CN104262445A - 金花茶皂苷a及其制备方法和抗肿瘤用途 - Google Patents
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Abstract
金花茶中分离出新的金花茶皂苷A化合物及其制备方法，以及该化合物在抗肿瘤中的应用。本发明对金花茶分离得到了一种达玛烷皂苷类新化合物，新化合物命名为(3β,6α,12β)-3,6,12-三羟基达玛烷-24-烯-20-甲基-2-O-β-D-吡喃葡萄糖-(2→1)-O-β-D-吡喃葡萄糖-(2→1)-O-α-L-吡喃鼠李糖苷[(3β,6α,12β)-3,6,12-trihydroxydammar-24-en-20-yl- 2-O -β-D-glucopyranosyl-(2→1)-O-β-D-glucopyranosyl-(2→1)-O-α-L-Rhamnopyranoside]，本发明采用CCk-8法对此新化合物进行了抗肿瘤活性检测，实验结果显示此化合物具有抑制人肺癌BeL-7402细胞、SMMC-7721等生长的活性。
Description
技术领域
本发明涉及一种从金花茶(Camellia chrysanth(Hu)Tuyama)中分离出的新的金花茶皂苷A化合物及其制备方法，以及该化合物在抗肿瘤应用。
背景技术
金花茶(Camellia chrysanth(Hu)Tuyama)是山茶科，山茶属，金花茶组，金花茶系植物。为常绿灌木或小乔木。主产于中国广西境内北回归线以南的两间断地区，1933年7月29日，我国植物学家左景烈在广西防城县大菉多阿泄隘最先发现金花茶，在已发现的23种金花茶中有21种生长在防城港，金花茶被列为国家一级保护珍稀植物。金花茶具有极高的观赏价值外，同时还具有很高的药用价值。含有多种保健成份，一直被民间作清热解毒、利尿利湿、止痢止血等使用。金花茶中含有的主成分金花茶皂苷，皂苷类成分对人体的新陈代谢也起着重要的生理作用。它可以抑制血清中脂类氧化，抑制过氧化脂质生成。降低血清中胆固醇的含量，抑制过氧化脂质对肝脏的损伤，防止动脉硬化，因而它具有抗衰老的作用。同时皂苷还具有免疫调节作用，增强机体免疫力。皂苷对核酸和蛋白质合成有促进作用，可增加肝、肌肉组织中蛋白质与DNA的含量，提高机体的耐力。
在金花茶皂苷技术领域，申请人检索到如下两篇相关的技术文献：
文献1：题名：《金花茶叶皂苷类成分研究》，作者：苏琳,莫建光,韦英亮等；刊物：《中草药》，2012,43(5)，877-879。
该文献研究了金花茶Camellia ；euphlebia叶皂苷类成分。方法利用超声提取、大孔树脂富集以及制备色谱对金花茶叶水溶性部分进行分离纯化,运用NMR、MS、IR等光谱手段进行结构鉴定。结果分离得到3个单体化合物,分别为人参皂苷Rg1(1)、人参皂苷F1(2)和人参皂苷F5(3)。结论化合物1～3均为首次从该植物中分离得到的人参皂苷,其中人参皂苷Rg1、F5为首次从山茶属中分离得到。金花茶为国家一级保护的珍稀药用植物,这些成分的分离鉴定对其进一步的活性研究、开发利用和推广种植具有重要意义。但该文献分离得到的人参皂苷Rg1(1)、人参皂苷F1(2)和人参皂苷F5(3)三种化合物均是前人研究已经定性的化合物，对金花茶的深度开发作用有限。
文献2：题名：《金花茶皂甙的分离纯化及化学结构研究》；作者：曾秋文；刊物：广东海洋大学硕士论文，2010年。
该文献研究以金花茶叶为实验材料提取其中的皂甙成分,然后筛选分离树脂纯化,对皂甙进行分离纯化。通过抗氧化指标比较皂甙组分的抗氧化活性,并对抗氧化活性最高的皂甙组分进行进一步的分离纯化,分析其理化性质,为金花茶皂甙的构效关系研究提供理论依据。
研究的主要内容及结果如下:
1、以新鲜金花茶叶为原料,经过微波灭酶后进行组织破碎,采用超声波浸提及纳米超滤等方法进行提取和浓缩,得到金花茶浓缩液。金花茶浓缩液经过乙醇沉淀去杂、乙醚脱色得到粗皂甙提取液。试验结果显示金花茶粗皂甙提取液中主要含有皂甙并含有少量的茶多酚,皂甙含量约为茶多酚的10倍。
2、通过静态吸附率和解吸率等指标比较了聚酰胺树脂、XAD16、DM130和XAD1600等4种树脂对金花茶粗皂甙分离的效果,并选择XAD16作为分离树脂对金花茶粗皂甙进行分离纯化。分离纯化结果:在水以及10％、20％和30％异丙醇洗脱液处分别得到了WS、IS1、IS2、IS3等4个皂甙组分。各皂甙组分的得率分别为34.8％、9.1％、20.3％、31.8％,皂甙总得率达96.0％。高效液相色谱分析结果显示,相对于粗皂甙,各皂甙组分的吸收峰数量明显减少,表明XAD16大孔吸附树脂层析柱可以有效将金花茶粗皂甙分离出极性不同的皂甙组分。
