CN112661862A - 一种融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种融合蛋白及其制备方法和应用。本发明提供如下任一所述产品：(B1)一种融合蛋白，所述融合蛋白由人胰高血糖素样肽‑1和人转铁蛋白融合组成；(B2)编码所述融合蛋白的核酸分子；(B3)含有(B2)所述核酸分子的表达盒；(B4)含有(B2)所述核酸分子的重组载体、或含有(B3)所述表达盒的重组载体；(B5)含有(B2)所述核酸分子的重组微生物、或含有(B3)所述表达盒的重组微生物、或含有B4)所述重组载体的重组微生物。该融合蛋白能够降低动物血糖。

Description

一种融合蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种融合蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

糖尿病(diabetes mellitus，DMs)是一种由于胰岛素分泌缺陷或者胰岛素作用不足而导致的慢性综合性代谢疾病，其主要临床表现为“三多一少”，多饮、多食、多尿和体重减轻，除此之外，还会导致一系列的并发症。据国际糖尿病联盟(IDF)统计2017年全球约4.25亿成人患糖尿病，预计到2045年，糖尿病患者可能达到6.29亿，如今糖尿病已经成为全球非传染性疾病中最具流行性的疾病(International DiabetesFederation,2017)。

在众多糖尿病的治疗药物中，胰高血糖素样肽-1(GLP-1)由于可抑制胃排空，减少肠蠕动，故有助于控制摄食，减轻体重；且相对于其他降糖药物GLP-1还表现出更高的疗效和安全性，具有依赖于人血糖浓度的高低进行血糖水平调节和保护与修复胰岛β细胞等优点。因此在近十几年以GLP-1作为糖尿病治疗药物作用靶点的研究受到了广泛关注。

糖尿病药物的给药方式分为口服给药和注射给药两种，但由于糖尿病是一种慢性疾病，会长期伴随病人，口服给药的方式无疑会更受大家欢迎。GLP-1是多肽，通过口服方式给药容易被消化道的酶或者胃酸灭活，生物利用率低，因此绝大多数的GLP-1药物都是通过注射的方式进行给药，但注射疗法毕竟是有创、有痛苦且依从性较低的给药方式。2019年9月20日，诺和诺德公司的索马鲁肽口服制剂(每日1次)正式批准上市，是首个上市的GLP-1RA口服制剂，大大增加患者的依从性，是GLP-RA治疗史上的一次飞跃，使GLP-1口服药物的研究成为可能(李艳梅,唐祎偌,夏旋.索马鲁肽口服剂:开启GLP-1受体激动剂的新时代[J].药品评价,2019(24):1-3.)。

现在用来生产GLP-1的平台主要有三种，①细菌：如大肠杆菌，生长迅速，易于培养，可以提供高重组蛋白产量，但其产物含有内毒素，缺乏复杂的翻译后修饰，且后续蛋白折叠不一定产生有功能蛋白；②酵母：酵母是生产功能性生物药品有吸引力的宿主，它可以提供高产量和有效的蛋白质分泌，然而高糖基化蛋白会导致免疫原性与过敏反应；③植物：如烟草，但其生长周期长，不利于培养(Sergio Rosales-Mendoza.2016)。

莱茵衣藻属于绿藻门，衣藻属，是几十年来用作分子生物学模式生物的淡水藻类，是单细胞真核绿藻，是目前微藻中研究最为透彻的藻类。莱茵衣藻作为动植物共同的祖先，拥有两根鞭毛、一个杯状叶绿体以及眼点，可以进行光合作用和游动。莱茵衣藻由于易于培养，生长迅速，生长周期短等优点，具有“绿色酵母”的美称，且其转基因技术成熟，遗传背景清楚，缺乏人类病原体，因此具有极高的应用价值。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的GLP-1蛋白半衰期短的缺陷，从而提供一种半衰期较长且可以口服给药的融合蛋白，相关生物材料，一种重组藻类制备方法，重组藻类在制备降血糖药物中的应用。

