CN101525387A

CN101525387A - 重组长效胰高血糖素样肽类似物及其制备方法

Info

Publication number: CN101525387A
Application number: CN200910009642A
Authority: CN
Inventors: 朱化星; 蔡丽君; 王英明; 丁剑锋
Original assignee: SINOBIO BIOTECH CO
Current assignee: Suzhou inshore protein Technology Co.,Ltd.
Priority date: 2008-07-04
Filing date: 2009-01-20
Publication date: 2009-09-09
Anticipated expiration: 2029-01-20
Also published as: CN101372705A; CN101525387B

Abstract

本发明涉及重组融合蛋白，公开了一种重组长效胰高血糖素样肽类似物及其制备方法，本发明的长效胰高血糖素样肽类似物，是由肠促胰岛素类似物exendin－4与人血清白蛋白直接连接获得的多肽，exendin－4与人血清白蛋白(human serum albumin)之间没有连接肽。本发明的长效胰高血糖素样肽类似物极大的延长了exendin－4的半衰期。在临床使用中可减少注射给药次数，减轻患者的痛苦，提高疗效并降低医疗费用。

Description

重组长效胰高血糖素样肽类似物及其制备方法

技术领域

本发明涉及重组融合蛋白，具体涉及重组长效胰高血糖素样肽类似物及其制备方法。

背景技术

糖尿病是一种多病因的代谢性疾病，已成为现代社会严重危害人类健康与生命的主要疾病。根据世界卫生组织(WHO)提供的数据，发达国家糖尿病患病率已高达5％-10％，在我国则为3％左右；到2030年，全世界糖尿病患者人数将比2000年翻一番。其中2型糖尿病患者人数目前约占所有糖尿病患者人数的90％以上。

胰高血糖素样肽-1(glucagon.like peptide.1GLP-1)可以与GLP-1受体相结合，通过多种作用控制血糖，包括刺激胰岛素分泌、同时抑制胰高血糖素和胃排空，但是不会产生低血糖，对II型糖尿病的治疗具有较好的效果。天然胰高血糖素样肽-1在体内很快被DPP-IV降解，半衰期只有2-3分钟，在给药上具有很大的困难。

肠促胰岛素类似物(exendin-4)最初由毒蜥属动物唾液中分离，是由基因exendin-4表达产生，可激活人体内GLP-1受体，可以通过促进胰岛素分泌和细胞再生、抑制食物摄入而降低血糖。但它不是DIP-IV的底物，因而具有较长的半衰期和较强的生物活性。exendin-4注射给药后，能够模拟调控机体胰岛素的激素在体内发挥作用，从而达到控制血糖的效果。exendin-4一天注射两次，优点在于不需要根据糖化血红蛋白(HbAlc)或血糖水平来调整剂量，在早餐和晚餐前给予固定剂量即可，从而减少患者频繁监测血糖的不便。HGS公司的Albugon，它是GLP-1和人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)的融合体，它在猴子体内的半衰期为3天，目前已进入临床II期。

人血清白蛋白(HSA)是一种可溶性单体蛋白质，构成血液中的蛋白质总量的一半。白蛋白作为一种基本载体，携带传递脂肪酸、类固醇和激素分子等，其稳定的惰性性质是维持血压的一个重要因素。人血清白蛋白是一种球状非糖基化的，分子量为65Kd的蛋白质。人血清白蛋白的基因位于4号染色体上，有16961个碱基对，分为15个间隔区，经RNA加工拼接后形成的mRNA可编码一个具有585个氨基酸的蛋白质。这一蛋白在经过高尔基体的转化加工，去除分泌信号而分泌到细胞外。人血清白蛋白有35个半胱氨酸，构成17个二硫键的单体(Brown JR，The structure，functional and application of human albumin，Pergamon，NY 1977)。人血清白蛋白具有多种多态形及30种不同的遗传分子(Weikamp，CR，human genomic Annual，37：219-226，1973)。人血清白蛋白分子的三维结构已经由X光衍射法测定(Carter，Science，244，1195-1198，1989)。人血清白蛋白是血液种的主要成分，在人体内含量为每升血液含40克，半衰期寿命为14-20天。综上所述，人血清白蛋白具有极大的优势使之可抵御生物体内酶的作用，并可使治疗性蛋白质以较高的剂量使用。