3、以维生素C为参照物,通过羟基自由基清除试验、超氧阴离子清除试验、DPPH·自由基清除试验、磷钼络合物法等4种不同的抗氧化试验,比较了粗皂甙、WS、IS1、IS2、IS3等皂甙组分的抗氧化活性。结果显示,各皂甙组分均有明显的抗氧化活性,在清除羟基自由基实验中,IS1的清除率为66.5％,比维生素C及其他三个皂甙组分高；在DPPH·自由基清除试验中,IS1的清除率为96.3％,接近同浓度维生素C的清除率100％；在清除超氧阴离子的实验中,IS1的清除率达到64.7％,比皂甙组分IS2、IS3高；在磷钼络合物法实验中,IS1的抗氧化活性比皂甙组分IS2、IS3高37.1％、39.8％,可以看出IS1的抗氧化活性较为显著。
4、通过XAD1600柱层析和聚酰胺柱层析对抗氧化活性最高的皂甙组分IS1进行进一步的分离纯化,得到IS1A皂甙组分。高效液相色谱分析结果显示,IS1A出现唯一一个尖锐的峰,表明IS1A为单一化合物。抗氧化活性分析结果显示,IS1A的抗氧化活性较IS1高出10％左右,表明IS1A是主要的功效因子。颜色反应及构成糖薄层层析分析结果显示,IS1A是含有葡萄糖和半乳糖的三萜类皂甙。对于具体的化学结构有待进一步分析。
但是该文献的研究因其工艺比较粗糙，虽然得到了WS、IS1、IS2、IS3等4个皂甙组分，但因其组分比较复杂，纯度不够，无法确定其组分的具体成分和结构。
发明内容
本发明是针对本领域以上现有研究的不足，提供一种以金花茶为原料，制备的金花茶皂苷A及其制备方法，以及金花茶皂苷A的抗肿瘤用途。本发明的具体方案如下：
金花茶皂苷A，其化学名称为：(3β,6α,12β)-3,6,12-三羟基达玛烷-24-烯-20-甲基-2-O-β-D-吡喃葡萄糖-(2→1)-O-β-D-吡喃葡萄糖-(2→1)-O-α-L-吡喃鼠李糖苷，其化学结构式为：
该化合物为白色针状晶体；溶解性：溶于甲醇、乙醇，微溶于水，不溶于石油醚、氯仿；熔点范围：192℃～197℃；其分子式为：C48H82O18；分子量为：946；重金属(以pb计)：≤5.0mg/Kg；灰分：≤0.2％；水分：≤0.5％；有关物质：≤5.0％。
该化合物的英文名称为：(3β,6α,12β)-3,6,12-trihydroxydammar-24-en-20-yl2-O-β-D-glucopyranosyl-(2→1)-O-β-D-glucopyranosyl-(2→1)-O-α-L-Rh amnopyranoside。
以上化合物，申请人目前没有发现相同结构、且理化性能相同的物质。
本发明的另一目的是提供以上所述的金花茶皂苷A的制备方法，包括以下步骤：
(1)原料提取：以金花茶为原料，经甲醇-水或乙醇-水溶液提取获得金花茶提取液；
(2)大孔树脂处理金花茶提取液：将金花茶提取液浓缩后加水溶解，并经大孔树脂吸附获得大孔树脂吸附物；
(3)金花茶粗皂甙的制备：然后将大孔树脂吸附物经一次柱层析分离得到金花茶粗皂甙；
(4)由金花茶粗皂甙制备金花茶皂苷A：最后将金花茶粗皂甙再经二次柱层析分离即可得到单一高纯度的化合物，经结构测定确认为金花茶皂苷A。
经过两次柱层析分离，得到的单一化合物纯度高达95％以上，否则将会引如大量费同类化合物的杂质，也就不可能将目标化合物分离出来。
以上所述的大孔吸附树脂为XAD-16、D101、AB-8、HP-20中的一种；所述的一次柱层析分离和二次柱层析分离所用的担体均为硅胶。经试验证明选用以上树脂和担体，能提高分离效率，单次分离的时间较背景文献1和2缩短5小时以上。
以上所述的二次柱层析分离为：将金花茶粗皂甙浓缩至干，干法上担体进行柱层析分离，用体积比为15～25:1～4的氯仿-甲醇进行洗脱，然后对洗脱液进行薄层色谱检测，合并123～162流份并浓缩得浓缩液，将浓缩液再上担体进行柱层析分离，重复二次柱层析分离步骤一次，最后得到的浓缩液静止结晶后即可得到金花茶皂苷A。申请人经过大量的探索试验，通过本发明特定流份技术方案的选取，方可得到高纯度金花茶皂苷A，流份选取过宽或与前述流份数值交叉，都将引入较多的同类杂质。
以上所述的一次柱层析分离为：将大孔树脂吸附物浓缩至干，干法上担体进行柱层析分离，用体积比为15～25:1～4的氯仿-甲醇进行洗脱，然后取洗脱液进行薄层色谱检测，合并123～162流份并浓缩得浓缩液，将浓缩液浓缩至干得到金花茶粗皂甙。
以上所述的金花茶是指是山茶科山茶属金花茶组金花茶系植物的根、茎、叶，并将金花茶的根、茎、叶切成1-3cm长。
