，从而极大的延长多肽或者蛋白质类药物的半衰期，增加了临床应用的潜力。
目前，应用的比较成熟的大分子量载体有PEG，Albumin和IgG-Fc等。现在最普遍用的一种方法，就是通过化学交联的方式将不同分子量的PEG与多肽或蛋白质类药物的特异位点相连，能显著延长多肽或蛋白质药物的半衰期。PEG修饰增加蛋白质和多肽药物的可溶性，提高了稳定性，降低免疫原性，减少蛋白酶的降解，延长在血液中的滞留时间，延长了药物的作用时间。但是，PEG修饰也存在一些问题，如生产成本较高；有些PEG修饰的药物其活性降低；近年来又发现PEG修饰的蛋白和其降解物容易在肾脏中累积，干扰了正常肾脏的过滤作用；人和动物能够对PEG产生一定的抗体，表明其具有一定的免疫原性。
因此，有必要开发一种免疫原性更低或无免疫原性，在体内更稳定的肽或者蛋白质类药物的载体，使多肽或者蛋白质类药物既能保持原来的活性，其半衰期又得到延长，从而更好的应用在临床上。
肌原纤维是由肌节(sarcomere)构成的，Z-盘(Z-disk)是肌节的分界线。在Z-盘中锚定着许许多多的蛋白质，构成了细胞的骨架成分，起着维持细胞结构和肌肉伸缩的重要作用。在Z-盘中，titin分子起着维持肌节完整性的重要作用。Titin分子是自然界中已知的最大的蛋白质，其分子量约为4MDa，长度约为1μm，其N端锚定在Z-盘中，其C端则跨越了肌节一半的长度到达M线。电镜图像和基因序列分析表明，titin分子是由300多个免疫球蛋白样结构域(Immunoglobulin-like，简写为Ig)和纤维连接蛋白III(fibronectin-like，简写为FN-III)样的结构域，以及其他一些结构域(如PEVK结构域)等构成。
在Z-盘中，titin的N端与许多蛋白质分子能发生相互作用，这些相互作用能在结构上支持肌原纤维的功能。在这些蛋白质分子中有一种特殊的分子，Telethonin，其能将两个titin分子的N端通过非共价键连接在一起。
晶体结构分析表明，Telethonin N端(TeN)的伪对称结构(pseudosymmetricstructure)通过氢键等非共价键将titin分子的N端的两个Ig结构域(Z1Z2)以反向平行的方式连接起来，构成了独特的β-折叠片结构，这种结构类型在先前的研究中仅在蛋白质-DNA复合物中被发现(Zou PJ et al,Nature,12Jan.2006,439:229-233)。这种交联代表着一种新型的配体和受体相互作用的方式。传统的配体和受体的相互作用是配体分子插入到受体分子的结合结构域中，而Telethonin与Z1Z2的相互作用是配体分子Telethonin的N端通过β-折叠片的交联作用将两个titin分子的N端(Z1Z2)结合在一起。这种相互作用对于稳定titin的N端具有非常重要的作用。
研究中，常将包含这种titin–Telethoninβ-折叠片结构的复合物称为Z1Z2/Telethonin复合物。Steered molecular dynamics(SMD)模拟显示，这种Z1Z2/Telethonin复合物所能承受的机械力远远大于单独的Z1Z2分子(Lee EH,et al,Structure,Mar.2006,14(3):497-509)。而单分子机械力实验表明，Z1Z2/Telethonin复合物能够承受700pN的拉力(Bertz M,et al,Proc Natl Acad Sci USA,11Aug.2009,106(32):13307-133310)，超过目前已知的蛋白质分子或者复合物所能承受的拉力，因此Z1Z2/Telethonin复合物是非常稳定的一种结构。
虽然对Z1Z2/Telethonin复合物这种独特的结构已经取得了一定的研究进展，但对于这种结构在各方面的应用却尚未见报道，而拥有这种结构的复合物在作为药物载体方面的适用性的研究至今也更未涉及。
发明内容
本发明创造提供一种基于Titin–Telethoninβ-折叠片结构的多肽复合物作为多肽或蛋白质药物载体的应用，所述多肽复合物含有：(i)多肽A：包含titin分子N端的两个Ig结构域(Z1Z2)的多肽、其同源物、类似物或衍生物；(ii)多肽B：包含Telethonin分子N端的β-折叠片区域的多肽、其同源物、类似物或衍生物；所述多肽B将两个所述多肽A结合在一起构成β-折叠片结构。
进一步，所述多肽复合物中，所述多肽A为包含SEQ ID NO:6中31-221位所示的氨基酸序列的片段、其保守性变体、生物活性片段或衍生物，所述多肽B为包含SEQ ID NO:2中30-116位所示的氨基酸序列的片段、其保守性变体、生物活性片段或衍生物，且所述多肽B将两个所述多肽A结合在一起构成β-折叠片结构。
在一些方案中，所述多肽复合物中所述多肽A为包含与SEQ ID NO:6中31-221位所示的氨基酸序列至少具有60％相同性的序列的多肽片段，优选为至少具有70％相同性，还优选为至少具有80％相同性，再优选为至少具有90％相同性，更优选为至少具有95％、96％、97％、98％、99％的相同性；所述多肽B为包含与SEQ ID NO:2中30-116位所示的氨基酸序列至少具有60％相同性的序列的多肽片段，优选为至少具有70％相同性，还优选为至少具有80％相同性，再优选为至少具有90％相同性，更优选为至少具有95％、96％、97％、98％、99％的相同性。
在一些方案中，所述多肽复合物中所述多肽A包含从SEQ ID NO:6中31-221位所示的氨基酸序列中连续或间断地缺失、替换或插入0-36中任意数值个氨基酸残基得到的多肽之一，优选为0-20中任意数值个，更优选为0-10中任意数值个，最优选为0、1、2、3、4、5、6个；所述多肽B包含从SEQ ID NO:2中30-116位所示的氨基酸序列中连续或间断地缺失、替换或插入0-36中任意数值个氨基酸残基得到的多肽之一，优选为0-20中任意数值个，更优选为0-10中任意数值个，最优选为0、1、2、3、4、5、6、7、8个。
进一步，所述多肽A和/或多肽B还可以包含或连接蛋白质纯化标识序列，所述蛋白质纯化标识序列可选自HA、GST、His6、MBP、Flag、Halo、CBD、Srep中的一种或多种。
进一步，所述多肽A和/或多肽B还可以包含或连接一段或多段蛋白质间隔或连接序列(linker)，所述蛋白质间隔或连接序列用于将外源的氨基酸序列插入多肽A和/或多肽B的氨基酸序列中，而不破坏所述多肽复合物的β-折叠片结构。
优选的，所述多肽复合物中，所述多肽A为具有SEQ ID NO:6中31-221位所示的氨基酸序列，多肽B为具有SEQ ID NO:2中30-116位所示的氨基酸序列或将其Cys突变为Ser的变体序列(SEQ ID NO:4中30-116位所示的氨基酸序列)。
