CN105198972B - 一种高纯度重组人脑利钠肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高纯度重组人脑利钠肽(hBNP)的制备方法，该制备方法包括优化人成熟脑利钠肽的编码基因，通过接头在其编码的成熟脑利钠肽N端融合一个在大肠杆菌中易于高效表达的融合标签。本发明还提供了包含编码上述融合蛋白的核酸的表达载体、包含所述表达载体的工程菌，以及利用该工程菌制备重组人脑利钠肽的方法。本发明所述方法制备的重组人脑利钠肽具有与天然蛋白相同的生物活性，纯度高，成本低等优点。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，特别涉及一种高纯度重组人脑利钠肽的制备方法，本发明进一步涉及用于制备重组人脑利钠肽的易于高效表达的融合标签蛋白。
背景技术
脑利钠肽(brain natriuretic peptide，BNP)又称B型利钠肽(B-typenatriuretic peptide，BNP)，是继心钠肽(ANP)后利钠肽系统的又一成员，于1988年首先在猪脑中被发现，随后的研究发现脑利钠肽主要在心室心肌中合成并分泌，可以促进排钠、排尿，舒张血管，具有较强的抗血管平滑肌细胞及内皮细胞的增殖作用，并能对抗肾素一血管紧张素一醛固酮系统(RAAS)的缩血管作用，对人体水和电解质的平衡，心血管、内分泌系统的调节起着重要作用。
人脑利钠肽是由32个氨基酸组成的多肽片段，分子量约为3.4kDa，在心肌细胞内首先合成其激素原前体，经裂解去除一个26氨基酸的信号肽，以含108氨基酸的激素前体proBNP形式分泌至细胞内，并裂解成为无活性的N末端(NT-BNP)和有活性的BNP(含32个氨基酸的C端片段)。2001年8月美国SCIOS公司生产的基因重组人脑利钠肽(recombinanthuman BNP，rhBNP)-Nesiritide上市，成为新一代静脉注射用治疗失代偿性心力衰竭的药物。2005年，中国成都诺迪康生物制药有限公司研制的治疗用生物制品1类新药，重组人脑利钠肽上市，商品名：新活素。用于患有休息或者轻微活动时呼吸困难的急性失代偿性心力衰竭患者静脉治疗，按纽约核心协会(NYHA)分级大于II级。
脑利钠肽的制备主要有化学合成法和基因工程法，其中化学合成脑利钠肽成本高、价格昂贵，产业化困难。用基因重组技术生产的人脑利钠肽是解决这个问题的有效途径。常规大肠杆菌表达外源蛋白常会导致目标蛋白在胞内积累而限制其表达量。大都在胞内积累，易形成包涵体。包涵体复性过程复杂，技术难度大，得率低，生产成本高，往往不能应用于工业化生产。另外，多肽因其分子小，直接表达存在困难，一般需要采用融合表达技术。目前研究采用的融合表达分为自身串联融合表达和与其它载体蛋白融合表达两种。如果融合标签选择不当，仍不能实现可溶表达，且表达量不高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于制备重组人脑利钠肽的易于高效表达的融合标签蛋白，该融合标签蛋白包括来源于大肠杆菌MrsB或其片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。该融合标签蛋白还包括：转录终止抗终止因子(NusA)，或者大肠杆菌硫氧还蛋白A(TrxA)，或者二硫键氧化还原酶(DsbA、DsbC)，或者谷胱甘肽S-转移酶(GST)。所述融合标签蛋白能促进重组人脑利钠肽的可溶高效表达，且不影响重组人脑利钠肽的生物活性。
包含重组人脑利钠肽的融合蛋白，上述融合标签蛋白通过包含酶切位点的接头融合至所述人脑利钠肽的N端，重组人脑利钠肽的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
所述接头还包含柔性连接肽-(GGS)n-、组氨酸标签或其组合，所述柔性连接肽的氨基酸序列为-HHHHHHGGSDDDDK-。
本发明还提供一种优化重组人脑利钠肽的核酸分子，该核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供一种用于表达重组人脑利钠肽的融合蛋白的载体，所述表达载体为pET系列载体，优选pET-28a-c(+)，或者pET29a，或者pET-30a-c(+)，或者pET39b(+)，或者pET-40b(+)，或者pET-41a(+)，或者pET-43.1a(+)。
