CN109535244B - 一种重组人脑利钠肽的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种重组人脑利钠肽的纯化方法，将发酵后的菌体药液依次进行Ni亲和层析捕获目的融合蛋白、酶切切除添加的标签和阳离子层析除杂及捕获目的蛋白。Ni亲和层析捕获目的融合蛋白；酶切切除添加的标签；阳离子层析除杂及捕获目的蛋白，该方法能够有效去除发酵后菌体中的绝大部分杂质，使目的产物的纯度达到90％以上。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及一种重组人脑利钠肽的纯化方法。
背景技术
脑利钠肽(brainnatriureticpeptide，BNP)又称B型利钠肽(B-typenatriureticpeptide，BNP)，是继心钠肽(ANP)后利钠肽系统的又一成员，于1988年首先在猪脑中被发现，随后的研究发现脑利钠肽主要在心室心肌中合成并分泌，可以促进排钠、排尿，舒张血管，具有较强的抗血管平滑肌细胞及内皮细胞的增殖作用，并能对抗肾素一血管紧张素一醛固酮系统(RAAS)的缩血管作用，对人体水和电解质的平衡，心血管、内分泌系统的调节起着重要作用。
人脑利钠肽是由32个氨基酸组成的多肽片段，分子量约为3.4kDa，在心肌细胞内首先合成其激素原前体，经裂解去除一个26氨基酸的信号肽，以含108氨基酸的激素前体proBNP形式分泌至细胞内，并裂解成为无活性的N末端(NT-BNP)和有活性的BNP(含32个氨基酸的C端片段)。2001年8月美国SCIOS公司生产的基因重组人脑利钠肽(recombinanthumanBNP，rhBNP)-Nesiritide上市，成为新一代静脉注射用治疗失代偿性心力衰竭的药物。2005年，中国成都诺迪康生物制药有限公司研制的治疗用生物制品1类新药，重组人脑利钠肽上市，商品名：新活素。用于患有休息或者轻微活动时呼吸困难的急性失代偿性心力衰竭患者静脉治疗，按纽约核心协会(NYHA)分级大于II级。
现有技术中，对重组人脑利钠肽制备方法有很多研究，但是对其制备后分离纯化的方法却很少。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种重组人脑利钠肽的纯化方法，所述的方法，由以下几个工艺步骤组成：Ni亲和层析捕获目的融合蛋白；酶切切除添加的标签；阳离子层析除杂及捕获目的蛋白，该方法能够有效去除发酵后菌体中的绝大部分杂质，使目的产物的纯度达到90％以上。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种重组人脑利钠肽的纯化方法，包括以下步骤：
将发酵后的菌体药液依次进行Ni亲和层析捕获目的融合蛋白、酶切切除添加的标签和阳离子层析除杂及捕获目的蛋白。
优选的，所述发酵后的菌体药液，由大肠杆菌发酵经过均质处理和中空纤维过滤得到。
优选的，所述Ni亲和层析，具体包括以下步骤：将亲和填料装入层析柱中，先对亲和的填料进行再生，使用合适的线流速和平衡液对填料进行平衡后上样，上样结束后，使用淋洗液进行淋洗，去除与填料结合不紧密的杂质，再用洗脱液洗脱，在特定波长的紫外吸收下收集药液，得到所需的融合蛋白。
更优选的，所述线流速为100-200cm/h。
更优选的，所述特定的波长210-220nm。
优选的，所述平衡液，包括按照摩尔浓度计的以下组份：
50-150mM的Tris-HCl、100-500mM的NaCl和10-50mM的咪唑溶液。
优选的，所述淋洗液，包括按照摩尔浓度计的以下组份：
50-150mM的Tris-HCl、10-100mM的NaCl和20-100mM的咪唑溶液。
优选的，所述洗脱液，包括按照摩尔浓度计的以下组份：
50-150mM的Tris-HCl、10-100mM的NaCl和100-500mM的咪唑溶液。
优选的，具体包括以下步骤：使用酶切缓冲液稀释Ni亲和的收集液，在稀释后的收集液中加入可识别上游构建时添加的标签的酶溶液，将最终的目标物从融合蛋白中酶切下来。