还优选的，所述多肽复合物中，所述多肽A为具有SEQ ID NO:6中27-221位所示的氨基酸序列，多肽B为具有SEQ ID NO:2中27-116位所示的氨基酸序列或具有SEQ ID NO:4中27-116位所示的氨基酸序列。
更优选的，所述多肽复合物中，所述多肽A为具有SEQ ID NO:6中25-221位所示的氨基酸序列，多肽B为具有SEQ ID NO:2中25-116位所示的氨基酸序列或具有SEQ ID NO:4中25-116位所示的氨基酸序列。
最优选的，所述多肽复合物中，所述多肽A为具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，多肽B为具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
进一步，所述多肽复合物包含编码所述多肽A的核酸序列A及编码所述多肽B的核酸序列B；所述核酸序列A选自下述的一种核酸序列或其变体：(a)编码具有SEQ ID NO:6中31-221位氨基酸序列的多肽、其保守性变体、生物活性片段或衍生物的核酸序列；(b)与核酸序列(a)互补的核酸序列；(c)与核酸序列(a)或(b)具有至少70％相同性的核酸序列；所述核酸序列B选自下述的一种核酸序列或其变体：(d)编码具有SEQ ID NO:2中30-116位或SEQ ID NO:4中30-116位氨基酸序列的多肽、其保守性变体、生物活性片段或衍生物的核酸序列；(e)与核酸序列(d)互补的核酸序列；(f)与核酸序列(d)或(e)具有至少70％相同性的核酸序列；且所述核酸序列B编码的多肽B能够将所述核酸序列A编码的两个多肽A结合在一起构成β-折叠片结构。
编码所述多肽A的核酸序列A及编码所述多肽B的核酸序列B可以分别优选为根据待构建表达载体的生物体的密码子偏爱性设计的核酸序列，例如根据原核生物大肠杆菌偏爱的密码子设计的分别编码所述多肽A及多肽B的核酸序列。
编码所述多肽A的核酸序列A还可以优选为具有SEQ ID NO:5中91-663位的核苷酸序列、其保守性变体、互补序列或互补序列的保守性变体，还优选为具有SEQ ID NO:5中79-663位的核苷酸序列、其保守性变体、互补序列或互补序列的保守性变体，更优选为具有SEQID NO:5中73-663位的核苷酸序列、其保守性变体、互补序列或互补序列的保守性变体，最优选为具有SEQ ID NO:5的核苷酸序列、其保守性变体、互补序列或互补序列的保守性变体；编码所述多肽B的核酸序列B还可以优选为具有SEQ ID NO:1中88-348位或SEQ ID NO:3中88-348位的核苷酸序列、其保守性变体、互补序列或互补序列的保守性变体，还优选为具有SEQ ID NO:1中79-348位或SEQ ID NO:3中79-348位的核苷酸序列、其保守性变体、互补序列或互补序列的保守性变体，更优选为具有SEQ ID NO:1中73-348位或SEQ ID NO:3中73-348位的核苷酸序列、其保守性变体、互补序列或互补序列的保守性变体，最优选为具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的核苷酸序列、其保守性变体、互补序列或互补序列的保守性变体。
本说明书和权利要求书中使用的下列术语，除非另外说明具有下述一般含义，且下述含义被认为在本领域技术人员的知识范围之内：
“核酸序列”指寡核苷酸、核苷酸或多核苷酸及其片段或部分，也可以指基因组或合成的DNA或RNA，可以为单链或双链，可以为有义链或反义链。
“多肽”泛指具有氨基酸序列的肽链，包括寡肽、肽、狭义的多肽(20个氨基酸残基以上的肽)或蛋白质序列及其片段或部分，可以使糖基化或非糖基化的，氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基可以被修饰或未被修饰。当其氨基酸序列涉及一种天然存在的蛋白质分子的氨基酸序列时，这种“多肽”或“蛋白质”不意味着将氨基酸序列限制为与该天然存在的蛋白质分子相关的完整的或完全一致的天然氨基酸或其序列。
“同源”包括完全同源和部分同源，在描述多肽、蛋白质或氨基酸序列时，指具有相同或相似的结构或功能，或具有相似的氨基酸序列；在描述核酸序列时，指具有相似性或互补的核酸序列；“同源”在本发明具有相对较为广泛的含义，例如，包括具有一定百分比的相同性的序列(氨基酸序列或核酸序列)，或包括序列的变体。
“类似物”指基本上保持本发明titin分子N端的两个Ig结构域(Z1Z2)的多肽A和Telethonin分子N端β-折叠片区域的多肽B的结构或生物学功能或活性的多肽，只要能够基本形成二者间β-折叠片结构。本发明的多肽“类似物”可以包括：(I)在序列中连续或间隔地插入、缺失、替换一个或多个氨基酸残基，且所述一个或多个氨基酸残基的插入、缺失、替换在同一序列中可同时或不同时存在；(II)序列中一个或多个氨基酸残基的基团被其他基团替换或缺失；(III)序列中一个或多个氨基酸残基被修饰。
“衍生物”在描述多肽、蛋白质或氨基酸序列时，指由原多肽、蛋白质或氨基酸序列衍生而来的关联多肽、蛋白质或氨基酸序列，本发明的多肽复合物在能够基本形成β-折叠片结构时包括这样的衍生物，例如，本发明中多肽A或多肽B包括这样的衍生物：(IV)成熟多肽与另一种化合物融合，或者(V)在氨基酸序列中融合或插入附加的氨基酸序列(linker、蛋白质纯化标识序列、酶切位点等)；在描述核酸序列时，指由原始序列衍生未来的关联序列，可以包括：(VI)序列或基因中连续或间隔地插入、缺失、替换一个或多个碱基(优选为等位基因的替换)，且所述一个或多个氨基酸残基的插入、缺失、替换在同一序列或基因中可同时或不同时存在；(VII)序列或基因中一个或多个碱基被修饰；(VIII)序列或基因中融合或插入编码附加的氨基酸序列的基因。
“保守”指所涉及的氨基酸序列或核酸序列与原始序列具有较高的相似性或同一性，能够维持其原始序列基本的结构、生物学活性或功能，一般可以通过相似的氨基酸残基替换或等位基因(简并密码子)替换等获得，例如，赖氨酸和精氨酸、亮氨酸和异亮氨酸之间的替换等。
“变体”指具有一个或多个氨基酸或核苷酸改变的氨基酸序列或核酸序列，所述改变可包括氨基酸序列或核酸序列中氨基酸或核苷酸的插入、缺失或替换。变体可具有保守性改变，其中替换的氨基酸与原氨基酸具有相似的结构或化学性质，如亮氨酸和异亮氨酸之间的替换，也可具有非保守性改变。值得指出的是，本发明中非保守性改变的变体也能够达到甚至超越天然氨基酸序列构成的多肽复合物所具有的性质及能够达到的效果，例如，研究发现，将SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中半胱氨酸全部替换为丝氨酸，能够去除多肽B链中β-折叠片区域多余的二硫键，使得本发明的多肽复合物的β-折叠片结构更加稳定。
“相似性”、“相似”、“相同性”或“同一性”在用于描述多肽或蛋白质结构、氨基酸序列或核酸序列时，指其包含的序列之间排列对比时相应位置氨基酸残基或核苷酸相同的程度，可以用百分数表示。
