CN1962695A

CN1962695A - 类胰高血素肽－1融合蛋白及其制备和用途

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Publication number: CN1962695A
Application number: CNA2005101101439A
Authority: CN
Inventors: 胡赓熙
Original assignee: ANPING BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL Co Ltd DEQING COUNTY ZHEJIANG; ZHEJIANG WOLWO BIOTECH CO Ltd
Current assignee: Zhejiang I Management Consulting Co.,Ltd.; Zhejiang Wolwo Bio Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2005-11-09
Filing date: 2005-11-09
Publication date: 2007-05-16
Anticipated expiration: 2025-11-09
Also published as: CN1962695B

Abstract

本发明提供一种类胰高血素肽－1重复序列与人血清白蛋白、免疫球蛋白、铁蛋白、类固醇结合蛋白、转铁蛋白、甲状腺素结合蛋白、α－2巨球蛋白和触珠蛋白形成的融合蛋白。本发明还提供了该融合蛋白的编码序列、含有该编码链的载体和宿主。本发明还提供了该融合蛋白的制备方法及其用途。本发明的融合蛋白可用于非胰岛素依赖型糖尿病及各种症状和肥胖症的治疗，其具有更好的稳定性和体内半衰期。

Description

类胰高血素肽-1融合蛋白及其制备和用途

发明领域

本发明涉及医药领域，更具体地说，涉及用于治疗非胰岛素依赖型糖尿病及肥胖症的长效类胰高血糖素肽-1融合蛋白、其制备方法、包含该胰高血糖素肽-1融合蛋白的药物组合物及其用途。

背景技术：

1.糖尿病

随着现代人类劳动强度显著下降和饮食习惯的改变，糖尿病的发病率迅速上升，据世界卫生组织最新统计，全世界有糖尿病患者1.25亿，平均每分钟就有6人因患糖尿病死亡，糖尿病造成的死亡，已居当今世界死亡原因的第五位。糖尿病通常分为I型糖尿病和II型糖尿病两种。I型糖尿病，约占糖尿病病人总数的10％，常发生于儿童和青少年，病因是患者体内胰腺产生胰岛素的细胞已经彻底损坏，从而完全失去了产生胰岛素的功能。患者需依靠外源胰岛素存活，一旦中止胰岛素治疗则威胁生命。II型糖尿病，约占糖尿病病人总数的90％，发病年龄多数在35岁以后。II型糖尿病，即非胰岛素依赖型糖尿病的确切发生机制，目前仍无定论；但推测可能受遗传及饮食失节、缺乏运动、形体肥胖、情志失调、化学药物等的影响，逐渐形成的一种内分泌失衡之疾病。主要根源于胰岛之β细胞受损，致胰岛素分泌不足；或是胰岛受体障碍而不能正常利用胰岛素；甚有报告指出α细胞所分泌之高血糖素相对太高亦是原因之一。II型糖尿病(NIDDM)在美国、瑞典、日本、智利、阿根廷等国患病率约5％～7％，西欧、东欧、苏联、加拿大、澳大利亚等国患病率约为2％～5％，印度、菲律宾等国患病率约为1％～4％，不同种族之间有差别，城市高于农村。据估计目前全世界约有糖尿病患者1亿2千万，美国约有糖尿病人1600万，中国糖尿病人约有3000万。据WHO最新数据预测，到2010年中国糖尿病人将达到目前的4倍，亚洲及非洲的糖尿病人将是目前的3倍，全世界将会有2.4亿糖尿病患者，同时糖尿病人群的发展正趋于低龄化。因此防治糖尿病已是一个迫不及待的紧急任务。

2.肥胖症

肥胖，特别是上身肥胖，是世界上营养过剩的人群当中最常见的营养紊乱。大量研究证实，减轻体重可大大降低慢性疾病的危险，所述慢性疾病如糖尿病、高血压、高脂血症、冠心病和肌骨骼病。减轻体重是许多慢性疾病治疗的一个具体目标。

目前帮助减轻体重的方法均不能让人完全满意。某些肥胖症患者可通过刻意调整行为来减轻体重，如改变饮食和增加运动，通过这些方法未能减轻体重可能是由于某些遗传因素，它们引起食欲增加，导致偏好高脂食物或脂肪生成代谢紊乱的倾向。不幸的是，每年用于减轻体重的措施上花费估计有330亿元，而这些措施中大部分没有效果。因此，急需帮助减轻体重的新方法和组合物(如药物)来补充旧的方法。

3.类胰高血素肽-1

类胰高血素肽-1(Glucogan Like Peptide 1，简称GLP-1，)是一个含37个氨基酸的短肽，具有在血糖浓度较高情况下促进胰岛素分泌的功能。GLP-1在调节高血糖中的一个优势是其本身受血糖水平的调节，在高血糖时活性增加，而低血糖时则相应降低，因此GLP-1在调节高血糖时不会产生低血糖副作用。又因GLP-1(7-36)酰胺可以抑制食欲，减缓胃液分泌和胃排空(Nauck，1993；Gutniak et al，1992)，所以也可将其作为控制体重的药物。根据这些特点，GLP-1受到广泛重视，期望能开发成治疗糖尿病和肥胖症的新一代药物。但是大量的研究表明，GLP-1无法作为药物在临床中使用，原因是GLP-1非常不稳定，在人体内会迅速降解，在血清中的半衰期只有1-2分钟，因此无法发挥其生物学功能。所以，开发出生物利用度更好的GLP-1类似物，是GLP-1研究领域所面临的挑战。

