CN114773446A

CN114773446A - 一种蜂毒肽及其分离纯化方法

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Publication number: CN114773446A
Application number: CN202210677389.8A
Authority: CN
Inventors: 杨梦瑞; 王敏; 史浩川; 周剑
Original assignee: Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology for Agro Products of CAAS
Current assignee: Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology for Agro Products of CAAS
Priority date: 2022-06-16
Filing date: 2022-06-16
Publication date: 2022-07-22
Anticipated expiration: 2042-06-16
Also published as: CN114773446B

Abstract

本发明公开了一种蜂毒肽及其分离纯化方法，涉及生物技术领域。其包括：将待分离纯化的蜂毒粗提液进行第一次反相C18半制备柱分离，采用甲酸水溶液和乙腈作为流动相进行梯度洗脱，收集洗脱液，然后将洗脱液冻干后复溶，复溶液用于二次反相C18半制备柱分离，二次反相C18半制备柱分离是采用三氟乙酸水溶液和甲醇作为流动相进行等度洗脱。该方法无需特定的pH环境下结合超滤工艺除杂即可达到分离纯度高、目标物质损失少、有机溶剂用量少的技术效果，具有环境友好、装置简单、工艺操作简便和适合工业化生产的技术优势。

Description

一种蜂毒肽及其分离纯化方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种蜂毒肽及其分离纯化方法。

背景技术

肽，是由一个氨基酸的羧基（－COOH）与另一个氨基酸的氨基（－NH₂）脱水缩合形成的产物。肽对自然界生物的生长发育、新陈代谢、疾病、衰老以及死亡的过程中起着关键作用。近年来对于肽的研究报道也越来越多。肽可以促进伤口愈合；抗炎抗菌、抗病毒感染；抗衰老，消除体内多余自由基；还可以抗肿瘤，诱导肿瘤细胞凋亡。农业上也有很多具有研究价值的肽值得我们深入研究。比如植物肽中有枸杞肽、人参肽等，动物肽有蜂毒肽、蝎毒肽、蛇毒肽等。

其中，蜂毒肽的抗炎性是目前人类所知的最强物质之一，是存在于蜜蜂毒里的一种多肽类物质。蜜蜂毒是工蜂尾部蛰刺腺内的有毒液体，其主要成分有多肽类、酶类、胺类物质和非肽类的其他物质。其中，蜂毒肽（Melittin）的含量约占40%－60%，具有一定生物学活性，在抗菌、抗炎、抗肿瘤、免疫调节等方面具有很好的功效，是近年来农业等领域研究的热点。

蜂毒肽是由26个氨基酸残基（NH₂－GLY－ILE－GLY－ALA－VAL－LEU－LYS－VAL－LEU－THR－THR－GLY－LEU－PRO－ALA－LEU－ILE－SER－TRP－ILE－LYS－ARG－LYS－ARG－GLN－GLN－COOH）构成的多肽类物质。分子式为C₁₃₁H₂₂₉N₃₉O₃₁，其相对分子质量为2840Da。其中蜂毒肽的亲水性主要集中在含有一段带正电荷的氨基酸残基的羧基末端区域（残基21-26），而疏水性主要集中在氨基末端区域（残基1-20），呈α-螺旋构象。由于蜂毒肽中赖氨酸、精氨酸等碱性氨基酸比例较大，所占比例为23.1%。因此，蜂毒肽显碱性。蜂毒肽易溶于水，且蜂毒肽等电点经测定可确定其pI>7。

目前的蜂毒肽的分离纯化方法需要在特定的pH除杂、超滤等一系列工艺条件下进行，存在工艺复杂、纯化条件严苛、试剂耗损成本高、分离纯度较低等问题。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蜂毒肽及其分离纯化方法以解决上述技术问题。

本发明是这样实现的：

本发明提供了一种蜂毒肽的分离纯化方法，其包括：将待分离纯化的蜂毒粗提液进行第一次反相C18半制备柱分离，采用甲酸水溶液和乙腈作为流动相进行梯度洗脱，收集洗脱液，然后将洗脱液冻干后复溶，获得的复溶液用二次反相C18半制备柱分离，二次反相C18半制备柱分离是采用三氟乙酸水溶液和甲醇作为流动相进行等度洗脱。

