CN109824643B - 一种提取余甘子中漆黄素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物提取技术领域，公开了一种提取余甘子中漆黄素的方法。本发明所述提取余甘子中漆黄素的方法将溶剂提取余甘子‑正相硅胶柱层析‑制备液相色谱仪三种方法连用，为一种新型有效的分离纯化方法，有效的分离纯化余甘子中抗炎活性成分漆黄素，分离步骤少，且漆黄素分离纯度高，能够达到95％以上。本发明首次从余甘子中分离得到漆黄素，为其他天然产物提取物中活性成分的分离纯化提供借鉴。
Description
技术领域
本发明属于植物提取技术领域，具体涉及一种提取余甘子中漆黄素的方法。
背景技术
炎症是机体受到外部刺激时经历的一系列复杂的生理变化。随着耐药性的出现和对合成抗炎药物的不良反应，中药材以其资源丰富、副作用少、疗效好而备受青睐，天然抗炎药的开发已成为研究的热点。余甘子(Phyllanthus emblica)是一种传统上可食用的水果，是大戟科(Euphorbiaceae)叶下珠属植物，主要分布于印度、印度尼西亚、马来西亚等热带和亚热带国家以及我国的海南、福建、广东、广西、云南等地，其应用于传统用药体系，如中药，藏药以及印度草药等。余甘子《中国药典》记载：余甘子，用于消化不良，血热血瘀，腹胀，咳嗽等。作为民间的传统用药，胆道疾病、支气管炎等疾病常用余甘子治疗。已有研究表明，余甘子富含酚类化合物、维生素、氨基酸以及黄酮类化合物等生物活性物质，具有很好的抗氧化、抗肿瘤、降血糖和保护肝脏等生物学活性和药理效应。余甘子提取物体内外的抗炎活性受到广泛认可，但天然产物提取物因其组分复杂、纯化困难，少有研究指出其抗炎活性的物质基础。
漆黄素，又名非瑟酮(Fisetin)，是一种从漆树科植物木腊树等植物中提取的天然类黄酮化合物。现代研究指出漆黄素具有显著抗炎、抗氧化、抗肿瘤等生理活性。目前，关于漆黄素的研究主要是应用居多，而分离纯化的研究相对较少。现有分离纯化工艺多采用多步溶剂萃取方法，这些方法具有溶剂消耗量大、效率低时间长、和劳动强度高等缺点，且提取的漆黄素纯度较低。
发明内容
本发明针对于现有技术存在的上述缺陷，提出了一种提取余甘子中漆黄素的方法，提取的漆黄素纯度高。
本发明采用以下技术方案实现上述技术目的：
一种提取余甘子中高纯度漆黄素的方法，包括如下步骤：
S1.用溶剂提取余甘子，得到提取液；
S2.将步骤S1中得到的提取液过正相硅胶柱层析，洗脱，收集得到洗脱液；
S3.将洗脱液浓缩，干燥后液相色谱法纯化得到漆黄素；
其中，步骤S1中提取的溶剂为乙醇；提取的料液比为1:2～1:20。
本发明所述提取方法首先采用溶剂提取得到余甘子提取液，然后将上述提取液通过正相硅胶柱层析，最后采用制备液相色谱仪分离纯化得到单一成分。通过高效液相色谱和高效液相色谱-质谱联用技术鉴定该成分为漆黄素，纯度可达95％以上。
优选地，步骤S1中所述溶剂为70％乙醇水溶液。
优选地，步骤S1中所述提取的次数为两次，第一次提取料液比为1：8～1：12，第二次提取料液比为1:3～1:6。
优选地，步骤S1中提取的温度为55℃～75℃。
在一些具体实施例中，步骤S1中所述提取温度为65℃，第一次提取料液比为1:8，第二次提取料液比为1:4。在一些具体实施例中，步骤S1中所述提取温度为65℃，所述第一次提取料液比为1:10，第二次提取料液比为1:4。在一些具体实施例中，步骤S1中所述提取温度为55℃，第一次提取料液比为1:8，第二次提取料液比为1:6。在一些具体实施例中，步骤S1中所述提取温度为75℃，第一次提取料液比为1:12，第二次提取料液比为1:6。
优选地，步骤S2中所述正相硅胶为80～200目正相硅胶。在一些具体实施例中，步骤S2中所述正相硅胶为100目正相硅胶。
优选地，洗脱采用的程序如下依次采用体积比为5:5的石油醚和乙酸乙酯，体积比为1:9的石油醚和乙酸乙酯，体积比为5:5的乙酸乙酯和甲醇洗脱。
以不同极性大小洗脱液洗脱组分，不同成分因洗脱能力不同而被逐步分离。
优选地，收集体积比为5:5的乙酸乙酯和甲醇洗脱组分。
优选地，步骤S3中所述液相色谱法纯化的色谱条件为：
柱温为30℃；
流动相为0.2％甲酸水溶液-甲醇；流速为1mL/min；
采用梯度洗脱，洗脱条件为：0～6min，0-7％甲醇；6～16min，7％～30％甲醇；16～31min，30％～80％甲醇；31～40min，80％～90％甲醇；
进样量为10μL；检测器为紫外检测器。
进一步的，作为优选，步骤S3中所述液相色谱法中使用的色谱柱为C18反相柱。
