CN106632609B - 一种六胜肽的制备方法及其产品 - Google Patents

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Abstract

一种六胜肽的制备方法，包括Fmoc‑Arg(pbf)‑Arg(pbf)‑NH‑resin合成；和氨基酸链延长：将Fmoc‑Arg(pbf)‑Arg(pbf)‑NH‑resin上依次连接Fmoc‑Gln(Trt)‑OH、Fmoc‑Met‑OH、Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH、Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH制备得到六胜肽产品；其中Fmoc‑Arg(pbf)‑Arg(pbf)‑NH‑resin通过Fmoc‑Arg(pbf)‑Arg(pbf)‑OH制备得到，Fmoc‑Arg(pbf)‑Arg(pbf)‑OH是将H‑Arg(pbf)‑OH与Fmoc‑Arg(pbf)‑OSu进行反应合成得到。

Description

一种六胜肽的制备方法及其产品
技术领域
本发明属于化妆品技术领域，具体涉及液相片段与固相合成六胜肽的方法及获得的产品。
背景技术
六胜肽是一种六个氨基酸组成的活性多肽，其序列为Ac-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH2，是由突触蛋白SNAP-25的氮端(AA12～17)衍生而来的六个氨基酸肽链，能与SNARE三元复合物相互作用，抑制嗜铬细胞中受Ca2+调控的儿茶酚胺释放，从而阻止神经-肌肉间的乙酰胆碱传导，引起肌肉麻痹。六胜肽是肉毒素类的安全替代品，与之活性相似，具有膜渗透性，有效避免了潜在的毒副作用。由于能够阻断神经肌肉间的信息传导，避免肌肉过度收缩，减少了动态纹的发生，同时还能有效重组胶原弹力，增加弹力蛋白活性，使脸部线条放松。因此，多用于化妆品内作为抗皱成分。
目前，有关六胜肽的制备均采用经典固相法完成，然而该方法不够灵活，Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin偶联较为困难，导致成本很高，收率较小。
因此，开发一种高效率低成本合成六胜肽的方法成为本领域急需解决的技术问题。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供一种固相合成与液相合成相结合的六胜肽的合成方法。该方法既有液相法降低成本、易于放大的优点，又有固相法易于纯化、操作简单的特点，是一种相对理想的六胜肽合成方法。
具体来说，本发明采用液相法分别合成片段A[Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH]，避开了直接偶联两个Fmoc-Arg(pbf)-OH较难的情况，再将片段A[Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH]以单个氨基酸组分的形式，按照经典固相法进行偶联，制得六胜肽产品。
更具体来说，本发明通过如下技术方案实现的：
一种六胜肽的制备方法，所述方法包括如下步骤
(1)Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin合成；以及
(2)氨基酸链延长：将步骤(1)得到的Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin上依次连接Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH制备得到六胜肽产品；
其中，步骤(1)中所述Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin是通过片段Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH制备得到，所述片段Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH是将H-Arg(pbf)-OH与Fmoc-Arg(pbf)-OSu进行反应合成得到。
其中，所述Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH的制备方法是将H-Arg(pbf)-OH和Fmoc-Arg(pbf)-OSu溶于N，N-二甲基甲酰胺，加入N,N-二异丙基乙胺进行反应，之后加入水、有机酸调节pH 5～6，对其用乙酸乙酯进行萃取分离得到乙酸乙酯相进行浓缩后加入乙醚再次进行浓缩，得到产物Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH；优选所述有机酸为柠檬酸。
其中，所述H-Arg(pbf)-OH是通过如下方法合成得到：
其中，将Fmoc-Arg(pbf)-OH、哌啶、四氢呋喃混合进行反应，反应后将溶剂蒸干，加入水，之后用盐酸调节PH≈6，固液分离得到固体，干燥得到产物H-Arg(pbf)-OH。
其中，所述盐酸的浓度是1mol/L；优选所述在用盐酸调节PH≈6后搅拌15分钟，再进行过滤。
其中，所述Fmoc-Arg(pbf)-OH、哌啶、四氢呋喃之间的比例是每克Fmoc-Arg(pbf)-OH加入0.60ml哌啶、20ml四氢呋喃。
其中，所述Fmoc-Arg(pbf)-OSu是通过如下方法合成得到：
其中，在Fmoc-Arg(pbf)-OH和HoSu中加入四氢呋喃和二环己基碳二亚胺进行反应，固液分离得到滤液，即为产物Fmoc-Arg(pbf)-OSu。
其中，所述Fmoc-Arg(pbf)-OH与N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺摩尔比为1:1.5:1.3。
其中，所述步骤(1)合成Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin包括如下步骤：
(1)将Rink-Amide-AM-Resin活化；
(2)步骤(1)活化后的树脂中加入哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液，除掉Rink-Amide-AM-Resin上的9-芴甲氧羰基基团；
