CN110922438A

CN110922438A - 一种从金花茶中制备鞣花酸衍生物冲山茶苷的方法

Info

Publication number: CN110922438A
Application number: CN201911154567.3A
Authority: CN
Inventors: 侯媛媛; 白钢; 吴文博; 程传景; 申福葵; 姜民; 高洁
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2019-11-22
Filing date: 2019-11-22
Publication date: 2020-03-27

Abstract

本发明公开了一种从金花茶中制备鞣花酸衍生物冲山茶苷(okicamelliaside,OCS)的方法。该方法是以金花茶(Camellia nitidissima Chi)的老叶为原料，以水煎煮的方式提取总鞣花酸，然后通过大孔吸附树脂富集其中的冲山茶苷，再利用高效制备液相色谱对其进行精制，并获得冲山茶苷单体的方法。所获得的冲山茶苷具有潜在的抗肿瘤、抗氧化、抗过敏等多种药理作用，具有深入开发的价值。

Description

一种从金花茶中制备鞣花酸衍生物冲山茶苷的方法

技术领域

本发明属于化学提取技术领域，涉及金花茶中冲山茶苷的提取制备技术。

背景技术

金花茶Camellia nitidissima Chi为山茶科植物，始载于《本草纲目》，是我国的一级保护植物，主要分布于我国广西壮族自治区防城港一带。金花茶味微苦、涩，性平，具有清热解毒、利尿消肿之功效，主治痢疾、溃疡等，为广西壮族传统用药和新资源食品。金花茶中含有400多种化学成分，其中包括黄酮类、鞣花酸、多糖类、皂苷类、茶多酚、挥发油等生物活性物质,以及糖类、蛋白质、脂肪、纤维素、维生素、氨基酸、矿质元素等营养成分，目前已被开发成为多种制品，被誉为“东方魔茶”、“茶族皇后”。

近年来的研究表明金花茶中的主要成分为鞣花酸类、黄酮类、挥发油、皂苷类等，目前研究最多的主要集中在黄酮类成分，并且主要的研究方向为黄酮类化合物的抗氧化、抗衰老及抗肿瘤等药理作用，而其他类成分的研究相对较少。

现代药理学表明金花茶提取物具有抗肿瘤、抗氧化、降血糖、降血脂和抗过敏等药理作用。有研究报道从金花茶中分离出16种化学成分[Hou XY等.Int J Mol Med.2018, 41(5):2793-2801]，并通过实验证实了金花茶提取物对肿瘤细胞有一定程度上的抑制作用；金花茶花中提取的酰化类黄酮苷具有抑制淋巴肿瘤的作用[Peng X等.JAsian Nat ProdRes. 2012,14(8):799-804]；用不同溶剂萃取金花茶提取物，发现乙酸乙酯萃取层的抗氧化能力最强[Yang R等.PLoS One.2018,13(4):e0195508]；目前已经从金花茶叶和花蕾中提取出多种挥发油，并发现其具有抗氧化和抗菌活性[Wang B等.J Food SciTechnol.2018, 55(12):5075-5081]；此外，研究发现金花茶花中的黄酮类成分对晚期糖基化终产物具有抑制作用[Yang R等.J Food DrugAnal.2018,26(1):252-259]。

金花茶中鞣花酸衍生物的基本结构为鞣花酸母核，在C3、C4、C3’、C4’位有不同的取代基取代，取代基有次甲基、甲基、糖链等。鞣花酸类成分是金花茶中的主要成分，其中冲山茶苷(okicamelliaside)的含量在1％以上。目前已有关于冲山茶苷抗过敏作用的报道[Kobayashi R.等Biosci Biotechnol Biochem.2013,77(4):810-813]，说明其具有深入研究的价值。