本发明还提供了上述多肽复合物作为药物载体的应用的方法，所述方法包括：将一个或多个多肽或蛋白质类药物的编码序列插入或连接所述多肽A和/或多肽B的编码序列的一个或多个合适位点，获得融合基因，并使融合基因在表达系统中表达获得含有该多肽或蛋白质药物的多肽A和/或多肽B的融合蛋白，然后使融合蛋白和其配合物接触，构成具有药用作用的融合蛋白复合物。其中，所述配合物是指能够与所述融合蛋白形成β-折叠片结构的多肽A或多肽B或另一连接了多肽或蛋白质药物的多肽A或多肽B的融合蛋白。
其中，所述位点是多肽复合物中能够与多肽或蛋白质药物结合的区域，本发明中优选的位点包括下述16个(图1)：多肽B的N端(NT)、C端(CT)和内部的两个loop区(LT1、LT2)，两个多肽A的N端(NZA、NZB)、C端(CZA、CZB)和八个loop区(LZA1、LZA2、LZA3、LZA4、LZB1、LZB2、LZB3、LZB4)。
其中，多肽或蛋白质药物能够在上述10个loop区中的任意位置与所述多肽复合物结合。
进一步，具体至具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6的氨基酸序列的多肽A和多肽B的中，上述10个loop区的位置分别为：
多肽B内部的两个loop区：SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中第42-43位和第72-73位氨基酸序列；
多肽A内部的四个loop区：SEQ ID NO:6中第57-62位、第111-113位、第142-147位、第170-175位氨基酸序列。其中，所述融合基因还包括蛋白质纯化标识序列、酶切位点、各种柔性或刚性linker的编码序列、调控序列等。所述融合基因可以通过PCR、酶切、酶连、基因重组、全基因合成等方式获得。所述表达系统可以采用大肠杆菌表达系统(可选用pET系列质粒做表达载体)、酵母表达系统(如毕赤酵母)、昆虫表达系统(如家蚕型多角体病毒)、哺乳动物表达系统或植物表达系统等，优选为采用pET系列质粒做表达载体的大肠杆菌表达系统。
进一步，所述方法还包括融合基因获得后的测序步骤以及融合蛋白的纯化步骤。
本发明还提供了上述多肽复合物作为药物载体的应用的另一种方法，包括用一些偶联试剂将多肽或者蛋白质药物与多肽复合物的一个或多个位点进行连接。如使用碳化二亚胺、戊二醛和二异氰酸化合物等常用偶联剂将多肽或蛋白质类药物与多肽A和/或多肽B的N端或C端进行连接，然后使连接后的多肽与其配合物接触，获得具有药用作用的融合蛋白复合物；或者通过基因突变的方式在多肽A和/或多肽B内部引入-SH，然后利用马来酰亚胺等偶联剂与多肽或蛋白药物相连，然后使连接后的多肽与其配合物接触，获得具有药用作用的融合蛋白复合物。
本发明的另一目的是提供一种延长药物半衰期的方法，所述方法使用一种多肽复合物作为载体，所述多肽复合物含有：(i)多肽A：包含titin分子N端的两个Ig结构域(Z1Z2)的多肽、其同源物、类似物或衍生物；(ii)多肽B：包含Telethonin分子N端的β-折叠片区域的多肽、其同源物、类似物或衍生物；所述多肽B将两个所述多肽A结合在一起构成β-折叠片结构。
进一步，所述方法包括：将一个或多个多肽或蛋白质药物的编码序列插入或连接所述多肽A和/或多肽B的编码序列的一个或多个合适位点，获得融合基因，并使融合基因在表达系统中表达获得含有该多肽或蛋白质药物的多肽A和/或多肽B的融合蛋白，然后使融合蛋白和其配合物接触，构成具有药用作用的融合蛋白复合物。其中，所述配合物是指能够与所述融合蛋白形成β-折叠片结构的多肽A或多肽B或另一连接了多肽或蛋白质药物的多肽A或多肽B的融合蛋白。
其中，所述位点是所述多肽复合物中能够与多肽或蛋白质药物结合的区域，本发明中优选的位点包括下述16个(图1)：多肽B的N端(NT)、C端(CT)和内部的两个loop区(LT1、LT2)，两个多肽A的N端(NZA、NZB)、C端(CZA、CZB)和八个loop区(LZA1、LZA2、LZA3、LZA4、LZB1、LZB2、LZB3、LZB4)。
进一步，具体至具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6的氨基酸序列的多肽A和多肽B的中，上述10个loop区的位置分别为：
多肽B内部的两个loop区：SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中第42-43位和第72-73位氨基酸序列；
多肽A内部的四个loop区：SEQ ID NO:6中第57-62位、第111-113位、第142-147位、第170-175位氨基酸序列。其中，所述融合基因还包括蛋白质纯化标识序列、酶切位点、各种柔性或刚性linker的编码序列、调控序列等。所述融合基因可以通过PCR、酶切、酶连、基因重组、全基因合成等方式获得。所述表达系统可以采用大肠杆菌表达系统(可选用pET系列质粒做表达载体)、酵母表达系统(如毕赤酵母)、昆虫表达系统(如家蚕型多角体病毒)、哺乳动物表达系统或植物表达系统等。
进一步，所述方法还包括融合基因获得后的测序步骤以及融合蛋白的纯化步骤。
本发明还提供了一种具有药用作用的融合蛋白复合物，所述融合蛋白复合物包含由多肽或蛋白质药物与多肽A和/或多肽B构成的融合蛋白，且该融合蛋白与多肽A或多肽B或另外的所述融合蛋白形成β-折叠片结构。
其中，所述多肽A为包含titin分子N端的两个Ig结构域(Z1Z2)的多肽、其同源物、类似物或衍生物；所述多肽B为包含Telethonin分子N端的β-折叠片区域的多肽、其同源物、类似物或衍生物。
进一步，所述融合蛋白中，多肽或蛋白质药物位于多肽A和/或多肽B的一个或多个下述位点：多肽B的N端(NT)、C端(CT)和内部的两个loop区(LT1、LT2)，两个多肽A的N端(NZA、NZB)、C端(CZA、CZB)和八个loop区(LZA1、LZA2、LZA3、LZA4、LZB1、LZB2、LZB3、LZB4)。
进一步，具体至具有SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:6的氨基酸序列的多肽A和多肽B的中，上述10个loop区的位置分别为：
多肽B内部的两个loop区：SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中第42-43位和第72-73位氨基酸序列；
多肽A内部的四个loop区：SEQ ID NO:6中第57-62位、第111-113位、第142-147位、第170-175位氨基酸序列。进一步，所述融合蛋白中，多肽或蛋白质药物可以有一种或多种。
进一步，所述融合蛋白的编码序列还可以包括蛋白质纯化标识序列、酶切位点、各种柔性或刚性linker的编码序列、调控序列等。