以上所述的原料提取步骤中使用的设备为：超声波提取器；提取的固液比为1:10～20；提取条件为40℃～80℃条件下以15-35KHz浸提1-5h。
以上所述的甲醇-水或乙醇-水溶液中甲醇或乙醇与水的体积比为：50～95:50～5。通过甲醇或乙醇与水的体积比的选择，能有效提高原料的超声波提取率，分别较甲醇、乙醇或水单一溶液的提取率分别提高了10％，10％，5％。
进一步的，以上所述大孔树脂吸附物浓缩至干为：将大孔树脂吸附物用水洗脱5个柱体积，然后用70％的乙醇洗脱，收集70％乙醇部分，蒸干后即得金花茶总皂苷。
薄层色谱法是一种吸附薄层色谱分离法，其主要原理是吸附力与分配系数的不同，使混合物得以分离。当溶剂沿着吸附剂移动时，带着样品中的各组分一起移动，同时发生连续吸附与解吸作用以及反复分配作用。由于各组分在溶剂中的溶解度不同，以及吸附剂对它们的吸附能力的差异，最终将混合物分离成一系列斑点。各种物质的迁移值(Rf)随要分离化合物的结构，薄层板的种类、溶剂、温度等不同而不同，但在条件固定的情况下，Rf对每一种化合物来说是一个特定数值。因此，可用薄层色谱法来鉴定经柱层析分离的各流份中的化合物成分，根据Rf值的大小来合并Rf值相同的流份。
本发明的再一目的是提供所述的金花茶皂苷A在制备抗肿瘤药物中的应用。经系列试验研究证明，金花茶皂苷A具备抗肿瘤的功效，完全能开发这一天然分离物质并将其应用到抗肿瘤药物的制备应用中。
本发明具有以下有益效果：
1.从金花茶中分离出一种目前没有发现相同结构、且理化性能的物质相同的化合物——金花茶皂苷A。
2.在分离提取工艺上，选择经过两次柱层析分离，得到的单一化合物纯度高达95％以上，否则将会引如大量非同类化合物的杂质，也就不可能将目标化合物分离出来。
3.在分离提取工艺上，通过本发明特定流份技术方案的选取，方可得到高纯度金花茶皂苷A，流份选取过宽或与前述流份数值交叉，都将引入较多的同类杂质。
4.在分离提取工艺上，通过甲醇或乙醇与水的体积比的选择，能有效提高原料的超声波提取率，分别较甲醇、乙醇或水单一溶液的提取率分别提高了10％，10％，5％。
附图说明
图1金花茶皂苷A的结构式
图2金花茶皂苷A的IR图谱
图3金花茶皂苷A的ESI-MS图谱
图4金花茶皂苷A的1HNMR图谱
图5金花茶皂苷A的13C NMR图谱
图6金花茶皂苷A的DEPT135图谱
图7金花茶皂苷A的HHCOSY图谱
图8金花茶皂苷A的TOCSY图谱
图9金花茶皂苷A的HSQC图谱
图10金花茶皂苷A的HMBC图谱
图11添加金花茶皂苷A对人肝癌Bel-7402细胞和SMMC-7721细胞生长的影响曲线图
图12金花茶皂苷A处理48h对人肝癌BeL-7402细胞和SMMC-7721细胞生长的影响曲线图
具体实施方式
一、金花茶皂苷A的制备
1.仪器与试剂
仪器：智能超声波提取器(上海之信仪器有限公司)。
旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)
Waters2695高效液相色谱仪(美国沃特斯公司)
Nicolet 4700傅里叶变换红外光谱仪(KBr压片，Nicolet公司)
紫外分光光度计(Thermo公司)
AV600核磁共振波谱仪(瑞士Bruker公司)
高分辨飞行时间质谱仪(瑞士Bruker公司)
试剂：XAD-16型大孔吸附树脂(天津市海光化工有限公司)
D101大孔吸附树脂(南开大学化工厂)
AB-8大孔吸附树脂(南开大学化工厂)
HP-20大孔吸附树脂(日本三菱)
色谱柱及薄层色谱用硅胶(大连海洋化工厂)
HPLC分析用甲醇、乙腈为色谱纯(默克股份两合公司)；
水为纯净水；
其余未特别说明的试剂均为分析纯。
2.原料准备
金花茶采自广西防城港市十万大山兰山地区、防城大王江、天峨龙滩库区，宁明县那陶大山，经广西中医药研究院赖茂祥研究员鉴定，将金花茶叶、根、茎洗净后自然阴干，切成1-3cm长，备用。
实施例1
将已经准备好选自广西防城港市十万大山兰山地区金花茶原料投入超声波提取器，按照固液比为1:10的比例投入体积比为50:50甲醇-水溶液，然后在条件为40℃条件下以15KHz浸提1h，得到金花茶提取液。
将金花茶提取液浓缩后加水溶解，并经大孔树脂XAD-16吸附获得大孔树脂吸附物。
将大孔树脂吸附物用水洗脱5个柱体积，然后用70％的乙醇洗脱，收集70％乙醇部分，蒸干后即得金花茶总皂苷；然后将金花茶总皂苷上硅胶担体进行一次柱层析分离，用体积比为15:1氯仿-甲醇洗脱，然后取洗脱液进行薄层色谱检测，合并123～162流份并浓缩得浓缩液，将浓缩液浓缩至干得到金花茶粗皂甙。