研究表明，一些GLP-1的衍生物和类似物具有更好的生物活性和稳定性，这些被称为GLP-1化合物。例如，Amylin公司的Exenatide/Exendin-4，每天注射2次可改善血浆葡萄糖水平，同时在24周后体重也减少3.4kg。但是Exenatide/Exendin-4也有其缺点，主要是副作用较强，会导致恶心、呕吐、甚至休克等副作用。由于副作用强，目前Exenatide/Exendin-4的临床剂量范围非常窄，剂量也很小，需要每天注射两次，很不方便。再有，HGS公司的Albugon，它是GLP-1和白蛋白的融合蛋白，它在猴子体内的半衰期可达3天。然后是N Nordisk公司的NN2211(Liraglutide)，它是GLP7-37，但带有一条与氨基酸26并连的16-碳脂肪酸尾，和一个碳终端突变。这条尾略微降低GLP-1的活性，但更重要的是，这个新GLP自我联系和结合血浆白蛋白，致使血浆半衰期超过10小时。此外，该化合物抑制细胞因子介导的胰β细胞程序死亡。总得来讲，目前开发的一些GLP-1类似物，表现了比GLP-1更好的生物活性和稳定性。但是在此领域中，人们迫切希望开发一种活性更高、稳定性更好而且副作用较低的用于治疗糖尿病和肥胖症的药物。

4.白蛋白

白蛋白是人血清中的主要蛋白组分，占血清总蛋白量的一半。人血清白蛋白由585个氨基酸组成，分子量为66KD。人血清白蛋白表现出多样性，有30种变异分子。人血清白蛋白基因已经被克隆(A.Drgaiczyk et al，PNAS，79：71-75，1982)，并被成功地在多种体外表达系统中进行表达。

人血清白蛋白生物学功能不详，但是其功能可能是多方面的。白蛋白在正常生理状态下不易透过肾小球，在血清中的半衰期达14-21天，作为血清中的主要成分，其存在可能对维持血液的稳定性有关键的作用。例如，大量白蛋白的存在可以保持血液的渗透压，离子强度等的稳定。同时，白蛋白由于具有较长的半衰期，也可以作为一种载体通过与血液中的其它因子，包括生物活性蛋白的结合，从而保持或延长其它因子在体内的生物活性。

事实上，白蛋白作为一种药物载体，在临床上已经获得了应用。使用白蛋白作为载体，既可以延长药物的半衰期，也可以提高药物的使用剂量。近年来，利用基因工程技术，将白蛋白与具有生物活性的蛋白分子进行重组表达的融合蛋白，已经成为开发长效蛋白药物的一个重要手段。

发明内容：

本发明的目的在于开发一类具有高活性、高稳定性、低副作用的类胰高血素肽，使之成为新一代治疗糖尿病和肥胖症的药物。

为实现上述目的，本发明第一方面提供了一种分离的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽的N端或C端与第二多肽的N端或C端直接相连，

其中所述第一多肽为多个类胰高血素肽-1以同一方向依次串联而成的类胰高血素肽-1重复序列，所述类胰高血素肽-1具有以下的氨基酸序列：

(a)序列表SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；

(b)相对于SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失、替代或插入且具有与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列相同生物活性的氨基酸序列；

(c)相对于SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列有90％以上同源性且具有与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列相同生物活性的氨基酸序列；

其中所述第二多肽选自人血清白蛋白、免疫球蛋白、铁蛋白、类固醇结合蛋白、转铁蛋白、甲状腺素结合蛋白、α-2巨球蛋白和触珠蛋白多肽。

在一个较佳的实施方案中，所述第二多肽选自人血清白蛋白多肽，所述多肽具有以下的氨基酸序列：

(a)序列表SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；

(b)相对于SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失、替代或插入且具有与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列相同生物活性的氨基酸序列；

(c)相对于SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列有90％以上同源性且具有与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列相同生物活性的氨基酸序列。

本发明另一方面提供了一种分离的核酸序列，其特征在于，它具有编码上述融合蛋白的核酸序列或其互补序列。

本发明另一方面提供了一种载体，其特征在于，它含有上述核酸序列。

本发明另一方面提供了一种宿主细胞，其特征在于，它被上述载体转化。

本发明另一方面提供了一种产生本发明所述融合蛋白的方法，其特征在于，该方法包括：

(a)提供一宿主细胞，该宿主细胞包含一表达载体，该表达载体包含本发明所述的核酸序列以及与其操作性相连的表达调控序列；

(b)在适合蛋白表达的条件下，培养步骤(a)所述的宿主细胞；

(c)分离出所述融合蛋白。

本发明另一方面提供了一种用于治疗非胰岛素依赖型糖尿病和肥胖症的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有本发明所述的融合蛋白以及药学上可接受的载体。