本发明提供如下任一所述产品：

(B1)一种融合蛋白，所述融合蛋白由人胰高血糖素样肽-1和人转铁蛋白融合组成；

(B2)编码所述融合蛋白的核酸分子；

(B3)含有(B2)所述核酸分子的表达盒；

(B4)含有(B2)所述核酸分子的重组载体、或含有(B3)所述表达盒的重组载体；

(B5)含有(B2)所述核酸分子的重组微生物、或含有(B3)所述表达盒的重组微生物、或含有B4)所述重组载体的重组微生物。

可选的，重组微生物为重组藻类。

可选的，重组载体为PDB124多克隆位点NdeI和NheI之间插入SEQ ID NO.1得到的重组载体。

可选的，人胰高血糖素样肽-1和人转铁蛋白通过连接肽连接。

可选的，所述融合蛋白的氨基酸序列为从N末端至C末端依次由所述人胰高血糖素样肽-1氨基酸序列、连接肽氨基酸序列、人转铁蛋白氨基酸序列组成；

可选的，所述融合蛋白的氨基酸序列为从N末端至C末端依次由甲硫氨酸、所述人胰高血糖素样肽-1氨基酸序列、连接肽氨基酸序列、人转铁蛋白氨基酸序列、标签蛋白的氨基酸序列组成。

可选的，所述人胰高血糖素样肽-1氨基酸序列为SEQ ID.No.2第2-31位；其编码DNA分子的核苷酸序列为SEQ ID No.1(5’-3’)第4-93位；

人转铁蛋白氨基酸序列为SEQ ID.No.2第48-725位；其编码DNA分子的核苷酸序列为SEQ ID No.1(5’-3’)第142-2175位；

连接肽氨基酸序列为SEQ ID.No.2第32-47位；其编码DNA分子的核苷酸序列为SEQID No.1(5’-3’)第94-141位；

标签蛋白的氨基酸序列为SEQ ID.No.2第726-731位；其编码DNA分子的核苷酸序列为SEQ ID No.1(5’-3’)第2176-2193位。

一种重组藻类制备方法，向藻类中导入上述核苷酸分子。

上述融合蛋白的制备方法，该方法是培养上述重组藻类。

可选的，所述藻类是绿藻门藻类；可选的，为团藻目藻类；可选的，为衣藻科藻类；可选的，为衣藻属藻类；可选的，为莱茵衣藻；可选的，为莱茵衣藻藻种；可选的，为细胞壁缺陷型CC-849。

上述的产品或制备得到的重组藻类在制备降血糖药物中的应用。

上述药物为口服制剂或注射剂。

上述的产品或制备得到的重组藻类在制备刺激胰岛素分泌产品中的应用。

SEQ ID No.1(5’-3’)第1-3位为起始密码子；SEQ ID No.1(5’-3’)第4-93位为GLP-1基因；第94-141位为连接多肽GGGGSX3；142-2175位为人铁转运蛋白TF基因；第2176-2193位为6xHis；第2194-2199位为终止密码子。

本发明技术方案，具有如下优点：

1、本发明提供如下任一所述产品：(B1)一种融合蛋白，所述融合蛋白由人胰高血糖素样肽-1和人转铁蛋白融合组成；(B2)编码所述融合蛋白的核酸分子；(B3)含有(B2)所述核酸分子的表达盒；(B4)含有(B2)所述核酸分子的重组载体、或含有(B3)所述表达盒的重组载体；(B5)含有(B2)所述核酸分子的重组微生物、或含有(B3)所述表达盒的重组微生物、或含有B4)所述重组载体的重组微生物。该融合蛋白能够降低动物血糖。此外，该融合蛋白半衰期较长且可以口服给药，与注射类的药物相比，可减轻患者痛苦。

2、本发明中生产融合蛋白的莱茵衣藻生长周期短，易培养，可进行高密度发酵生产，有绿色酵母之称，且具有高附加值产物，不占用耕地面积。

3、本发明表达融合蛋白，选用的表达载体为适合莱茵衣藻的核表达载体，转化方法为珠磨法，材料简单，操作简便；

4、本发明还可以用莱茵衣藻的冻干细胞形式给药，不需要进行蛋白纯化，简化了生产流程，且属于口服降糖药，可减轻患者痛苦。

5、莱茵衣藻遗传背景清晰，转基因技术成熟，不含人类病原体和内毒素，利用它作为药物生产平台具有高度安全性。

6、本发明通过基因工程技术在莱茵衣藻细胞内稳定表达长效GLP-1类似物，可以以莱茵衣藻全细胞口服药物方式给药，以期为Ⅱ型糖尿病病人提供一种安全有效的口服降糖药。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明的实验流程图；