目前用于临床的人血清白蛋白均是从人血浆中提取的。利用微生物重组表达白蛋白(rHSA)的生产专利已经公开，EP330451和EP361991。

发明内容

本发明的目的在于提供一种长效胰高血糖素样肽类似物及其制备方法。

本发明将exendin-4和人血清白蛋白通过基因工程的方法融合在一起，融合蛋白分子既保持exendin-4蛋白的生物学功能，又含有HSA稳定的惰性性质，极大的延长了exendin-4的半衰期。在临床使用中可减少注射给药次数，减轻患者的痛苦，提高疗效并降低医疗费用。

以往不同基因融合表达中，在考虑两个蛋白生物学活性上，两个基因之间往往需要连接肽(linker)连接，而连接肽在临床治疗中可能造成高的免疫原性。本发明在研究exendin-4蛋白和人血清白蛋白构象和活性中心后，充分利用两个不同蛋白N端和C端的序列特征，使两个基因直接相连融合表达，避免了免疫原性的担忧，同时保留了exendin-4的降糖活性。本发明在获得了表达长效胰高血糖素样肽类似物的基因工程菌的基础上，又对其发酵和纯化工艺进行了选择及优化，在保证产物活性的基础上，进一步提高了蛋白表达效率及纯化产物得率。

本发明一方面公开了一种长效胰高血糖素样肽类似物，是由肠促胰岛素类似物exendin-4与人血清白蛋白(human serum albumin)直接连接获得的多肽，exendin-4与人血清白蛋白(human serum albumin)之间没有连接肽。

较佳的，上述exendin-4具有SEQ ID NO：1的序列，人血清白蛋白具有SEQ ID NO：2的序列，exendin-4在人血清白蛋白的N端。

本发明第二方面公开了一种多核苷酸序列，该序列编码上述长效胰高血糖素样肽类似物。较佳的，该多核苷酸序列为针对酵母表达优化过的序列。最佳的，上述多核苷酸序列为SEQ ID NO：3。该序列的获得可通过全基因合成获得。

本发明第三方面，公开了一种载体，其含有前述多核苷酸序列。

本发明第四方面，公开了一种基因工程毕赤酵母菌株，它是被前述载体所转化的毕赤酵母菌株。

本发明第五方面，公开了一种长效胰高血糖素样肽类似物的制备方法，将长效胰高血糖素样肽类似物通过带有长效胰高血糖素样肽类似物基因的工程酵母发酵表达，长效胰高血糖素样肽分泌表达于培养基中。含有胰高血糖素样肽的培养上清通过蓝色染料亲和层析进行粗纯化，再经过疏水层析中纯化和离子交换层析精纯化获得纯度大于95％的胰高血糖素样肽精制品。

长效胰高血糖素样肽类似物的制备方法具体包括下列步骤：

1)在发酵罐中接种前述基因工程毕赤酵母菌种；

2)在适合表达前述长效胰高血糖素样肽类似物的条件下，发酵罐发酵培养基因工程毕赤酵母菌种；

3)发酵液离心并收集上清；

4)发酵液上清液中长效人胰高血糖素样肽类似物的分离纯化：发酵液上清经蓝色染料亲和层析进行粗纯化，再经疏水层析中纯化，再经离子交换层析精纯化后获得纯度大于95％的产物。

