CN115947829A

CN115947829A - 基于凝血酶亲和磁性微球的水蛭素分离纯化方法及其应用

Info

Publication number: CN115947829A
Application number: CN202310130339.2A
Authority: CN
Inventors: 李璐璐; 黄明贤; 屈琴; 周维海
Original assignee: Zhengzhou Innosep Biosciences Co ltd
Current assignee: Zhengzhou Innosep Biosciences Co ltd
Priority date: 2023-02-17
Filing date: 2023-02-17
Publication date: 2023-04-11

Abstract

本发明属于生物医药分离纯化的技术领域，尤其涉及基于凝血酶亲和磁性微球的水蛭素分离纯化方法及其应用。本发明用自制浸提液从蚂蟥粉中粗提水蛭素，然后选用羧基磁性微球制备凝血酶亲和磁性微球，利用凝血酶亲和磁性微球进一步分离纯化，最终得到活性为17000ATU/g以上的天然水蛭素。本发明自制的浸提液能将蚂蟥的细胞壁破坏，使其中的水蛭素充分溶出，为蚂蟥粉中水蛭素的粗提提供更高的效率；制备的凝血酶亲和磁性微球可充分利用其样品富集作用，与琼脂糖微球和聚合物微球相比可分离纯化得到活性及纯度更高的水蛭素，保存期长、质量稳定，可为保健食品、药品或化妆品提供安全、优质的原料，有利于工业化生产及应用。

Description

基于凝血酶亲和磁性微球的水蛭素分离纯化方法及其应用

技术领域

本发明属于生物医药分离纯化的技术领域，涉及动物有效成分的提取，尤其涉及基于凝血酶亲和磁性微球的水蛭素分离纯化方法及其应用。

背景技术

水蛭素是从水蛭（Leech）唾液腺中分离纯化制得的一种由65-66个氨基酸残基组成的、无糖基化的小分子酸性单链多肽。水蛭素具有高度特异的抗凝血酶活性，可抑制凝血酶结合底物，是迄今为止发现的作用最强的凝血酶特异性抑制剂，可改善血液微循环，发挥良好的抗凝化瘀效果，对人类心脑血管疾病，尤其是脑血栓等血栓性疾病具有显著的功效；此外，水蛭素还具有较强的抗氧化性，可协助机体免疫细胞识别、吞噬、包裹、清除自由基等，防止皮肤因被氧化而产生细纹、色斑、干燥等衰老现象。而与天然水蛭素相比，重组水蛭素在第63位氨基酸(酪氨酸)上未硫酸酪化，活性略低，对凝血酶的抑制作用仅为天然水蛭素的1/10。因此，天然水蛭素在医药、保健品及化妆品研究领域均具有巨大的应用前景。

目前天然水蛭素多是以活体水蛭为原料提取得到，如公开号为CN 102286108 A的专利提供一种天然水蛭素的生产方法先从吸血水蛭活体中提取天然水蛭素粗品，然后经过分离纯化得到天然水蛭素粉；公开号为CN 108727487 A的专利提供一种水蛭素的液膜萃取方法，将冷冻水蛭捣碎制得水蛭素粗提液；公开号为CN 102964446 A的专利提供一种吸血水蛭活体多次提取天然水蛭素方法。但是，以活体水蛭为原料提取时方法大多繁杂，耗时久，不利于工业化生产；同时提取得到的水蛭素有效成分活性不高，多在150-6000ATU/g左右，杂质含量也较高，不适合注射用药。而公开号为CN 107936115 A的专利提供的水蛭素提取方法，虽然从水蛭粉末中提取水蛭素，操作简单，但所得水蛭素的活性依然较低。因此，开发一种步骤简单且水蛭素产品活性更高的水蛭素提取方法，对水蛭素的进一步研究和应用推广具有十分重要的意义。

发明内容

针对背景技术中存在的技术问题，本发明提出基于凝血酶亲和磁性微球的水蛭素分离纯化方法及其应用，该方法提取得到活性较高的高质量天然水蛭素，且操作简单、成本低，可实现快速工业化生产。

