CN111748024A

CN111748024A - 美洲大蠊多肽的制备方法

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Publication number: CN111748024A
Application number: CN201910251549.0A
Authority: CN
Inventors: 石小和
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2019-03-29
Filing date: 2019-03-29
Publication date: 2020-10-09

Abstract

本发明属于多肽制备技术领域，具体涉及一种美洲大蠊多肽的制备方法，包括：提供美洲大蠊，将美洲大蠊进行脱脂处理，然后采用65％‑85％乙醇水溶液作为提取液进行成分提取，收集提取液，浓缩，获得总提取物；将总提取物与水进行混合均匀，过滤，收集滤液；将滤液上大孔树脂柱进行梯度洗脱，梯度洗脱采用的流动相包括：水、70％‑80％醇水溶液和至少一个质量百分比浓度低于70％的醇水溶液，然后收集70％‑80％醇水溶液的洗脱液，并浓缩至洗脱液体积的0.1倍以下，获得浓缩液；将浓缩液与有机溶剂进行混合，进行萃取，收集有机溶剂萃取液，并将有机溶剂萃取液进行结晶，收集晶体，干燥；有机溶剂为乙酸乙酯和石油醚的混合溶剂，且乙酸乙酯和石油醚的混合体积比为(1‑5):1。

Description

美洲大蠊多肽的制备方法

技术领域

本发明属于多肽制备技术领域，具体涉及一种美洲大蠊多肽的制备方法。

背景技术

美洲大蠊，为昆虫纲蜚蠊目蜚蠊科大蠊属昆虫，俗称蟑螂，我国历代本草专著如《本草纲目》、《新修本草》中均有详细记载，近代多部药学专著和学术文献中也有研究和记述。美洲大蠊，烘干入药，具有较高的药用价值，有200多种重要成分与其相配，作为中药，其性寒、味咸、且有微毒，能入三经、逐瘀破血、接骨续筋、消肿止痛等功效，主治腰腿痛、跌打损伤、关节炎等病症。现代医学证明，美洲大蠊对白血病有治疗作用，并且能抑制肿瘤的扩散，对某些癌症具有一定的治疗作用有散瘀解毒、抗菌消肿、保肝利水、增强免疫及抗肿瘤等功效。

美洲大蠊主要活性成分包括多肽、挥发油、氨基酸、多糖类、脂肪、有机酸及生物碱，机体内含有铁、锌、锰、铜等8种人体必需微量元素，还含有17种氨基酸，缬氨酸、亮氨酸等必须氨基酸以及20多种非必须氨基酸等。美洲大蠊多肽作为一类具有抗菌活性的碱性多肽物质，是由大蠊脑神经分泌细胞分泌的，对生长、变态、生殖、动态平衡等生理过程起调节作用的多肽类物质，这类活性多肽具有广谱抗菌、稳定性好、分子量较小，抗炎，抗氧化，增强免疫力及促进伤口愈合等药理作用，并且能够在不伤害正常细胞、组织的前提下选择性杀伤肿瘤细胞，不产生毒副反应，是美洲大蠊中最有效的成分之一。

目前对美洲大蠊多肽的开发还处于初级阶段，采用传统方法制备得到的美洲大蠊多肽纯度低，杂质多，色泽深，并存在一定程度的腥臭味，这限制了美洲大蠊多肽的进一步应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种美洲大蠊多肽的制备方法，旨在解决现有方法得到的美洲大蠊多肽纯度低的技术问题。

为了实现上述发明目的，本发明提供了一种美洲大蠊多肽的制备方法，包括如下步骤：

提供美洲大蠊，将所述美洲大蠊进行脱脂处理，然后采用40％-90％乙醇水溶液作为提取液进行成分提取，收集提取液，浓缩至密度为1.10-1.15g/mL，获得总提取物；

提供水，将所述总提取物与所述水混合，进行水沉，随后过滤，并收集滤液；将所述滤液上大孔树脂柱进行梯度洗脱，所述梯度洗脱采用的流动相包括：水、70％-80％醇水溶液和至少一个质量百分比浓度低于70％的醇水溶液，然后收集所述70％-80％醇水溶液的洗脱液，并浓缩至所述洗脱液体积的0.1以下，获得浓缩液；