上述步骤2)的发酵罐发酵培养条件为：采用基础盐培养基，控制溶解氧大于30％，温度最优为30℃，pH最优为6.0，培养16-20小时后，补加甘油溶液，再培养4-6小时；甘油培养阶段结束后，以向发酵罐中补加甲醇，发酵约45-80小时后结束发酵。

上述步骤2)中，在酵母中表达融合蛋白时，通过分泌到酵母细胞外的培养液中完成。

进一步的，本发明还对发酵产物的发酵及纯化工艺条件进行了优化：

对前述步骤1，先将基因工程毕赤酵母菌种以YPD培养基摇瓶培养14小时-24小时后接种发酵罐。

对前述步骤2，包括下述几方面的工艺条件优化：

1.所述基础盐培养基中加微量元素添加剂PTM1 4-10ml/L培养基，优选的，微量元素添加剂PTMl的添加量为6ml/L培养基。

2.补加甘油溶液的浓度为45-55％(v％)，优选50％，且甘油溶液中含有8-15ml/L的PTM1，优选12ml/L。此阶段培养主要为生物量的增长阶段，使菌体的量在短时间内得到扩增。

3.补加甲醇的过程为：控制补加甲醇的速度由2-5ml/小时/升培养基逐步提高到8-12ml/小时/升培养基，其中甲醇中含有8-15ml/L甲醇的PTM1。优选的，先控制补加甲醇的速度为3.6ml/小时/升培养基，其中甲醇中含有12ml/L的PTM1，而后逐步提高甲醇补料速度到10.8ml/小时/升培养基，并以此速度补加甲醇70小时后结束发酵。

采用上述工艺条件，发酵液上清液中的长效胰高血糖素样肽类似物的含量可达到300mg-600mg/L。

对于前述步骤3，包括下述几方面的工艺条件优化：

1.发酵液上清经蓝色染料亲和层析进行粗纯化的步骤为：发酵上清液pH到7.0，上样到经20mM pH为7.0的磷酸盐、500mM NaCl缓冲液平衡的蓝色染料(Blue Sephroase)亲和层析柱，上样完毕后先用20mM pH为7.0的磷酸盐、128mM KSCN缓冲液冲洗去未结合的物质，再用20mM pH为7.0的磷酸盐、230mM KSCN缓冲液冲洗脱结合在柱上的融合蛋白，以紫外280nM吸收检测，收集蛋白峰。

2.疏水层析中纯化的步骤为：收集的蛋白溶液，调节硫酸铵的终浓度为0.46M，调节pH到7.0，此溶液上样到经20mM的磷酸盐加0.5M硫酸铵pH为7.0缓冲液平衡的Phenyl High Performance层析柱，上样完毕后先用20mM的磷酸盐加0.3M硫酸铵pH为7.0缓冲液冲洗去未结合的物质，使紫外280nm吸收的降回到基线，再用20mM磷酸盐加上0.1M硫酸铵pH7.0的溶液洗脱结合在柱上的融合蛋白。

3.离子交换层析精纯化的步骤为：收集的蛋白溶液调节pH到5.0，并用水稀释到电导率小于3ms/cm，此溶液上样到经20mM的醋酸钠pH为5.0缓冲液平衡的CM FF层析柱，上样完毕后先用80mM的醋酸钠pH为6.5缓冲液缓慢洗脱，收集pH为6.2时的目标峰。

重组长效胰高血糖素样肽类似物经亲和层析、疏水层析和离子交换层析后的纯度已大于95％，细菌内毒素、宿主DNA或蛋白残留等指标都能到达药典的一般要求，样品可用于下一步的制剂或除菌过滤后于-20℃冻存。

本发明的长效胰高血糖素样肽类似物极大的延长了exendin-4的半衰期。在临床使用中可减少注射给药次数，减轻患者的痛苦，提高疗效并降低医疗费用。此外，本发明制备方法，工艺条件容易控制，可以获得具有生物活性的长效胰高血糖素样肽类似物，且蛋白表达效率高及纯化产物得率高。