为了达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

基于凝血酶亲和磁性微球的水蛭素分离纯化方法，包括以下步骤：

（1）从蚂蟥粉中粗提水蛭素：按照蚂蟥粉重量的2-6倍加入浸提液，浸泡，超声，离心取上清，将沉淀继续重复提取两次，收集所有上清液并调节pH至4.5，利用不同蛋白在不同pH下溶解度的差异将一部分杂蛋白沉淀去除，再次离心取上清液，调节pH至7.0，为下一步中性条件下水蛭素与磁球的结合做准备。

（2）凝血酶亲和磁性微球制备：将凝血酶与羧基磁性微球混合反应，然后加入乙醇胺继续反应，分离去除液体，经洗涤，得凝血酶亲和磁性微球；其中，加入乙醇胺是为了屏蔽磁球表面未完全反应的羧基，防止吸附蚂蟥粗提液中的杂蛋白，造成水蛭素纯度下降。

（3）凝血酶亲和磁性微球分离纯化：将步骤（2）的凝血酶亲合磁性微球加入到步骤（1）的水蛭素粗提液中混合均匀后静置，随后磁分离去除上清，再依次进行洗涤和洗脱，收集洗脱液。

（4）脱盐浓缩：将步骤（3）的洗脱液透析处理，中间换水2-8次，每次间隔不小于2h；将透析后的洗脱液通过旋转蒸发(40-70℃，100-130r/min)进行浓缩，去除30-80%的水分后，将浓缩液于-8℃冷藏备用。

（5）取步骤（4）的浓缩液利用冻干机进行冻干，得到粉末态的水蛭素，收集并密封保存。

优选地，所述步骤（1）中浸提液的用量为蚂蟥粉重量的2-4倍；所述浸提液的成分为50mM Tris(三羟甲基氨基甲烷)、10mM EDTA(乙二胺四乙酸)、150mM氯化钠、3% SDS（十二烷基硫酸钠）、2% Triton X-100和2% 脱氧胆酸钠。

优选地，所述步骤（2）中凝血酶和乙醇胺使用时均预先溶于浓度为50mM/L、pH5.5的MES缓冲液；羧基磁性微球预先用活化剂EDC/Sulfo-NHS活化；凝血酶与羧基磁性微球在室温下反应2-3h，然后加入乙醇胺继续在室温下反应1-1.5h。

更优选地，所述凝血酶的活性为2ku/mg，凝血酶与MES缓冲液的质量体积比为1:(1-5)mg/mL；羧基磁性微球的粒度为2.5-3.0μm；凝血酶与乙醇胺的质量体积比为(4-1):1mg/mL；乙醇胺与MES缓冲液的体积比为1:(5-10)。

优选地，所述步骤（3）中洗涤具体为分别用磷酸盐溶液和去离子水洗涤凝血酶亲合磁性微球；磷酸盐溶液的pH为7.4；洗脱使用的洗脱液为(0.01-0.03)mol/L KCl-(0.05-0.2)mol/L HCl。该浓度范围的洗脱液既可维持水蛭素的活性和亲和介质的稳定性，同时又能有效分离洗脱水蛭素。该步骤使用的洗涤液与洗脱液均为纯盐溶液，无毒无污染，分离效率高，可适配于全自动核酸纯化仪，实现自动化生产。

优选地，所述步骤（4）中透析具体为使用截留分子量小于等于5000Da的透析袋，中间换水2-8次，每次间隔不小于2h，透析的总时间不少于24h；所述浓缩具体为使水分去除率达到70-80%。