将金花茶粗皂甙浓缩至干，干法上硅胶担体进行柱层析分离，用体积比为15:1的氯仿-甲醇进行洗脱，然后对洗脱液进行薄层色谱检测，合并123～162流份并浓缩得浓缩液，将浓缩液再上担体进行柱层析分离，重复二次柱层析分离步骤一次，最后得到的浓缩液静止结晶后即可得到单一高纯度的化合物1。经HPLC检测、归一化法定量，含量：95.1％。
实施例2
将已经准备好选自防城大王江金花茶原料投入超声波提取器，按照固液比为1:12的比例投入体积比为55:45乙醇-水溶液，然后在条件为50℃条件下以20KHz浸提2h，得到金花茶提取液。
将金花茶提取液浓缩后加水溶解，并经大孔树脂D101吸附获得大孔树脂吸附物。
将大孔树脂吸附物用水洗脱5个柱体积，然后用70％的乙醇洗脱，收集70％乙醇部分，蒸干后即得金花茶总皂苷；然后将金花茶总皂苷上硅胶担体进行一次柱层析分离，用体积比为17:2氯仿-甲醇洗脱，然后取洗脱液进行薄层色谱检测，合并123～162流份并浓缩得浓缩液，将浓缩液浓缩至干得到金花茶粗皂甙。
将金花茶粗皂甙浓缩至干，干法上硅胶担体进行柱层析分离，用体积比为17:2的氯仿-甲醇进行洗脱，然后对洗脱液进行薄层色谱检测，合并123～162流份并浓缩得浓缩液，将浓缩液再上担体进行柱层析分离，重复二次柱层析分离步骤一次，最后得到的浓缩液静止结晶后即可得到单一高纯度的化合物2。经HPLC检测、归一化法定量，含量：95.6％。
实施例3
将已经准备好选自天峨龙滩库区金花茶原料投入超声波提取器，按照固液比为1:14的比例投入体积比为60:40甲醇-水溶液，然后在条件为60℃条件下以25KHz浸提3h，得到金花茶提取液。
将金花茶提取液浓缩后加水溶解，并经大孔树脂AB-8吸附获得大孔树脂吸附物。
将大孔树脂吸附物用水洗脱5个柱体积，然后用70％的乙醇洗脱，收集70％乙醇部分，蒸干后即得金花茶总皂苷；然后将金花茶总皂苷上硅胶担体进行一次柱层析分离，用体积比为20:3氯仿-甲醇洗脱，然后取洗脱液进行薄层色谱检测，合并123～162流份并浓缩得浓缩液，将浓缩液浓缩至干得到金花茶粗皂甙。
将金花茶粗皂甙浓缩至干，干法上硅胶担体进行柱层析分离，用体积比为20:3的氯仿-甲醇进行洗脱，然后对洗脱液进行薄层色谱检测，合并123～162流份并浓缩得浓缩液，将浓缩液再上担体进行柱层析分离，重复二次柱层析分离步骤一次，最后得到的浓缩液静止结晶后即可得到单一高纯度的化合物3。经HPLC检测、归一化法定量，含量：95.5％。
实施例4
将已经准备好选自宁明县那陶大山金花茶原料投入超声波提取器，按照固液比为1:16的比例投入体积比为65:35乙醇-水溶液，然后在条件为70℃条件下以30KHz浸提4h，得到金花茶提取液。
将金花茶提取液浓缩后加水溶解，并经大孔树脂HP-20吸附获得大孔树脂吸附物。
将大孔树脂吸附物用水洗脱5个柱体积，然后用70％的乙醇洗脱，收集70％乙醇部分，蒸干后即得金花茶总皂苷；然后将金花茶总皂苷上硅胶担体进行一次柱层析分离，用体积比为22:4氯仿-甲醇洗脱，然后取洗脱液进行薄层色谱检测，合并123～162流份并浓缩得浓缩液，将浓缩液浓缩至干得到金花茶粗皂甙。
将金花茶粗皂甙浓缩至干，干法上硅胶担体进行柱层析分离，用体积比为22:4的氯仿-甲醇进行洗脱，然后对洗脱液进行薄层色谱检测，合并123～162流份并浓缩得浓缩液，将浓缩液再上担体进行柱层析分离，重复二次柱层析分离步骤一次，最后得到的浓缩液静止结晶后即可得到单一高纯度的化合物4。经HPLC检测、归一化法定量，含量：95.2％。
实施例5
将已经准备好选自广西防城港市十万大山兰山地区金花茶原料投入超声波提取器，按照固液比为1:18的比例投入体积比为70:30甲醇-水溶液，然后在条件为80℃条件下以35KHz浸提1.5h，得到金花茶提取液。
将金花茶提取液浓缩后加水溶解，并经大孔树脂XAD-16吸附获得大孔树脂吸附物。
将大孔树脂吸附物用水洗脱5个柱体积，然后用70％的乙醇洗脱，收集70％乙醇部分，蒸干后即得金花茶总皂苷；然后将金花茶总皂苷上硅胶担体进行一次柱层析分离，用体积比为25:1.5氯仿-甲醇洗脱，然后取洗脱液进行薄层色谱检测，合并123～162流份并浓缩得浓缩液，将浓缩液浓缩至干得到金花茶粗皂甙。
将金花茶粗皂甙浓缩至干，干法上硅胶担体进行柱层析分离，用体积比为25:1.5的氯仿-甲醇进行洗脱，然后对洗脱液进行薄层色谱检测，合并123～162流份并浓缩得浓缩液，将浓缩液再上担体进行柱层析分离，重复二次柱层析分离步骤一次，最后得到的浓缩液静止结晶后即可得到单一高纯度的化合物5。经HPLC检测、归一化法定量，含量：95.6％。