中国专利公开了多种金花茶制剂的制备方法[申请号：CN201910452002.7；CN201910524129.5；CN201910243942.5；CN201711405768.7；CN201711405768.7；CN201710774960.7；CN201810032103.4；CN201710332815.3]，包括了颗粒剂、凝胶、药液、纳米颗粒、喷雾等制剂；此外，在食品和保健品方面的专利公开也颇多[申请号：CN201711187797.0；CN201710816365.5；CN201811613815.1；CN201710828999.2；CN201711121164.X；CN201711405755.X；CN201811501453.7；CN201910318657.5；CN201711208284.3；CN201710997872.3；CN201711189206.3；CN201711189129.1；CN201711009732.7]；在药理功能方面也分别公开了抗鼻咽癌[申请号：CN201910044932.9]、抗焦虑[申请号：CN201510267358.5]、治疗高脂血症[申请号：CN201711200451.X]、治疗糖尿病[申请号：CN201711188828.4]、治疗胃癌[申请号：CN201711188995.9]等的专利。

在金花茶的提取分离方面，中国专利公开了金花茶中黄酮类成分的提取方法[申请号： CN201910544700.X；CN201910544707.1；CN201810041888.1]，分别公开了采用乙醇浸提、超声波辅助提取、超临界流体萃取等的工艺对黄酮类成分进行提取；通过水煮得到水提物，再通过大孔吸附树脂对皂苷类成分进行分离[申请号：CN201711189264.6]；利用水解酶对金花茶粉进行水解，再通过超声萃取并沉淀蛋白，进一步通过柱层析的方法制备多糖[申请号：CN201810046711.0]；通过乙醇水溶液回流提取金花茶，并利用不同截留分子量的中空纤维膜、弱极性大孔吸附树脂对提取液进行处理，制备多酚类物质[申请号：CN201510573856.2]；以及对金花茶粉进行脱脂预处理、提取、醇沉、纯化得到多糖肽[申请号：CN201810034515.1]等的工艺方法。

关于金花茶中鞣花酸类成分冲山茶苷的制备方法尚未见报道，影响了其药用价值的开发。

发明内容

本发明目的是为了获取金花茶中的鞣花酸类主要成分冲山茶苷，设计并公开了从防城港普通种金花茶Camellia nitidissima Chi的树叶中制备高纯度冲山茶苷的工艺和方法。

本发明的技术方案

一种从金花茶中制备鞣花酸衍生物冲山茶苷的方法，包括：

1)、以金花茶叶为原料，特别是以山茶科植物防城港普通种金花茶Camellianitidissima Chi的老叶(颜色偏黄、质地硬厚)为原料，以水煎煮的方式提取叶中水溶性鞣花酸成分，提取条件限定在：采用100度的水煎煮提取，提取液料比在5:1至10:1之间，提取次数在 1至3次之间，提取时间在0.5至1.5小时之间；最优条件为：液料比6.6:1，提取次数1次，提取时间0.66小时。提取液浓缩至溶液密度为1.1，经70％乙醇沉淀除去多糖，过滤取上清，经浓缩干燥得到总鞣花酸粗提物。采用该方法，所得粗提物中冲山茶苷的含量可以达到19％。

2)、利用AB-8大孔吸附树脂富集后采用高效制备液相对大孔吸附树脂粗提物精制的纯化；

采用大孔吸附树脂富集冲山茶苷，所述的大孔吸附树脂限定为AB-8型大孔吸附树脂，上样量限定为：固含量为1％粗提物溶液，上样体积不超过柱体积的10倍；洗脱体系限定为乙醇-水二元体系，洗脱梯度为：10％乙醇溶液平衡洗脱体系，20％乙醇溶液洗脱主要的鞣花酸(冲山茶苷)馏分，30％至40％乙醇溶液进行平衡再生。收集20％的乙醇洗脱馏分，所得纯化产物中冲山茶苷的含量可以达到37％。

3)、选用C18色谱柱的高效制备液相色谱制备冲山茶苷，其中优选PhenomenexLuna C18色谱柱(5μm,250mm×21.2mm)。洗脱体系为甲醇(B)-纯水(A)二元梯度洗脱的体系，二元梯度洗脱程序：0～7分钟，10％～25％B；7～20分钟，25％～40％B；20～35分钟，40％～48％B； 35～36分钟，48％～100％B；36～45分钟，100％～100％B。流速：9毫升/分钟，进样量：500 微升，柱温：25度；收集16.5分钟至18分钟的洗脱馏分(甲醇浓度：35.9％至37.7％)。所得冲山茶苷的纯度在98％以上。