将所述浓缩液与有机溶剂混合，进行萃取，收集有机溶剂萃取液，并浓缩所述有机溶剂至晶体析出，然后静置于10℃以下的环境中自然析晶，过滤，收集晶体，干燥，即得；

其中，所述有机溶剂为乙酸乙酯和石油醚的混合溶剂，且所述乙酸乙酯和所述石油醚的混合体积比为(2-5):1。

在本发明美洲大蠊的制备方法中，将所述美洲大蠊进行脱脂处理，并采用40％-90％乙醇水溶液作为提取液对经过脱脂处理的美洲大蠊进行成分提取，然后采用大孔树脂富集活性成分，并采用乙酸乙酯和石油醚的混合溶剂作为萃取溶剂，之后于10℃以下的环境中自然析晶，进而制备获得了纯度高且颜色纯白的美洲大蠊多肽。本发明方法操作简单，工艺优化，可获得高纯度的美洲大蠊多肽，适合工业化大规模生产。

附图说明

图1为测试例中绘制的标准曲线。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例说明书的“％乙醇水溶液”、“％甲醇水溶液”或“％醇水溶液”中的“％”均指的是溶液中的醇(例如乙醇)的质量百分比浓度。

为了解决现有方法制备得到的美洲大蠊多肽纯度低的技术问题，本发明实施例提供了一种美洲大蠊多肽的制备方法，其具体技术方案如下：

一种美洲大蠊多肽的制备方法，包括如下步骤：

S01、提供美洲大蠊，将所述美洲大蠊进行脱脂处理，然后采用40％-90％乙醇水溶液作为提取液进行成分提取，收集提取液，浓缩至密度为1.10-1.15g/mL，获得总提取物；

S02、提供水，将所述总提取物与所述水混合，进行水沉，随后过滤，收集滤液；将所述滤液上大孔树脂柱进行梯度洗脱，所述梯度洗脱采用的流动相包括：水、70％-80％醇水溶液和至少一个质量百分比浓度低于70％的醇水溶液，然后收集所述70％-80％醇水溶液的洗脱液，并浓缩至所述洗脱液体积的0.1倍以下，获得浓缩液；

S03、将所述浓缩液与有机溶剂进行混合，进行萃取，收集有机溶剂萃取液，并浓缩所述有机溶剂至晶体析出，然后静置于10℃以下的环境中自然析晶，过滤，收集晶体，干燥，即得；

具体的，步骤S01中，所述美洲大蠊指的是美洲大蠊的成虫虫体，其可为新鲜虫体或经过干燥处理后的干燥虫体，或者为经过粉碎处理后的干燥虫体。

在一具体实施例中，取停止喂食15天后的美洲大蠊成虫，用开水烫1min，晾干，然后均匀地铺在不锈钢盘中，放置于20℃-55℃电热鼓风干燥箱中烘72小时，之后置于高速万能粉碎机中进行粉碎，再过10-100目筛。

将所述美洲大蠊进行脱脂处理，用于初步除杂，防止油溶性成分进入到后期的提取纯化过程，进而影响产物的纯度。

作为优选，所述脱脂处理采用非极性有机溶剂，所述非极性有机溶剂选自石油醚、正己烷和环己烷中的至少一种。

在一实施例中，采用所述非极性有机溶剂与所述美洲大蠊混合，然后进行高速搅拌提取、回流提取或渗漉提取，然后去除溶剂。

在另一实施例中，所述非极性有机溶剂选自石油醚，石油醚容易挥发，无残留，价格便宜。

在又一实施例中，将美洲大蠊浸于至少10倍美洲大蠊体积的石油醚中，于45℃-55℃下重复提取至少3次，每次浸没的时间至少为2小时，过滤，之后去除石油醚。

采用40％-90％乙醇水溶液作为提取液进行成分提取，一方面，美洲大蠊多肽为偏极性成分，采用40％-90％乙醇水溶液能够尽量地将美洲大蠊多肽尽可能多的提取完全；另一方面，乙醇水溶液无毒，且可避免使用其余有机溶剂影响美洲大蠊多肽结构的稳定性。