图2是实施例1中的重组质粒PDB124-GLP-1-TF的示意图；

图3是实施例1中对重组质粒PDB124-GLP-1-TF进行双酶切验证结果；

图4是实施例3中转基因莱茵衣藻藻株DNA水平筛选结果；从左到右泳道依次是Marker，标号为1-24的品系；

图5是实施例3中qRT-PCR结果；G15表示野生型对照，1、4、7、22、23均表示转基因莱茵衣藻藻株品系；

图6是实施例3中western blot结果；

图7是实施例4融合蛋白刺激胰岛素分泌效果实验结果；

图8是实施例4中降糖效果实验结果。

具体实施方式

PDB124载体在黄观钦.高效表达Glut1蛋白的莱茵衣藻的构建及初步功能研究[D].2018.中公开过。

总体实验流程见图1。

实施例1人胰高血糖素样肽-1-转铁蛋白序列的设计与合成

1、以人胰高血糖素样肽-1基因(GLP-1,NM002054)和人转铁蛋白基因作为优化对象，按照莱茵衣藻密码子偏好性，进行密码子优化，获得如SEQ ID NO.1所示的人胰高血糖素样肽-1-转铁蛋白融合基因(GLP-1-Tf)，由通用生物系统(安徽)有限公司直接合成pMD18-T-GLP-1-Tf，该基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2、将pMD18-T-GLP-1-Tf热激转化到大肠杆菌Top10菌株感受态细胞中，37℃培养8h后挑取单克隆，提取质粒pMD18-T-GLP-1-Tf。

3、人胰高血糖素样肽-1-转铁蛋白表达载体的构建

1)GLP-1-TF-T载体、PDB124载体酶切

用NdeI和NheI内切酶对PDB124载体进行双酶切，按照表1配置反应液，37℃酶切30min；酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，DNA纯化回收试剂盒回收线性化PDB124载体骨架。

用NdeI和NheI内切酶对pMD18-T-GLP-1-Tf载体进行双酶切，按照表1配置反应液，37℃酶切30min；酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，DNA纯化回收试剂盒回收两侧带酶切位点的目标基因GLP-1-Tf的DNA片段(将其命名为DNA片段1)。

表1双酶切反应体系

2)DNA片段1与PDB124载体骨架连接转化

纯化后的DNA片段1和PDB124载体骨架，用T4 DNA连接酶进行连接；按照表2配置反应体系，22℃连接反应30min。

表2连接体系

3)连接反应结束后，取5μL连接产物与大肠杆菌Top10感受态细胞混合，冰上放置30min后42℃热激30s，加入无抗LB液体培养基，37℃摇床复苏60min；复苏菌液涂布氨苄青霉素抗性平板；倒置于37℃培养箱培养过夜，得到转化子。

4)转化子筛选鉴定

步骤3)得到的转化子用新抗性平板进行第二轮筛选，第二轮筛选后的转化子进行菌落PCR扩增，菌落PCR扩增使用的检测引物，F：ttggaggtacgaccgagatg(SEQ ID NO.3)，R：gaacgcgctagctcattagt(SEQ ID NO.4)按照表3，配置PCR反应体系进行扩增。扩增参数：预变性98℃2min；35个扩增循环，每个循环依次：98℃10s、65℃5s、68℃20s；然后68℃延伸10min；16℃保存。

表3

菌落PCR阳性的转化子，小量培养后提取质粒，按照1)的方法，用NdeI和NheI对重组质粒PDB124-GLP-1-TF进行双酶切验证，结果见图3。重组质粒PDB124-GLP-1-TF的示意图见图2。

将上述步骤中的GLP-1-TF替换为GLP-1，作为对照，得到PDB124-GLP-1。

实施例2莱茵衣藻的遗传转化

在本实例中，莱茵衣藻的转化方法为珠磨法，莱茵衣藻为细胞壁缺陷型CC-849，转化用载体为PDB124-GLP-1-TF表达载体。具体方法如下：

1)取对数生长期的2mL细胞壁缺陷型衣藻CC-849接种于100mL TAP培养基中，在光照条件下培养至对数生长前期，室温3000rpm离心5min收集藻细胞，并用新鲜TAP培养基重悬藻细胞至浓度为2×10 ⁸cells/mL。