发明人基于现有的分离纯化方法存在的纯化工艺对于纯化条件的要求高、试剂耗损高、分离纯度低的问题出发，开发了一种较为简便的可以获得99.6%以上纯度的蜂毒肽的分离纯化方法。该方法无需特定的pH环境下结合超滤工艺除杂即可达到分离纯度高、目标物质损失少、有机溶剂用量少的技术效果，具有环境友好、装置简单、工艺操作简便和适合工业化生产的技术优势。

相比于现有的层析柱（包括不限于亲和层析、分子筛层析、葡聚糖凝胶柱层析和阴离子交换柱），发明人采用半制备柱分离纯化蜂毒肽具有分离效果好、节省洗脱溶剂、纯化步骤简单等优点。

现有技术需要调节离心液的pH为3.0～4.0，方可使蜂毒粗品中的部分杂质在此pH条件下沉淀除去，同时此pH条件（酸性条件）还可使病毒灭活，同时使得尽可能多地使蜂毒粗品中杂质沉淀析出。现有技术还需进一步将pH调节为4.5～5.5，从而提高蜂毒的稳定性；再经超滤浓缩的方法除去离子以及组胺等小分子杂质。

而本发明提供的分离纯化方法无需反复地调节粗提液的pH，也无需超滤浓缩，可以通过直接上半制备柱的方式实现较高纯度的蜂毒肽的制备。极大程度上简化了高纯度蜂毒肽的分离纯化工艺，减少了分离纯化阶段对于特定设备（比如超滤膜、浓缩装置、pH测量仪）的依赖程度，降低了试剂的耗损，更适合于工艺化生产。

经过第一次反相C18半制备柱分离，可以获得纯度大于90%的产物，经过二次反相C18半制备柱分离，可以获得纯度大于99.6%的蜂毒肽产物。

发明人发现选择甲酸水溶液和乙腈作为流动相进行第一反相C18半制备柱的梯度洗脱，选择三氟乙酸水溶液和甲醇作为流动相进行二次反相C18半制备柱的等度洗脱可以获得较好的分离度，且出峰时间稳定。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述甲酸水溶液是指体积百分含量为0.1-0.2%的甲酸水溶液，三氟乙酸水溶液是指体积百分含量为0.1-0.2%的三氟乙酸水溶液。

在上述体积百分数的流动相条件下，有助于提升洗脱的分离度。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述二次反相C18半制备柱分离前，将洗脱液进行冷冻干燥，然后进行复溶。复溶的作用在于：选择合适的二次纯化时的进样浓度，获得较高纯度的蜂毒肽的同时尽可能提高纯化效率。

复溶液采用超纯水，复溶液中蜂毒肽浓度3.5-4.5mg/ml。

在一种可选的实施方式中，在复溶后还包括将复溶后的溶液过滤，收集滤液进行二次反相C18半制备柱分离。

进行二次反相C18半制备柱分离时最佳进样量为65-70μl。

在一种可选的实施方式中，过滤是采用0.45μm滤膜过滤。通过过滤以去除部分杂质，以提高产物的纯度。

在一种可选的实施方式中，冷冻干燥后的固体粉末的纯度大于90%。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述第一反相C18半制备柱分离时，梯度洗脱顺序包括：

0-2min 流动相中甲酸水溶液的体积百分比为95%，流动相中乙腈的体积百分比为5%，流速为3.6-4ml/min；

2-28min 流动相中甲酸水溶液的体积百分比为15%，流动相中乙腈的体积百分比为85%，流速与0-2min时流动相的流速相同；

28-30min 流动相中甲酸水溶液的体积百分比为95%，流动相中乙腈的体积百分比为5%，流速与0-2min时流动相的流速相同。

发明人发现上述第一反相C18半制备柱分离时，收集14min-15min内的洗脱液，经低温冷冻干燥后，获得白色粉末状蜂毒肽，色谱纯度大于90%。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述二次反相C18半制备柱分离时，等度洗脱顺序包括：