本发明的多肽复合物能够承载的药物，包括在多肽复合物作为药物载体的应用、方法、延长药物半衰期的方法、以及具有药用作用的融合蛋白复合物几个主题中涉及到的多肽或蛋白质药物，可以是能够与下述受体相互作用的多肽或蛋白质药物，包括这些受体的激活剂(agonist)或拮抗剂(antagonist)：(a)含离子通道的受体，如N胆碱受体、兴奋性氨基酸受体等；(b)G-蛋白偶联受体(GPCR)；(c)酶活性的受体，如胰岛素受体、表皮生长因子受体、生长激素受体、干扰素受体等；(d)细胞核激素受体，如肾上腺皮质激素受体、甲状腺素受体等。
其中，GPCR是人体内最大的膜受体蛋白家族，现代药物中约有50％的多肽或蛋白质药物以GPCR为作用靶点。这些多肽或者蛋白质药物尤其适合以本发明多肽复合物作为载体，非限定性的例子可以针对以下几种GPCR的一种或几种：一，肿瘤相关GPCR，如Samatostatin(SST)/Growth(GH)受体群，Gonadotropin releasing hormone(GnRH)/Luteinizing hormone(LH)/类固醇激素受体群，CXCR4等等；二，免疫系统GPCR，如CCchemokine受体或者CXC chemokine受体，Formyl多肽受体等等；三，内分泌系统GPCR的多肽或者蛋白质药物，如GLP-1受体，Glucagon受体，NPYY2受体，Canabinoid受体CB1和CB2，Ghrelin受体GHS-R，Melanocortin受体MC4以及一些孤儿受体如GPR35，GPR85，GPR101等等。
进一步，所述多肽复合物能够承载的药物还包括经改造后的多肽或蛋白质药物，例如在保持药物活性的条件下对多肽或蛋白质药物的氨基酸序列或其核酸序列进行连续或间隔地插入、缺失、替换、修饰一个或多个氨基酸残基或碱基，且所述一个或多个氨基酸残基或碱基的插入、缺失、替换、修饰在同一序列或基因中可同时或不同时存在。所述改造可以在本发明的融合蛋白复合物制备过程的任一步骤进行，例如，在制备多肽或蛋白质药物与多肽A和/或多肽B的融合蛋白之前先对多肽或蛋白质药物的编码序列进行突变，然后再进行基因融合获得编码融合蛋白的融合基因；或者先获得编码多肽或蛋白质药物与多肽A和/或多肽B的融合蛋白的融合基因，再对融合基因中多肽或蛋白质药物的编码序列部分进行突变等。
本发明说明书和权利要求中，在涉及到除本发明多肽复合物作为药物载体应用外的其他主题时，诸如多肽复合物作为药物载体的应用的方法、一种延长药物半衰期的方法、一种具有药用作用的融合蛋白复合物等，所提及的多肽A和多肽B，均与本发明在多肽复合物作为药物载体应用的主题内讨论的多肽A和多肽B具有同等的含义和范围，不再赘述。
本发明的多肽复合物可以抗蛋白酶水解，稳定性较好，其分子量大小在50kDa左右或更高，肾脏不能将其快速滤除；其源自于人体的肌肉蛋白质，由四个类免疫球蛋白的亚基所组成，免疫原性较低；且多肽复合物含有多个位点，在这些位点接入或插入肽或小分子蛋白质而不影响复合物的结构及稳定性；将本发明的多肽复合物作为多肽或蛋白质药物的载体的同时，能够快速地对多肽或蛋白质药物进行设计和改造，构建新型的具有药用作用的融合蛋白复合物，在保持原有药物活性的同时，有效延长多肽或者蛋白质类药物的半衰期，更好地在临床上得到应用。
附图说明
图1是本发明中多肽复合物晶体结构及药物接入或插入位点示意图。其中，Z1A和Z2A分别表示多肽复合物中一条多肽链上的两个Ig结构域，Z1B和Z2B分别表示多肽复合物中另一条多肽链上的两个Ig结构域。
图2是实施例一中Z1Z2/GLTe(A)和Z1Z2/TeN(B)纯化后SDS和Native-PAGE。
图3是实施例一中不同浓度GLP-1和Z1Z2/GLTe刺激RINm5F细胞产生Camp。
图4是实施例一活性检测结果图。其中，(A)，一次腹腔注射25nmol Z1Z2/GLTe，Z1Z2/TeN和GLP-1对血糖的控制作用；(B)表示A实验的曲线下面积(AUC)；(C)表示一次腹腔注射25nmol Z1Z2/GLTe和GLP-1后，大鼠血浆中胰岛素含量变化；(D)表示一次腹腔注射25nmol Z1Z2/GLTe 24h后，进行OGTT；(E)表示D实验的AUC；(F)表示不同浓度Z1Z2/GLTe对血糖的控制作用；(G)表示E实验的AUC。(不同处理组与PBS组进行比较，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001。)
图5是实施例一Z1Z2/GLTe和GLP-1在大鼠血清中的稳定性测试图。(**表示p<0.01，***表示p<0.001。)
图6是实施例一Z1Z2/GLTe和GLP-1通过腹腔注射(A)和静脉注射(B)大鼠后，活性GLP-1在大鼠血浆中的含量随时间变化曲线。
图7是实施例一每天注射一次Z1Z2/GLTe对糖尿病小鼠空腹血糖长期控制的影响曲线。
图8是实施例一腹腔注射25nmol Z1Z2/GLTe和等体内PBS后，24h内对STZ诱导的糖尿病模型小鼠(A)和正常小鼠(B)饮食量的影响对比图。(**表示p<0.01，***表示p<0.001。)
图9是实施例二活性检测结果图。其中，(A)表示不同浓度(1，5，25nmol/kg)Z1Z2/GLTe-G进行OGTT实验结果图；(B)表示不同浓度(1，5，25nmol/kg)Z1Z2/GLTe-G刺激胰岛素分泌实验结果图。(**表示p<0.01，***表示p<0.001。)
图10是实施例二中体内稳定性检测实验中Z1Z2/GLTe-G经静脉注射入大鼠后，血浆中GLP-1的含量变化曲线图。
图11是实施例三中Z1Z2/SSTe纯化后SDS和Native-PAGE。
图12是实施例三中活性检测实验中大鼠体内生长激素含量变化曲线图。
图13是实施例三中半衰期检测实验中Z1Z2/SSTe经静脉注射入大鼠后，血浆中SST的含量变化曲线图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明创造进行进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或本领域技术人员在知识范围内能够推知的条件，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中涉及的试剂和仪器用具，通常为商用可市购产品，或能够通过其他公开途径获得的产品。
实施例一一多肽复合物作为GLP-1的载体
GLP-1(Glucagon-like peptide 1)是一种葡萄糖依赖的促胰岛素分泌肽，其具有两种活性形式，GLP-1(7-36)酰胺和GLP-1(7-37)。GLP-1在体内能与属于G蛋白偶联受体(GPCRs)的GLP-1受体结合，能促进胰岛β细胞分泌胰岛素，抑制胰高血糖素的分泌，控制血糖，是有效治疗2型糖尿病的多肽激素，但其在体内受到二肽基肽酶IV(DipeptidylPeptidase IV，DPP-IV)的降解，其半衰期仅2min左右，临床应用时需要高剂量频繁注射，严重限制了其作为药物在临床上的应用。