在一实施例中，在采用40％-90％乙醇水溶液作为提取液进行成分提取的步骤中，提取温度优选为35℃-75℃，更优选为50℃。如此，可最大限度的保证美洲大蠊多肽不会因为温度过高失活，且温度过高耗能大，时间成本增加。

在另一实施例中，在采用40％-90％乙醇水溶液作为提取液进行成分提取的步骤中，所述提取液与经过脱脂处理的美洲大蠊的体积比为12-22倍。基于美洲大蠊多肽在乙醇中的溶解度关系，保证美洲大蠊多肽提取完全。

为了尽可能的将活性成分提取完全，提高产率，在在采用40％-90％乙醇水溶液作为提取液进行成分提取的步骤中，采用40％-90％乙醇水溶液进行多次重复提取。

在一具体实施例中，依次采用美洲大蠊8倍体积、6倍体积和8倍体积的75％乙醇水溶液进行浸没提取、回流提取或渗漉提取，每次提取时间为2小时，然后合并提取液，-0.09MPa真空度下浓缩至无醇味，获得总提取物。

在步骤S02中，将所述总提取物与水进行混合均匀，使得总提取物中的偏极性成分溶解于水中。

在一实施例中，将所述总提取物与水进行混合均匀的步骤中，所述水的体积至少为所述总提取物体积的3倍，使得所述总提取物中的目标成分能够充分溶解于水中。

在另一实施例中，将所述总提取物与水进行混合均匀的步骤中，一边加入所述总提取物，一边搅拌，以促进目标成分的溶解。

将所述滤液上大孔树脂柱进行梯度洗脱的步骤中，大孔树脂对总提取物中的活性成分按极性大小进一步富集。洗脱时，滤液中的活性成分按极性先大后小的顺序从大孔树脂中被洗脱液洗脱出来，被洗脱出来的活性成分的极性大小与其洗脱液的极性相当。

所述梯度洗脱采用的流动相包括：水、70％-80％醇水溶液和至少一个质量百分比浓度低于70％的醇水溶液，指的是该梯度洗脱采用的流动相多种，可以为水、70％-80％醇水溶液和50％-69％醇水溶液，也可以为水、70％-80％醇水溶液、15％-25％醇水溶液和35％-25％醇水溶液。

在一实施例中，将所述滤液上大孔树脂柱进行梯度洗脱的步骤中，依次采用水、20％醇水溶液、40％醇水溶液和75％醇水溶液进行洗脱，且收集75％醇水溶液洗脱液进行梯度洗脱。

在又一实施例中，将所述滤液上大孔树脂柱进行梯度洗脱的步骤中，梯度洗脱的流速为0.5-2.0倍柱体积。

在另一实施例中，将所述滤液上大孔树脂柱进行梯度洗脱的步骤中，梯度洗脱的温度为45℃-55℃。

收集70％-80％醇水溶液洗脱液的步骤中，美洲大蠊多肽的极性与70％-80％醇水溶液的极性相当，通过采用大孔树脂吸附，使得美洲大蠊多肽被进一步富集纯化。

在一实施例中，收集75％醇水溶液洗脱液。

在另一实施例中，所述大孔吸附树脂优选为D101、LSA-21、AB-8、LX-11、LX-60、XDA-7、LSD-0001、XDA-8E、LX-68M、XDA-8或LSA-700。

在又一实施例中，所述醇水溶液为乙醇水溶液。在又一实施例中，甲醇水溶液。

将所述70％-80％醇水溶液洗脱液进行浓缩至少至无醇味，以获得浓缩液，用于作为水相，便于后续的萃取结晶。

在一实施例中，所述浓缩液的密度为1.10-1.15g/mL。

在步骤S03中，将所述浓缩液与有机溶剂进行混合，进行萃取，收集有机溶剂萃取液。通过萃取使得美洲大蠊多肽与其他杂质进一步分离，提高了产物中美洲大蠊多肽的纯度。

在本发明实施例中，采用乙酸乙酯和石油醚的混合溶剂作为有机溶剂，且所述乙酸乙酯和所述石油醚的混合体积比优选为(1-5):1，更优选为4:1。如此，可充分提纯浓缩液中的美洲大蠊多肽，选择性高，杂质少，利于后续结晶，从而大大提高产品纯度。