本发明另一方面提供了本发明所述的融合蛋白在制备用于治疗非胰岛素依赖型糖尿病和肥胖症的药物中的用途。

本发明另一方面提供了本发明所述的融合蛋白在制备用于使哺乳动物血糖水平正常化的药物中的用途。

本发明中的药物通过融合多个GLP-1多肽重复序列和人血清白蛋白、免疫球蛋白、铁蛋白、类固醇结合蛋白、转铁蛋白、甲状腺素结合蛋白、α-2巨球蛋白和触珠蛋白等蛋白，从而达到延长GLP-1在体内的作用时间的目的。本发明使用遗传工程技术，制备人GLP-1化合物长效融合蛋白。其长效效果主要通过两种设计来实现。一是该融合蛋白中含有多个GLP-1化合物重复衔接，二是该融合蛋白含有在人血液中具有长半衰期的人血清白蛋白、免疫球蛋白、铁蛋白、类固醇结合蛋白、转铁蛋白、甲状腺素结合蛋白、α-2巨球蛋白和触珠蛋白。通过生化以及细胞和动物实验验证，融合蛋白具有生物活性和生物功能，而且融合蛋白与天然GLP-1相比具有更好的稳定性和体内半衰期。

附图简述

图1显示了本发明所用表达载体质粒图谱。

图2显示了HSA/GLP-1融合蛋白表达的SDS-PAGE电泳结果。

图3显示HSA/GLP-1融合蛋白表达的Western印迹结果。

图4表明HSA/GLP-1融合蛋白具有激活人GLP-1受体的生物活性。

图5显示了小鼠注射HSA和HSA/GLP-1前后的浓度。

图6显示了小鼠注射HSA和HSA/GLP-1后20分钟后的血浆中胰岛素含量。

具体实施方案

本发明第一方面提供了一种分离的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含第一多肽和第二多肽，所述第一多肽的N端或C端与第二多肽的N端或C端直接相连，

(a)序列表SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；

在一个较佳的实施方案中，所述第二多肽是人血清白蛋白多肽，所述多肽具有以下的氨基酸序列：

(a)序列表SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；

在本发明中，术语“分离的”在用于核酸或蛋白质时，表示核酸或蛋白质基本上不含其它在天然状态下相关的细胞成分，其最好呈均质状态，但也可以是干的或水溶液。纯度和均一性通常可用分析化学方法如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法来测定。术语“蛋白质”、“肽”或“多肽”可互换使用。它们指通过肽键或酰胺键连接在一起的两个或多个氨基酸的链，无论是否经过翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)。该定义范围中特别包括抗体。本发明的多肽还可包含一个以上的亚基，每个亚基一条由分开的DNA序列编码。

在该技术方案中，术语“第一多肽的N端或C端与第二多肽的N端或C端直接相连”是指这两种多肽/蛋白质分子间的连接无任何连接多肽，这避免了因不必要的连接肽可能导致的免疫原性。连接方式可以是以第一多肽的N-末端直接连接在第二多肽的C末端或N末端上，也可以是第一多肽的C-末端直接连接在第二多肽的C末端或N末端上。优选连接方式是第一多肽的N-末端直接连接在第二多肽的C末端。

本发明融合蛋白中的“第一多肽”是类胰高血素肽-1(即GLP-1)重复序列，它由多个(较佳的为2-10个，更佳的为2-5个)类胰高血素肽-1单体以同一方向依次串联而成。术语“类胰高血素肽-1单体”是相对于“重复序列”而言，其指单个类胰高血素肽-1多肽。术语“同一方向依次串联”指每个GLP-1单体的N-末端直接连接在上一个多肽GLP-1单体的C-末端上，或者也可以是每一个GLP-1单体的C-末端直接连接在上一个GLP-1化合物单体的N-末端上。

本发明的术语“类胰高血素肽-1”和“人白蛋白多肽”的含义中不仅包括了具有如SEQ ID NO：2(类胰高血素肽-1第7-36位氨基酸)和SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，而且还包括了所述蛋白多肽的具有相同或相似生物活性或功能的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：相对于所述多肽的氨基酸序列有若干个(较佳地1-10个，更佳为1-5个，最佳为1-3个)氨基酸的缺失、插入和/或取代。另外，所述缺失或插入(增加)也可发生在C末端和/或N末端(通常有20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内的氨基酸缺失或增加)。在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。提供功能相似氨基酸的保守性置换表是本领域所熟知的。下列5组各自含有能相互保守置换的氨基酸：脂族：甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)；芳族：苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；含硫：甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)；碱性：精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H)；酸性：天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)。另外，该术语还包括了类胰高血素肽-1和人白蛋白的片段或衍生物，较佳的是该片段或衍生物保留了所需的蛋白生物活性。

就类胰高血素肽-1而言，其“生物活性或功能”指的是激活类胰高血素肽-1受体、降低血糖和升高血浆胰岛素等活性或功能。对于人白蛋白、免疫球蛋白、铁蛋白、类固醇结合蛋白、转铁蛋白、甲状腺素结合蛋白、α-2巨球蛋白和触珠蛋白多肽而言，其“生物活性或功能”指的是延长类胰高血素肽-1体内半衰期的功能。

上述变异形式还包括上述蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异和/或不影响序列的修饰形式上的差异。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。