实验部分：
1.基因融合
将具有编码Z1Z2的基因序列(如SEQ ID NO:5中73-663位，以下简称Z序列)和具有编码Telethonin N端(TeN)的基因序列(如SEQ ID NO:1中73-348位，以下简称T序列)通过NcoI/KpnI酶切位点克隆到一个经过改造的pET24d的载体上(在pET24d上引入以6xHis标签和一个TEV蛋白酶酶切位点)，并且将T序列中的Cys突变为Ser(Zou PJ et al,J BiolChem.24Jan 2003,278(4):2636-2644)，得到pET-Z1Z2(原pET24d载体之外的序列部分如SEQ ID NO:5所示)和pET-TeN(原pET24d载体之外的序列部分如SEQ ID NO:3所示)质粒。
通过PCR的方法将GLP-1(7-37)连接到T序列的N端，中间通过linker(GGGGSGGGGSGGGGS)连接。用引物TeN-F、TeN-R将pET-TeN质粒全长进行扩增，
TeN-F:(SEQ ID NO:13)
GGTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGCCATGGCTACCTCAGAGCTGAG(下划线部分为linker密码子)
TeN-R:(SEQ ID NO:14)
CTGAAAATAAAGATTCTCAGTAGTGGGGAT
GLP-1全长基因采用重叠延伸法扩增，引物分别为GLP-1-F、GLP-1-R，
GLP-1-F:(SEQ ID NO:15)
P’CATGCGGAAGGCACCTTTACCAGCGATGTGAGCAGCTATCTGGAAGGCCAGGC
GLP-1-R:(SEQ ID NO:16)
P’GCCACGGCCTTTCACCAGCCACGCAATAAACTCTTTCGCCGCCTGGCCTTCCAGAT
P’表示5’端磷酸化。
先用TeN-F和TeN-R扩增全长且带有(GGGGS)3的pET-TeN，然后用T4DNA ligase将pET-TeN和带有5’磷酸的GLP-1基因进行连接，转化，挑选单克隆提取质粒后测序。测序正确的质粒命名为pET-24d-GLTe，原pET24d载体之外的序列部分如下(SEQ ID NO:7)：
Figure BDA0000663213250000101
Figure BDA0000663213250000111
其中，箭头所指为TEV酶酶切位点，双下划线为6xHis标签，单下划线为GLP-1氨基酸序列，曲线部分为linker。
2.表达
将pET-Z1Z2、pET-TeN和pET-24d-GLTe分别转化入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，挑取单菌落于含60μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃摇床过夜培养后，以1％接种量转接下一级，37℃继续培养至菌液OD600约为0.4-0.6时加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG，并于30℃诱导表达12h。待表达时间结束后在4℃，5000g条件下离心10min，收集菌体。
收集菌体后，用平衡缓冲液(25mM Tris/HCl,300mM NaCl,10mM咪唑，pH 8.0)进行重悬，然后，用细胞高压破碎仪(广州聚能生物科技有限公司)对菌体进行破碎，破碎结束后，14000rpm离心30min。
对于Z1Z2，吸取上清到Ni2+-NTA柱子(预先用平衡缓冲液进行平衡)中；利用AKTApurifier 10蛋白纯化仪对蛋白分别用漂洗缓冲液(25mM Tris/HCl,300mM NaCl,30mM咪唑，pH 8.0)进行漂洗，然后用洗脱缓冲液(25mM Tris/HCl,300mM NaCl,400mM咪唑，pH8.0)进行洗脱，收集洗脱液。
对于TeN和GLTe则将上清弃掉，用含有8M尿素的平衡缓冲液进行重悬，14000rpm离心30min后，吸取上清加入到用含有8M尿素的平衡缓冲液平衡好Ni2+-NTA柱中；利用AKTApurifier 10蛋白纯化仪对蛋白分别用漂洗缓冲液(8M尿素，25mM Tris/HCl,300mM NaCl,30mM咪唑，pH 8.0)进行漂洗，然后用洗脱缓冲液(8M尿素，25mM Tris/HCl,300mM NaCl,400mM咪唑，pH 8.0)进行洗脱，收集洗脱液。
3.纯化
分别将等体积TeN和GLTe逐滴加入到Z1Z2中，边加边摇动，使最终尿素的浓度达4M；然后将混合溶液在透析液I(25mM Tris/HCl，300mM，pH 8.0)中透析4h，然后换到透析液II(25mM Tris/HCl，pH 8.0)中透析过夜。最终分别形成Z1Z2/TeN复合物和Z1Z2/GLTe复合物。
在Z1Z2/TeN复合物和Z1Z2/GLTe复合物中按1/50的体积比加入TEV蛋白酶，以及TEV蛋白酶酶缓冲液(50mM Tris/HCl pH 8.0，0.5mM EDTA，1mM DTT)，在室温反应2h。
将用TEV蛋白酶酶切后的Z1Z2/TeN复合物和Z1Z2/GLTe复合物过Ni2+-NTA柱，没有被切完全的或者一些杂蛋白与Ni2+重新结合。流穿为没有His-tag的Z1Z2/TeN复合物和Z1Z2/GLTe复合物。
用HiTrapTM Q离子交换柱对Z1Z2/TeN和Z1Z2/GLTe进行进一步的纯化。分别将Z1Z2/TeN和Z1Z2/GLTe与Q离子交换柱进行结合，然后用AKTA Purifier10蛋白纯化系统进行线性洗脱，分别得到纯度较高的Z1Z2/TeN复合物和Z1Z2/GLTe复合物。
4.除内毒素
用大肠杆菌表达的蛋白质中含有大量的内毒素，而内毒素会对后期的细胞和动物实验产生严重影响，因此必须去除。用Q离子交换柱纯化后的Z1Z2/TeN复合物和Z1Z2/GLTe复合物加入到内毒素去除柱子中(ToxinEraserTM Endotoxin Removal kit，Genscript，Nanjing，China)以除去内毒素，并用内毒素检测试剂盒(ToxinSensorTM Chromogenic LALEndotoxin Assay Kit，Genscript)进行内毒素含量检测，最终Z1Z2/TeN复合物和Z1Z2/GLTe复合物中内毒素的含量小于2EU/ml。
5.GLP-1受体(GLP-1receptor，GLP-1R)激活实验