实施例6
将已经准备好选自防城大王江金花茶原料投入超声波提取器，按照固液比为1:20的比例投入体积比为75:25乙醇-水溶液，然后在条件为45℃条件下以18KHz浸提2.5h，得到金花茶提取液。
将金花茶提取液浓缩后加水溶解，并经大孔树脂D101吸附获得大孔树脂吸附物。
将大孔树脂吸附物用水洗脱5个柱体积，然后用70％的乙醇洗脱，收集70％乙醇部分，蒸干后即得金花茶总皂苷；然后将金花茶总皂苷上硅胶担体进行一次柱层析分离，用体积比为18:2.5氯仿-甲醇洗脱，然后取洗脱液进行薄层色谱检测，合并123～162流份并浓缩得浓缩液，将浓缩液浓缩至干得到金花茶粗皂甙。
将金花茶粗皂甙浓缩至干，干法上硅胶担体进行柱层析分离，用体积比为18:2.5的氯仿-甲醇进行洗脱，然后对洗脱液进行薄层色谱检测，合并123～162流份并浓缩得浓缩液，将浓缩液再上担体进行柱层析分离，重复二次柱层析分离步骤一次，最后得到的浓缩液静止结晶后即可得到单一高纯度的化合物6。经HPLC检测、归一化法定量，含量：95.5％。
实施例7
将已经准备好选自天峨龙滩库区金花茶原料投入超声波提取器，按照固液比为1:11的比例投入体积比为80:20甲醇-水溶液，然后在条件为55℃条件下以23KHz浸提3.5h，得到金花茶提取液。
将金花茶提取液浓缩后加水溶解，并经大孔树脂AB-8吸附获得大孔树脂吸附物。
将大孔树脂吸附物用水洗脱5个柱体积，然后用70％的乙醇洗脱，收集70％乙醇部分，蒸干后即得金花茶总皂苷；然后将金花茶总皂苷上硅胶担体进行一次柱层析分离，用体积比为23:3.5氯仿-甲醇洗脱，然后取洗脱液进行薄层色谱检测，合并123～162流份并浓缩得浓缩液，将浓缩液浓缩至干得到金花茶粗皂甙。
将金花茶粗皂甙浓缩至干，干法上硅胶担体进行柱层析分离，用体积比为23:3.5的氯仿-甲醇进行洗脱，然后对洗脱液进行薄层色谱检测，合并123～162流份并浓缩得浓缩液，将浓缩液再上担体进行柱层析分离，重复二次柱层析分离步骤一次，最后得到的浓缩液静止结晶后即可得到单一高纯度的化合物7。经HPLC检测、归一化法定量，含量：95％。
实施例8
将已经准备好选自宁明县那陶大山，金花茶原料投入超声波提取器，按照固液比为1:13的比例投入体积比为85:15乙醇-水溶液，然后在条件为65℃条件下以28KHz浸提4.5h，得到金花茶提取液。
将金花茶提取液浓缩后加水溶解，并经大孔树脂HP-20吸附获得大孔树脂吸附物。
将大孔树脂吸附物用水洗脱5个柱体积，然后用70％的乙醇洗脱，收集70％乙醇部分，蒸干后即得金花茶总皂苷；然后将金花茶总皂苷上硅胶担体进行一次柱层析分离，用体积比为15:2氯仿-甲醇洗脱，然后取洗脱液进行薄层色谱检测，合并123～162流份并浓缩得浓缩液，将浓缩液浓缩至干得到金花茶粗皂甙。
将金花茶粗皂甙浓缩至干，干法上硅胶担体进行柱层析分离，用体积比为15:2的氯仿-甲醇进行洗脱，然后对洗脱液进行薄层色谱检测，合并123～162流份并浓缩得浓缩液，将浓缩液再上担体进行柱层析分离，重复二次柱层析分离步骤一次，最后得到的浓缩液静止结晶后即可得到单一高纯度的化合物8。经HPLC检测、归一化法定量，含量：95.3％。
实施例9
将已经准备好选自广西防城港市十万大山兰山地区金花茶原料投入超声波提取器，按照固液比为1:15的比例投入体积比为90:10甲醇-水溶液，然后在条件为75℃条件下以35KHz浸提3h，得到金花茶提取液。
将金花茶提取液浓缩后加水溶解，并经大孔树脂XAD-16吸附获得大孔树脂吸附物。
将大孔树脂吸附物用水洗脱5个柱体积，然后用70％的乙醇洗脱，收集70％乙醇部分，蒸干后即得金花茶总皂苷；然后将金花茶总皂苷上硅胶担体进行一次柱层析分离，用体积比为20:3氯仿-甲醇洗脱，然后取洗脱液进行薄层色谱检测，合并123～162流份并浓缩得浓缩液，将浓缩液浓缩至干得到金花茶粗皂甙。
将金花茶粗皂甙浓缩至干，干法上硅胶担体进行柱层析分离，用体积比为20:3的氯仿-甲醇进行洗脱，然后对洗脱液进行薄层色谱检测，合并123～162流份并浓缩得浓缩液，将浓缩液再上担体进行柱层析分离，重复二次柱层析分离步骤一次，最后得到的浓缩液静止结晶后即可得到单一高纯度的化合物9。经HPLC检测、归一化法定量，含量：95.4％。
实施例10
将已经准备好选自防城大王江金花茶原料投入超声波提取器，按照固液比为1:17的比例投入体积比为95:5乙醇-水溶液，然后在条件为50℃条件下以25KHz浸提3h，得到金花茶提取液。