4)、所制备的金花茶中主要成分为冲山茶苷，经质谱法和核磁法鉴定，其结构如下化学式所示：

本发明的优点和有益效果：

本发明提供的金花茶中冲山茶苷的制备方法，选用水煎煮的方法提取金花茶叶，所得总鞣花酸粗提物通过70％乙醇沉除去多糖，通过大孔吸附树脂富集得到总鞣花酸粗品，再经高效制备液相色谱进一步纯化获得高纯度单体，其纯度在98％以上。所获得的冲山茶苷具有潜在的抗肿瘤、抗氧化、抗过敏等多种药理作用，具有深入开发的价值。

附图说明

图1是金花茶叶中冲山茶苷的含量检测图。其中(a)为金花茶提取物与冲山茶苷标品的 HPLC对比图，其中(b)为80批次金花茶中冲山茶苷的含量分布图。

图2是金花茶中冲山茶苷的提取工艺优化图。

图3是AB-8大孔树脂富集冲山茶苷的效果图。其中(a)为AB-8大孔吸附树脂富集冲山茶苷的流出曲线图，(b)为AB-8大孔吸附树脂不同的洗脱液中冲山茶苷的HPLC含量对比图。

图4是冲山茶苷的高效制备液相的制备图。

图5是冲山茶苷制备工艺图，其中(a)为冲山茶苷制备工艺流程图，(b)为所制备冲山茶苷的HPLC检测图。

图6是冲山茶苷的液质鉴定图。其中(a)为UPLC-Q/TOF MS负离子模式下的总离子流图，(b)为冲山茶苷负离子模式下的二级质谱裂解碎片图。

图7是冲山茶苷的核磁鉴定图。其中(a)为核磁氢谱图，(b)为核磁碳谱图。

图8是冲山茶苷的核磁二维谱图。

具体实施方式

实施例1：金花茶叶中冲山茶苷的含量检测

取80批广西防城港普通种金花茶叶(Camellia nitidissima Chi)，粉碎，分别称重，按 10:1比例(V/W)加入50％甲醇溶液，超声提取30分钟，3600转离心10分钟，取上清，采用岛津LC-15C(日本)液相色谱仪检测其中冲山茶苷的含量。

HPLC色谱条件：Phenomenex Luna C18色谱柱(5μm,250mm×4.6mm)；流速1.0毫升/分钟；紫外检测器，检测波长254nm；样品进样量：20.0微升；柱温35度；流动相：A 为0.1％甲酸-水溶液，B为乙腈；二元梯度洗脱：0～5分钟，2％～20％B；5～7分钟，20％～25％B； 7～40分钟，25～35％B；40～45分钟，35％～100％B。

结果如图1所示，80批金花茶叶中冲山茶苷的含量有所不同，其最高含量可达1.8％，最低的仅为0.2％，其含量平均在1％左右。相比于颜色偏绿、质地较薄的新叶(灰)，颜色偏黄、质地厚硬的老叶(黑)中冲山茶苷的含量较高。

实施例2：金花茶中冲山茶苷提取工艺的优化

利用响应曲面试验优化提取条件，选取颜色偏黄、质地偏厚的老叶作为提取原料，进行提取条件的考察，综合考察提取液料比、提取次数、提取时间对提取效率的影响。并通过实施例1的HPLC法考察提取液中冲山茶苷的提取情况。

首先通过单因素试验确定液料比、次数和时间三个因素的范围，再通过响应面实验确定最佳提取条件。具体响应曲面设计方案及试验结果见表1。

表1.响应曲面设计方案及试验结果

结果如图2所示，根据中心复合设计响应曲面试验，最终确定得到冲山茶苷的最佳提取条件为：液料比6.6:1，提取次数1次，时间0.66小时。

实施例3：利用优化条件提取金花茶叶中的鞣花酸衍生物

选取防城港普通种的金花茶老叶1.12千克，粉碎，加入7.4升水，按上述实施例2所述最优提取条件，对金花茶叶进行加热提取40分钟。采用100目不锈钢筛趁热过滤，滤液经闪蒸仪(JMF-320，西安)浓缩至密度1.1的混悬液，约2.5升。再向上述混悬液中加入乙醇，调整溶液中乙醇的比例至70％，混匀后静置过夜，沉淀多糖。过滤取上清，采用闪蒸仪减压浓缩后得总鞣花酸粗提物74.4克，检测其中冲山茶苷的含量为19.2％。