本发明还包括上述分离纯化方法得到的水蛭素。

优选地，所述水蛭素的活性为17167ATU/g。

本发明还包括所述水蛭素在制备保健食品、药品或化妆品中的应用。

本发明的有益效果：

本发明用自制浸提液从蚂蟥粉中粗提水蛭素，然后利用制得凝血酶亲和磁性微球进一步分离纯化，最终得到活性为17000 ATU/g以上的天然水蛭素。本发明自制的浸提液能将蚂蟥的细胞壁破坏，使其中的水蛭素充分溶出，可为蚂蟥粉中水蛭素的粗提提供更高的效率。本发明选用羧基磁性微球制备凝血酶亲和磁性微球，可充分利用其样品富集作用，与琼脂糖微球和聚合物微球相比可分离纯化得到活性更高的水蛭素，且最终所得的水蛭素中的杂质大大少于水蛭素粗提液中的杂质，水蛭素纯度得到明显提高。凝血酶亲和磁性微球使用时不要求样品浓度、不使用有机溶剂、载量高、对环境的危害小，手动操作或自动化操作也都很方便。本发明分离纯化水蛭素的方法操作简单、生产成本低，所得水蛭素产品的活性及纯度高、保存期长、质量稳定，可为保健食品、药品或化妆品提供安全、优质的原料，有利于工业化生产及应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明利用凝血酶亲和磁性微球分离纯化水蛭素的原理图。

图2为实施例1中水蛭素粗提液的HPLC图谱，图中2号峰为水蛭素峰。

图3为实施例1中分离纯化所得水蛭素的HPLC图谱，图中1号峰为水蛭素峰。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明的实施例中所使用的羧基磁性微球均购于苏州海狸生物医学工程有限公司，粒度为2.5-3.0μm。

本发明的实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明利用凝血酶亲和磁性微球分离纯化水蛭素的原理：如图1所示，本申请基于凝血酶（Throbin）与大分子底物的相互作用取决于三个不同的区域：催化反应位点的初级结合位（C），邻近催化位点的非极性结合位点（AB）和负责凝血酶与纤维蛋白原专一性作用的阴离子结合位点(识别位点)（R）。水蛭素（Hirudin）的N端能封阻凝血酶的活性位点，其疏水结构域与凝血酶的非极性结合位点(AB)互补；该非极性结合位点（AB）靠近凝血酶的催化中心。水蛭素的C端末端有6个酸性氨酸，能与带正电的凝血酶识别位点（R）形成许多离子键。N端、C端两个功能域以协同的方式结合到凝血酶上，在凝血酶的活性部位形成一个帽子，阻止底物的结合。这种结合不会影响水蛭素的活性，在一定的pH下可以将凝血酶与水蛭素分离开。

本发明中HPLC检测的条件如下：

色谱柱：Biopearl-HC C18 4.6*200mm 检测器：UV 280nm

流动相：A：水 B：乙腈柱温：室温

进样量：10uL 流速：1mL/min

洗脱梯度：10%-30%乙腈。

实施例1

本实施例提供的基于凝血酶亲和磁性微球的水蛭素分离纯化方法，具体步骤如下：

（1）从蚂蟥粉中粗提水蛭素：取蚂蟥粉（购自南宁市金海科康医药科技有限公司）并按蚂蟥粉质量的2倍加入浸提液（由50mM Tris、10mM EDTA、150mM氯化钠、3% SDS、2%Triton X-100和2% 脱氧胆酸钠混合得到），浸泡，超声，离心，上清备用，将沉淀继续重复提取两次，收集所有上清液并调节pH至4.5左右，再次离心取上清液，调节pH至7.0左右，备用。

（2）凝血酶亲和磁性微球制备：取含量为 20mg/mL的羧基磁性微球（购于苏州海狸生物医学工程有限公司）5mL放入15mL离心管中置于磁分离架上，去除液体，用3倍体积的去离子水反复洗涤3次，再向其中加入浓度为50mM/L、pH为5.5的MES（1-吗啉乙磺酸）缓冲液5mL以及0.06g的Sulfo-NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）和0.1g的EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)，室温往复振荡1h，磁分离，弃溶液，既得活化的羧基磁性微球；另取2mg凝血酶（2ku/mg，购于湖南沃凯生物有限公司）溶于2mL的MES缓冲液（50mM/L，pH5.5）中，并加入上述活化的羧基磁性微球，室温振荡2h后，向该反应体系中加入0.5mL乙醇胺（提前溶于5mL浓度为50mM/L、pH为5.5的MES缓冲液中），室温下继续振荡1h，磁分离去除液体，并用MES缓冲液（浓度为50mM/L、pH为5.5）、PBS缓冲液（浓度为20mM/L、pH为7.4）洗涤，最后再将其置于PBS缓冲液内4℃保存，所得即为凝血酶亲和磁性微球。