更优选的，所述酶切的酶切缓冲液，包括按照摩尔浓度计的以下组份：
50-150mM的Tris-HCl和10-100mM的NaCl溶液。
更优选的，所述酶切的温度为20-40℃，酶切的时间1-10小时。
更优选的，每mg融合蛋白中加入1-2IU酶。
优选的，所述阳离子层析，具体包括以下步骤：
将阳离子填料装入层析柱中，使用合适的线流速和平衡液对填料进行平衡后上样酶切后经过滤药液，上样结束后，使用淋洗液进行淋洗，去除与其他填料结合不紧密的杂质，再用洗脱液洗脱，在特定波长的紫外吸收下收集药液，得到所需的目的产物。
更优选的，所述合适的线流速为300-500cm/h。
更优选的，所述平衡液为50-150mM的Tris-HCl溶液。
更优选的，所述特定波长的紫外吸收的波长为280nm。
优选的，所述淋洗液，包括按照摩尔浓度计的以下组份：
50-150mM的Tris-HCl溶液和100-200mM的NaCl溶液。
优选的，所述洗脱液，包括按照摩尔浓度计的以下组份：
50-150mM的Tris-HCl溶液和200-400mM的NaCl溶液。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明所提供的重组人脑利钠肽的纯化方法，由以下几个工艺步骤组成：Ni亲和层析捕获目的融合蛋白；酶切切除添加的标签；阳离子层析除杂及捕获目的蛋白，该方法能够有效去除发酵后菌体中的绝大部分杂质，使目的产物的纯度达到90％以上。
(2)本发明所提供的重组人脑利钠肽的纯化方法，方便、简单，易于实现工业化生产。
具体实施方式
下面将结合具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
一种重组人脑利钠肽的纯化方法，包括以下步骤：
将发酵后的菌体药液依次进行Ni亲和层析捕获目的融合蛋白、酶切切除添加的标签和阳离子层析除杂及捕获目的蛋白。
本发明所提供的重组人脑利钠肽的纯化方法，Ni亲和层析捕获目的融合蛋白；酶切切除添加的标签；阳离子层析除杂及捕获目的蛋白，该方法能够有效去除发酵后菌体中的绝大部分杂质，使目的产物的纯度达到90％以上。
优选的，所述发酵后的菌体药液，由大肠杆菌发酵经过均质处理和中空纤维过滤得到。
优选的，所述Ni亲和层析，具体包括以下步骤：将亲和填料装入层析柱中，先对亲和的填料进行再生，使用合适的线流速和平衡液对填料进行平衡后上样，上样结束后，使用淋洗液进行淋洗，去除与填料结合不紧密的杂质，再用洗脱液洗脱，在特定波长的紫外吸收下收集药液，得到所需的融合蛋白。
更优选的，所述线流速为100-200cm/h。
更优选的，所述特定的波长210-220nm。
优选的，所述平衡液，包括按照摩尔浓度计的以下组份：
50-150mM的Tris-HCl、100-500mM的NaCl和10-50mM的咪唑溶液。
优选的，所述淋洗液，包括按照摩尔浓度计的以下组份：
50-150mM的Tris-HCl、10-100mM的NaCl和20-100mM的咪唑溶液。
优选的，所述洗脱液，包括按照摩尔浓度计的以下组份：
50-150mM的Tris-HCl、10-100mM的NaCl和100-500mM的咪唑溶液。
优选的，具体包括以下步骤：使用酶切缓冲液稀释Ni亲和的收集液，在稀释后的收集液中加入可识别上游构建时添加的标签的酶溶液，将最终的目标物从融合蛋白中酶切下来。
更优选的，所述酶切的酶切缓冲液，包括按照摩尔浓度计的以下组份：
50-150mM的Tris-HCl和10-100mM的NaCl溶液。
更优选的，所述酶切的温度为20-40℃，酶切的时间1-10小时。
更优选的，每mg融合蛋白中加入1-2IU酶。
优选的，所述阳离子层析，具体包括以下步骤：
将阳离子填料装入层析柱中，使用合适的线流速和平衡液对填料进行平衡后上样酶切后经过滤药液，上样结束后，使用淋洗液进行淋洗，去除与其他填料结合不紧密的杂质，再用洗脱液洗脱，在特定波长的紫外吸收下收集药液，得到所需的目的产物。
更优选的，所述合适的线流速为300-500cm/h。