在一实施例中，在进行萃取时，温度优选为30℃-55℃，更优选为50℃。在该温度范围下，可保证充分萃取水相中的美洲大蠊多肽，并有利于水相和有机相之间的分层，且萃取温度过高，容易导致溶剂挥发，影响环境和人体安全。

为了尽可能地将目标成分提取完全，在提高纯度的同时能够提高产率，在进行萃取时，采用混合体积比为(2-5):1的乙酸乙酯和石油醚的混合溶剂进行多次重复萃取。

在一具体实施例中，依次采用浓缩液2倍体积、1倍体积和1倍体积的乙酸乙酯-石油醚(体积比为4:1)进行萃取，每次萃取的时间至少为2小时，然后合并有机溶剂萃取液。

将所述有机溶剂萃取液进行结晶，通过析晶的方式对美洲大蠊多肽进一步纯化，进而获得高纯度的美洲大蠊多肽。在本发明实施例中，所述结晶为：

将所述有机溶剂萃取液进行浓缩，直至晶体析出，然后静置于10℃以下的环境中自然析晶。

为使本发明上述实施细节和操作能清楚地被本领域技术人员理解，以及本发明实施例美洲大蠊多肽的进步性能显著地体现，以下通过实施例对本发明的实施进行举例说明。

实施例1

本实施例提供了一种美洲大蠊多肽的制备方法，包括如下步骤：

1、取停止喂食15天后的美洲大蠊成虫，用开水烫1min，晾干，然后均匀地铺在不锈钢盘中，放置于45℃电热鼓风干燥箱中烘48小时，之后置于高速万能粉碎机中进行粉碎，再过10目筛，得到美洲大蠊粉碎物。

2、将美洲大蠊粉碎物(10kg)浸于至少10倍美洲大蠊粉碎物体积的石油醚(300L)中，于50℃下提取2小时，之后以同样方法重复提取一次，然后过滤，之后去除石油醚，得到经过脱脂处理的美洲大蠊，待用。

3、依次采用美洲大蠊8倍体积、6倍体积和8倍体积的75％乙醇水溶液，于50℃下进行高速搅拌提取，每次提取时间为2小时，合并提取液，于60℃、-0.085MPa真空度下进行浓缩至无醇味，获得总提取物。

4、将总提取物加入其至少3倍体积的水中，边加边搅拌，然后过滤，收集滤液；之后，将滤液上LSA-7000大孔树脂柱，依次采用水、20％甲醇水溶液、40％甲醇水溶液和75％甲醇水溶液进行洗脱，洗脱流速为0.8倍柱体积，收集75％甲醇水溶液洗脱液，于50℃、-0.09MPa真空度下浓缩至无醇味，获得浓缩液，密度为1.12g/mL。

5、采用混合体积比为1:1的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂作为有机溶剂，将浓缩液依次采用浓缩液2倍体积、1倍体积和1倍体积的上述有机溶剂进行萃取，每次萃取时间至少为2小时，合并有机溶剂萃取液；然后，将有机溶剂萃取液进行浓缩，待浓缩至所述浓缩液体积的0.5倍时，开始析出晶体，然后，将其静置于10℃以下的环境中自然析晶；之后，收集晶体，洗涤，过滤，干燥，即得。

实施例2

1、取停止喂食15天后的美洲大蠊成虫，用开水烫1min，晾干，然后均匀地铺在不锈钢盘中，放置于55℃电热鼓风干燥箱中烘48小时，之后置于高速万能粉碎机中进行粉碎，再过20目筛，得到美洲大蠊粉碎物。

2、将美洲大蠊粉碎物(20kg)浸于至少10倍美洲大蠊粉碎物体积的石油醚(300L)中，于50℃下提取2小时，之后以同样方法重复提取两次，然后过滤，之后去除石油醚，得到经过脱脂处理的美洲大蠊，待用。