将金花茶提取液浓缩后加水溶解，并经大孔树脂D101吸附获得大孔树脂吸附物。
将大孔树脂吸附物用水洗脱5个柱体积，然后用70％的乙醇洗脱，收集70％乙醇部分，蒸干后即得金花茶总皂苷；然后将金花茶总皂苷上硅胶担体进行一次柱层析分离，用体积比为20:4氯仿-甲醇洗脱，然后取洗脱液进行薄层色谱检测，合并123～162流份并浓缩得浓缩液，将浓缩液浓缩至干得到金花茶粗皂甙。
将金花茶粗皂甙浓缩至干，干法上硅胶担体进行柱层析分离，用体积比为20:4的氯仿-甲醇进行洗脱，然后对洗脱液进行薄层色谱检测，合并123～162流份并浓缩得浓缩液，将浓缩液再上担体进行柱层析分离，重复二次柱层析分离步骤一次，最后得到的浓缩液静止结晶后即可得到单一高纯度的化合物10。经HPLC检测、归一化法定量，含量：95％。
二、化合物的理化性质、波谱数据和结构确定
1.实施例1制备得到的化合物结构测定
仪器设备：用Nicolet 4700(KBr压片)傅立叶变换红外光谱仪测定红外光谱；用BRUKER高分辨飞行时间质谱测定ESI-MS；核磁共振谱用BRUKER AV III600型超导核磁共振波谱仪测定(TMS为内标)。经对实施例1的产品化合物1检测分析得到附图2-10的图谱。
制备得到的化合物理化性质：性状为白色针状晶体，溶解性：溶于甲醇、乙醇，微溶于水，不溶于石油醚、氯仿；熔点范围：192℃～197℃；其分子式为：C48H82O18；分子量为：946；重金属(以pb计)：≤5.0mg/Kg；灰分：≤0.2％；水分：≤0.5％；有关物质：≤5.0％。
由图2金花茶皂苷A的IR图谱分析得知：:3384(-OH)；2935,2869(-CH3,-CH2)，1398(偕二甲基)；1632(双键)；1073(C-O-C)。
由图3金花茶皂苷A的ESI-MS图谱分析得知：ESI-MS(positive)m/z HR-TOF-MS(positive)947.5029[M+H]+,结合碳谱给出分子式为C48H82O18。不饱和度为8，由皂甙的4个环、1个双键和3个糖构成。
由图4金花茶皂苷A的1HNMR图谱分析得知：1H-NMR(C5D5N,600MHz)显示有9个甲基信号，δ(ppm):1.76(3H,s)为鼠李糖甲基峰，对应碳谱13C-NMR(C5D5N,150MHz)化学位移为δ(ppm):18.62。其余8个甲基为甙元特征甲基质子信号，δ(ppm):0.95(6H,s,CH3-29,CH3-30),1.16(3H,s,CH3-27),1.35(3H,s,CH3-19),1.58(9H,s,CH3-18,CH3-21,CH3-26),2.10(3H,s,CH3-28)。HSQC对应的碳信号δ(ppm):17.1,17.20,17.60,17.40,17.51,22.17,25.84,32.07。
由图5金花茶皂苷A的13C NMR图谱分析得知：3个糖端基质子信号δ5.16(1H,d,J＝7.38Hz)，δ5.25(1H,d,J＝7.38Hz)，δ6.49(1H,s)，对应谱中对应的碳信号δ(ppm):98.13，101.78，101.72。烯氢信号δ5.24(1H，信号与糖端基质子重叠)，对应的碳信号δ(ppm):125.85。
由图6金花茶皂苷A的DEPT135图谱分析得知：DEPT135显示有10个仲碳(CH2)，由低场到高场依次为δ(ppm)：62.94、62.72、45.82、39.27、35.90、30.81、30.60、27.62、26.50、23.09；6个季碳(C)由由低场到高场依次为δ(ppm)：130.77、83.12、51.27、41.06、39.86、39.52；23个叔碳(CH)由由低场到高场依次为δ(ppm)：126.85、101.78、101.73、98.13、79.28、79.09、78.45、78.26、78.14、78.11、75.02、74.44、74.03、72.43、72.29、72.15、71.47、70.05、69.34、60.89、51.53、49.41、48.94。
由图7金花茶皂苷A的HHCOSY图谱、图8金花茶皂苷A TOSCY图谱和图9金花茶皂苷A的HSQC图谱分析得知：HHCOSY、TOSCY和HSQC三个糖的连接顺序分别是：98.13-75.02-71.47-78.19-74.44-62.93；101.78-72.43-78.12-79.28-74.44-62.72；101.72-78.25-74.03-79.09-69.34-18.62。