更优选的，所述平衡液为50-150mM的Tris-HCl溶液。
更优选的，所述特定波长的紫外吸收的波长为280nm。
优选的，所述淋洗液，包括按照摩尔浓度计的以下组份：
50-150mM的Tris-HCl溶液和100-200mM的NaCl溶液。
优选的，所述洗脱液，包括按照摩尔浓度计的以下组份：
50-150mM的Tris-HCl溶液和200-400mM的NaCl溶液。
实施例1
试验时间：2018.09.06-2018.09.11；
试验药液：经大肠杆菌发酵所得的菌体，经均质及中空纤维过滤所得的药液约360L。
(1)将约9.5L的亲和填料装入直径300mm的层析柱中，装柱高度约为135mm，装柱后检测柱效。
(2)将层析系统经碱液灭菌处理后，用注射用水冲洗至中性，使用NiSO4对亲和填料进行再生，再生后使用注射用水进行冲洗(注意废液的收集处理)。
(3)使用50-150mM的Tris-HCl、100-500mM的NaCl和10-50mM的咪唑溶液平衡层析柱，平衡后使用100-200cm/h的线流速上样，上样结束后，使用50-150mM的Tris-HCl、10-100mM的NaCl和20-100mM的咪唑溶液淋洗，再使用50-150mM的Tris-HCl、10-100mM的NaCl和100-500mM的咪唑溶液进行洗脱，在波长210-220nm处观察吸收峰，收集峰范围：500mAU-最大-500mAU。得到亲和后药液，检测蛋白总量。
(4)使用酶切稀释液：50-150mM的Tris-HCl和10-100mM的NaCl溶液将亲和后的药液稀释5-10倍，根据检测的蛋白总量加入酶1-2IU/mg，在20-40℃的温度下酶切1-10小时。
(5)将约5.4L的阳离子填料装入直径200mm的层析柱中，装柱高度约为170mm，装柱后检测柱效。
(5)将层析系统经碱液灭菌处理后，用注射用水冲洗至中性，使用50-150mM的Tris-HCl溶液平衡层析柱，平衡后，将经过滤后的酶切液进行上样，上样速度为300-500cm/h；上样结束后，使用50-150mM的Tris-HCl溶液和100-200mM的NaCl溶液进行淋洗；再用50-150mM的Tris-HCl溶液和200-400mM的NaCl溶液进行洗脱，在280nm的吸收处检测吸收峰，，收集峰范围：1000mAU-最大-500mAU。得到阳离子后药液，检测蛋白纯度。
检测结果：
2018.09.19检测，检测结果为：纯度：90.7493％
实施例2
试验时间：2018.11.15-2018.11.17；
试验药液：经大肠杆菌发酵所得的菌体，经均质及中空纤维过滤所得的药液约160L。
(1)将约9.5L的亲和填料装入直径300mm的层析柱中，装柱高度约为135mm，装柱后检测柱效。
(2)将层析系统经碱液灭菌处理后，用注射用水冲洗至中性，使用NiSO4对亲和填料进行再生，再生后使用注射用水进行冲洗(注意废液的收集处理)。
(3)使用50-150mM的Tris-HCl、100-500mM的NaCl和10-50mM的咪唑溶液平衡层析柱，平衡后使用100-200cm/h的线流速上样，上样结束后，使用50-150mM的Tris-HCl、10-100mM的NaCl和20-100mM的咪唑溶液淋洗，再使用50-150mM的Tris-HCl、10-100mM的NaCl和100-500mM的咪唑溶液进行洗脱，在波长210-220nm处观察吸收峰，收集峰范围：500mAU-最大-500mAU。得到亲和后药液，检测蛋白总量。
(4)使用酶切稀释液：50-150mM的Tris-HCl和10-100mM的NaCl溶液将亲和后的药液稀释5-10倍，根据检测的蛋白总量加入酶1-2IU/mg，在20-40℃的温度下酶切1-10小时。
(5)将约5.4L的阳离子填料装入直径200mm的层析柱中，装柱高度约为170mm，装柱后检测柱效。