本发明的术语“类胰高血素肽-1”和“人白蛋白多肽”还包括与其相同(同源)或基本上相同(同源)的多肽，例如，有至少60％、更佳70％、还要佳80％、90％、甚至95％以上的同源性或相同性的多肽。

在两个或多个核酸或多肽序列的情况下，术语“相同”或“相同性百分数”是指，当比较和排列对比其最大一致性(用下列序列对比算法之一(或本领域技术人员可获得的其他算法)或目视观察来测定)时，两个或多个序列或亚序列相同，或具有指定百分数的相同氨基酸残基或核苷酸。术语“基本上相同”是指，当比较和排列对比其最大一致性(用下列序列对比算法之一或目视观察来测定)时，两个或多个序列或亚序列具有至少60％、较佳的80％、最佳的90-95％的核苷酸或氨基酸残基相同性。这样的“基本上相同的”序列通常被认为是同源的。为了比较序列和确定同源性，通常将一个序列作为参比序列与测试序列比较。当用序列对比算法时，将测试和参比序列输入计算机内，指定亚序列坐标，如果需要，指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法根据指定的程序参数计算测试序列相对于参比序列的序列相同性百分数。序列比较的最优序列排列对比可采用例如Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)中的局部同源性算法、Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)中的同源性排列算法、Pearson和Lipman Proc.Natl.Acad.Sci(USA)85：2444(1988)中的相似性搜寻方法、这些算法的计算机化操作(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Wisconsin Genetics软件包，GeneticsComputer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)来进行。

具体地说，由如上所述的与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列有至少90％同源性、更佳有95％同源性的类胰高血素肽-1的多个重复序列以及与SEQID NO：1所示氨基酸序列有至少90％同源性、更佳有95％同源性的人白蛋白多肽构成的融合蛋白也包括在本发明的范围内，只要该融合蛋白表现出所述类胰高血素肽-1活性半衰期延长、稳定性好的效果。

在本发明的一个较佳实施方案中，本发明的所述融合蛋白具有选自下列的氨基酸序列：

(a)序列表SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；

(b)相对于SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失、替代或插入且具有与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列相同生物活性的氨基酸序列；

(c)相对于SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列有90％以上同源性且具有与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列相同生物活性的氨基酸序列。

本发明另一方面提供了一种分离的核酸序列，其特征在于，它具有编码上述融合蛋白的核酸序列或其互补序列。另外，本发明的核酸序列的范围内还涵盖了与相同(同源)或基本上相同(同源)以下的核酸序列，如有至少60％、更佳70％、还要佳80％、90％、甚至95％以上的同源性或相同性的核酸序列。两个核酸序列基本上相同/同源的另一个指标是两个核酸序列在高度严谨条件下相互杂交。因此，本发明的核酸序列的范围内还涵盖了在中度严谨条件下，更佳的在高度严谨条件下与本发明核酸序列杂交的核酸序列。

本发明的核酸序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，通常可通过重叠(overlapping)扩增，例如进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

本发明的融合蛋白可用固相技术通过直接合成肽而加以生产，也可以分别化学合成本发明蛋白的各片段，然后用化学方法加以连接以产生全长的分子。在一个较佳的方案中，本发明的融合蛋白用重组方法来制备。具体地说，首先用常规手段克隆获得编码HSA多肽和GLP-1多肽重复序列的核酸序列。具体是从适当的组织、细胞提取mRNA，通过RT-PCR获得相应的cDNA。也可以从适当的cDNA文库直接获得相应的cDNA。还可以通过人工合成获得。人工合成的核苷酸序列可适当进行密码子的改变，以便在相应的蛋白表达宿主中获得表达蛋白的最佳效果。

随后，将编码HSA多肽的核酸序列与编码GLP-1多肽重复序列的核酸序列连接起来。优选的合成方法为Overlap PCR的方法合成。然后，上述重组核酸序列被克隆到表达载体质粒中，使该核酸序列与表达调控序列操作性相连。本文所用的术语“表达调控序列”通常指参与控制核苷酸序列表达的序列。表达调控序列包括与目标核苷酸序列操作性相连的启动子和终止信号。它们通常还包括核苷酸序列适当翻译所需的序列。“操作性相连”是指线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。

例如，如果启动子或增强子增加了编码序列的转录，则它与编码序列是操作性相连的。本发明选用的表达质粒载体，包括适合在不同细胞宿主中表达融合蛋白的各种质粒，优选的质粒是表达载体质粒pYES3/CT(Novogen)，可以在市场上获得。

然后，将上述表达质粒转化到重组工程细胞宿主内，从而构建表达本发明融合蛋白的重组工程细胞宿主。这些重组工程细胞可以是来源于动物，植物，昆虫，真菌，酵母，细菌等。质粒pYES3/CT适合在酵母工程菌中表达融合蛋白，因此优选的重组工程细胞宿主为酵母工程菌，更优选的酵母工程菌为酿酒酵母工程菌BJ5457。本文所用的术语“转化”是指用本领域技术人员熟知的方法将含有感兴趣的核酸的表达载体直接导入宿主细胞内。转化方法因宿主细胞类型而异，通常包括：电转化；采用氯化钙、DEAE-葡聚糖或其它物质的转染；微粒轰击；脂转染；感染和其它方法(见Sambrook等人的《分子克隆实验指南》第2版，1989年)。较佳的方法是电转化方法。