2)37℃下，采用限制性内切酶kpnI线性化处理2-3μg重组质粒(PDB124-GLP-1-TF)1h；

3)在无菌1.5ml离心管中依次加入0.3g无菌酸洗玻璃珠、400μL藻细胞和1-2μg经kpnI线性化的载体DNA；

4)将上述混合物在涡旋振荡器上高速涡旋25s，再转移至含10ml新鲜TAP培养基的50ml离心管中，避光过夜培养14-16h，使细胞恢复。

5)收集藻细胞涂布于含有0.01mg/mL博来霉素的TAP固体培养基中，直至平板中长出绿色单克隆细胞壁缺陷型衣藻CC-849转化子。

实施例3转基因莱茵衣藻藻株筛选与鉴定

(一)DNA水平筛选：挑取抗性平板上长的单克隆衣藻转化子，于新的0.01mg/mL博来霉素TAP固体平板上划线扩大培养。待其生长形成规模后，挑取各个克隆藻体入50mL液体TAP培养基中扩大培养，并利用试剂盒提取各个转化子的总DNA，并进行PCR对转化子基因组进行验证，F：TTGGAGGTACGACCGAGATG(SEQ ID NO.3)R：GAACGCGCTAGCTCATTAGT(SEQ IDNO.4)进行PCR扩增。PCR扩增体系，见下表。

表4

扩增条件：预变性98℃2min；35个扩增循环，每个循环依次：98℃10s、65℃5s、68℃20s；68℃10min；

PCR扩增产物大小为2342bp的转化子即为阳性工程藻，见图4。

(二)RNA水平筛选：挑取DNA水平筛选为阳性的工程藻，培养至对数前期后提取总RNA。

藻类总RNA的提取包括以下步骤：

1.从平板挑取适量藻种于100ml TAP的250ml三角瓶中，置于22℃光照培养箱培养至对数期。

2.取一定量对数期藻液至离心管中，8000rpm，离心2min，取一定量对数期藻液至2ml离心管中，8000rpm，离心2min，弃上清夜。

3.加入1mL RNAiso plus，充分混匀，使细胞重悬，室温静置5min。

4.于上述溶液中加入200μL氯仿，盖紧盖子剧烈震荡混匀，直到溶液呈乳状。

5.静置5min，4℃，12000rpm，离心15min。

6.取上层溶液于一个新的离心管中，加入700μL异丙醇，混匀。

7.静置10min，4℃，12000rpm，离心15min。如果底部未见有白色沉淀，可多离心几次。

8.弃上清，加入与上清等体积(1mL)的75％(v/v)乙醇，轻轻颠倒洗涤离心管管壁。4℃，9000rpm，离心5min。

9.弃上清。4℃，9000rpm，离心2min，用枪头轻轻吸取移除剩余的乙醇。

10.在室温下开盖干燥3-5min，加入35μL RNA free water溶解，保存于-80℃。

以总RNA作模板，用PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser(Takara)反转试剂盒进行反转录，得到cDNA，以引物F：gagctttcgggaccacatga(SEQ ID NO.5)，R：ttgttaggagcgaggtacgc(SEQ ID NO.6)进行qRT-PCR，野生型藻株作为对照。PCR扩增体系见下表。

表5

扩增条件：98℃ 2min；98℃ 10s、60℃ 10s、68℃ 30s，40cycle；95℃ 15s、60℃1min、99℃ 15s，筛选表达量高的莱茵衣藻转化藻株，见图5，从图5中可以看出，品系1、4、22和7GLP-1表达量较高。

(三)蛋白水平检测(western blot)

1)取养至对数后期的品系1转基因莱茵衣藻藻株培养液约5mL左右，取相同条件下野生莱茵衣藻藻株培养液作为对照，离心收集藻细胞后用PBS清洗3次；

2)在藻细胞中加入200μL蛋白裂解液，放于30℃震荡裂解30min左右，然后4℃离心，收集上清液即为总蛋白，加入蛋白酶抑制剂-20℃保存。

3)总蛋白进行10％SDS-PAGE电泳分离，取总蛋白加入蛋白上样缓冲液混合，沸水浴10min后离心，置于冰上；

4)将预制胶提前拿出恢复室温，撕掉底部绝缘条，安装好后加入蛋白电泳缓冲液，检查是否漏液；

5)上样前拔掉梳子，用枪头小心将煮好的蛋白样品加入泳道(从第二个孔开始加样，左右两个孔和其它没有蛋白样品的孔加入等体积不加蛋白样品的蛋白上样缓冲液)；

6)150V恒压，电泳40min左右，直至目的蛋白条带在胶的中间位置；

7)将电泳好的蛋白胶切掉梳子孔，并切掉左上角进行标记，放置在提前准备好的转膜液中；

8)PVDF膜裁剪到跟海绵垫大小一致，切掉左上角进行标记，用甲醇进行15s激活后，充分浸泡在转膜液中3-5min，将海绵(滤纸)放在托盘中，用转膜液充分浸泡2-3min；