附图说明

图1：重组长效胰高血糖素样肽类似物表达电泳图

图2：蓝色染料亲和层析图谱

图3：疏水层析图谱

图4：离子交换层析图谱

图5：纯化后的重组长效胰高血糖素样肽类似物电泳图

图6：小鼠口服葡萄糖耐受实验血糖浓度随时间图

图7：半衰期测定图

具体实施方式

以下列举具体实施例进一步阐述本发明，应理解，实施例并非用于限制本发明的保护范围，实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：试验手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。

实施例1基因工程菌的构建

按SEQ ID NO：3全基因合成exendin-4-HSA基因序列，酵母密码子优化。在exendin-4序列的N端引入甲醇酵母KEX2酶切序列KR及xho1酶切位点，HAS的C端引入Not1位点。合成片段XhoI和NotI双酶切，同时用XhoI和NotI双酶切处理载体pPICZαA质粒，分别回收片段后连接转化到DH5α中，筛选pPICZα-exendin-4-HSA转化子。测序鉴定正确的pPICZα-exendin-4-HSA用sacI酶切，电转甲醇酵母X33，YPD平板上zeocin抗性筛选，得到阳性转化子。挑选一单菌落，置于装有25ml BMGY培养基的250ml摇瓶中，于30℃，300rpm培养至OD600＝6；室温下1500rpm离心5min，收集菌体，10ml BMMY重悬菌体(约10~20ml，置于100ml的摇瓶中，30℃，300rpm的摇床上继续生长；每12h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为1.0％；分离样品的上清液10％SDS-PAGE鉴定重组蛋白的表达。经测序表明蛋白序列正确。

实施例2基因工程菌的培养和表达

摇瓶菌种培养：5个容量为1L的三角瓶，装YPD培养基各200ml，培养基配方为酵母提取物(1％)10g、蛋白胨(2％)20g，葡萄糖(2％)20g，用去离子水溶解并定容到1L，115℃蒸汽灭菌20分钟。每瓶接实施例1获得的甘油菌种100ul，30℃摇床300rpm培养24小时，此时菌浓度OD600在6-20之间。

30L罐发酵培养：30L全自动发酵罐(Biostat c-dcu，Sartourius)，具体操作可参照其使用说明书。30L罐中装入基础盐培养基15L，配方为CaSO₄·2H₂O 0.93g/l，K₂SO₄ 18.2g/l，MgSO₄·7H2O，KOH 4.13g/l，H₃PO₄ 26.7ml/l，甘油40g/l用去离子水溶解并定容到15L。连接好pH电极、溶氧电极，温度电极等，开动搅拌500rpm，121℃在位灭菌30分钟。灭菌结束后，待其温度降到95℃时开始通气，继续待其冷却道30℃时，加大通气量到30L每分钟，搅拌速度调到900rpm。调整溶氧电极读数到100，接上氨水调节发酵罐中的培养基pH到6.0，加入66ml经无菌过滤的微量元素添加剂70ml(PTM1：GuSO₄·5H₂O 6g/l，NaI 0.08g/l，MnSO₄·H₂O 3g/l，CoCl₂ 0.5g/l，ZnCl 20g/l，H₃BO₃ 0.02g/l NaMoO₃·2H₂O 0.2g/l，FeSO₄·7H₂O 65g/l，Biotin 0.2g/l，6 M H₂SO₄ 30ml/l)，加入已培养好的菌种开始培养。培养条件为：温度30℃、溶氧大于30％、pH用氨水控制在6.0、搅拌速度900rpm、空气流量为30L每分钟。如此培养20小时后，培养基中的甘油逐渐被耗尽，此时溶氧开始上升。当溶氧上升后，开始以280ml/小时的速度向发酵罐中补加50％的甘油(含12ml/L的PTM1)溶液，如此再培养6小时，停止甘油补料。此时菌体浓度OD600在150左右，开始以50ml/小时向发酵罐中补加甲醇(含12ml/L PTM1)。稳定2小时后提高甲醇补料速度为100ml/小时，此流速再稳定2小时后提高甲醇补料速度到150ml/小时，以此速度补加甲醇70小时后结束发酵。取出发酵液，6000rpm离心10分钟，收集上清液。共收集上清液22L，上清液中的目标蛋白表达量在470mg/L，目标蛋白测序符合预期。重组长效胰高血糖素样肽类似物表达电泳图如图1所示。