实施例4：利用AB-8大孔吸附树脂富集金花茶水提物中的冲山茶苷

取上述实施例3的粗提物70克，加入蒸馏水7升溶解，配制成固含量约1％的溶液，并上样AB-8大孔吸附树脂柱(直径：5.5厘米；柱高：35厘米，柱体积约830毫升)，流速 2毫升/分钟。经10％的乙醇溶液平衡后，分别以不同浓度的乙醇溶液(20％→30％→40％乙醇)梯度洗脱，流速1毫升/分钟。每500毫升分别收集洗脱液，并采用HPLC检测其中冲山茶苷的洗脱情况。

结果如图3所示，20％乙醇洗脱部分的冲山茶苷含量最高。因此收集20％乙醇洗脱部分，减压浓缩后得到冲山茶苷的粗提物1.1克。

实施例5：利用高效制备液相色谱制备冲山茶苷

取上述实施例4所得的冲山茶苷的粗提物1克，加入20毫升水溶解，3600转离心10分钟，取上清，配制成约50毫克/毫升的溶液。采用高效制备液相色谱法对冲山茶苷进行进一步纯化制备。选用CoMetro高效制备液相色谱仪(美国)，选用Phenomenex Luna C18 色谱柱(5μm,250mm×21.2mm)；流速9毫升/分钟；CoMetro紫外检测器(美国)，检测波长 254nm；样品进样量：500微升；柱温35度；流动相：A为纯水，B为甲醇；二元梯度洗脱：0～7分钟，10％～25％B；7～20分钟，25％～40％B；20～35分钟，40％～48％B；35～36 分钟，48％～100％B；36～45分钟，100％～100％B。

采用实施例1的HPLC色谱条件检测冲山茶苷的制备效果。如图4所示，收集含量较高的色谱峰馏分(16.5分钟至18分钟，甲醇比例：35.9％至37.7％)，减压浓缩干燥后制得冲山茶苷。通过上述实施例3、实施例4及本实施例中所述方法，最终得到冲山茶苷6.6 毫克，纯度在98％以上(图5)。

实施例6：冲山茶苷的结构确证

分别采用UPLC-Q/TOF MS液质联用仪和核磁法，鉴定实施例5中所制备的冲山茶苷，具体条件如下：

UPLC-Q/TOF实验条件：

1)色谱条件：

色谱柱Waters ACQUITY

BEH C18色谱柱(2.1×100mm,1.7μm)；流速0.4毫升/ 分钟；PAD检测器，检测波长254nm；样品进样量：3.0微升；柱温：30度；流动相：A 为0.1％甲酸-水溶液，B为乙腈；二元梯度洗脱：0～3分钟，5％～20％B；3～5分钟，20％～25％B； 5～10分钟，25％～27％B；10～18分钟，27％～100％B；18～20分钟，100％B。

2)质谱条件：

离子源为软电离模式ESI电喷雾离子源，数据采集工作站为Waters MassLynx 4.1工作站。在负离子模式下，毛细管电压2.5kV；离子源温度110度；锥孔电压30V；雾化气高纯氮气的流速为600L/小时，雾化器温度设定为350度；离子质量扫描范围50～1500Da，扫描频率0.1秒，扫描间隔延时0.02秒；校正液采用亮氨酸脑啡肽([M-H]^-＝553.2775)。

结果如图6所示，负离子模式下冲山茶苷的m/z为475，特征碎片为[M-H]^-475.0505， [2M-H]^-951.1107，[M-Glu]^-312.9997。

采用全数字核磁共振仪(Bruker 400M)进行核磁鉴定，结果见图7和图8。其氢谱和碳谱的具体数据如下：

¹HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.54(s,1H),7.42(s,1H),6.32(d,J＝2.6Hz,2H),4.99(d,J＝4.0Hz,1H),4.92(d,J＝5.0Hz,1H),4.64(t,J＝5.8Hz,1H),4.47(d,J＝7.0Hz,1H),3.70(dd,J＝11.5,5.0Hz,2H),3.48(dd,J＝11.8,5.9Hz,2H),3.15(qd,J＝9.9,9.5,3.7Hz,4H).