0-30min 流动相中三氟乙酸水溶液的体积百分比为27%，流动相中甲醇的体积百分比为73%，流速为3.6-4ml/min。

各色谱条件的选择及其组合可以直接影响各组分之间的分离度以及出峰时间等。

发明人发现，上述二次反相C18半制备柱分离时，保留19-21min内的洗脱液。

将19-21min内的洗脱液进行冷冻干燥，获得色谱纯度大于99.6%的蜂毒肽。

经低温冷冻干燥，获得白色粉末状蜂毒肽，经质谱定性为蜂毒肽，色谱纯度大于99.6%。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述分离纯化方法包括制备蜂毒粗提液，其包括将待分离纯化的蜂毒粗品与提取剂按照料液比1-1.2g：1-1.5mL混合，然后离心取上清。

在混合比下，一方面可以保证蜂毒充分溶解，另一方面可以使得其他不溶物沉淀在混合液底部，利于后续的离心分离，提高蜂毒肽的纯度。

在一种可选的实施方式中，提取剂为体积百分含量为20-25%的乙腈水溶液。发明人发现，当提取剂选自体积百分含量为20-25%的乙腈水溶液时，可以较高效率的完成蜂毒肽的粗提取，使得较多的蜂毒肽保留于上清液中。

在一种可选的实施方式中，离心前还包括将蜂毒粗品与提取剂混合后的液体进行涡旋；离心是在14000-15000rpm，0-4℃下离心15-20min。在上述离心条件下可以减少蜂毒肽在分离过程中的损失，也可以极大程度上完成杂质的分离。

在一种可选的实施方式中，重复涡旋离心步骤，合并上清液。

本发明还提供了一种由上述的蜂毒肽的分离纯化方法制得的蜂毒肽。上述蜂毒肽具有纯度高的优势，可以直接用于质谱分析。

本发明具有以下有益效果：

本发明开发了一种较为简便的可以获得99.6%以上纯度的蜂毒肽的分离纯化方法。该方法无需特定的pH环境下结合超滤工艺除杂即可达到分离纯度高、目标物质损失少、有机溶剂用量少的技术效果，具有环境友好、装置简单、工艺操作简便和适合工业化生产的技术优势。

相比于现有的层析柱，发明人采用半制备柱分离纯化蜂毒肽具有分离效果好、节省洗脱溶剂、纯化步骤简单等优点。

此外，本发明提供的分离纯化方法无需反复地调节粗提液的pH，也无需超滤浓缩，可以通过直接上半制备柱的方式实现较高纯度的蜂毒肽的制备。极大程度上简化了高纯度蜂毒肽的分离纯化工艺，减少了分离纯化阶段对于特定设备（比如超滤膜、浓缩装置、pH测量仪）的依赖程度，降低了试剂的耗损，更适合于工艺化生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明制备的蜂毒肽提取液第一次半制备色谱图；

图2 为本发明制备的蜂毒肽一次纯化后冻干产物的HPLC色谱图；

图3 为本发明制备的蜂毒肽二次分离纯化制备色谱图；

图4为本发明制备的蜂毒肽基质辅助激光解析电离飞行时间质谱图；

图5为本发明制备的蜂毒肽二次纯化后冻干产物的HPLC色谱图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

（1）溶剂提取

将粗蜂毒按照料液比（粗蜂毒：乙腈水提取剂）1g:1mL进行混合。具体地，在离心管中加入20%乙腈水提取剂，在20%乙腈水提取剂中加入粗蜂毒，涡旋25min后于14000rpm，4℃下离心20分钟，取上清液。重复上述涡旋离心步骤，合并上清液。

（2）蜂毒肽第一次分离纯化

将上清液液进行反相C18半制备柱分离，采用0.2%（体积百分数）甲酸水溶液和乙腈体系梯度洗脱，洗脱程序见表1，收集蜂毒肽出峰范围的洗脱液，如图1中保留时间14min-15min范围，低温冷冻干燥，获得白色粉末状蜂毒肽，色谱纯度大于90%，如图2所示。

表1 洗脱程序

时间（ min ）	流速（ ml/min ）	0.2% 甲酸水 %	乙腈 %
				0	4	95	5
2	4	95	5
				28	4	15	85
30	4	95	5