9)将转膜夹黑色面朝下放置在托盘中，依次放上海绵垫、蛋白胶、PVDF膜、海绵垫，每放完一层注意赶走气泡，最后夹紧转膜夹，转膜夹黑色面对应转膜槽黑色面放入(夹子向上)；

10)加入转膜液，和冰盒，使转膜液覆盖整张PVDF膜，350mA恒流湿转90min(可将转膜槽放置在冰水中降温)；

11)转膜结束后，用TBST洗膜3次，每次5min；

12)洗膜结束后，将PVDF膜放入提前准备的5％全脂奶粉中(使用TBST进行配置)，置于水平摇床，室温封闭1h；

13)封闭结束后，用TBST洗膜3次，每次10min；

14)蛋白面朝下加入10mL TF鼠源一抗(用封闭液1：1000稀释)，4℃孵育过夜；

15)回收一抗，于-20℃保存，用TBST洗膜3次，每次10min；

16)加入10mL羊抗鼠二抗(北京聚合美)(用TBST1：5000稀释)，置于水平摇床，室温孵育1h；孵育结束后，用TBST洗膜3次，每次10min，然后尽快显影观察。

17)进行western blot，结果见图6，WT为野生型藻株，GLP-TF为转基因莱茵衣藻藻株(实验组)，实验组在70-100KD有条带。实验证明，莱茵衣藻藻株能够高表达胰高血糖素样肽-1-转铁蛋白(GLP-1-TF)。

实施例4胰高血糖素样肽-1(GLP-1)短肽与转铁蛋白的融合蛋白活性检测

1、融合蛋白刺激胰岛素分泌效果

实验采用小鼠胰岛β细胞-MIN6作为实验细胞，使用DMEM高糖培养基(加入50μMβ巯基乙醇和体积分数为10％胎牛血清)培养细胞，当细胞密度达到80％时，将其以3X10⁴Cells/mL接种到96孔板中，孵育培养3天后，用Earle’s balanced salt solution(碧云天C0213-500ml)洗两次，然后饥饿1h，用采用常规纯化方法，纯化后的GLP-1-TF、GLP-1和TF蛋白在不同葡萄糖浓度(5nM、10nM、15nM)与细胞进行孵育，细胞培养液中每种蛋白的浓度均为1mg/kg(细胞培养液)，孵育135min后，收取细胞培养上清液，用mouse insulin ELISAKits(SAB EK1781)测定胰岛素浓度。具体见图7，从图7中可以看出GLP-1-TF蛋白在葡萄糖浓度为5nM、10nM和15nM时，刺激胰岛素分泌水平均较高。

2、降糖效果实验

将8周龄相同体重的II型糖尿病模型小鼠禁食过夜(12h)，然后随机分成3组，每组10只，分别为对照组、GLP-1-TF和GLP-1组。在IPGTT实验前1h，对照组小鼠灌胃无菌生理盐水，而GLP-1-TF组和GLP-1组小鼠灌胃相应的纯化后的蛋白和商品化蛋白(Ctrl)(1.5μg/g体重)，每组小鼠腹腔注射2mg/g的葡萄糖后，分别在0min、15min、30min、60min和120min测量其血浆的葡萄糖水平，每组使用5-6只小鼠。结果见图8，可以看出0-30min，三组实验血浆的葡萄糖水平均升高，GLP-1-TF组血浆的葡萄糖水平最低；30-120min，GLP-1-TF组血浆的葡萄糖水平较另外两组显著降低。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