随后，在适合本发明融合蛋白表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。本领域技术人员根据常规试验就能选择和确定培养基、培养温度、时间等条件。采用本领域常规检测手段，如SDS-PAGE，Western印迹等，可以检测出本发明融合蛋白的表达。最后，可用常规的蛋白分离纯化技术，进行融合蛋白的纯化，其包括离心，沉淀，过滤，层析等手段。具体地，层析方法又包括亲和法，凝胶过滤，离子交换，疏水层析，以及反向层析等。本发明提供的本发明的融合蛋白的分离纯化方法也包括上述各种方法的适当组合。

本发明也提供了一种鉴定HSA/GLP-1重复序列的融合蛋白的生物活性的方法。具体而言，本发明采用了HEK-293 Aurora CRE-BLAM体外测定方法对HSA/GLP-1融合蛋白进行活性测定。该方法具体是测定HSA/GLP-1融合蛋白激活GLP-1受体的能力，并与Exendin 4激活GLP-1受体的能力进行比较。HEK-293 Aurora CRE-BLAM是表达人GLP-1受体的细胞系，GLP-1及激动剂可诱导该细胞系产生cAMP，并通过一系反应元件产生荧光，且产生的荧光强度与GLP-1及激动剂的活性呈正相关。

本发明还提供了测定本发明的融合蛋白体内半衰期鉴定的方法。具体地，检测方法包括测定融合蛋白在动物以及人类体内的活性半衰期。动物包括但不限制于小鼠，狗，猴子。

本发明的融合蛋白可以用作药物，以治疗非胰岛素依赖型糖尿病和肥胖症等病症。因此，本发明另一方面还提供了一种药物组合物，该组合物含有药学上有效量的本发明融合蛋白以及药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。本文所用的“载体”应当与本发明的融合蛋白相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物的药效。可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。

本发明的药物组合物可根据需要制成各种剂型(如注射剂、片剂、胶囊剂、喷雾剂、颗粒剂、散剂、鼻用制剂等)，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量，通过是注射，口服，鼻内，呼吸道等方式进行施用。为了提高用药效果，本发明的融合蛋白也可以与其他药物，如用于治疗非胰岛素依赖型糖尿病和肥胖症的药物共同使用。

本发明另一方面还提供了本发明融合蛋白在制备用于治疗非胰岛素依赖型糖尿病和肥胖症的药物中的用途。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。这些技术在下列文献中有完整的描述：例如，Sambrook《分子克隆实验指南》第2版(1989)；《DNA克隆》第I和II卷(D.N.Glover编辑1985)；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait编辑，1984)；《核酸杂交》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑.1984)；《蛋白质纯化：原理和实践》第2版(Springer-Verlag，N.Y.)，以及《实验免疫学手册》I-IV卷(D.C.Weir和C.C.Blackwell编辑1986)。或者，可按照试剂生产商所提供的说明书进行。

实施例

实施例1：白蛋白基因克隆

白蛋白基因可以通过RT-PCR获得。首先取正常人外周血获得人白细胞，并从中制备RNA。然后通过反转录方法获得cDNA。再用PCR分子克隆技术扩增获得白蛋白基因。具体说明如下：

首先制备总RNA。具体是取正常人外周血人白细胞，然后在白细胞中加入1ml Trizol试剂裂解细胞，再以氯仿和异丙醇进行抽提RNA，用乙醇进行洗涤，RNA便可以进行RT-PCR反转录了。

RT-PCR使用宝生物公司mRNA Selective PCR试剂盒。具体条件如下。

2xmRNA Selective PCR缓冲液I，25μl，MgCl₂，10μl，dNTP/类似物混合物，5μl，RNase抑制剂，1μl，AMV RNase XL，1μl，Oligo dT引物，1μl，RNA，1μl，RNase Free dH₂O，6μl。根据下列的程序进行反应：30℃，10min，42℃，30min，5℃，5min。合成的cDNA可以在-20℃保存。

也可以用常规的PCR方法扩增HSA基因。条件如下：

扩增HSA所用的引物为：HSA引物1：TTTAAGAAGTAAGGAAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATC(SEQID NO：4)和

HSA引物2：CCCctcgag(XhoI)TTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT(SEQ ID NO：5)。

反应条件为：人胚胎cDNA文库，1μl；HSA引物1，2.5μl；HSA引物2，2.5μl；Premix Taq(Ex Taq)，25μl；ddH₂O，19μl。

PCR根据下列的程序进行反应。开始，94℃；5min；然后，94℃，1min；55℃，1min，72℃，1min，一共30个循环。最后，72℃，5min。

然后用常用的分子生物学方法，分离获得HSA基因。具体是用1％的琼脂糖胶电泳酶切产物，然后切下1800bp左右的目的条带，再用博大泰克公司<<PCR产物快速胶回收试剂盒>>回收切胶产物。电泳检测回收产物的粗浓度后-20℃保存。