(3)将步骤(2)的Rink-Amide-AM-Resin加入N，N-二甲基甲酰胺，之后与Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH、1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基碳二亚胺进行反应，得到产物用有机溶剂洗涤，得到保护肽树脂Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin。
其中所述Rink-Amide-AM-Resin树脂与Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH、1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基碳二亚胺的摩尔比为1:2:5:5。
其中步骤(2)所述氨基酸链延长包括如下步骤：
(1)在Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽树脂中加入哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液进行反应，去除溶剂后用有机溶剂洗涤得到H2N-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin；
(2)将步骤(1)得到的H2N-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin，加入Fmoc-Gln(Trt)-OH、1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基碳二亚胺进行反应，之后用有机溶剂洗涤树脂，得到保护肽树脂Fmoc-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin；
(3)在Fmoc-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin上按照上述步骤(1)和(2)的方法将Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH依次连接得到Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin；
(4)将步骤(3)得到的Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin脱9-芴甲氧羰基得到H2N-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin；在H2N-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin加入二氯甲烷、乙酸酐、N,N-二异丙基乙胺进行反应，经固液分离得到产物Ac-HN-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin；然后将其加入到切割液中进行切割反应，经分离、纯化得到六胜肽产品。
其中，步骤(2)所述Rink-Amide-AM-Resin树脂与Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH、1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基碳二亚胺的摩尔比为1:2:5:5；优选步骤(1)和步骤(2)中用有机溶剂进行洗涤是用N，N-二甲基甲酰胺进行洗涤。
其中，步骤(4)所述H2N-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽树脂与乙酸酐、N,N-二异丙基乙胺的质量比为2:4:3。
其中，步骤(4)所述切割液是体积比为6:3:86:5的三异丙基硅烷、苯甲硫醚、三氟乙酸、水的混合溶液，优选切割液的加入量是按每克树脂加入8～10mL切割液。
其中，步骤(4)所述分离、纯化是对切割后的反应液进行过滤，滤液倾倒到冷冻的无水乙醚中，搅拌，离心、分离出上清液，室温减压烘干，得六胜肽的粗品，经反相色谱法纯化、浓缩、冻干得纯度大于95％的六胜肽。
本发明还提供上述制备方法制备得到六胜肽，其纯度大于95％。再具体来说，本发明提供一种六胜肽的合成方法，其包括下述步骤：
(1)液相法合成Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH
①将Fmoc-Arg(pbf)-OH加入茄型瓶中，每克Fmoc-Arg(pbf)-OH加入0.60ml哌啶、20ml四氢呋喃，室温搅拌反应3小时，将溶剂旋转蒸干，每克Fmoc-Arg(pbf)-OH加入200ml水，用1mol/L的盐酸调节PH≈6，搅拌15分钟，过滤得滤饼，烘干得到产物，产物为H-Arg(pbf)-OH；
②将Fmoc-Arg(pbf)-OH加入茄型瓶中，加入N-羟基琥珀酰亚胺，加入四氢呋喃中搅拌溶解，再投入二环己基碳二亚胺，Fmoc-Arg(pbf)-OH与N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺摩尔比为1:1.5:1.3，搅拌反应3小时，过滤得到滤液，产物为Fmoc-Arg(pbf)-OSu；
③以上述步骤①、②的产物为原料，以1:1的比例溶于N，N-二甲基甲酰胺，按每克Fmoc-Arg(pbf)-OSu加入10mlN，N-二甲基甲酰胺、0.5ml N,N-二异丙基乙胺，反应2小时，加入5倍体积的水，用柠檬酸调节PH 5～6，加入乙酸乙酯，搅拌分层，取乙酸乙酯层，乙酸乙酯层用饱和氯化钠水溶液淋洗2遍，蒸干溶剂，蒸干后，再加入乙醚搅拌，再蒸干，加入乙醚，搅拌过滤，得到固体产物，产物为Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH。
(2)树脂活化
将Rink-Amide-AM-Resin树脂加入反应器中，每克Rink-Amide-AM-Resin树脂加入10mL N，N-二甲基甲酰胺，室温搅拌30分钟使其充分溶胀活化；
(3)合成Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽树脂