3、依次采用美洲大蠊8倍体积、6倍体积和8倍体积的75％乙醇水溶液，于50℃下进行搅拌提取，每次提取时间为2小时，合并提取液，于60℃、-0.085MPa真空度下进行浓缩至无醇味，获得总提取物。

4、将总提取物加入其至少3倍体积的水中，一边加以搅拌，然后过滤，收集滤液；之后，将滤液上LSA-21大孔树脂柱，依次采用水、20％甲醇水溶液、40％甲醇水溶液和75％甲醇水溶液进行洗脱，洗脱流速为0.8倍柱体积，收集75％甲醇水溶液洗脱液，于50℃、-0.09MPa真空度下浓缩至无醇味，获得浓缩液，密度为1.15g/mL。

5、采用混合体积比为2:1的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂作为有机溶剂，将浓缩液依次采用浓缩液2倍体积、2倍体积和1倍体积的上述有机溶剂进行萃取，每次萃取时间至少为2小时，合并有机溶剂萃取液；然后，将有机溶剂萃取液进行浓缩，待浓缩至有晶体析出时，将其静置于10℃以下的环境中自然析晶；之后，收集晶体，洗涤，过滤，干燥，即得。

实施例3

2、将美洲大蠊粉碎物(40kg)浸于至少10倍美洲大蠊粉碎物体积的石油醚(300L)中，于50℃下提取2小时，之后以同样方法重复提取两次，然后过滤，之后去除石油醚，得到经过脱脂处理的美洲大蠊，待用。

3、依次采用美洲大蠊8倍体积、6倍体积和8倍体积的75％乙醇水溶液，于50℃下进行浸没提取，每次提取时间为2小时，合并提取液，于60℃、-0.085MPa真空度下浓缩至无醇味，获得总提取物。

4、将总提取物加入其至少3倍体积的水中，一边加以搅拌，然后过滤，收集滤液；之后，将滤液上LX-68M大孔树脂柱，依次采用水、20％甲醇水溶液、40％甲醇水溶液和75％甲醇水溶液进行洗脱，洗脱流速为0.8倍柱体积，收集75％甲醇水溶液洗脱液，于50℃、-0.09MPa真空度下浓缩至无醇味，获得浓缩液，密度为1.13g/mL。

5、采用混合体积比为3:1的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂作为有机溶剂，将浓缩液依次采用浓缩液2倍体积、2倍体积和1倍体积的上述有机溶剂进行萃取，每次萃取时间至少为2小时，合并有机溶剂萃取液；然后，将有机溶剂萃取液进行浓缩，待浓缩至所述浓缩液体积的0.5倍时，将其静置于10℃以下的环境中自然析晶；之后，收集晶体，洗涤，过滤，干燥，即得。

实施例4

2、将美洲大蠊粉碎物(50kg)浸于至少10倍美洲大蠊粉碎物体积的石油醚(300L)中，于50℃下提取2小时，之后以同样方法重复提取两次，然后过滤，之后去除石油醚，得到经过脱脂处理的美洲大蠊，待用。

4、将总提取物加入其至少3倍体积的水中，一边加以搅拌，然后过滤，收集滤液；之后，将滤液上LSD-0001大孔树脂柱，依次采用水、20％甲醇水溶液、40％甲醇水溶液和75％甲醇水溶液进行洗脱，洗脱流速为0.8倍柱体积，收集75％甲醇水溶液洗脱液，于50℃、-0.09MPa真空度下浓缩至无醇味，获得浓缩液，密度为1.10g/mL。

5、采用混合体积比为2:1的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂作为有机溶剂，将浓缩液依次采用浓缩液2倍体积、2倍体积和1倍体积的上述有机溶剂进行萃取，每次萃取时间至少为2小时，合并有机溶剂萃取液；然后，将有机溶剂萃取液进行浓缩，待浓缩至所述浓缩液体积的0.5倍时，将其静置于10℃以下的环境中自然析晶；之后，收集晶体，洗涤，过滤，干燥，即得。