实施例2：GLP-1基因克隆

GLP-1基因的克隆，是利用人工合成方法获得的。以下以2XGLP(含两个GLP的重复序列)的DNA合成进行说明。

首先，在保持氨基酸序列不变的情况下，两段GLP分别进行人工合成。然后，使用PCR方法，用两段GLP相互为引物PCR，合成2XGLP的DNA。具体条件如下：两段人工合成的GLP，10μl；10×pfu Buffer，5μl；dNTP混合物，2μl；pfu DNA Polymerase，0.5μl；ddH₂O，32.5μl。然后，把加好样品的PCR管放到PCR仪的96孔中，根据下列的程序进行反应。开始，94℃；5min；然后，94℃，1min；55℃，1min，72℃，1min，一共10个循环。最后，72℃，5min。

在两段GLP融合前加入一前导肽。以PCR方法获得，具体如下。

两条引物，加上了KEX的前导肽，分别为：

GLP1：CCCggtacc(KpnI)ATGAAGTGGGTAAGCTTTATTTCCCTTCTTTTTCTCTTTAGCTCGGCTTATTCCGGTTCTTTGGATAAGAGCACGGTGAAGGTACTTTCAC(SEQ ID NO：6)

GLP2：CCTCACTGTTGTGTGCATGCCTTCCTTTTACTAAC(SEQ IDNO：7)

然后，用常规的PCR方法扩增前导肽和两段GLP融合DNA。一般体系为，GLP合成PCR产物，10μl；10×pfu Buffer，5μl；dNTP混合物，2μl；GLP1，2.5μl；GLP2，2.5μl；pfu DNA Polymerase，0.5μl；ddH₂O，26.5μl。

PCR条件为：开始，94℃；5min；然后，94℃，1min；55℃，1min，72℃，1min，一共30个循环。最后，72℃，5min。

所产生的PCR反应产物使用琼脂糖电泳方法进行分析。在紫外灯下观察电泳情况。如果只有一对引物可以扩出300bp条带时，切胶回收条带。如果不只一对以上的引物可以扩出400bp的条带时，重复前面的实验，提高PCR的退火温度，至只有一条引物对可以扩出400bp的条带为止，再回收特异条带。

PCR反应产物最后进行序列测定，以保证克隆的正确。

实施例3：融合基因克隆

本实验以HSA基因和GLP-1基因形成HSA/GLP-1融合基因为例，说明融合基因的克隆方法。本方法也适合HSA基因与其它GLP-1化合物基因形成融合基因的克隆。

融合蛋白基因的克隆使用Overlap PCR的反应方法获得。具体如下。

Overlap PCR的反应体系为：GLP DNA，2μl；HSA DNA，2ul；PremixTaq(Ex Taq)，50μl；ddH₂O，36μl。

PCR条件为：开始，94℃；5min；然后，94℃，1min；55℃，1min，72℃，2min，一共5个循环。然后，加入引物GLP-11 5ul和HSA2 5ul。进入下个程序：94℃，1min；55℃，1min，72℃，2min，一共30个循环。最后，72℃，5min。

然后用常用的分子生物学方法，分离获得融合基因克隆。电泳检测回收产物的粗浓度后-20℃保存。

实施例4：HSA/GLP-1载体质粒的构建

以下以HSA/GLP-1融合基因为例，说明表达载体质粒的构建。

本实验采用PYES3/CT为表达载体质粒，其制备方法为常用分子生物学方法。即，通过培养含有表达载体的菌种，提取获得该质粒。制备好的质粒-20℃保存待用。

为了将HSA/GLP-1融合基因克隆到pYES3/CT表达载体质粒中，先对表达载体质粒PYES3/CT和GLP-1-HSA双酶切。具体条件如下。

37℃恒温水浴锅内反应3小时，酶切体系如下：

酶切体系：表达载体质粒HSA/GLP-1，10ul；KpnI，1ul；XhoI，1ul；10xM，2ul；ddH₂O，6ul。

然后用常用的分子生物学方法，分离获得HSA/GLP-1融合基因。具体是用agarose胶电泳酶切产物，然后切下目的条带，再用博大泰克公司<<PCR产物快速胶回收试剂盒>>回收切胶产物。电泳检测回收产物的粗浓度后-20℃保存。

然后，对酶切产物进行连接，获得HSA/GLP-1融合基因表达载体。具体如下：连接体系一般为10ul，solution I连接酶占体系的一半，剩下一半体系中表达载体与双酶切HSA/GLP-1的摩尔比为1∶2-10，不足补加无菌水。16℃恒温水浴锅内反应2小时。连接产物转化感受态DH5α细胞。转化反应用博大泰克生物基因技术有限公司的高效DH5α感受态及配带的试剂操作。

转化体系为：连接产物，10ul，无菌水，30ul，酶A，10ul。

取一管感受态DH5α细胞加入上述混合液中，轻柔混匀后冰上放置30分钟再37℃放置10分钟。加入500ul LB液体培养基37℃180rpm摇30分钟。取100ul转化液涂氨苄抗性的LB固体培养基，37℃倒置培养12-16小时。