在步骤(2)的活化树脂中加入哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液，除掉Rink-Amide-AM-Resin上的9-芴甲氧羰基基团，用N，N-二甲基甲酰胺清洗树脂。加入N，N-二甲基甲酰胺，室温搅拌，加入步骤(1)制得Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH、1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基碳二亚胺，Rink-Amide-AM-Resin树脂与Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH、1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基碳二亚胺的摩尔比为1:2:5:5，室温搅拌反应3～5小时，用N，N-二甲基甲酰胺清洗树脂，得到保护肽树脂，序列为Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽树脂；
(4)合成Fmoc-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽树脂
在每克步骤(3)合成的Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽树脂中加入10ml哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液，室温反应20～40分钟，抽滤除去溶剂，N，N-二甲基甲酰胺清洗树脂，得H2N-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin；加入Fmoc-Gln(Trt)-OH、1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基碳二亚胺，Rink-Amide-AM-Resin树脂与Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH、1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基碳二亚胺的摩尔比为1:2:5:5，室温搅拌反应3～5小时，用N，N-二甲基甲酰胺清洗树脂，得到保护肽树脂，序列为Fmoc-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽树脂；
(5)合成Fmoc-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽树脂重复步骤(3)(4)，对保护蛋氨酸进行偶联，得到保护肽树脂，序列为Fmoc-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽树脂；
(6)合成Fmoc-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽树脂
重复步骤(3)(4)，对保护谷氨酸进行偶联，得到保护肽树脂，序列为Fmoc-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽树脂；
(7)合成Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽树脂
重复步骤(3)(4)，对保护谷氨酸进行偶联，得到保护肽树脂，序列为Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽树脂；
(8)合成H2N-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽树脂
将步骤(7)中得到肽树脂，加入哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液，室温反应20～40分钟，抽滤除去溶剂，N，N-二甲基甲酰胺清洗树脂，脱除9-芴甲氧羰基基团，得到H2N-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽树脂；
(9)合成Ac-HN-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽树脂
在H2N-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽树脂中加入二氯甲烷、乙酸酐、N,N-二异丙基乙胺，按每克树脂加入20ml二氯甲烷，H2N-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽树脂与乙酸酐、N,N-二异丙基乙胺的质量比为2:4:3。室温反应30分钟，抽滤，用N，N-二甲基甲酰胺洗树脂，得到产物Ac-HN-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽树脂；
(10)制备六胜肽
配制肽树脂切割液：将三异丙基硅烷、苯甲硫醚、三氟乙酸、水按体积比为6:3:86:5加入到烧杯内搅拌混合；
切割肽树脂：在步骤(11)肽树脂中加入切割液，按每克树脂加入8～10mL切割液，室温搅拌反应2小时，过滤，滤液倾倒到冷冻的无水乙醚中，搅拌，离心、分离出上清液，室温减压烘干，得六胜肽粗品，经反相色谱法纯化、浓缩、冻干得纯度大于95％的六胜肽。
其中，所述Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH的合成是以Fmoc-Arg(pbf)-OH用哌啶脱除9-芴甲氧羰基后的H-Arg(pbf)-OH与Fmoc-Arg(pbf)-OH的活波酯Fmoc-Arg(pbf)-OSu在碱性环境下反应生成。
本发明有益效果如下：
1.本发明的方法液相合成的Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH以单个氨基酸组分的形式，按照经典固相合成法进行偶联，制得六胜肽产品。该方法既有液相法降低成本、易于放大的优点，又有固相法易于纯化、操作简单的特点，是一种相对理想的六胜肽合成方法。