实施例5

2、将美洲大蠊粉碎物(80kg)浸于至少10倍美洲大蠊粉碎物体积的石油醚(300L)中，于50℃下提取2小时，之后以同样方法重复提取两次，然后过滤，之后去除石油醚，得到经过脱脂处理的美洲大蠊，待用。

3、依次采用美洲大蠊8倍体积、6倍体积和8倍体积的75％乙醇水溶液，于50℃下进行浸泡提取，每次提取时间为2小时，合并提取液，于60℃、-0.085MPa真空度下浓缩至无醇味，获得总提取物。

4、将总提取物加入其至少3倍体积的水中，一边加以搅拌，然后过滤，收集滤液；之后，将滤液上LSD-0001大孔树脂柱，依次采用水、20％甲醇水溶液、40％甲醇水溶液和75％甲醇水溶液进行洗脱，洗脱流速为0.8倍柱体积，收集75％甲醇水溶液洗脱液，于50℃、-0.09MPa真空度下浓缩至无醇味，获得浓缩液，密度为1.14g/mL。

5、采用混合体积比为4:1的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂作为有机溶剂，将浓缩液依次采用浓缩液2倍体积、2倍体积和1倍体积的上述有机溶剂进行萃取，每次萃取时间至少为2小时，合并有机溶剂萃取液；然后，将有机溶剂萃取液进行浓缩，待浓缩至所述浓缩液体积的0.5倍时，将其静置于10℃以下的环境中自然析晶；之后，收集晶体，洗涤，过滤，干燥，即得。

对比例1

本对比例与实施例5的区别在于：步骤5中的有机溶剂采用乙酸乙酯；其余地方与实施例1基本相同，此处不再一一赘述。

对比例2

本对比例与实施例5的区别在于：步骤5中的有机溶剂采用石油醚；其余地方与实施例1基本相同，此处不再一一赘述。

对比例3

本对比例提供了一种美洲大蠊多肽的制备方法，包括以下步骤：

1、美洲大蠊的脱脂处理：与实施例5的步骤1基本相同；

2、乙醇提取液的制备：与实施例5的步骤2基本相同；

3、取上述由75％乙醇水溶液浸泡提取得到的提取液，于60℃、-0.085MPa真空度下浓缩至相对密度1.09-1.16，然后加入其至少3倍体积的水中，70℃保温搅拌60min，静置12小时，过滤，取滤液；然后，将滤液真空浓缩至相对密度为1.16-1.22的药液，每1000mL加60mL甘油进行保存。

测试例

1、标准曲线的制备

精密称取0.0150g标准品Tyr-leu二肽，加入蒸馏水混合并定容至100mL规格的容量瓶中，超声30min溶解，作为母液；然后，吸取母液稀释配置系列浓度梯度(0-100μg/mL)的Tyr-Leu二肽标准品溶液，以蒸馏水做空白对照，分别于220nm下测定吸光值。

如图1绘制的标准曲线所示，以肽的浓度为横坐标x(μg/mL)，吸光值为纵坐标y,所得直线回归方程为：y＝0.0115x-0.0059，R²＝0.99998，表明Tyr-leu二肽在浓度为6.0μg/mL-35μg/mL内，样品浓度与吸光度线性关系良好。

2、取实施例1-5制备的美洲大蠊多肽作为检测样品，以及对比例1-3得到的提取物作为对照样品，基于上述制备的标准曲线，进行含量检测。

表1为检测结果，结果显示，本发明实施例制备的美洲大蠊多肽的纯度较高，基本在95％以上。

表1

测试例2

本测试例选择实施例5制备的美洲大蠊多肽为例，采用高效体积排阻色谱法测定其分子量分布。

1、实验方法

采用高效体积排阻色谱法测定。即以多孔性填料为固定相，依据样品组分分子体积大小的差别进行分离，在肽键的紫外吸收波长220nm条件下检测，使用相对分子质量分布测定的专用数据处理软件(即GPC软件)，对标准品和样品的色谱图及其数据进行处理，根据相对分子质量校正曲线方程，计算得到蛋白肽的相对分子质量大小及分布范围。