由图10金花茶皂苷A的HMBC图谱分析得知：HMBC谱中葡萄糖残基H-1’(δ5.16,d)与季碳(δ83.1,C-20)相关，δ5.25(H-1”)与C-2’位δ75.02相关，两组葡萄糖连接顺序为Glc(2→1)Glc；HMBCδ6.49(1H,s)，与δ72.43远程相关，葡萄糖和鼠李糖连接顺序为Glc(2→1)Rha，因此三个糖的连接顺序为Glc(2→1)Glc(2→1)Rha。
综合以上分析，可以得到实施例1制备得到的化合物的13C NMR和1H NMR数据如表1.
表1实施例1制备得到的化合物的13C NMR和1H NMR数据(溶剂：氚代吡啶)
通过以上分析确定实施例1制备得到的化合物1为(3β,6α,12β)-3,6,12-三羟基达玛烷-24-烯-20-甲基-2-O-β-D-吡喃葡萄糖-(2→1)-O-β-D-吡喃葡萄糖-(2→1)-O-α-L-吡喃鼠李糖苷。
进一步的，对实施例2-10所制备的化合物2-10进行与实施例1所制备的化合物相同的检测，其结果与化合物1的结果高度吻合，重现性极好。
申请人进一步将该化合物命名为：金花茶皂苷A。
进一步的可以确认该化合物的英文名称为：(3β,6α,12β)-3,6,12-trihydroxydammar-24-en-20-yl-2-O-β-D-glucopyranosyl-(2→1)-O-β-D-glucopyranosyl-(2→1)-O-α-L-Rh amnopyranoside。
三、金花茶皂苷A的抗肿瘤活性检测
1.实验材料与方法
1.1仪器耗材与试剂
耗材：细胞培养板、培养皿、移液管、离心管(Corning)。
仪器：CO2细胞培养箱(Thermo Forma)，超净工作台(上海博迅)，倒置显微镜(Nikon)，电动移液器、移液枪(Eppendorf)，酶联免疫检测仪(BIO-RAD)。
试剂：胎牛血清、高糖培养基、胰蛋白酶(GIBCO)，CCK8(日本同仁)。
1.2细胞株
人肝癌Bel-7402细胞株、SMMC-7721细胞株。
1.3受试药品
从金花茶植物中分离得到的金花茶皂苷A：(3β,6α,12β)-3,6,12-三羟基达玛烷-24-烯-20-甲基-2-O-β-D-吡喃葡萄糖-(2→1)-O-β-D-吡喃葡萄糖-(2→1)-O-α-L-吡喃鼠李糖苷。
受试药品先用少量酒精溶解完全，然后配制为2mg/mL的母液备用。使用时加培养液稀释至所需浓度。
1.4操作步骤
(1)单细胞悬液的制备：将人肝癌Bel-7402细胞株和SMMC-7721细胞株用含10％胎牛血清的高糖培养基在37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中培养，0.25％胰蛋白酶消化传代，调整细胞浓度为1×103个/mL，制成细胞悬液。
(2)接种与培养：取细胞悬液接种到96孔细胞培养板中(处理24h每孔细胞数量20000个；处理48h每孔细胞数量8000个)，同时设置空白对照(即不接种细胞)，最后每孔补足培养基至200μL/孔。接种后将细胞培养板置于37℃、5％CO2培养箱中培养至少2h。
(3)加药：待细胞贴壁后，吸弃细胞培养板中的培养基，加入含有药物的培养液100μL/孔。药物设置5个不同的浓度组(12.5、25、50、100、200μg/mL)并设置阴性对照组(即不添加药物组)。加药后置37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中继续培养。
(4)染色：按1：10的体积比加入CCK-8溶液。将细胞培养板置于37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中孵育1.5h。
(5)比色：用酶标仪测定在450nm处的吸光度(OD值)，计算细胞生长抑制率。
1.5数据处理
采用SPSS17.0软件完成统计学处理，实验数据均以均数±标准差即表示，组间分析比较采用t检验，p＜0.05表示差异有统计学意义。
细胞生长抑制率的计算：
细胞生长抑制率(％)＝1-(添加药物OD-空白OD)/(阴性对照OD-空白OD)×100
2、实验结果与分析
CCK-8是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的试剂。在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物。颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450mM波长处测定OD值，间接反映活细胞数量。