序列表

<110> 深圳大学

<120> 一种融合蛋白及其制备方法和应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2199

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgcacggtg agggtacgtt cacctcggat gtctcctcct acctggaggg tcaggctgcg 60

aaggagttta ttgcgtggct ggtcaagggc cgcgggggtg gcggttcggg cggcggtggg 120

agcggtggtg gtggctccgt cccggataag accgtccgct ggtgcgccgt gtcggagcat 180

gaggccacca agtgccagag ctttcgggac cacatgaaga gcgtcattcc cagcgacggg 240

cctagcgtcg cgtgcgtcaa gaaggcttcg tacctcgatt gcattcgggc gattgctgcg 300

aacgaggctg atgctgtgac cctggacgcc gggctggtct acgatgcgta cctcgctcct 360

aacaacctca agcctgtcgt cgccgagttc tacggtagca aggaggaccc gcagacgttc 420

tactacgccg tcgccgtcgt gaagaaggac agcgggtttc agatgaacca gctgcggggc 480

aagaagtcgt gccacaccgg cctgggccgg agcgcggggt ggaacatccc tattggtctg 540

ctctactgcg acctccccga gcctcggaag cccctggaga aggctgtcgc caacttcttt 600

tcgggttcgt gcgcgccgtg cgccgatggg acggattttc cgcagctctg ccagctgtgc 660

ccgggctgcg gctgctcgac gctcaaccag tactttggtt actccggggc ttttaagtgc 720

ctgaaggacg gggccggtga tgtggcgttt gtgaagcatt cgaccatctt cgagaacctc 780

gccaacaagg ccgatcggga ccagtacgag ctcctgtgcc tggacaacac ccggaagccc 840

gtggatgagt acaaggactg ccatctcgcc caggtgccgt cgcacaccgt cgtggcccgc 900

tccatgggcg ggaaggagga tctcatctgg gagctgctca accaggccca ggagcatttt 960

ggcaaggaca agtccaagga gttccagctg ttcagctccc cgcatggtaa ggatctcctc 1020

ttcaaggact ccgcgcatgg ttttctgaag gtgcccccgc gcatggatgc taagatgtac 1080

ctggggtacg agtacgtgac ggccatccgc aacctccggg agggcacgtg ccctgaggcg 1140

ccgacggatg agtgcaagcc ggtgaagtgg tgcgccctgt cgcatcatga gcgcctcaag 1200

tgcgacgagt ggtcggtgaa ctccgtgggt aagattgagt gcgtgtccgc tgagaccacg 1260

gaggactgca ttgcgaagat catgaacggt gaggctgacg ctatgtccct ggacggcggt 1320

tttgtgtaca ttgccggtaa gtgcggcctg gtccccgtcc tcgctgagaa ctacaacaag 1380

tcggacaact gcgaggatac gccggaggcc ggctactttg cggtcgcggt cgtgaagaag 1440

tcggcgtcgg atctcacgtg ggacaacctg aagggtaaga agtcgtgcca taccgccgtg 1500

gggcgcaccg ccggctggaa catccccatg gggctcctct acaacaagat caaccattgc 1560

cggtttgatg agttcttcag cgaggggtgc gctcccggct cgaagaagga ttcgtcgctg 1620

tgcaagctgt gcatgggttc gggtctgaac ctctgcgagc ccaacaacaa ggagggttac 1680

tacgggtaca cgggcgcgtt tcggtgcctc gtcgagaagg gggatgtcgc gtttgtcaag 1740

catcagacgg tgccccagaa cacgggcggt aagaaccccg acccctgggc caagaacctc 1800

aacgagaagg attacgagct cctgtgcctc gacggcacgc gcaagcccgt ggaggagtac 1860

gcgaactgcc atctcgctcg cgccccgaac catgcggtgg tgacccggaa ggataaggag 1920

gcgtgcgtgc acaagattct ccggcagcag cagcatctgt ttggctccaa cgtcacggat 1980

tgcagcggga acttttgcct ctttcgcagc gagaccaagg atctgctctt ccgcgatgac 2040

acggtgtgcc tggccaagct gcatgatcgg aacacctacg agaagtacct cggtgaggag 2100

tacgtgaagg cggtgggcaa cctccggaag tgctccacca gctcgctcct ggaggcttgc 2160

acgttccggc ggccgcacca tcatcaccac cactaatga 2199

<210> 2

<211> 731

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met His Gly Gly Gly Thr Pro Thr Ser Ala Val Ser Ser Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gly Gly Ala Ala Leu Gly Pro Ile Ala Thr Leu Val Leu Gly Ala Gly