（3）凝血酶亲和磁性微球分离纯化：将上述上清液与凝血酶亲合磁球混合，涡旋分散，静置吸附，磁分离，弃上清，分别用10倍体积的pH为7.4的磷酸盐溶液和去离子水洗涤凝血酶亲和磁性微球，然后用0.02mol/L KCl-0.05mol/L HCl溶液进行洗脱，最后收集洗脱液，备用。

（4）脱盐浓缩：将上述洗脱液进行透析，透析膜为截留分子量小于等于5000的透析袋，中间换水2次，每次间隔2h；将透析后的洗脱液通过旋转蒸发(70℃，250r/min)进行浓缩，直至去除70%水分后，将所得浓缩液于-8℃冷藏，备用。

（5）取上述浓缩液用冻干机进行冻干，得到粉末状的水蛭素，收集后密封保存。

对本实施例中步骤（1）所得的水蛭素粗提液及最终分离纯化所得的水蛭素进行HPLC检测，检测结果如图2和图3所示。由图2可知，检测到水蛭素粗提液中存在包括水蛭素在内的4个色谱峰，其中2号峰（水蛭素）和4号峰的峰值均较高，可见水蛭素粗提液中除水蛭素外，还含有大量的杂蛋白，水蛭素的纯度较低。图3中除水蛭素外无其他的色谱峰，可见本实施例所得的水蛭素纯度很高。

根据水蛭素与凝血酶特异性1:1结合的原理，可用Matkwardt凝血酶直接滴定法检测天然水蛭素的活性。水蛭素的计量单位为国际单位，以ATU表示，凝血酶活性的国际单位为NIH，即1个ATU等于中和1个NIH凝血酶的水蛭素量。天然蚂蟥粉中抗凝血活性最高的那一组分通常被认为是水蛭素。

本实施例所得的天然水蛭素粉末产品，可采用Markwardt凝血酶直接滴定法检测其抗凝血活性。具体检测方法如下：准确称取产品粉末0.01g，置于1.5mL离心管中，加入400μL浸提液，摇匀使之溶解，配制成0.025g/mL供试品溶液。精密量取供试品溶液100μL，置1.5mL离心管中，加入含有0.5%牛纤维蛋白原的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液（PH7.4）200μL，摇匀，置水浴（37±0.5）℃中，缓缓滴加每1mL（中）含40NIH（单位）的凝血酶溶液（5uL/min，边滴加边轻轻摇匀）至溶液中出现凝固为止，记录消耗凝血酶溶液的体积。按下式计算活性：

U = C1V1/（C2V2）

式中：U为每1 g水蛭素的活性单位（ATU/g）；

C1为凝血酶溶液的浓度（NIH/mL）；

C2为供试品溶液的质量浓度（g/mL）；

V1为消耗凝血酶溶液的体积（μL）；

V2为供试品溶液的加入量（μL）。

由上述方法测得本实施例所得水蛭素的活性为17167ATU/g，并测得其产率为1.13%，活性得率为16.17%。

实施例2

（1）从蚂蟥粉中粗提水蛭素：取蚂蟥粉（购自南宁市金海科康医药科技有限公司）并按蚂蟥粉质量的4倍加入浸提液（由50mMTris、10mM EDTA、150mM氯化钠、3% SDS、2%Triton X-100和2% 脱氧胆酸钠混合得到），浸泡，超声，离心，上清备用，将沉淀继续重复提取两次，收集所有上清液并调节pH至4.5左右，再次离心取上清液，调节pH至7.0左右，备用。