大鼠胰岛素瘤细胞RINm5F在含有10％FBS(Life Technology)的RPMI 1640培养基(Life Technology)，并放于37℃，5％CO2培养箱中培养。5000个RINm5F细胞接种到96孔细胞培养板中，过夜培养；用不含血清的RPMI 1640培养基清洗两遍后，将不同浓度的Z1Z2/GLTe复合物和GLP-1(用不含血清的培养基稀释，并加100μM的IBMX)分别与RINm5F细胞在37℃下孵育20min；然后，裂解细胞，细胞内cAMP的含量按照cAMP-GloTM Assay试剂盒(Promega)说明书进行检测。
6.活性检测
为了确定Z1Z2/GLTe对葡萄糖的控制作用，我们进行了口服葡萄糖耐受性实验(Oral glucose tolerance test，OGTT)。将250g左右大鼠随机分为4组(n＝5)，分别为Z1Z2/TeN组，Z1Z2/GLTe组，GLP-1组和PBS组；前3组分别按体重给腹腔注射25nmol/kg，PBS组给予相同体积的PBS，并用血糖仪测血糖浓度。30min后，通过灌胃的方式给予每kg体重2g葡萄糖，此时计为0min，此后分别在10，30，60，90，120min时测血糖。曲线下面积(Area ofunder curve，AUC)用Graphpad Prism 6.0软件进行计算。在这个过程中，分别在0，10，30min时通过尾静脉取血，加入到含有EDTA-Na2的离心管中，4000rpm离心10min，取上清，用Rat/Mouse Insulin Elisa kit(Millipore)测定其胰岛素含量。
为了进一步确定Z1Z2/GLTe的浓度与血糖控制的关系，我们进行了不同浓度Z1Z2/GLTe的OGTT实验；将250g左右SD大鼠随机分为4组(n＝5)，为别为1nmol/kg组，5nmol/kg组，25nmol/kg组和PBS组；通过腹腔注射分别将上述浓度剂量的Z1Z2/GLTe和PBS注射入大鼠体内，30min后通过灌胃的方式给予每kg体重2g的葡萄糖，此时计为0min，此后分别在10，30，60，90，120min时用血糖仪测血糖，并分别计算AUC。
为确定Z1Z2/GLTe可以在多长时间内发挥控制血糖的作用，我们进行了腹腔注射药物24h后对SD大鼠进行OGTT。正常进食的大鼠随机分为两组(n＝5)，分别是PBS组和Z1Z2/GLTe组。Z1Z2/GLTe组，将25nmol/kg的Z1Z2/GLTe通过腹腔注射入大鼠体内，另一组注射等体积的PBS。让其自由进食12h，然后禁食12h，禁食后进行OGTT。
7.体外稳定性检测
将Z1Z2/GLTe复合物和GLP-1分别加入新鲜采集的大鼠血清中，使其终浓度为1nM，然后分别在0，0.25，0.5，1，2，4，6，10h进行取样，取样后马上加入DPP-4抑制剂(Millipore)使抑制剂的终浓度为50μM。样品中活性GLP-1的浓度用Active GLP-1Elisa kit(Millipore)进行检测。
8.体内稳定性检测
将Z1Z2/GLTe和GLP-1分别通过腹腔(4nmol)和静脉(1nmol)注射入SD大鼠体内，分别在0，0.5，1，1.5，2，4，6，10h从尾部取血，滴入预先用EDTA-Na2处理过的Ep管中，取血后立即(30s以内)加入DPP-4抑制剂。样品中活性GLP-1的浓度用Active GLP-1Elisa kit(Millipore)进行检测。
9.对糖尿病小鼠血糖及饮食控制
将链脲佐菌素(STZ)按45mg/kg体重腹腔注射入KM小鼠中，连续注射5d，然后正常饲喂10d。然后，过夜禁食(12-16h)后测血糖，空腹血糖值>11.1mM的可判断为糖尿病模型。实验分为三组，正常组(即非糖尿病模型组)；糖尿病小鼠对照组(注射PBS)和糖尿病小鼠实验组(注射Z1Z2/GLTe)，每组6只，分3笼饲养。实验组每天上午9点按体重给予腹腔注射25nmol/kg Z1Z2/GLTe，对照组和正常组分别给予腹腔注射PBS。每4d过夜禁食(12-16h)一次，第4d测空腹血糖值。
为了研究Z1Z2/GLTe对正常小鼠和糖尿病小鼠饮食的影响。我们将正常KM小鼠(非糖尿病模型)12只，分2组，对照组(PBS)和Z1Z2/GLTe组；糖尿病模型小鼠12只，分2组，对照组(PBS)和Z1Z2/GLTe组。过夜禁食(12-16h)后，正常小鼠和糖尿病小鼠分别称重，然后Z1Z2/GLTe组分别按重量腹腔注射25nmol/kg Z1Z2/GLTe，PBS组分别腹腔注射同体积的PBS；给予预先称重的鼠粮，然后分别在2h，4h，8h和24h时称鼠粮的重量，以鼠粮的减少量除以每笼小鼠的体重为指标测定小鼠的进食量。
结果与分析部分：
1.Z1Z2/GLTe表达纯化
从图2可以看出，经过一系列的纯化后，Z1Z2/GLTe在SDS-PAGE图上表现为两条非常纯的条带，分别为Z1Z2(上)和GLTe(下)；而在Native-PAGE图上则表现为一条非常纯的条带，为Z1Z2/GLTe复合物。这表明，我们获得了纯度较高的用于后续试验的Z1Z2/GLTe复合物。
Z1Z2/GLTe复合物经内毒素去除预装柱处理后，其内毒素含量控制在2EU/ml的范围内，可以进行后续的细胞和动物实验。
2.激活GLP-1R实验
GLP-1R是一个细胞表面表达的G蛋白偶联受体，GLP-1能够与细胞表面表达的GLP-1R结合，从而激活下游的信号通路，产生cAMP。通过产生的cAMP的量可以反映与受体的结合情况。结果表明，Z1Z2/GLTe和GLP-1均能与GLP-1R结合，且能以浓度依赖的方式刺激cAMP的产生。Z1Z2/GLTe和GLP-1的EC50值分别为0.35±0.05nM和0.24±0.03nM(图3)。这表明Z1Z2/GLTe能够与GLP-1R结合且能强有力的激活GLP-1R，是GLP-1R的一种激动剂。
3.活性检测
GLP-1在体内能促进胰岛β细胞分泌胰岛素，抑制胰高血糖素的分泌，控制血糖。结果表明Z1Z2/GLTe能够非常显著地降低大鼠血糖。当口服葡萄糖后，血糖含量急剧升高，GLP-1和Z1Z2/GLTe能显著降低血糖，但是GLP-1只能在30min内发挥作用，而Z1Z2/GLTe却能在整个120min内有效控制血糖(图4A，B)。从胰岛素的产生来看，Z1Z2/GLTe和GLP-1都能显著地增加血液中胰岛素的含量，因此能够有效的发挥降血糖的作用(图4C)。
Z1Z2/GLTe控制血糖的能力具有浓度依赖性，随着浓度的升高而增加，当Z1Z2/GLTe的注射量为1nmol/kg时，即能显著降低血糖；当注射量为25nmol/kg时，其抑制血糖升高的能力最强(图4F，G)。
通过腹腔注射Z1Z2/GLTe 24h后，进行OGTT，发现Z1Z2/GLTe仍然能在60min内控制血糖，表明其在24h后血液中仍然存在Z1Z2/GLTe，且其浓度仍然能够发挥作用(图4D，E)。
4.体外稳定性检测