试剂：乙腈(色谱纯)、三氟醋酸(色谱纯)、水，实验用水应符合GB/T 6682中二级用水的规格，使用试剂除特殊规定外，均为分析纯；

标准品：细胞色素C(cytochrome C，MW12384)，杆菌酶(bacitracin，MW1423)，乙氨酸－乙氨酸－酪氨酸－精氨酸(MW451)，乙氨酸－乙氨酸－乙氨酸(MW189)。

仪器和设备：高效液相色谱仪：配有紫外检测器和含有GPC数据处理软件的色谱工作站；流动相真空抽滤脱气装置，超声波振荡器，分析天平：感量0.0001g。

色谱柱：TSKgel G2000SWXL 300mm×7.8mm或性能与此相近的同类型其他适用于测定肽的分子量分布的凝胶柱

流动相：乙腈/水/三氟乙酸，40/60/0.1(V/V)，检测波长：UV220nm，流速：0.5mL/min

柱温：30℃，进样体积：10μL；

为使色谱系统符合检测要求，规定在上述色谱条件下，凝胶色谱柱的柱效即理论塔板数(N)按三肽标准品(乙氨酸－乙氨酸－乙氨酸)峰计算不低于5000。

相对分子质量校正曲线制作：分别用流动相配制成0.1％～0.2％(W/V)的上述不同相对分子质量的肽标准品溶液，用孔径为0.2μm～0.5μm的有机相膜过滤后分别进样，得到系列标准品的色谱图。以相对分子质量的对数(lgMW)对保留时间作图或作线性回归得到相对分子质量校正曲线及其方程。

样品制备：取样品500mg左右于10ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，旋涡混匀1min，离心后微孔过滤膜过滤后供进样。

相对分子质量的计算：将待测的样品溶液在上述色谱条件下进样分析，然后使用GPC数据处理软件，根据相对分子质量校正曲线方程对样品的色谱图及其数据进行计算处理，即可得到样品中蛋白肽的相对分子质量大小及分布范围。用峰面积归一化法计算不同肽段相对分子质量的分布情况。

2、实验结果

检测结果如表2所示，本发明实施例所提供的方法得到的美洲大蠊多肽的分子量集中在1000道尔顿以下，主要为小分子活性肽。

表2

分子量	检测结果(％)
		>10000	1.15
10000-5000	1.98
		5000-2000	4.26
2000-1000	4.15
		1000-500	7.69
500-200	27.59
		<200	53.17

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种美洲大蠊多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

提供水，将所述总提取物与所述水混合，进行水沉，随后过滤，并收集滤液；将所述滤液上大孔树脂柱进行梯度洗脱，所述梯度洗脱采用的流动相包括：水、70％-80％醇水溶液和至少一个质量百分比浓度低于70％的醇水溶液，然后收集所述70％-80％醇水溶液的洗脱液，并浓缩至所述洗脱液体积的0.1倍以下，获得浓缩液；

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，采用40％-90％乙醇水溶液作为提取液进行成分提取的步骤中，提取温度为35℃-75℃；和/或

采用40％-90％乙醇水溶液作为提取液进行成分提取的步骤中，所述提取液与经过脱脂处理的美洲大蠊的体积比为6-8倍。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将所述滤液上大孔树脂柱进行梯度洗脱的步骤中，所述醇水溶液为乙醇水溶液和/或甲醇水溶液；和/或

将所述滤液上大孔树脂柱进行梯度洗脱的步骤中，梯度洗脱的流速为0.5-2.0倍柱体积。

4.根据权利要求1至3任一项所述的制备方法，其特征在于，在所述总提取物与所述水混合均匀的步骤中，所述水的体积至少为所述总提取物体积的3倍。

5.根据权利要求1至3任一项所述的制备方法，其特征在于，在进行所述萃取时，温度为30℃-55℃；和/或

在进行所述萃取时，所述浓缩液与所述有机溶剂的体积比为1:(1-2)。

6.根据权利要求1至3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述脱脂处理采用非极性有机溶剂；

所述非极性有机溶剂选自石油醚、正己烷和环己烷中的至少一种。

7.根据权利要求1至3任一项所述的制备方法，其特征在于，在所述脱油去脂处理之前，对所述美洲大蠊依次进行干燥、粉碎。