（3）凝血酶亲和磁性微球分离纯化：将上述上清液与凝血酶亲合磁球混合，涡旋分散，静置吸附，磁分离，弃上清，分别用10倍体积的pH为7.4的磷酸盐溶液和去离子水洗涤凝血酶亲和磁性微球，然后用0.01mol/L KCl-0.1mol/L HCl溶液进行洗脱，最后收集洗脱液，备用。

（4）脱盐浓缩：将上述洗脱液进行透析，透析膜为截留分子量小于等于5000的透析袋，中间换水4次，每次间隔4h；将透析后的洗脱液通过旋转蒸发(50℃，250r/min)进行浓缩，直至去除80%的水分后，将所得浓缩液于-8℃冷藏，备用。

参照实施例1所述的测定方法，测得本实施例所得水蛭素的活性为16218ATU/g，产率为0.97%，活性得率为13.11%。

实施例3

（1）从蚂蟥粉中粗提水蛭素：取蚂蟥粉（购自南宁市金海科康医药科技有限公司）并按蚂蟥粉质量的3倍加入浸提液（由50mM Tris、10mM EDTA、150mM氯化钠、3% SDS、2%Triton X-100和2%脱氧胆酸钠混合得到），浸泡，超声，离心，上清备用，将沉淀继续重复提取两次，收集所有上清液并调节pH至4.5左右，再次离心取上清液，调节pH至7.0左右，备用。

（3）凝血酶亲和磁性微球分离纯化：将上述上清液与凝血酶亲合磁球混合，涡旋分散，静置吸附，磁分离，弃上清，分别用10倍体积的pH为7.4的磷酸盐溶液和去离子水洗涤凝血酶亲和磁性微球，然后用0.03mol/L KCl-0.2mol/L HCl溶液进行洗脱，最后收集洗脱液，备用。

（4）脱盐浓缩：将上述洗脱液进行透析，透析膜为截留分子量小于等于5000的透析袋，中间换水8次，每次间隔3h；将透析后的洗脱液通过旋转蒸发(40℃，150r/min)进行浓缩，直至去除75%的水分后，将所得浓缩液于-8℃冷藏，备用。

参照实施例1所述的测定方法，测得本实施例所得水蛭素的活性为16528ATU/g，产率为0.88%，活性得率为12.12%。

实施例1、2和3中三种不同浓度的洗脱液所得到的水蛭素活性与产率略有差别，相差不大。但磁性微球含有Fe₃O₄，洗脱液中HCl可与Fe₃O₄发生反应，进而影响磁性微球介质，导致介质的使用寿命缩短，所以在不影响洗脱的条件下，应尽量降低洗脱液中HCl的浓度，故实施例1所述的洗脱液（0.02mol/L KCl-0.05mol/L HCl溶液）为最优选。

实施例4

（2）凝血酶亲和磁性微球制备：取含量为 20mg/mL的羧基磁性微球（购于苏州海狸生物医学工程有限公司）5mL放入15mL离心管中置于磁分离架上，去除液体，用3倍体积的去离子水反复洗涤3次，再向其中加入浓度为50mM/L、pH为5.5的MES（1-吗啉乙磺酸）缓冲液5mL以及0.06g的Sulfo-NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）和0.1g的EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)，室温往复振荡1h，磁分离，弃溶液，既得活化的羧基磁性微球；另取2mg凝血酶（2ku/mg，购于湖南沃凯生物有限公司）溶于4mL的MES缓冲液（50mM/L，pH5.5）中，并加入上述活化的羧基磁性微球，室温振荡2.5h后，向该反应体系中加入1mL乙醇胺（提前溶于6mL浓度为50mM/L、pH为5.5的MES缓冲液中），室温下继续振荡1.2h，磁分离去除液体，并用MES缓冲液（浓度为50mM/L、pH为5.5）、PBS缓冲液（浓度为20mM/L、pH为7.4）洗涤，最后再将其置于PBS缓冲液内4℃保存，所得即为凝血酶亲和磁性微球。