实施例3基因工程菌表达产物的分离纯化

蓝色染料亲和层析：将实施例2获得的发酵上清液用6M NaOH调节pH到7.0，上样到经20mM pH为7.0的磷酸盐、500mMNaCl缓冲液平衡的蓝色染料亲和层析柱，柱床直径100mm，柱床高度15cm，柱床体积为1000ml。流速8L/小时，经3小时后上完样。上样完毕后先用20mM pH为7.0的磷酸盐、128mM KSCN缓冲液冲洗去未结合的物质，再用20mM pH为7.0的磷酸盐、230mM KSCN缓冲液冲洗脱结合在柱上的融合蛋白。以紫外280nM吸收检测，收集蛋白峰，共收集洗脱液3200ml。蓝色染料亲和层析图谱如图2所示

疏水层析：收集的蛋白溶液加入3M的硫酸铵溶液630ml，使溶液中的硫酸铵的终浓度到0.46M，调节pH到7.0。此溶液上样到经20mM的磷酸盐加0.5M硫酸铵pH为7.0缓冲液平衡的Phenyl High Performance层析柱，柱床直径50mm，柱床高度10cm，柱床体积为300ml。流速为1.2L/小时，经3小时上样完毕，然后先用20mM的磷酸盐加0.3M硫酸铵pH为7.0缓冲液冲洗去未结合的物质，使紫外280nm吸收的降回到基线。再用20mM磷酸盐加上0.1M硫酸铵pH7.0的溶液洗脱结合在柱上的融合蛋白。共收集蛋白峰780ml。疏水层析图谱如图3所示。

离子交换层析：收集的蛋白溶液加入1M醋酸调节pH到5.0，加入1500ml去离子水使电导率小于3ms/cm。此溶液上样到经20mM的醋酸钠pH为5.0缓冲液平衡的CM FF层析柱，柱床直径50mm，柱床高度15cm，柱床体积为300ml。流速1.2L/小时，上样完毕后先用80mM的醋酸钠pH为6.5缓冲液缓慢洗脱，收集pH为6.2时的目标峰。共收集蛋白溶液820ml。离子交换层析图谱如图4所示。纯化后的重组长效胰高血糖素样肽类似物电泳图如图5所示。

实施例4小鼠的口服葡萄糖耐受实验

采用实施例3获得的蛋白溶液，按常规配制注射液。

采用8-10周的昆明小鼠，购买后适应性饲养1周，自由采食和饮水。试验前1天禁食16-18小时，按体重静脉注射5mg/Kg人血清白蛋白或上述配置的重组胰高血糖素样肽类似物白蛋白融合蛋白注射液。给药后1小时口服灌注给予1.5mg/g体重的葡萄糖，分别在给糖前10分钟和给糖后的10、20、30、60、120分钟通过尾静脉取血并测定葡萄糖水平。

小鼠口服葡萄糖耐受实验血糖浓度随时间图如图6所示。

结果如下：

时间	HSA组(n＝6)mM/L	E4/HSA组(n＝6)mM/L
时间	HSA组(n＝6)mM/L	E4/HSA组(n＝6)mM/L	给糖前10分钟	4.2	3.0
给糖后10分钟	9.8	6.3	给糖前10分钟	4.2	3.0
给糖后10分钟	9.8	6.3	20分钟	10.2	6.5
30分钟	9.6	6.1	20分钟	10.2	6.5
30分钟	9.6	6.1	60分钟	6.2	4.3
120分钟	5.5	3.8	60分钟	6.2	4.3