阳性克隆的鉴定是通过挑选阳性克隆抽提质粒，进行酶切和测序结果来确定。

实施例5：HSA/GLP-1融合蛋白表达工程菌的构建

本实施例利用电转化方法和HSA/GLP-1融合基因为例，构建HSA/GLP-1融合蛋白表达工程菌的构建。具体方法如下。

首先挑选含有HSA/GLP-1融合基因的表达载体质粒的细菌克隆，提取表达载体质粒。然后，用电转化的方法把质粒转入酿酒酵母。提取方法为常用的分子生物学方法。

电转化方法转化酿酒酵母具体如下：先进行菌体的准备。挑取酵母单菌落，接种至含有5ml YPD培养基的50ml三角瓶中，30℃、250-300r/min培养过夜。然后取100-500μl的培养物接种至含有500ml新鲜培养基的2L三角摇瓶中，28～30℃、250-300r/min培养过夜，至OD600达到1.3～1.5。再将细胞培养物于4℃，1500g离心5min，用500ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬。离心后，再用250ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬。再离心，用20ml的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬。再离心，用1ml的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为1.5ml。

然后用电击方法进行转化。具体如下。

将5～20μgHSA/GLP-1融合基因的表达载体质粒DNA溶解于5～10μlTris缓冲液中，与80μl的上述步骤6所得的菌体混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中。将电转化杯冰浴5min。然后根据相应的电转化仪，采用优化的电压、电流、电容等参数，进行电击。电击完毕后，加入1ml冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5ml的Eppendorf管中，将菌体悬液涂布于山梨醇平板上，每200～600μl涂布一块平板。将平板置于30℃培养，直至单个菌落出现。

实施例6：HSA/GLP-1融合蛋白表达和纯化

实施例5中构建的HSA/GLP-1融合蛋白表达工程细胞，可以用以下的方法表达融合蛋白并进行纯化。以下是HSA/GLP-1融合基因的表达方法。

将酵母接种于500ml的SDA培养基中，摇床30℃，180转/分，培养24小时。然后，接种至装有5升YPD(蛋白胨2％，酵母提取物1％，葡萄糖2％)的发酵罐中，高压灭菌30分钟。发酵过程控温在30℃，溶氧始终大于20％的饱和度。PH不能低于5。培养至密度OD600为8。

利用常用的重组蛋白分离方法，获得以上酵母所表达的融合蛋白初提物。具体地，可以利用离心，超滤浓缩等方法。然后，可以利用层析方法，进一步纯化融合蛋白。具体地，可以采用Sepharose SP XL层析柱用于融合蛋白的捕获，再利用Butyl Sepharose FF层析柱，Ceramic Hydroxyapatite层析柱，以及DEAE Sepharose FF层析柱，进行更高的纯化。

融合蛋白表达和纯化结果通过常用的蛋白分析方法进行鉴定，包括但不限制于SDS-PAGE，Western印迹等方法。图2为HSA/GLP-1融合蛋白表达产物的SDS-PAGE电泳，结果显示73 KDa的蛋白质条带，Western印迹方法证明该蛋白质条带为HSA/GLP-1融合蛋白(图3)。

实施例7：HSA/GLP-1融合蛋白的活性

本实施例中采用HEK-293 Aurora CRE-BLAM体外测定方法对HSA/GLP-1融合蛋白进行活性测定。具体是测定HSA/GLP-1融合蛋白激活GLP-1受体的能力，并与Exendin 4激活GLP-1受体的能力进行比较。HEK-293 Aurora CRE-BLAM是表达人GLP-1受体的细胞系，GLP-1及激动剂可诱导该细胞系产生cAMP，并通过一系反应元件产生荧光，且产生的荧光强度与GLP-1及激动剂的活性呈正相关。具体方法如下：

按20,000至40,000细胞/孔(96孔黑亮底平板)的量，接种HEK-293Aurora CRE-BLAM细胞(中科院生化细胞研究所)，培养一天后换用无血浆培养3天后分别加入不同浓度的HSA/GLP-1融合蛋白，Exendin 4或HSA，培育5小时后再添加β-内酰胺酶继续温育1小时，在荧光测定仪上测定荧光。结果表明，HSA/GLP-1融合蛋白具有与GLP-1(7-37)-OH类似的激活人GLP-1受体的功能(结果见图4)。

实施例8：小鼠耐糖试验

小鼠禁食过夜(15小时)后按每公斤小鼠体重腹腔内注射HSA/GLP-1融合蛋白或白蛋白5mg。一小时后小鼠再口饲料葡萄糖2mg/kg小鼠体重，不同的时间段取血样测定其葡萄糖含量，结果显示HSA/GLP-1融合蛋白组小鼠能明显降低血糖(结果见图5)。

实施例9：血浆胰岛素测定

小鼠禁食过夜(15小时)后按每公斤小鼠体重腹腔内注射HSA/GLP-1融合蛋白或白蛋白5mg。一小时后小鼠再口饲料葡萄糖2mg/kg小鼠体重，以20分钟时间段时取血样测定其胰岛素含量，结果显示HSA/GLP-1融合蛋白组小鼠能明显升高血浆胰岛素含量(结果见图6)。