（4）脱盐浓缩：将上述洗脱液进行透析，透析膜为截留分子量小于等于5000的透析袋，中间换水2次，每次间隔2h；将透析后的洗脱液通过旋转蒸发(70℃，250r/min)进行浓缩，直至去除30%水分后，将所得浓缩液于-8℃冷藏，备用。

参照实施例1所述的测定方法，测得本实施例所得水蛭素的活性为17012ATU/g，产率为0.98%，活性得率为15.12%。

实施例5

（2）凝血酶亲和磁性微球制备：取含量为 20mg/mL的羧基磁性微球（购于苏州海狸生物医学工程有限公司）5mL放入15mL离心管中置于磁分离架上，去除液体，用3倍体积的去离子水反复洗涤3次，再向其中加入浓度为50mM/L、pH为5.5的MES（1-吗啉乙磺酸）缓冲液5mL以及0.06g的Sulfo-NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）和0.1g的EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)，室温往复振荡1h，磁分离，弃溶液，既得活化的羧基磁性微球；另取2mg凝血酶（2ku/mg，购于湖南沃凯生物有限公司）溶于10mL的MES缓冲液（50mM/L，pH5.5）中，并加入上述活化的羧基磁性微球，室温振荡3h后，向该反应体系中加入2mL乙醇胺（提前溶于10mL浓度为50mM/L、pH为5.5的MES缓冲液中），室温下继续振荡1.5h，磁分离去除液体，并用MES缓冲液（浓度为50mM/L、pH为5.5）、PBS缓冲液（浓度为20mM/L、pH为7.4）洗涤，最后再将其置于PBS缓冲液内4℃保存，所得即为凝血酶亲和磁性微球。

参照实施例1所述的测定方法，测得本实施例所得水蛭素的活性为16998ATU/g，产率为1.08%，活性得率为16.02%。

对比例1

参照实施例1的分离纯化方法，但使用不同的浸提液(生理盐水、浸提液1、浸提液2)处理蚂蟥粉。

浸提液1（即本发明所用的浸提液）：50mM Tris(三羟甲基氨基甲烷)，10mM EDTA(乙二胺四乙酸)，150mM氯化钠，3% SDS（十二烷基硫酸钠），2% Triton X-100，2% 脱氧胆酸钠。

浸提液2（依据RIPA裂解液配方调整得到）：1.2M盐酸胍，50mM Tris-HCL(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)，pH7.0的30mM EDTA(乙二胺四乙酸)，10%Tween-20，1% Triton X-100。

生理盐水：0.9%氯化钠水溶液。

浸提液1（即本发明所用的浸提液）使用效果较温和，对破坏细胞壁后溶出的蛋白的性质无太大影响；浸提液2能将细胞壁破坏，但所含成分的不同导致对蛋白的提取效果不同，且较高的盐浓度对后续蛋白与磁球的结合有一定影响；生理盐水只有单纯的溶解作用，只能将游离在细胞外的蛋白溶解，并不能将细胞中的有效成分溶出。参照实施例1所述的测定方法，测得浸提液1（即本发明所用的浸提液）处理蚂蟥粉后进行下一步实验得到的水蛭素的活性为17167ATU/g，产率为1.13%；浸提液2处理蚂蟥粉后进行下一步实验得到的水蛭素的活性为2780ATU/g，产率为1.24%；生理盐水处理蚂蟥粉后进行下一步实验得到的水蛭素的活性为1320ATU/g，产率为1.27%。可见，本发明所用的浸提液1提取效果良好，能够将蚂蟥的细胞壁破坏，使其中的水蛭素充分溶出，但不损害其中的有效成分，可为蚂蟥粉中水蛭素的粗提提供更高的效率。

对比例2

参照实施例1的分离纯化方法，但使用不同基质（琼脂糖、聚合物微球、磁性微球）制备的亲和微球从蚂蟥粉中提取水蛭素，并参照实施例1所述的测定方法，测得最终所得水蛭素的活性及产率。