¹³C NMR(1010MHz,DMSO-d6)δ159.9,158.5,150.5,149.8,138.4,137.7,132.4,118.9, 117.1,115.5,112.8,105.8,103.8,102.7,94.8,92.8,77.5,76.9,73.6,69.6,60.9。

Claims

1.一种从金花茶老叶中制备鞣花酸衍生物冲山茶苷(okicamelliaside)的方法，其特征在于，该方法通过响应曲面试验优化金花茶叶提取条件，制备其中的鞣花酸衍生物；以金花茶叶为原料，通过水煎煮的方法提取叶中水溶性鞣花酸成分，并利用AB-8大孔吸附树脂富集后采用高效制备液相对大孔吸附树脂粗提物精制的纯化工艺，最终得到含量大于98％的鞣花酸衍生物冲山茶苷。

2.根据权利要求1所述的从金花茶中制备鞣花酸衍生物冲山茶苷的方法，其特征在于，所述的金花茶叶为山茶科植物Camellia nitidissima Chi防城港普通种的叶子，选择颜色偏黄、质地硬厚的老叶。

3.根据权利要求1所述的从金花茶中制备鞣花酸衍生物冲山茶苷的方法，其特征在于，所述水煎煮提取条件限定在：采用100度的水煎煮提取，提取液料比在5:1至10:1之间，提取次数在1至3次之间，提取时间在0.5至1.5小时之间。

4.根据权利要求3所述的从金花茶中制备鞣花酸衍生物冲山茶苷的方法，其特征在于，所述提取条件为：液料比6.6:1，提取次数1次，提取时间0.66小时。

5.根据权利要求1所述的从金花茶中制备鞣花酸衍生物冲山茶苷的方法，其特征在于，水提液浓缩至溶液密度为1.1后经70％乙醇溶液沉淀多糖，过滤取上清，经浓缩干燥得到总鞣花酸粗提物，所得粗提物中冲山茶苷的含量达到19％；浓缩后再采用大孔吸附树脂富集其中的冲山茶苷；所使用的大孔吸附树脂限定为AB-8型，洗脱体系限定为乙醇-水二元体系，洗脱梯度为：10％乙醇溶液平衡上样体系，20％乙醇溶液洗脱主要鞣花酸馏分，采用30％至40％的乙醇溶液进行平衡再生；收集20％的乙醇洗脱馏分，所得纯化产物中冲山茶苷的含量达到37％。

6.根据权利要求1所述的从金花茶中制备鞣花酸衍生物冲山茶苷的方法，其特征在于，所述高效制备液相色谱限定在选用C18色谱柱的制备色谱系统。

7.根据权利要求6所述的从金花茶中制备鞣花酸衍生物冲山茶苷的方法，其特征在于，所述的色谱柱为Phenomenex Luna C18色谱柱，色谱柱规格：5μm,250mm×21.2mm，二元梯度洗脱体系，流动相A：纯水，流动相B：甲醇；洗脱程序：0～7分钟，10％～25％B；7～20分钟，25％～40％B；20～35分钟，40％～48％B；35～36分钟，48％～100％B；36～45分钟，100％～100％B平衡；流速：9毫升/分钟，进样量：500微升，柱温：25度；收集16.5分钟至18分钟，即甲醇浓度在35.9％至37.7％的洗脱馏分。

8.根据权利要求7所述的从金花茶中制备鞣花酸衍生物冲山茶苷的方法，其特征在于，所制备的冲山茶苷的纯度为98％以上，结构式如下：