检测结果如图5所示，实验表明，在大鼠血清中，GLP-1具有较短的半衰期，大约为0.5h，这是由于血清中含有DPP-IV，DPP-IV会将GLP-1N端的两个氨基酸His和Ala切下，形成没有活性的多肽；而Z1Z2/GLTe可能由于空间位阻的原因减少了DPP-IV对其的酶切作用，明显延长了GLP-1的半衰期，其半衰期大约为4h。
5.体内稳定性检测
实验数据表明，Z1Z2/GLTe不论通过腹腔注射(图6A)或静脉注射(图6B)都能显著延长GLP-1半衰期。Z1Z2/GLTe腹腔注射后2h时，血浆中浓度达到最大，而GLP-1则是0.5h时达到最大；然后，GLP-1迅速下降，1h时达到检测下限，而腹腔注射Z1Z2/GLTe 24h后仍然能检测到200pM以上的浓度。这表明，Z1Z2/GLTe显著增加了GLP-1的稳定性，延长了其半衰期，也就增加了其发挥作用的时间。静脉注射后，Z1Z2/GLTe浓度缓慢下降，而GLP-1迅速下降，0.5h时达到检测下限。GLP-1经静脉注射半衰期为1-2min(Kim BJ et al,J Pharmacol ExpTher,2012,334(3):682-692)，而本实验中Z1Z2/GLTe为67±3.3min，显著延长了GLP-1的半衰期。
6.Z1Z2/GLTe对糖尿病小鼠血糖的长期控制
Z1Z2/GLTe较原始GLP-1具有更长的半衰期，但是其活性并没有减弱，因此比GLP-1具有更长时间的控制血糖的能力。通过对糖尿病小鼠血糖控制实验可以看出(图7)，每天腹腔注射25nmol/kg的Z1Z2/GLTe，能有效降低糖尿病小鼠空腹血糖水平。每天一次注射，能有效地长时间控制空腹血糖水平在一个较低的范围内。当停止注射(28d)后，其Z1Z2/GLTe组血糖值又开始升高。
7.对进食量的影响
实验数据表明Z1Z2/GLTe能够显著减少糖尿病小鼠(图8A)和正常小鼠(图8B)的进食量，这应该是由于Z1Z2/GLTe中的GLP-1能够增加饱腹感，减少胃排空的原因。减少了进食量也就减少了血糖的进一步升高，对血糖的控制具有积极的作用。
实施例二多肽复合物作为GLP-1(8G)的载体
GLP-1(7-37)由于其氨基酸序列的前两个氨基酸为HA，所以在血液中易受到DPP-4的切割作用而失去活性，所以将GLP-1(7-37)氨基酸序列中第8位氨基酸突变为Gly，可以有效的抑制DPP-4对其的酶切，从而更长时间延长半衰期。
实验部分：
1.载体构建
采用下列引物对实施例一中的载体pET-24d-GLTe进行定点突变，将GLP-1(7-37)氨基酸序列中第8位氨基酸Ala突变为Gly。
8A-G-F:(SEQ ID NO:17)
AATCTTTATTTTCAGCATGGCGAAGGCACCTTTACC(下划线部分为突变位点)
8A-G-R:(SEQ ID NO:18)
GCCATGCTGAAAATAAAGATTCTCAGTAGTGGGGATGTC
测序成功后，命名为pET-24d-GLTe-G，原pET24d载体之外的序列部分如下(SEQ IDNO:9)：
Figure BDA0000663213250000151
其中，箭头所指为TEV酶酶切位点，双下划线为6xHis标签，单下划线为GLP-1氨基酸序列，曲线部分为linker，黑斜体部分为突变的氨基酸。
2.表达、纯化、除内毒素
采用同实施例1的方法步骤进行，分别获得纯度较高且内毒素的含量小于2EU/ml的Z1Z2/GLTe-G复合物，其他复合物如Z1Z2/TeN复合物可直接由实施例1中的载体或其表达产物或除内毒素后的产物获得。
3.活性检测
为了确定Z1Z2/GLTe-G能否有效控制血糖，以及不同浓度与血糖控制的关系，我们进行了不同浓度Z1Z2/GLTe-G的OGTT实验；将250g左右SD大鼠随机分为4组(n＝5)，为别为1nmol/kg组，5nmol/kg组，25nmol/kg组和PBS组；通过腹腔注射分别将上述浓度剂量的Z1Z2/GLTe-G和PBS注射入大鼠体内，30min后通过灌胃的方式给予每kg体重2g的葡萄糖，此时计为0min，此后分别在10，30，60，90，120min时用血糖仪测血糖。
在每组进行OGTT实验中，10-30min分别从大鼠尾静脉取血，滴入含有EDTA-Na2的Ep管中，取血浆，用Insulin Elisa kit(Millipore)进行胰岛素含量测定。。
4.体内稳定性检测
将1nmol Z1Z2/GLTe-G通过大鼠尾静脉注射入大鼠体内，此时计为0h，然后分别在1，2，4，8，24h取血，滴入预先用EDTA-Na2处理过的Ep管中。样品中活性GLP-1的浓度用GLP-1(Total)Elisa kit(Millipore)进行检测。
结果与分析部分：
1.活性检测
对不同浓度Z1Z2/GLTe-G复合物进行OGTT实验，发现其能剂量依赖性的降低血糖(图9A)。即使在1nmol/kg时仍然能够发挥降血糖作用，而25nmol/kg时，其降血糖作用最为显著。这充分表明了，对GLP-1序列中的第8位氨基酸A突变为G时，其活性不受影响，依然能够发挥降血糖作用。
而胰岛素分泌试验也表明，随着浓度的增加，其胰岛素分泌量也增加(图9B)。表明，Z1Z2/GLTe-G复合物能有效刺激胰岛细胞分泌胰岛素，从而发挥降血糖作用。
2.体内稳定性检测
将Z1Z2/GLTe-G复合物经静脉注射入SD大鼠体内后，每隔一定时间尾部取血，用GLP-1(Total)Elisa Kit(Millipore)对血浆中Z1Z2/GLTe-G进行检测(图10)。发现其下降速度较慢，经计算其半衰期约为4h，是突变前(67min)的4倍，而是原GLP-1(1-2min)的约200倍，极大的延长了其半衰期，为更好的应用于临床奠定了基础。
实施例三多肽复合物作为SST的载体
生长抑素(Somatostatin，SST)是一种环状多肽，广泛分布于中枢神经系统和外周神经系统以及胃肠道中，能显著抑制生长激素的分泌和释放，也能抑制胰腺激素、胃泌素分泌等。SST能调控胰岛素和胰高血糖素的分泌。SST有两种活性形式，SST14和SST28。SST与属于GPCRs的SST受体结合，从而激活下游通路。主要用于治疗肢端肥大症，肝硬化门脉高压导致的食管静脉出血，急性胰腺炎及其并发症和胰胆肠瘘等。但是由于其在体内的半衰期只有2-3min(Afargan M et al,Endocrinology,2001,142(1):477-486)，严重限制了其在临床上的应用。
实验部分：
1.基因融合
采用全基因合成的方式分别获得实施例1中pET-Z1Z2和pET-TeN载体(也可以直接使用实施例1中的这两个载体或其表达产物)，以及具有将SST基因插入到TeN突变体Loop(LT1)中的基因序列的载体pET-24d-SSTe(原pET24d载体之外的序列部分如下SEQ ID NO:11)。
Figure BDA0000663213250000171