优选地，所述C18反相柱为C18Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5μm)。
相对于现有技术，本发明具有如下的优点及效果：
本发明所述提取余甘子中漆黄素的方法将溶剂提取余甘子-正相硅胶柱层析-制备液相色谱仪三种方法连用，为一种新型有效的分离纯化方法，有效的分离纯化余甘子中抗炎活性成分漆黄素，分离步骤少，且漆黄素分离纯度高，能够达到95％以上。本发明首次从余甘子中分离得到漆黄素，为其他天然产物提取物中活性成分的分离纯化提供借鉴。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为HPLC-Q-TOF/MS检测总离子流图(负离子模式)；
图2为制备液相色谱仪分离后漆黄素高效液相色谱鉴定图。
具体实施方式
本发明公开了一种提取余甘子中漆黄素的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂、材料、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1、一种提取余甘子中漆黄素的方法
1、将余甘子用70％乙醇水溶液进行二次提取，第一次提取料液比1：8，第二次提取按照1:4，提取温度65℃，合并提取液后真空浓缩干燥；
2、取乙醇提取物过100目正相硅胶柱，依次用石油醚：乙酸乙酯(5:5)、石油醚：乙酸乙酯(1:9)、乙酸乙酯：甲醇(5:5)、乙酸乙酯：甲醇(1:9)、乙酸乙酯：甲醇：水(1:4:5)洗脱；
3、收集乙酸乙酯：甲醇(5:5)组分，浓缩干燥后再用高效制备液相色谱分离纯化得到漆黄素。
为定性检测得到的漆黄素，采用HPLC-Q-TOF/MS检测技术进行鉴定。HPLC-Q-TOF/MS检测条件如下：
液相色谱条件：色谱柱为Jupiter C18(150*2.1mm，5μm，Phenomex)，联用Agilent6540UHD Q-TOF ESI负离子分析；柱温：40℃；流动相0.2％甲酸水溶液-甲醇；流速为1mL/min；采用梯度洗脱，洗脱条件为：0～6min，0-7％甲醇；6～16min，7％～30％甲醇；16～31min；30％～80％甲醇；31～40min；80％～90％甲醇；进样量：5μL；检测器：PDA；
质谱条件：离子源：双喷雾离子源；负离子模式下采用多反应检测(MRM)；扫描范围：105m/z-1100m/z；气路参数：干燥氮气，流速为9L/min；干燥气温度350℃；气帘气50Psi；喷头电压：500V；毛细管出口电压：150V。
HPLC-Q-TOF/MS结果见图1。
图1结果显示，经HPLC-Q-TOF/MS检测技术鉴定，图中所示位置峰为漆黄素。为进一步验证鉴定结果，以漆黄素标准品为参照，通过高效液相色谱技术比较保留时间，样品出峰时间与标准品一致(图2)，故定性鉴定该物质为漆黄素。
漆黄素纯度检测方法：将分离纯化的漆黄素进行高效液相色谱分析检测，其中色谱柱为Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5um)；柱温：30℃；流动相0.2％甲酸水溶液-甲醇；流速为1mL/min；采用梯度洗脱，洗脱条件为：0～6min，0-7％甲醇；6～16min，7％～30％甲醇；16～31min；30％～80％甲醇；31～40min；80％～90％甲醇；进样量：10μL；检测器：紫外检测器。以峰面积归一化法计算漆黄素纯度，结果见表1。漆黄素纯度为99.05％，得率为0.33％。
表1 漆黄素检测结果数据
实施例2、一种提取余甘子中漆黄素的方法，具体包括如下步骤：
1、将余甘子用70％乙醇水溶液进行二次提取，第一次提取料液比1：10，第二次提取按照1:4，提取温度65℃，合并提取液后真空浓缩干燥；
2、取乙醇提取物过100目正相硅胶柱，依次用石油醚：乙酸乙酯(5:5)、石油醚：乙酸乙酯(1:9)、乙酸乙酯：甲醇(5:5)、乙酸乙酯：甲醇(1:9)、乙酸乙酯：甲醇：水(1:4:5)洗脱；
3、收集乙酸乙酯：甲醇(5:5)组分，浓缩干燥后再用高效制备液相色谱分离纯化得到漆黄素。其中色谱柱为Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5um)；柱温：30℃；流动相0.2％甲酸水溶液-甲醇；流速为1mL/min；采用梯度洗脱，洗脱条件为：0～6min，0-7％甲醇；6～16min，7％～30％甲醇；16～31min；30％～80％甲醇；31～40min；80％～90％甲醇；进样量：10μL；检测器：紫外检测器。漆黄素纯度为98.38％，得率为0.42％.