2.本发明使用液相法分别合成片段A[Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH]，避开了固相合成的常用方法直接偶联两个Fmoc-Arg(pbf)-OH较难的情况，Fmoc-Arg(pbf)-OH是常用的固相合成保护氨基酸，但是Fmoc-Arg(pbf)-OH的空间位阻大，如果直接在树脂上进行缩合连接，产率低下，本发明将片段A[Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH]以单个氨基酸组分的形式，按照经典固相法进行偶联，制得六胜肽产品，降低了成本，而且同时达到了易于规模化生产目的。
附图说明
图1是实施例1合成的六胜肽的质谱图。
图2是实施例1合成的六胜肽的液相色谱图，其中，(a)表示液相色谱图，(b)表示处理通道。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。
下面对说明书中的简写进行说明：
pbf是精氨酸Arg的侧链氨基保护基，名称为2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基；
OtBu是谷氨酸Glu的侧链羧基保护基，名称为叔丁氧基；
Trt是谷氨酰胺Gln的侧链酰胺基保护基，名称为三苯甲基。
Fmoc是Rink-Amide-AM-Resin的氨基保护基团，也是精氨酸Arg、谷氨酸Glu、谷氨酰胺Gln和蛋氨酸Met的侧链氨基保护基，名称为9-芴甲氧羰基。
一种六胜肽的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤
(1)Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin合成；以及(2)氨基酸链延长：将步骤(1)得到的Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin上依次连接Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH制备得到六胜肽产品；
其中步骤(1)中所述Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin是通过片段Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH制备得到，所述片段Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH是将H-Arg(pbf)-OH与Fmoc-Arg(pbf)-OSu进行反应合成得到。
上述序列中各个氨基酸选择的保护基可以是任意保护基，只要能够达到所希望的可以保护的技术效果即可，但发明人经过优选上述取代基效果最好。选择H-Arg(pbf)-OH与Fmoc-Arg(pbf)-OSu合成Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH是发明人对多个因素进行考虑的结果。
在一种具体实施方式中，所述Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH的制备方法是将H-Arg(pbf)-OH和Fmoc-Arg(pbf)-OSu溶于N，N-二甲基甲酰胺，加入N,N-二异丙基乙胺进行反应，之后加入水、有机酸调节pH 5～6，对其用乙酸乙酯进行萃取分离得到乙酸乙酯相,进行浓缩后,加入乙醚再次进行浓缩，得到产物Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH。在该步骤中使用柠檬酸调节pH值，然而任何有机弱酸都能达到相应的技术效果，只要能将pH值调节到5-6，并且不对各种原料和产物有影响即可。加入乙酸乙酯萃取后加入乙醚，能够纯化产品，以提高该产物在下一步反应中的反应活性。
在一种具体实施方式中，其中所述H-Arg(pbf)-OH是通过如下方法合成得到：将Fmoc-Arg(pbf)-OH、哌啶、四氢呋喃混合进行反应，反应后将溶剂蒸干，加入水，之后用盐酸调节PH≈6，固液分离得到固体，干燥得到产物H-Arg(pbf)-OH。优选其中所述盐酸的浓度是1mol/L；优选所述在用盐酸调节PH≈6后搅拌15分钟，再进行过滤；优选地，所述Fmoc-Arg(pbf)-OH、哌啶、四氢呋喃之间的比例是每克Fmoc-Arg(pbf)-OH加入0.60ml哌啶、20ml四氢呋喃。其中所述Fmoc-Arg(pbf)-OSu是通过如下方法合成得到：在Fmoc-Arg(pbf)-OH和N-羟基琥珀酰亚胺中加入四氢呋喃和二环己基碳二亚胺进行反应，固液分离得到滤液，即为产物Fmoc-Arg(pbf)-OSu；优选所述Fmoc-Arg(pbf)-OH与N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺摩尔比为1：1.5：1.3。
上述制备方法是通过液相法合成Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH，之后通过固相法进行氨基酸链的延长而获得产品，这是发明人创造性劳动的结果，由于这样巧妙的应用将成本降低的同时还达到了规模化生产的目的。
其中所述步骤(1)合成Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin包括如下步骤：
(1)将Rink-Amide-AM-Resin活化；
(2)将活化后的Rink-Amide-AM-Resin加入N，N-二甲基甲酰胺，之后与Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH、1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基碳二亚胺进行反应，得到产物用N，N-二甲基甲酰胺洗涤，得到保护肽树脂Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin。其中所述Rink-Amide-AM-Resin树脂与Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH、1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基碳二亚胺的摩尔比为1:2:5:5。
在一种优选的具体实施方式中，步骤(2)所述氨基酸链延长包括如下步骤：