本发明还提供一种宿主菌，该宿主菌其能够表达包含上述融合标签和重组人脑利钠肽的融合蛋白。该宿主菌为细菌或真菌，优选地为大肠杆菌，该大肠杆菌为BL21(DE3)，或者BL21(DE3)PlysS，或者TB1，较好的是大肠杆菌为BL21(DE3)。
重组人脑利钠肽的制备方法，包括如下步骤：
1)上述的融合标签蛋白通过包含酶切位点的接头融合至核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示的人脑利钠肽的N端，得到融合蛋白核酸序列；
2)将步骤1)所获得的核酸序列克隆至表达载体构建重组载体；
3)培养能够表达权利要求3所述的融合蛋白的宿主菌，将步骤2)所述的重组载体用化学转染法转化至宿主菌；
4)诱导转化后的宿主菌表达重组人脑利钠肽；
5)纯化重组人脑利钠肽。
步骤3)所述的表达是将步骤3)所述的融合蛋白被分泌到宿主菌的周质空间或者在宿主细胞的胞内表达。
步骤5)所述的纯化是从所述宿主菌的培养物中回收权利要求3所述的融合蛋白，对回收的融合蛋白进行酶切，并从酶切产物中回收重组人脑利钠肽。
本发明的有益效果是：
通过接头将融合标签融合至人脑利钠肽N端形成融合蛋白，进行融合表达，利用纯化手段将产物完全分离，实现了脑利钠肽的可溶、高效表达。
通过接头序列-HHHHHHGGSDDDDK-实现融合表达，其包含柔性连接肽-(GGS)n-，使得融合标签未对目的蛋白结构发生影响，产物具有生物活性；包含组氨酸标签，利于纯化，提高收率；包含肠激酶位点-DDDDK-，使得融合标签被有效去除，最终获得的重组人脑利钠肽的N端序列与天然序列完全一致。
对编码人脑利钠肽的核苷酸序列进行优化，同时选择的融合标签为可以在宿主细胞，尤其是大肠杆菌中实现高效表达的MrsB或其片段，使得重组人脑利钠肽高效、可溶表达。
利用本发明的方法制备重组人脑利钠肽融合蛋白为可溶表达，表达量大于菌体总蛋白的20％。最终重组人脑利钠肽得率为100mg纯品/L发酵液，纯度大于96％，生物活性与阳性对照药物一致，内毒素小于5EU/mg。制备的重组人脑利钠肽，用于治疗急性失代偿心力衰竭。
本发明利用大肠杆菌MrsB作为融合标签，可高效促进hBNP可溶表达，避免了包涵体复性，降低生产成本，能够满足工业化生产的需求。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进一步详细说明。应当理解，此处说描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
附图说明
图1为本发明构建的表达质粒pET30-a(+)-hBNP的结构图；
图2为本发明构建的pET30-a(+)-hBNP/BL21(DE3)工程菌摇瓶诱导筛选结果；
图3为RP-HPLC检测结果，纯度大于98％；
图4为rhBNP N端氨基酸序列检测结果；
图5-1、5-2为rhBNP高分辨率质谱分子量检测结果；
图6-1、6-2、6-3为rhBNP二硫键鉴定结果；
图7为rhBNP生物活性测定结果。
具体实施方式
实施例1重组人脑利钠肽融合蛋白工程菌构建
1、pET30-a(+)-hBNP/BL21(DE3)工程菌构建
人脑利钠肽成熟蛋白序列(GenBank登录号：NP_002512.1)为32个氨基酸，人脑利钠肽基因序列如SEQ ID NO.1所示。
标签蛋白选取来源于大肠杆菌MrsB全序列(GenBank登录号：BAA15575.2)；所述融合标签蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
设计街头序列为-HHHHHHGGSDDDDK-、对应的核酸序列为CACCATCATCATCATCATGGTGGTTCTGACGACGACGACAAG作为接头，通过接头将上述MrsB标签蛋白C端与人脑利钠肽成熟蛋白序列N端连接，所获融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，该融合蛋白的核酸序列如SEQ ID NO.5所示。
将设计的融合蛋白核酸序列(SEQ ID NO.5)委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行全基因合成，并通过NdeI/NotI位点亚克隆至表达载体，其载体选自商业化(即市售，下同)载体pET-28a-c(+)，或者pET29a，或者pET-30a-c(+)，或者pET39b(+)，或者pET-40b(+)，或者pET-41a(+)，或者pET-43.1a(+)，载体的宿主细胞为细菌或真菌，所述宿主细胞为大肠杆菌，选自商业化菌株BL21(DE3)，或者BL21(DE3)PlysS，或者TB1。本实施例采用大肠杆菌表达载体pET30-a(+)，构建获得表达载体pET30-a(+)-hBNP，构建示意图如图1所示。