20 25 30

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Pro

35 40 45

Ala Leu Thr Val Ala Thr Cys Ala Val Ser Gly His Gly Ala Thr Leu

50 55 60

Cys Gly Ser Pro Ala Ala His Met Leu Ser Val Ile Pro Ser Ala Gly

65 70 75 80

Pro Ser Val Ala Cys Val Leu Leu Ala Ser Thr Leu Ala Cys Ile Ala

85 90 95

Ala Ile Ala Ala Ala Gly Ala Ala Ala Val Thr Leu Ala Ala Gly Leu

100 105 110

Val Thr Ala Ala Thr Leu Ala Pro Ala Ala Leu Leu Pro Val Val Ala

115 120 125

Gly Pro Thr Gly Ser Leu Gly Ala Pro Gly Thr Pro Thr Thr Ala Val

130 135 140

Ala Val Val Leu Leu Ala Ser Gly Pro Gly Met Ala Gly Leu Ala Gly

145 150 155 160

Leu Leu Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Ala Ser Ala Gly Thr Ala Ile

165 170 175

Pro Ile Gly Leu Leu Thr Cys Ala Leu Pro Gly Pro Ala Leu Pro Leu

180 185 190

Gly Leu Ala Val Ala Ala Pro Pro Ser Gly Ser Cys Ala Pro Cys Ala

195 200 205

Ala Gly Thr Ala Pro Pro Gly Leu Cys Gly Leu Cys Pro Gly Cys Gly

210 215 220

Cys Ser Thr Leu Ala Gly Thr Pro Gly Thr Ser Gly Ala Pro Leu Cys

225 230 235 240

Leu Leu Ala Gly Ala Gly Ala Val Ala Pro Val Leu His Ser Thr Ile

245 250 255

Pro Gly Ala Leu Ala Ala Leu Ala Ala Ala Ala Gly Thr Gly Leu Leu

260 265 270

Cys Leu Ala Ala Thr Ala Leu Pro Val Ala Gly Thr Leu Ala Cys His

275 280 285

Leu Ala Gly Val Pro Ser His Thr Val Val Ala Ala Ser Met Gly Gly

290 295 300

Leu Gly Ala Leu Ile Thr Gly Leu Leu Ala Gly Ala Gly Gly His Pro

305 310 315 320

Gly Leu Ala Leu Ser Leu Gly Pro Gly Leu Pro Ser Ser Pro His Gly

325 330 335

Leu Ala Leu Leu Pro Leu Ala Ser Ala His Gly Pro Leu Leu Val Pro

340 345 350

Pro Ala Met Ala Ala Leu Met Thr Leu Gly Thr Gly Thr Val Thr Ala

355 360 365

Ile Ala Ala Leu Ala Gly Gly Thr Cys Pro Gly Ala Pro Thr Ala Gly

370 375 380

Cys Leu Pro Val Leu Thr Cys Ala Leu Ser His His Gly Ala Leu Leu

385 390 395 400

Cys Ala Gly Thr Ser Val Ala Ser Val Gly Leu Ile Gly Cys Val Ser

405 410 415

Ala Gly Thr Thr Gly Ala Cys Ile Ala Leu Ile Met Ala Gly Gly Ala

420 425 430

Ala Ala Met Ser Leu Ala Gly Gly Pro Val Thr Ile Ala Gly Leu Cys

435 440 445

Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Gly Ala Thr Ala Leu Ser Ala Ala Cys