结果表明：本发明获得的重组胰高血糖素样肽类似物白蛋白融合蛋白有明显的降糖活性。

实施例5小鼠体内半衰期测定实验

采用8-10周的昆明小鼠，购买后适应性饲养1周，自由采食和饮水。试验前1天禁食16-18小时，按体重静脉注射5mg/Kg上述配置的重组胰高血糖素样肽类似物白蛋白融合蛋白注射液或exendin-4溶液300ug/Kg。给药后1小时后自由采食和饮水，分别在给药前10分钟和给糖后的30、60分钟、2、4、8、16、24小时通过尾静脉取血，离心取血清于-80℃冻存。以Exendin-4 Assay Kits测定血清中的exendin-4的浓度，根据时间和浓度求出半衰期。

结果表明：本发明获得的重组胰高血糖素样肽类似物白蛋白融合蛋白在小鼠体内的半衰期约为14小时，而exendin-4的体内半衰期约为60分钟。所以本发明获得的融合蛋白能显著延长exendin-4在小时体内的作用时间(14倍)，推测在人体内在半衰期在2-4天。

序列表

<110>上海欣百诺生物科技有限公司

<120>重组长效胰高血糖素样肽类似物及其制备方法

<160>3

<210>1

<211>39

<212>PRT

<213>希拉毒蜥种(heloderma suspectum)

<220>

<400>1

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu

1 5 10 15

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

35

<210>2

<211>585

<212>PRT

<213>人种(Homo sapiens)