实施例3、一种提取余甘子中漆黄素的方法，具体包括如下步骤：
1、将余甘子用70％乙醇水溶液进行二次提取，第一次提取料液比1:8，第二次提取按照1:6，提取温度55℃，合并提取液后真空浓缩干燥；
2、取乙醇提取物过100目正相硅胶柱，依次用石油醚：乙酸乙酯(5:5)、石油醚：乙酸乙酯(1:9)、乙酸乙酯：甲醇(5:5)、乙酸乙酯：甲醇(1:9)、乙酸乙酯：甲醇：水(1:4:5)洗脱；
3、收集乙酸乙酯：甲醇(5:5)组分，浓缩干燥后再用高效制备液相色谱分离纯化得到漆黄素。其中色谱柱为Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5um)；柱温：30℃；流动相0.2％甲酸水溶液-甲醇；流速为1mL/min；采用梯度洗脱，洗脱条件为：0～6min，0-7％甲醇；6～16min，7％～30％甲醇；16～31min；30％～80％甲醇；31～40min；80％～90％甲醇；进样量：10μL；检测器：紫外检测器。漆黄素纯度为97.82％，得率为0.23％.
实施例4、一种提取余甘子中漆黄素的方法，具体包括如下步骤：
1、将余甘子用70％乙醇水溶液进行二次提取，第一次提取料液比1：12，第二次提取按照1:6，提取温度75℃，合并提取液后真空浓缩干燥；
2、取乙醇提取物过100目正相硅胶柱，依次用石油醚：乙酸乙酯(5:5)、石油醚：乙酸乙酯(1:9)、乙酸乙酯：甲醇(5:5)、乙酸乙酯：甲醇(1:9)、乙酸乙酯：甲醇：水(1:4:5)洗脱；
3、收集乙酸乙酯：甲醇(5:5)组分，浓缩干燥后再用高效制备液相色谱分离纯化得到漆黄素。其中色谱柱为Diamonsil C18(250mm×4.6mm，5um)；柱温：30℃；流动相0.2％甲酸水溶液-甲醇；流速为1mL/min；采用梯度洗脱，洗脱条件为：0～6min，0-7％甲醇；6～16min，7％～30％甲醇；16～31min；30％～80％甲醇；31～40min；80％～90％甲醇；进样量：10μL；检测器：紫外检测器。漆黄素纯度为97.95％，得率为0.38％。
Claims (5)
1.一种提取余甘子中漆黄素的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.用70％乙醇水溶液提取余甘子，得到提取液；
S2.将步骤S1中得到的提取液过正相硅胶柱层析，洗脱，所述洗脱采用的程序如下：依次采用体积比为5:5的石油醚和乙酸乙酯，体积比为1:9的石油醚和乙酸乙酯，体积比为5:5的乙酸乙酯和甲醇洗脱，收集体积比为5:5的乙酸乙酯和甲醇洗脱组分，收集得到洗脱液；
S3.将洗脱液浓缩，干燥后液相色谱法纯化得到单体漆黄素；
其中，提取的料液比为1:2～1:20；
所述液相色谱法纯化的色谱条件为：
色谱柱为C18反相柱，柱温为30℃；
流动相为0.2％甲酸水溶液-甲醇；流速为1mL/min；
采用梯度洗脱，洗脱条件为：0～6min，0-7％甲醇；6～16min，7％～30％甲醇；16～31min，30％～80％甲醇；31～40min，80％～90％甲醇；
进样量为10μL；检测器为紫外检测器。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中所述提取的次数为两次，第一次提取料液比为1:8～1:12，第二次提取料液比为1:3～1:6。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S1中提取的温度为55℃～75℃。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S2中所述正相硅胶为80～200目正相硅胶。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，C18反相柱为C18Diamonsil C18。
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