使用以琼脂糖为基质制得的凝血酶亲和琼脂糖微球，最终得到的水蛭素的活性为7329ATU/g，产率为0.48%。但使用凝血酶亲和琼脂糖微球时对上样浓度有一定要求，从蚂蟥粉中粗提水蛭素时需要用丙酮进行沉淀，且琼脂糖微球的耐压强度低，进行分离时，流速小，效率低。

使用以聚合物微球为基质制得的凝血酶亲和聚合物微球，最终得到的水蛭素的活性为6730ATU/g，产率为0.26%。但使用凝血酶亲和聚合物微球同样对上样浓度有一定要求，从蚂蟥粉中粗提水蛭素时需要用丙酮进行沉淀，且聚合物微球的载量较低，手动操作不便。

使用以磁性微球为基质制得的凝血酶亲和磁性微球，最终得到的水蛭素的活性为17167ATU/g，产率为1.13%。所得的水蛭素的纯度高，杂质少，虽然产率有限，但单位质量活性高，其活性得率高达16.17%，能将蚂蟥干粉中的高活性成分得到充分利用。本发明以磁性微球为基质制备凝血酶亲和磁性微球同于水蛭素的分离纯化，具有样品富集的效果，对样品浓度无要求，可以不使用有机溶剂，对环境危害小，且载量高，操作简便，手动与自动化操作都很方便。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.基于凝血酶亲和磁性微球的水蛭素分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）称取蚂蟥粉，加浸提液浸泡后进行超声及离心，收集上清液并调节pH，得水蛭素粗提液；

（2）将凝血酶与羧基磁性微球混合反应，然后加入乙醇胺继续反应，分离去除液体，经洗涤，得凝血酶亲和磁性微球；

（3）将步骤（2）的凝血酶亲合磁性微球加入到步骤（1）的水蛭素粗提液中混合均匀后静置，随后分离去除上清，洗涤所得沉淀，经洗脱，收集洗脱液；

（4）将步骤（3）的洗脱液透析处理，然后进行浓缩及冻干，即得水蛭素。

2. 根据权利要求1所述的水蛭素分离纯化方法，其特征在于：所述步骤（1）中浸提液为蚂蟥粉重量的2-6倍；所述浸提液的成分为50mM Tris、10mM EDTA、150mM 氯化钠、3% SDS、2% Triton X-100和2% 脱氧胆酸钠。

3.根据权利要求2所述的水蛭素分离纯化方法，其特征在于，所述收集上清液并调节pH具体为：收集上清液并调节pH至4.5，再次离心取上清液，调节pH至7.0。

4.根据权利要求1所述的水蛭素分离纯化方法，其特征在于：所述步骤（2）中凝血酶和乙醇胺使用时均预先溶于浓度为50mM/L、pH5.5的MES缓冲液；羧基磁性微球预先用活化剂EDC/Sulfo-NHS活化；凝血酶与羧基磁性微球在室温下反应2-3h，然后加入乙醇胺继续在室温下反应1-1.5h。

5.根据权利要求4所述的水蛭素分离纯化方法，其特征在于：所述凝血酶的活性为2ku/mg，凝血酶与MES缓冲液的质量体积比为1:(1-5)mg/mL；羧基磁性微球的粒度为2.5-3.0μm；凝血酶与乙醇胺的质量体积比为(4-1):1mg/mL；乙醇胺与MES缓冲液的体积比为1:(5-10)。

6. 根据权利要求1所述的水蛭素分离纯化方法，其特征在于：所述步骤（3）中洗脱使用的洗脱液为含(0.01-0.03)mol/L KCl-(0.05-0.2)mol/L HCl的水溶液。

7.根据权利要求1所述的水蛭素分离纯化方法，其特征在于：所述步骤（4）中透析具体为使用截留分子量小于等于5000Da的透析袋，中间换水2-8次，每次间隔不小于2h；所述浓缩具体为使水分去除率达到30-80%。

8.权利要求1-7任一项所述的分离纯化方法得到的水蛭素。

9.根据权利要求8所述的水蛭素，其特征在于：所述水蛭素的活性为17167ATU/g。

10.权利要求8所述的水蛭素在制备药品、保健食品或化妆品中的应用。