<220>

<400>1

Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu

1 5 10 15

Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln

20 25 30

Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Ash Glu Val Thr Glu

35 40 45

Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys

50 55 60

Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu

65 70 75 80

Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro

85 90 95

Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu

100 105 110

Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His

115 120 125

Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg

130 135 140

Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg

145 150 155 160

Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala

165 170 175

Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser

180 185 190

Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu

195 200 205

Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro

210 215 220

Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys

225 230 235 240

Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp

245 250 255

Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser

260 265 270

Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His

275 280 285

Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser

290 295 300

Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala

305 310 315 320

Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg

325 330 335

Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr

340 345 350

Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu

355 360 365

Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro

370 375 380

Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu

385 390 395 400

Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro

405 410 415

Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys

420 425 430

Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys

435 440 445

Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His

450 455 460

Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser

465 470 475 480

Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr

485 490 495

Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp

500 505 510

Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala

515 520 525

Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu

530 535 540

Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys

545 550 555 560

Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val

565 570 575

Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

580 585

<210>3

<211>1878

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>两个基因直接连接

<400>1

cacggtgaag gtactttcac ttctgacttg tctaagcaaa tggaagaaga agctgttaga 60

ttgttcatcg aatggttgaa gaacggtggt ccatcttctg gtgctccacc accatctgat 120

gcacacaaga gtgaggttgc tcatagattt aaagatttgg gagaagaaaa tttcaaagcc 180

ttggtgttga ttgcctttgc tcagtatctt cagcagtgtc catttgaaga tcatgtaaaa 240

ttagtgaatg aagtaactga atttgcaaaa acatgtgttg ctgatgagtc agctgaaaat 300

tgtgacaaat cacttcatac cctttttgga gacaaattat gcacagttgc aactcttcgt 360

gaaacctatg gtgaaatggc tgactgctgt gcaaaacaag aacctgagag aaatgaatgc 420

ttcttgcaac acaaagatga caacccaaac ttgccaagat tggtgagacc agaggttgat 480

gtgatgtgca ctgcttttca tgacaatgaa gagacatttt tgaaaaaata cttatatgaa 540

attgccagaa gacatcctta cttttatgcc ccagaattgc ttttctttgc taaaagatat 600

aaagctgctt ttacagaatg ttgccaagct gctgataaag ctgcctgcct gttgccaaag 660

cttgatgaac ttagagatga aggtaaggct tcttctgcca aacagagatt gaagtgtgcc 720

agtttgcaaa aatttggaga aagagctttc aaagcatggg cagttgctag actgtctcag 780

agatttccaa aagctgagtt tgcagaagtt tccaagttag tgacagatct taccaaagtc 840

cacactgaat gttgtcatgg agatctgctt gaatgtgctg atgacagagc tgaccttgcc 900

aagtatatct gtgaaaatca agattctatc tccagtaaac tgaaggaatg ctgtgaaaaa 960

cctctgttgg aaaaatccca ctgcattgcc gaagtggaaa atgatgagat gcctgctgac 1020

ttgccttcat tagctgctga ttttgttgaa agtaaggatg tttgcaaaaa ctatgctgag 1080

gcaaaggatg tcttcctggg tatgtttttg tatgaatatg caagaagaca tcctgattac 1140

tctgtcgtgc tgctgctgag acttgccaag acatatgaaa ccactctaga gaagtgctgt 1200

gccgctgcag atcctcatga atgctatgcc aaagtgttcg atgaatttaa acctcttgtg 1260

gaagagcctc agaatttaat caaacaaaat tgtgagcttt ttgagcagct tggagagtac 1320

aaattccaga atgctctatt agttagatac accaagaaag ttccacaagt gtcaactcca 1380

actcttgttg aggtctcaag aaacctagga aaagtgggat ccaaatgttg taaacatcct 1440

gaagcaaaaa gaatgccatg tgcagaagac tatctatccg tggtcctgaa ccagttatgt 1500

gtgttgcatg agaaaactcc agttagtgac agagtcacca aatgttgtac agaatccttg 1560

gtgaacagaa gaccatgttt ttcagctctg gaagtcgatg aaacatacgt tccaaaagag 1620

tttaatgctg aaacgttcac cttccatgca gatatatgca cactttctga gaaggagaga 1680

caaatcaaga aacaaactgc acttgttgag cttgtgaaac acaagccaaa ggcaacaaaa 1740

gagcaactga aagctgttat ggatgatttc gcagcttttg tagagaagtg ctgcaaggct 1800

gacgataagg agacctgctt tgccgaggag ggtaaaaaac ttgttgctgc aagtcaagct 1860

gccttaggtt tataatag 1878

Claims

1.一种长效胰高血糖素样肽类似物，是由肠促胰岛素类似物exendin-4与人血清白蛋白直接连接获得的多肽，exendin-4与人血清白蛋白(human serum albumin)之间没有连接肽，exendin-4在人血清白蛋白的N端。

2.如权利要求1所述长效胰高血糖素样肽类似物，其特征在于，所述exendin-4具有SEQ IDNO：1的序列，人血清白蛋白具有SEQ ID NO：2的序列。

3.一种多核苷酸序列，该序列编码权利要求1或2所述长效胰高血糖素样肽类似物。

4.如权利要求3所述多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列为针对酵母表达优化过的序列。

5.如权利要求4所述多核苷酸序列，其特征在于，所述多核苷酸序列为SEQ ID NO：3。

6.一种载体，其含有权利要求3或4或5所述多核苷酸序列。

7.一种基因工程毕赤酵母菌株，它是被权利要求6所述载体所转化。

8.如权利要求1或2所述长效胰高血糖素样肽类似物的制备方法，包括下列步骤：

a)在发酵罐中接种权利要求7所述基因工程毕赤酵母菌种；

b)在适合基因工程毕赤酵母菌种分泌表达权利要求1或2所述长效胰高血糖素样肽类似物的条件下，发酵罐发酵培养基因工程毕赤酵母菌种；

c)发酵液离心并收集上清；

d)发酵液上清液中长效人胰高血糖素样肽类似物的分离纯化：发酵液上清经蓝色染料亲和层析进行粗纯化，再经疏水层析中纯化，再经离子交换层析精纯化后获得纯度大于95％的产物。