（3）蜂毒肽二次分离纯化

将一次纯化冻干的白色粉末复溶、过0.45μm滤膜后，采用反相C18半制备柱分离，以0.2%三氟乙酸水溶液和甲醇体系进行等度洗脱，洗脱程序见表2，收集蜂毒肽出峰范围的洗脱液，如图3中保留时间19min-21min范围，低温冷冻干燥，获得白色粉末状蜂毒肽，质谱定性为蜂毒肽，如图4所示。色谱纯度大于99.6%，如图5所示。

表2 洗脱程序

时间（ min ）	流速（ ml/min ）	0.2% 三氟乙酸水 %	甲醇 %
				0	4	27	73
30	4	27	7 3

对比例1

与实施例1相比区别仅在于，采用DAC-100为色谱柱，其他的工艺条件不变，同实施例1。

对比例2

与实施例1相比区别仅在于，第一次分离纯化采用的流动相为0.2%三氟乙酸水溶液和乙腈体系，其他的工艺条件不变，同实施例1。

对比例3

与实施例1相比区别仅在于，第一次分离纯化后收集的洗脱液不进行冻干复溶，直接进行第一次分离纯化。其他工艺条件同实施例1。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种蜂毒肽的分离纯化方法，其特征在于，其包括：将待分离纯化的蜂毒粗提液进行第一次反相C18半制备柱分离，采用甲酸水溶液和乙腈作为流动相进行梯度洗脱，收集洗脱液，然后将洗脱液冻干后复溶，获得的复溶液用二次反相C18半制备柱分离，所述洗脱液用于二次反相C18半制备柱分离，所述二次反相C18半制备柱分离是采用三氟乙酸水溶液和甲醇作为流动相进行等度洗脱。

2.根据权利要求1所述的蜂毒肽的分离纯化方法，其特征在于，所述甲酸水溶液是指体积百分含量为0.1-0.2%的甲酸水溶液，所述三氟乙酸水溶液是指体积百分含量为0.1-0.2%的三氟乙酸水溶液。

3.根据权利要求1或2所述的蜂毒肽的分离纯化方法，其特征在于，所述复溶液采用超纯水，复溶液中蜂毒肽浓度3.5-4.5mg/ml；

优选地，在复溶后还包括将复溶后的溶液过滤，收集滤液进行二次反相C18半制备柱分离；

优选地，进行二次反相C18半制备柱分离时最佳进样量为65-70μl；

优选地，所述过滤是采用0.45μm滤膜过滤；

优选地，所述冷冻干燥后的固体粉末的纯度大于90%。

4.根据权利要求1所述的蜂毒肽的分离纯化方法，其特征在于，所述第一反相C18半制备柱分离时，所述梯度洗脱顺序包括：

0-2min 流动相中甲酸水溶液的体积百分比为95%，流动相中乙腈的体积百分比为5%，流速为3.6-4.0ml/min；

5.根据权利要求4所述的蜂毒肽的分离纯化方法，其特征在于，所述第一反相C18半制备柱分离时，收集14min-15min内的洗脱液。

6.根据权利要求1所述的蜂毒肽的分离纯化方法，其特征在于，所述二次反相C18半制备柱分离时，所述等度洗脱顺序包括：

7.根据权利要求6所述的蜂毒肽的分离纯化方法，其特征在于，所述二次反相C18半制备柱分离时，保留19-21min内的洗脱液。

8.根据权利要求7所述的蜂毒肽的分离纯化方法，其特征在于，将19-21min内的洗脱液进行冷冻干燥，获得色谱纯度大于99.6%的蜂毒肽。

9.根据权利要求1所述的蜂毒肽的分离纯化方法，其特征在于，所述分离纯化方法包括制备蜂毒粗提液，其包括将待分离纯化的蜂毒粗品与提取剂按照料液比1-1.2g：1-1.5mL混合，然后离心取上清；

优选地，所述提取剂为体积百分含量为20-25%的乙腈水溶液；

优选地，所述离心前还包括将蜂毒粗品与提取剂混合后的液体进行涡旋；所述离心是在14000-15000rpm，0-4℃下离心15-20min；

优选地，重复涡旋离心步骤，合并上清液。

10.一种由权利要求1-9任一项所述的蜂毒肽的分离纯化方法制得的蜂毒肽。