(1)在Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽树脂中加入哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液进行反应，去除溶剂后用N，N-二甲基甲酰胺洗涤得到H2N-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin；
(2)将步骤(1)得到的H2N-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin，加入Fmoc-Gln(Trt)-OH、1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基碳二亚胺进行反应，之后用N，N-二甲基甲酰胺洗涤树脂，得到保护肽树脂Fmoc-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin；
(3)在Fmoc-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin上按照上述步骤(1)和(2)的方法将Fmoc-Met-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH依次连接得到Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin；
(4)将步骤(3)得到的Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin脱9-芴甲氧羰基得到H2N-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin；在H2N-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin加入二氯甲烷、乙酸酐、N,N-二异丙基乙胺进行反应，经固液分离得到产物Ac-HN-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin；然后将其加入到切割液中进行切割反应，经分离、纯化得到六胜肽产品；
其中，步骤(2)所述Rink-Amide-AM-Resin树脂与Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH、1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基碳二亚胺的摩尔比为1:2:5:5；其中步骤(4)所述H2N-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽树脂与乙酸酐、N,N-二异丙基乙胺的质量比为2:4:3；其中步骤(4)所述切割液是体积比为6:3:86:5的三异丙基硅烷、苯甲硫醚、三氟乙酸、水的混合溶液，优选切割液的加入量是按每克树脂加入8～10mL切割液。步骤(4)所述分离、纯化是对切割后的反应液进行过滤，滤液倾倒到冷冻的无水乙醚中，搅拌，离心、分离出上清液，室温减压烘干，得六胜肽的粗品，经反相色谱法纯化、浓缩、冻干得纯度大于95％的六胜肽。
该步骤中各个物质的投料量均是以Rink-Amide-AM-Resin作为参比，通过这种控制有助于对投料量的有效控制，保证原料的完全反应，从而达成保持产品品质，同时控制成本的目的。该比例保证了合成的成本最低化，同时纯度和工艺达到要求。在制备过程中各个物质之间的比例可以进行适当调节，获得的产品仍旧能够满足要求，因此，对制备过程中的各个物质之间的比例进行适当调整也在本发明的保护范围内。
实施例
下面对实施例中使用的各个物质的来源进行说明，如果没有特别说明，所使用的原料和仪器均是商购获得，是本领域常规使用仪器和原料，只要其能满足实验需要即可。
本发明的Fmoc-Rink Amide AM Resin的取代度为0.90mmol/g，由天津南开和成科技有限公司生产。
分析型高效液相色谱仪为日立全自动L-2000。
制备型高效液相色谱仪为创新恒通LC-3000，C18分析色谱柱为大连物理化学研究所4.6mm×250mm，C18制备色谱柱为成都科普生物有限公司40.1mm×450mm。
所用各型氨基酸及1-羟基苯丙三唑、N,N-二异丙基碳二亚胺购自上海吉尔生化有限公司。
LTQ-XL电喷雾电离质谱仪为美国Thermo Finnigan公司。
水为北京爱思泰克科技开发有限责任公司CRS-4-10型纯水机制得的纯水。
哌啶、四氢呋喃、乙酸乙酯、氯化钠、盐酸、N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二异丙基乙胺、柠檬酸、三氟乙酸、苯甲硫醚、三异丙基硅烷、无水甲醇等其它试剂均为国产AR或CP。
实施例1
本实施例六胜肽的制备方法包括如下步骤：
(1)液相法合成Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH
①将10g的Fmoc-Arg(pbf)-OH、200ml四氢呋喃加入茄型瓶中，磁力搅拌，使其全部溶解，加入6ml哌啶，室温搅拌反应3小时，TLC显示反应完全后，将溶剂在40℃下旋转蒸干，加入200ml水，用1mol/L的盐酸调节PH≈6，搅拌15分钟，过滤得滤饼，烘干后研磨至粉末，将粉末加入茄型瓶，加入100ml的冰乙醚，磁力搅拌1小时后，过滤得产物为H-Arg(pbf)-OH，称重6g；
②将10gFmoc-Arg(pbf)-OH、1.57gN-羟基琥珀酰亚胺加入茄型瓶中，加入100ml四氢呋喃中磁力搅拌溶解，再投入2.44g的二环己基碳二亚胺，Fmoc-Arg(pbf)-OH与N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺摩尔比为1：1.5：1.3，搅拌反应3小时，TLC显示反应完全后，过滤得到滤液，产物为Fmoc-Arg(pbf)-OSu，称重11g；
③将5gH-Arg(pbf)-OH、8.76gFmoc-Arg(pbf)-OSu加入茄型瓶中，溶于100mlN，N-二甲基甲酰胺，加入5.0ml N,N-二异丙基乙胺，反应2小时，加入500ml的水，用柠檬酸调节PH≈5～6，加入乙酸乙酯，搅拌分层，取乙酸乙酯层，再将乙酸乙酯层用饱和氯化钠水溶液淋洗2遍，旋转蒸干溶剂，蒸干后，再加入乙醚搅拌后，再蒸干，加入乙醚，搅拌过滤，得到固体产物，产物为Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH，称重11g。
(2)树脂活化