实施例10：HSA/GLP-1融合蛋白的体内药代动力学

采用Beagle犬两个组，每组4只单剂量静脉(IV)或皮下(SC)注射0.2mg/kgHSA/GLP-1融合蛋白，在0、15、30分钟、1、4、8、12、24、48、96、144、192、240小时分别取1ml的加入抗凝剂(EDTA)的血，离心后取上清液，-20℃保存待测定。在完成全部取样后，用免疫法测定血样中HSA/GLP-1融合蛋白含量，并计算该药在猕猴体内的药代动力学参数。结果表明IV给于HSA/GLP-1融合蛋白在Beagle犬体内的平均半衰期为约44小时。SC给于HSA/GLP-1融合蛋白在Beagle犬体内的平均消除半衰期为约62小时。而文献报道的GLP-1在体内的半衰期仅为数分种。可见HSA/GLP-1融合蛋白在体内具有长效作用的药代动力学特征。

尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。本文引用的所有出版物、专利和专利申请均纳入本文作参考。

序列表

<110>浙江我武生物技术有限公司

浙江德清安平生物制药有限公司

<120>类胰高血素肽-1融合蛋白及其制备和用途

<130>056414

<160>7

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>585

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu

1 5 10 15

Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln

20 25 30

Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu

35 40 45

Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys

50 55 60

Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu

65 70 75 80

Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro

85 90 95

Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu

100 105 110

Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His

115 120 125

Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg

130 135 140

Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg

145 150 155 160

Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala

165 170 175

Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser

180 185 190

Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu

195 200 205

Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro

210 215 220

Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys

225 230 235 240

Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp

245 250 255

Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser

260 265 270

Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His

275 280 285

Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser

290 295 300

Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala

305 310 315 320

Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg

325 330 335

Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr

340 345 350

Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu

355 360 365

Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro

370 375 380

Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu

385 390 395 400

Tyr Lys Phe Gln Ash Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro

405 410 415

Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys

420 425 430

Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys

435 440 445

Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His

450 455 460

Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser

465 470 475 480

Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr

485 490 495

Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp

500 505 510

Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala

515 520 525

Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu

530 535 540

Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys

545 550 555 560

Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val

565 570 575

Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

580 585

<210>2

<211>30

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg

20 25 30

<210>3

<211>645

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>3

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg His Gly

20 25 30

Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala

35 40 45

Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Asp Ala His Lys

50 55 60

Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys

65 70 75 80

Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe

85 90 95

Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr

100 105 110

Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr

115 120 125

Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr

130 135 140

Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu

145 150 155 160

Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val

165 170 175

Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu

180 185 190

Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr

195 200 205

Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala

210 215 220

Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro

225 230 235 240

Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln

245 250 255

Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys

260 265 270

Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe

275 280 285

Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu

290 295 300

Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu

305 310 315 320

Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys

325 330 335

Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu

340 345 350

Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp

355 360 365

Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp

370 375 380

Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp

385 390 395 400

Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr

405 410 415

Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys

420 425 430

Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile

435 440 445

Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln

450 455 460

Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr

465 470 475 480

Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys

485 490 495

Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr

500 505 510

Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro

515 520 525

Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg

530 535 540

Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys

545 550 555 560

Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu

565 570 575

Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu

580 585 590

Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met

595 600 605

Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys

610 615 620

Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln

625 630 635 640

Ala Ala Leu Gly Leu

645

<210>4

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc feature

<223>引物

<400>4

tttaagaagt aaggaagatg cacacaagag tgaggttgct catc 44

<210>5

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc feature

<223>引物

<400>5

cccctcgagt tataagccta aggcagcttg actt 34

<210>6

<211>100

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc feature

<223>引物

<400>6

cccggtacca tgaagtgggt aagctttatt tcccttcttt ttctctttag ctcggcttat 60

tccggttctt tggataagag cacggtgaag gtactttcac 100

<210>7

<211>35

<212>DNA

<213>智人

<400>7

cctcactgtt gtgtgcatgc cttcctttta ctaac 35

Claims

1.一种分离的融合蛋白，其特征是含有2个多肽区，其中第一多肽由多个类胰高血素肽-1重复序列组成，并通过其C-末端与第二多肽的N-末端，或者第二多肽的C末端和第一多肽的N末端直接连接，

(a)序列表SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述第二多肽为人血清白蛋白多肽，所述多肽具有以下的氨基酸序列：

(a)序列表SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；

3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述第一多肽中的类胰高血素肽-1重复序列数为2-10。

4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有选自下列的氨基酸序列：

(a)序列表SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列；

5.一种分离的核酸序列，其特征在于，它具有编码权利要求1所述的融合蛋白的核酸序列或其互补序列。

6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求5所述的核酸序列。

7.一种宿主细胞，其特征在于，它被权利要求6所述的载体转化。

8.一种产生权利要求1所述的融合蛋白的方法，其特征在于，该方法包括：

(a)提供一宿主细胞，该宿主细胞包含一表达载体，该表达载体包含权利要求5所述的核酸序列以及与其操作性相连的表达调控序列；

(b)在适合蛋白表达的条件下，培养步骤(a)所述的宿主细胞；

(c)分离出权利要求1所述的融合蛋白。

9.一种用于治疗非胰岛素依赖型糖尿病和肥胖症的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求1所述的融合蛋白以及药学上可接受的载体。

10.权利要求1所述的融合蛋白在制备用于治疗非胰岛素依赖型糖尿病和肥胖症的药物或使哺乳动物血糖水平正常化的药物中的用途。