将构建的表达载体用化学转染法，转入大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)，利用LB+kan固体平板筛选，获得重组表达工程菌pET30-a(+)-hBNP/BL21(DE3)。
2、工程菌诱导筛选
随机挑取上述pET30-a(+)-hBNP/BL21(DE3)工程菌接种至10ml LB培养基(100ug/ml kan)，100ml锥形瓶培养，37℃220rpm摇床培养过夜。第二天取过夜培养的母液按1％比例转接于40ml LB液体培养基(100ug/ml kan)，在250ml锥形瓶中，37℃，220rpm培养2.5h，至OD600值约0.6-1.0。加入终浓度1mM IPTG，30℃诱导4h。
SDS-PAGE电泳检测，结果如图2所示，泳道1-6：pET30-a(+)-hBNP/BL21(DE3)1-6号诱导4h总蛋白；对照：未诱导总蛋白；泳道M：蛋白质分子量Marker。与对照比较，在理论分子量20kD处6株工程菌实现特异表达，表达量占菌体总蛋白20％以上。对诱导表达菌体进行破菌分析，表明全部实现可溶表达。
实施例2重组人脑利钠肽工程菌发酵
将pET30-a(+)-hBNP/BL21(DE3)工程菌划线LB平板(kan 100mg/L)，37℃恒温培养箱培养约16-18h，至单菌落长出。挑工程菌单菌落接种20ml LB培养基中(kan 100mg/L)，37℃，230rpm培养8h。0.1％转接至250mlLB(kan 100mg/L)，lL锥形瓶，37℃，230rpm培养13h。平行培养4瓶，制备菌液1000ml，5％接种至发酵罐NLF-2220L发酵培养基中(TB培养基)，接种前用氨水将pH调至7.0，发酵过程控制温度为36℃。发酵培养基的pH值和溶氧通过流加氨水和增加搅拌速度和通气量来控制，溶氧大余30％。约5h后培养基中的碳源耗尽，OD600达到20，之后以240mL/h/20L培养基的速度开始流加补料培养基(40％甘油+20％酵母粉)继续培养，OD600达到35，以60mL/h/20L培养基的速度流加补料培养基开始诱导，诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，鼎国生物)，终浓度1mM。并保持此流加速度，维持DO在30％以上。诱导4h，下罐。
离心收集菌体，将菌体悬浮在破菌缓冲液中(25mm Tris-HCl，150mmNaCl，PH8.0)，高压匀浆破菌，将破碎液离心，收集上清液，弃沉淀。
实施例3重组人脑利钠肽分离纯化
将破菌液上清上样于经0.2M NiSO4处理并以20mM Tris-HCl(pH8.0)平衡的Ni2+-Chelating Sepharose Fast Flow(GE Healthcare)螯合层析介质，以200mM咪唑(含20mMTris-HCl，pH8.0)洗脱；收集的目的融合蛋白经脱盐处理，按每1mg融合蛋白加入0.5U肠激酶(50mM Tris-HCl，2mM CaCl2，0.1％Tween-20，pH8.0)在6-8℃条件下酶切融合蛋白约17h。
酶切目的蛋白上样于Ni2+-Chelating Sepharose Fast Flow，目的蛋白和融合标签同时挂柱。但目的蛋白挂柱结合力低，用50mM浓度咪唑(上海生工，批号：B421BA0025)洗脱目的蛋白，收集洗脱蛋白峰。再经过CMFF精纯化获得高纯度目的蛋白。SDS-PAGE检测分子量约20kD，纯度大于95％，HPLC分析纯度大于98％，见图3。
实施例4重组人脑利钠理化性质测定
1、N末端氨基酸序列测定
将上述方法制备得到的rhBNP，进行N末端氨基酸序列测定，测定结果经中国科学院上海生命科学研究院检测与天然BNP成熟蛋白N端序列一致，见图4。
2、质谱分子量
将上述方法制备得到的rhBNP，进行高分辨质谱分析，委托中国科学院上海生命科学研究院测定分子量为3461.7，与理论分子量一致，见图5-1、5-2。
3、二硫键鉴定
上述方法制备得到的rhBNP，进行二硫键鉴定，委托中国科学院上海生命科学研究院完成。检测结果表明分子内有一对二硫键，与理论配对位置一致，见图6-1、6-2、6-3。
实施例5重组人脑利钠肽生物活性测定