金花茶皂苷A对人肝癌Bel-7402细胞和SMMC-7721细胞生长的影响见表2。结果表明从植物中提取分离得到的金花茶皂苷A对人肝癌Bel-7402细胞和SMMC-7721细胞生长具有抑制作用，呈良好的量效线性关系。且处理时间越长抑制效果越好，48h处理组抑制效果均比24h处理组效果要好；抑制作用随样品浓度增加而增强(见图11)。样品浓度为12.5μg/mL时，对Bel-7402和SMMC-7721细胞处理48h，生长抑制率为10.01±2.68％和5.45±1.28％；样品浓度为200μg/mL时，对Bel-7402和SMMC-7721细胞处理48h生长抑制率为29.64±3.55％和21.71±3.80％(见图12)。说明金花茶皂苷A具有较强的抗人肝癌Bel-7402和SMMC-7721细胞生长的活性。
表2添加金花茶皂苷A对人肝癌Bel-7402细胞和SMMC-7721细胞生长的影响
注：不同小写字母者，表示组间差异显著(p＜0.05)。
申请人用同样的方法对其他肿瘤细胞进行相同的对照试验，结果也证明金花茶皂苷A具有较强的抑制肿瘤细胞生长的活性。
Claims (10)
1.金花茶皂苷A，其特征在于：所述的金花茶皂苷A化学名称为：(3β,6α,12β)-3,6,12-三羟基达玛烷-24-烯-20-甲基-2-O-β-D-吡喃葡萄糖-(2→1)-O-β-D-吡喃葡萄糖-(2→1)-O-α-L-吡喃鼠李糖苷，其化学结构式为：
该化合物为白色针状晶体；溶解性：溶于甲醇、乙醇，微溶于水，不溶于石油醚、氯仿；熔点范围：192℃～197℃；其分子式为：C48H82O18；分子量为：946；重金属（以pb计）：≤5.0 mg/Kg；灰分：≤0.2%；水分：≤0.5%；有关物质：≤5.0%。
2.一种如权利要求1所述的金花茶皂苷A 的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）原料提取：以金花茶为原料，经甲醇-水或乙醇-水溶液提取获得金花茶提取液；
（2）大孔吸附树脂处理金花茶提取液：将金花茶提取液浓缩后加水溶解，并经大孔树脂吸附获得大孔树脂吸附物；
（3）金花茶粗皂甙的制备：然后将大孔树脂吸附物经一次柱层析分离得到金花茶粗皂甙；
（4）由金花茶粗皂甙制备金花茶皂苷A：最后将金花茶粗皂甙再经二次柱层析分离即可得到单一高纯度的化合物，经结构测定确认为金花茶皂苷A。
3.根据权利要求2所述的金花茶皂苷A 的制备方法，其特征在于：所述的大孔吸附树脂为XAD-16、D101、AB-8、HP-20中的一种；所述的一次柱层析分离和二次柱层析分离所用的担体均为硅胶。
4.根据权利要求2或3任一所述的金花茶皂苷A的制备方法，其特征在于：所述的二次柱层析分离为：将金花茶粗皂甙浓缩至干，干法上担体进行柱层析分离，用体积比为15～25:1～４的氯仿-甲醇进行洗脱，然后取洗脱液进行薄层色谱检测，合并123～162流份并浓缩得浓缩液，将浓缩液再上担体进行柱层析分离，重复二次柱层析分离步骤一次，最后得到的浓缩液静止结晶后即可得到金花茶皂苷A。
5.根据权利要求4任一所述的金花茶皂苷A的制备方法，其特征在于：所述的一次柱层析分离为：将大孔树脂吸附物浓缩至干，干法上担体进行柱层析分离，用体积比为15～25:1～４的氯仿-甲醇进行洗脱，然后取洗脱液进行薄层色谱检测，合并123～162流份并浓缩得浓缩液，将浓缩液浓缩至干得到金花茶粗皂甙。
6.根据权利要求4所述的金花茶皂苷A的制备方法，其特征在于：所述的金花茶是指是山茶科山茶属金花茶组金花茶系植物的根、茎、叶，并将金花茶的根、茎、叶切成1-3cm长。
7.根据权利要求5或6所述的金花茶皂苷A的制备方法，其特征在于：所述的原料提取步骤中使用的设备为：超声波提取器；提取的固液比为1:10～20；提取条件为40℃～80℃条件下以15-35KHz超声波浸提1-5h。
8.根据权利要求7所述的金花茶皂苷A的制备方法，其特征在于：所述的甲醇-水或乙醇-水溶液中甲醇或乙醇与水的体积比为：50～95:50～5。
9.权利要求5所述的金花茶皂苷A的制备方法，其特征在于：所述大孔树脂吸附物浓缩至干为：将大孔树脂吸附物用水洗脱5个柱体积，然后用70%的乙醇洗脱，收集70%乙醇部分，蒸干后即得金花茶总皂苷。
10.权利要求1所述的金花茶皂苷A在制备抗肿瘤药物中的应用。
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