其中，箭头所指为TEV酶酶切位点，双下划线为6xHis标签，单下划线为GLP-1氨基酸序列，曲线部分为linker。
2.表达、纯化、除内毒素
采用同实施例1的方法步骤进行，分别获得纯度较高且内毒素的含量小于2EU/ml的Z1Z2/TeN复合物和Z1Z2/SSTe复合物。
3.活性检测
将250g左右的SD大鼠禁食12-16h后，随机分为2组，一组为实验组，按体重腹腔注射200nmol/kg的Z1Z2/SSTe复合物；另一组注射等体积的PBS。在0，30，60，120min时分别从尾部取血，加入到含有EDTA-Na2的离心管中，4000rpm离心10min，取上清。上清中生长激素的浓度用Growth hormone ELISA kit(Millipore)试剂盒检测。
4.半衰期检测
将Z1Z2/SSTe 0.28mg通过尾静脉注射入大鼠体内，分别在0，0.5，1，2，4，8，24h，从尾静脉取血，加入到含有EDTA-Na2的离心管中，4000rpm离心10min，取上清。上清中Z1Z2/SSTe中的SST用Somatostatin(SST)EIA kit(Phoenix pharmaceuticals)进行检测。
结果与分析部分：
1.Z1Z2/SSTe表达纯化
从图11可以看出，经过一系列的纯化后，Z1Z2/SSTe在SDS-PAGE图上表现为两条非常纯的条带；而在Native-PAGE图上则表现为一条非常纯的条带，为Z1Z2/SSTe复合物。这表明，我们获得了纯度较高的用于后续试验的Z1Z2/SSTe复合物。
Z1Z2/SSTe复合物的内毒素经内毒素去除树脂处理后含量控制在2EU/ml的范围内，可以用于后续实验。
2.活性检测
SST在体内能抑制生长激素的分泌，因此可以通过测定大鼠体内生长激素的含量来验证Z1Z2/SSTe复合物的活性。Z1Z2/SSTe复合物注射入大鼠体内后，显著抑制了大鼠生长激素的水平。SST及Z1Z2/SSTe注射入大鼠体内后，初期均能明显抑制体内生长激素的分泌，但是SST的半衰期(2-3min)较短，随着SST的降解，其抑制作用逐渐减弱，最后在2h时恢复到对照水平；而Z1Z2/SSTe能在120min内明显抑制生长激素的水平，说明其具有更长的半衰期(图12)。表明其具有与原SST类似的生物学活性，且能更长时间地发挥对生长激素的抑制作用。
3.半衰期检测
Z1Z2/SSTe复合物经静脉注射后，血浆中SST的含量如图13所示，其计算的半衰期为6.62±0.43h，比原SST(2-3min)延长了大约200倍。这表明Z1Z2/SSTe复合物在不影响SST与其受体结合的情况下，极大延长了其半衰期，使其能更长时间发挥药效。
Figure IDA0000663213340000011
Figure IDA0000663213340000021
Figure IDA0000663213340000031
Figure IDA0000663213340000041
Figure IDA0000663213340000051
Figure IDA0000663213340000061
Figure IDA0000663213340000071
Figure IDA0000663213340000081
Figure IDA0000663213340000091
Figure IDA0000663213340000101
Figure IDA0000663213340000111
Figure IDA0000663213340000121
Figure IDA0000663213340000131
Figure IDA0000663213340000141

Claims (7)

1.一种多肽复合物作为多肽或蛋白质药物载体的应用，所述多肽复合物含有：(i)多肽A：由SEQ ID NO:6中25-221位所示的氨基酸序列组成；(ii)多肽B：由SEQ ID NO:2中25-116位所示的氨基酸序列或SEQ ID NO:4中25-116位所示的氨基酸序列组成；所述多肽复合物在作为多肽或蛋白质药物载体时，所述多肽或蛋白质药物与多肽B构成融合蛋白，且该融合蛋白与多肽A形成β-折叠片结构；
所述融合蛋白中，多肽或蛋白质药物位于下述位点：多肽B的N端或内部的LT1 loop区；所述LT1 loop区是SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中第42-43位；
所述多肽或蛋白质药物是GLP-1或生长抑素。
2.根据权利要求1所述的多肽复合物作为多肽或蛋白质药物载体的应用，其特征在于：所述多肽A和/或多肽B还可以包含或连接蛋白质纯化标识序列和/或蛋白质间隔或连接序列。
3.根据权利要求1所述的多肽复合物作为多肽或蛋白质药物载体的应用，其特征在于：编码所述多肽A的核酸序列A及编码所述多肽B的核酸序列B可以分别为根据待构建表达载体的生物体的密码子偏爱性设计的核酸序列。
4.根据权利要求1所述的多肽复合物作为多肽或蛋白质药物载体的应用，其特征在于：编码所述多肽A的核酸序列A为具有SEQ ID NO:5中73-663位的核苷酸序列；编码所述多肽B的核酸序列B为具有SEQ ID NO:1中73-348位或SEQ ID NO:3中73-348位的核苷酸序列。
5.权利要求1-4任一项所述的多肽复合物作为多肽或蛋白质药物载体的应用的方法，包括：将所述多肽或蛋白质类药物的编码序列插入或连接多肽B的编码序列的所述位点，获得融合基因，并使融合基因在表达系统中表达获得含有该多肽或蛋白质药物的多肽B的融合蛋白，然后使融合蛋白和多肽A接触，构成具有药用作用的融合多肽复合物。
6.一种具有药用作用的融合蛋白复合物，所述融合蛋白复合物包含由多肽或蛋白质药物与多肽B构成的融合蛋白，且该融合蛋白与多肽A形成β-折叠片结构；其中，所述多肽A为由SEQ ID NO:6中25-221位所示的氨基酸序列组成的多肽；所述多肽B为由SEQ ID NO:2中25-116位所示的氨基酸序列或SEQ ID NO:4中25-116位所示的氨基酸序列组成的多肽；所述融合蛋白中，多肽或蛋白质药物位于多肽B的下述位点：多肽B的N端或内部的LT1 loop区；所述LT1 loop区是SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4中第42-43位；
所述多肽或蛋白质药物是GLP-1或生长抑素。
7.根据权利要求6所述的具有药用作用的融合蛋白复合物，其特征在于：所述融合蛋白复合物为由SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的片段以及两个SEQ ID NO:6中25-221位所示的氨基酸序列的片段结合在一起构成的具有β-折叠片结构的复合物。
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