450 455 460

Gly Ala Thr Pro Gly Ala Gly Thr Pro Ala Val Ala Val Val Leu Leu

465 470 475 480

Ser Ala Ser Ala Leu Thr Thr Ala Ala Leu Leu Gly Leu Leu Ser Cys

485 490 495

His Thr Ala Val Gly Ala Thr Ala Gly Thr Ala Ile Pro Met Gly Leu

500 505 510

Leu Thr Ala Leu Ile Ala His Cys Ala Pro Ala Gly Pro Pro Ser Gly

515 520 525

Gly Cys Ala Pro Gly Ser Leu Leu Ala Ser Ser Leu Cys Leu Leu Cys

530 535 540

Met Gly Ser Gly Leu Ala Leu Cys Gly Pro Ala Ala Leu Gly Gly Thr

545 550 555 560

Thr Gly Thr Thr Gly Ala Pro Ala Cys Leu Val Gly Leu Gly Ala Val

565 570 575

Ala Pro Val Leu His Gly Thr Val Pro Gly Ala Thr Gly Gly Leu Ala

580 585 590

Pro Ala Pro Thr Ala Leu Ala Leu Ala Gly Leu Ala Thr Gly Leu Leu

595 600 605

Cys Leu Ala Gly Thr Ala Leu Pro Val Gly Gly Thr Ala Ala Cys His

610 615 620

Leu Ala Ala Ala Pro Ala His Ala Val Val Thr Ala Leu Ala Leu Gly

625 630 635 640

Ala Cys Val His Leu Ile Leu Ala Gly Gly Gly His Leu Pro Gly Ser

645 650 655

Ala Val Thr Ala Cys Ser Gly Ala Pro Cys Leu Pro Ala Ser Gly Thr

660 665 670

Leu Ala Leu Leu Pro Ala Ala Ala Thr Val Cys Leu Ala Leu Leu His

675 680 685

Ala Ala Ala Thr Thr Gly Leu Thr Leu Gly Gly Gly Thr Val Leu Ala

690 695 700

Val Gly Ala Leu Ala Leu Cys Ser Thr Ser Ser Leu Leu Gly Ala Cys

705 710 715 720

Thr Pro Ala Ala Pro His His His His His His

725 730

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttggaggtac gaccgagatg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gaacgcgcta gctcattagt 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gagctttcgg gaccacatga 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttgttaggag cgaggtacgc 20

Claims (10)

1.如下任一所述产品：

(B1)一种融合蛋白，所述融合蛋白由人胰高血糖素样肽-1和人转铁蛋白融合组成；

(B2)编码所述融合蛋白的核酸分子；

(B3)含有(B2)所述核酸分子的表达盒；

(B4)含有(B2)所述核酸分子的重组载体、或含有(B3)所述表达盒的重组载体；

(B5)含有(B2)所述核酸分子的重组微生物、或含有(B3)所述表达盒的重组微生物、或含有B4)所述重组载体的重组微生物。

2.根据权利要求1所述的产品，其特征在于，人胰高血糖素样肽-1和人转铁蛋白通过连接肽连接。

3.根据权利要求1或2所述的产品，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列为从N末端至C末端依次由所述人胰高血糖素样肽-1氨基酸序列、连接肽氨基酸序列、人转铁蛋白氨基酸序列组成；

或，

所述融合蛋白的氨基酸序列为从N末端至C末端依次由甲硫氨酸、所述人胰高血糖素样肽-1氨基酸序列、连接肽氨基酸序列、人转铁蛋白氨基酸序列、标签蛋白的氨基酸序列组成。

4.根据权利要求1-3任一所述的产品，其特征在于，所述人胰高血糖素样肽-1氨基酸序列为SEQ ID.No.2第2-31位；其编码DNA分子的核苷酸序列为SEQ ID No.1(5’-3’)第4-93位；

人转铁蛋白氨基酸序列为SEQ ID.No.2第48-725位；其编码DNA分子的核苷酸序列为SEQ ID No.1(5’-3’)第142-2175位；

连接肽氨基酸序列为SEQ ID.No.2第32-47位；其编码DNA分子的核苷酸序列为SEQ IDNo.1(5’-3’)第94-141位；

标签蛋白的氨基酸序列为SEQ ID.No.2第726-731位；其编码DNA分子的核苷酸序列为SEQ ID No.1(5’-3’)第2176-2193位。

5.一种重组藻类制备方法，其特征在于，向藻类中导入权利要求1中所述核苷酸分子。

6.权利要求1中所述融合蛋白的制备方法，其特征在于，该方法是培养权利要求5所述重组藻类。

7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述藻类是绿藻门藻类；可选的，为团藻目藻类；可选的，为衣藻科藻类；可选的，为衣藻属藻类；可选的，为莱茵衣藻；可选的，为莱茵衣藻藻种；可选的，为细胞壁缺陷型CC-849。

8.权利要求1-4任一所述的产品或权利要求5制备得到的重组藻类在制备降血糖药物中的应用。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物为口服制剂或注射剂。

10.权利要求1-4任一所述的产品或权利要求5制备得到的重组藻类在制备刺激胰岛素分泌产品中的应用。

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