1、离体动脉条法
该方法使用离体主动脉条直接观察重组人脑利钠肽(rhBNP)的舒张血管效应，最能够真实有效地反映药物临床药理效用。
2、实验方法
用去氧肾上腺素(国家标准物质ID：V5LW-03RV)使离体兔动脉条收缩，然后使用由低到高的系列rhBNP浓度的溶液松弛动脉条，用张力感应器记录张力变化。
2.1兔离体动脉条制备与平衡
取1.5～2.5kg新西兰大白兔，麻醉状态下取胸主动脉降支，剪成长约1.5cm，宽约2～3mm的动脉条，悬挂于含通氧的37℃台氏液的麦氏浴槽中，加1g前负荷平衡1-2h，期间每20min换1次台氏液，连接多导联生理记录仪，监测离体动脉条的张力变化，待张力稳定。
2.2兔离体动脉条测定
2.2.1在台氏液中加入去氧肾上腺素溶液使张力上升，待保持稳定后，加入阳性对照药物“新活素”。“新活素”由成都诺迪康生物制药有限公司生产，批号：20131201。加入“新活素”使其终浓度依次为：0.3125，0.625，1.25，2.5，5，10，20，40，80，160，320，640，1280，2560ng/mL。按照以上浓度从低到高依次加入阳性对照药，每一浓度张力稳定后再加入下一浓度药物，以此类推记录离体动脉条的张力变化，计算“新活素”半效浓度。
2.2.2继续每20min换1次台氏液，平衡2h，其间监测离体动脉条的张力变化，待张力稳定后，用2.2.1同法检测供试品rhBNP溶液。
2.2.3数据处理
用Graph Prism5.0软件计算舒张度EC50和半效稀释倍数，以下式计算：
式中Pr为标准品生物学活性，U/ml；
Ds为供试品预稀释倍数；
Dr为标准品预稀释倍数；
Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；
Er为标准品半效量的稀释倍数。
3、实验结果
以已上市药物“新活素”作为阳性对照，本发明制备的rhBNP生物活性与已上市药物相当，见图7。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
Claims (11)
1.包含重组人脑利钠肽的融合蛋白，其特征在于，融合标签蛋白包括来源于大肠杆菌MrsB，该融合标签蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；融合标签蛋白通过包含酶切位点的接头融合至所述人脑利钠肽的N端，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示，其核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于：所述接头还包含柔性连接肽-(GGS)n-、组氨酸标签或其组合。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于：所述柔性连接肽的氨基酸序列为-HHHHHHGGSDDDDK-。
4.一种表达载体，其特征在于：包含编码权利要求1中所述核酸序列。
5.根据权利要求4表达载体，其特征在于：所述表达载体为pET系列载体。
6.根据权利要求5表达载体，其特征在于：所述表达载体为pET-28a-c(+)，或者pET29a，或者pET-30a-c(+)，或者pET39b(+)，或者pET-40b(+)，或者pET-41a(+)，或者pET-43.1a(+)。
7.一种表达如权利要求4或5所述表达载体的宿主菌。
8.根据权利要求7所述的宿主菌，其特征在于：该宿主菌为细菌或真菌。
9.根据权利要求8所述的宿主菌，其特征在于：所述宿主菌为大肠杆菌，该大肠杆菌为BL21(DE3)，或者BL21(DE3)P1ysS，或者TB1。
10.重组人脑利钠肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)权利要求1中所述的融合标签蛋白通过包含酶切位点的接头融合至核苷酸序列如SEQIDNO：1所示的人脑利钠肽的N端，得到融合蛋白核酸序列；
2)将步骤1)所获得的核酸序列克隆至表达载体构建重组载体；
3)培养能够表达权利要求1所述的融合蛋白的宿主菌，将步骤2)所述的重组载体用化学转染法转化至宿主菌；
4)诱导转化后的宿主菌表达重组人脑利钠肽；
5)纯化重组人脑利钠肽。
11.权利要求1中所述大肠杆菌MrsB的氨基酸序列作为融合标签蛋白在制备重组人脑利钠肽中的应用。
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