(6)将层析系统经碱液灭菌处理后，用注射用水冲洗至中性，使用50-150mM的Tris-HCl溶液平衡层析柱，平衡后，将经过滤后的酶切液进行上样，上样速度为300-500cm/h；上样结束后，使用50-150mM的Tris-HCl溶液和100-200mM的NaCl溶液进行淋洗；再用50-150mM的Tris-HCl溶液和200-400mM的NaCl溶液进行洗脱，在280nm的吸收处检测吸收峰，，收集峰范围：1000mAU-最大-500mAU。得到阳离子后药液，检测蛋白纯度。
检测结果：
2018.11.26检测，检测结果为：纯度：93.91％
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；本领域的普通技术人员应当理解：在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围；因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些替换和修改。
Claims (1)
1.一种重组人脑利钠肽的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
将发酵后的菌体药液依次进行Ni亲和层析捕获目的融合蛋白、酶切切除添加的标签和阳离子层析除杂及捕获目的蛋白；
所述发酵后的菌体药液，由大肠杆菌发酵经过均质处理和中空纤维过滤得到；
所述Ni亲和层析，具体包括以下步骤：将亲和填料装入层析柱中，先对亲和的填料进行再生，使用50-150mM的Tris-HCl、100-500mM的NaCl和10-50mM的咪唑平衡液对填料进行平衡，平衡后使用100-200cm/h的线流速上样，上样结束后，使用50-150mM的Tris-HCl、10-100mM的NaCl和20-100mM的咪唑淋洗液进行淋洗，去除与填料结合不紧密的杂质，再用50-150mM的Tris-HCl、10-100mM的NaCl和100-500mM的咪唑洗脱液洗脱，在波长210-220nm的紫外吸收下收集药液，得到所需的融合蛋白；
所述酶切，具体包括以下步骤：使用50-150mM的Tris-HCl和10-100mM的NaCl酶切缓冲液稀释Ni亲和的收集液，在稀释后的收集液中加入可识别上游构建时添加的标签的酶溶液，每mg融合蛋白中加入1-2IU酶，在20-40℃的温度下酶切1-10小时，将最终的目标物从融合蛋白中酶切下来；
所述阳离子层析，具体包括以下步骤：将阳离子填料装入层析柱中，使用50-150mM的Tris-HCl平衡液对填料进行平衡，平衡后，上样经过滤的酶切后药液，使用300-500cm/h的线流速上样，上样结束后，使用50-150mM的Tris-HCl和100-200mM的NaCl淋洗液进行淋洗，去除与其他填料结合不紧密的杂质，再用50-150mM的Tris-HCl和200-400mM的NaCl洗脱液洗脱，在波长为280nm的紫外吸收下收集药液，得到所需的目的产物。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010107256A3 (en) * | 2009-03-20 | 2011-03-17 | Hanmi Holdings Co., Ltd. | Method for preparing a site-specific physiologically active polypeptide conjugate |
| CN105198972A (zh) * | 2015-09-28 | 2015-12-30 | 重庆科润生物医药研发有限公司 | 一种高纯度重组人脑利钠肽的制备方法 |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| "重组人脑利钠肽表达及生物学活性测定";李海潮;《中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）医药卫生科技辑》;20170415(第4期);正文第15、25-30页 * |
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