9.如权利要求8所述长效胰高血糖素样肽类似物的制备方法，其特征在于，所述步骤a为，先将基因工程毕赤酵母菌种以YPD培养基摇瓶培养14小时-24小时后接种发酵罐。

10.如权利要求8所述长效胰高血糖素样肽类似物的制备方法，其特征在于，步骤b中，发酵罐发酵培养基因工程毕赤酵母菌种的条件为：采用基础盐培养基，控制溶解氧大于30％，培养16-20小时后，补加甘油溶液，再培养4-6小时；甘油培养阶段结束后，以向发酵罐中补加甲醇，发酵45-80小时后结束发酵。

11.如权利要求10所述长效胰高血糖素样肽类似物的制备方法，其特征在于，所述温度为30℃，pH为6.0。

12.如权利要求10所述长效胰高血糖素样肽类似物的制备方法，其特征在于，所述基础盐培养基中加有微量元素添加剂PTM14-10ml/L培养基。

13.如权利要求10所述长效胰高血糖素样肽类似物的制备方法，其特征在于，所述甘油溶液的浓度为45-55％(v％)，且甘油溶液中含有8-15ml/L的PTM1。

14.如权利要求10所述长效胰高血糖素样肽类似物的制备方法，其特征在于，所述补加甲醇的过程为：控制补加甲醇的速度由2-5ml/小时/升培养基逐步提高到8-12ml/小时/升培养基，其中甲醇中含有8-15ml/L的PTM1。

15.如权利要求13所述长效胰高血糖素样肽类似物的制备方法，其特征在于，所述补加甲醇的过程为：先控制补加甲醇的速度为3.6ml/小时/升培养基，其中甲醇中含有12ml/L的PTM1，而后逐步提高甲醇补料速度到10.8ml/小时/升培养基，并以此速度补加甲醇70小时后结束发酵。

16.如权利要求8所述长效胰高血糖素样肽类似物的制备方法，其特征在于，步骤c中，所述发酵液上清经蓝色染料亲和层析进行粗纯化的步骤为：发酵上清液pH到7.0，上样到经20mM pH为7.0的磷酸盐、500mM NaCl缓冲液平衡的蓝色染料亲和层析柱，上样完毕后先用20mM pH为7.0的磷酸盐、128mM KSCN缓冲液冲洗去未结合的物质，再用20mM pH为7.0的磷酸盐、230mM KSCN缓冲液冲洗脱结合在柱上的融合蛋白，以紫外280nM吸收检测，收集蛋白峰。

17.如权利要求8所述长效胰高血糖素样肽类似物的制备方法，其特征在于，步骤c中，所述疏水层析中纯化的步骤为：收集的蛋白溶液，调节硫酸铵的终浓度为0.46M，调节pH到7.0，此溶液上样到经20mM的磷酸盐加0.5M硫酸铵pH为7.0缓冲液平衡的PhenylHigh Performance层析柱，上样完毕后先用20mM的磷酸盐加0.3M硫酸铵pH为7.0缓冲液冲洗去未结合的物质，使紫外280nm吸收的降回到基线，再用20mM磷酸盐加上0.1M硫酸铵pH7.0的溶液洗脱结合在柱上的融合蛋白。

18.如权利要求8所述长效胰高血糖素样肽类似物的制备方法，其特征在于，步骤c中，所述离子交换层析精纯化的步骤为：收集的蛋白溶液调节pH到5.0，并用水稀释到电导率小于3ms/cm，此溶液上样到经20mM的醋酸钠pH为5.0缓冲液平衡的CM FF层析柱，上样完毕后先用80mM的醋酸钠pH为6.5缓冲液缓慢洗脱，收集pH为6.2时的目标峰。