将1g Rink-Amide-AM-resin树脂加入反应器中，加入10mL N，N-二甲基甲酰胺，室温搅拌浸泡30分钟使其充分溶胀活化；
(3)合成Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽树脂
在步骤(2)的活化树脂中加入10ml N，N-二甲基甲酰胺，室温搅拌，加入步骤(1)制得Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH、1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基碳二亚胺，Rink-Amide-AM-Resin树脂与Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH(1.9g)、1-羟基苯并三唑(0.62g)、N,N-二异丙基碳二亚胺(0.85ml)的摩尔比为1:2:5:5，室温搅拌反应3～5小时，用N，N-二甲基甲酰胺清洗树脂两次，得到保护肽树脂，序列为Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽树脂；
(4)合成Fmoc-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽树脂
在步骤(3)合成的Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽树脂中加入10ml哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液，室温反应40分钟，抽滤除去溶剂，用N，N-二甲基甲酰胺清洗树脂两次，得H2N-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin；加入Fmoc-Gln(Trt)-OH、1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基碳二亚胺，Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽树脂与Fmoc-Gln(Trt)-OH(1.1g)、1-羟基苯并三唑(0.62g)、N,N-二异丙基碳二亚胺(0.85ml)的摩尔比为1:2:5:5，室温搅拌反应3～5小时，用N，N-二甲基甲酰胺清洗树脂两次，得到保护肽树脂，序列为Fmoc-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽树脂；
(5)合成Fmoc-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽树脂
重复步骤(3)(4)，对保护蛋氨酸进行偶联，Fmoc-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽树脂与Fmoc-Met-OH(0.67g)、1-羟基苯并三唑(0.62g)、N,N-二异丙基碳二亚胺(0.85ml)的摩尔比为1:2:5:5，得到保护肽树脂，序列为Fmoc-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽树脂；
(6)合成Fmoc-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽树脂
重复步骤(3)(4)，对保护谷氨酸进行偶联，Fmoc-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽树脂与Fmoc-Glu(OtBu)-OH(0.77g)、1-羟基苯并三唑(0.62g)、N,N-二异丙基碳二亚胺(0.85ml)的摩尔比为1:2:5:5，得到保护肽树脂，序列为Fmoc-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽树脂；
(7)合成Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽树脂
重复步骤(3)(4)，对保护谷氨酸进行偶联，Fmoc-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽树脂与Fmoc-Glu(OtBu)-OH(0.77g)、1-羟基苯并三唑(0.62g)、N,N-二异丙基碳二亚胺(0.85ml)的摩尔比为1:2:5:5，得到保护肽树脂，序列为Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽树脂；
(8)合成H2N-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽树脂
将步骤(7)中得到肽树脂中加入20ml哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液，室温反应40分钟，抽滤除去溶剂，用N，N-二甲基甲酰胺清洗树脂二次，脱除9-芴甲氧羰基保护基团，得到H2N-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽树脂；
(9)合成Ac-HN-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽树脂
在步骤(8)中得到的肽树脂中加入二氯甲烷、乙酸酐、N,N-二异丙基乙胺，H2N-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽树脂与3.7ml乙酸酐、1.8ml N,N-二异丙基乙胺的质量比为2:4:3。室温反应30分钟，抽滤，用N，N-二甲基甲酰胺洗树脂三次，无水甲醇洗涤三次，减压干燥，得到产物Ac-HN-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽树脂，称重2.2g；
(10)制备六胜肽
配制肽树脂切割液：将三异丙基硅烷、苯甲硫醚、三氟乙酸、水按体积比为6:3:86:5加入到烧杯内搅拌混合；
切割肽树脂：在步骤(9)肽树脂中加入10mL切割液，室温搅拌反应2小时，过滤，滤液倾倒到冷冻的100ml无水乙醚中，搅拌，离心、分离出上清液，室温减压烘干，得六胜肽粗品，经反相色谱法纯化、浓缩、冻干得到六胜肽0.45g，纯度95％。
采用质谱仪对合成产物的结构进行表征，结果见图1。由图1可见，所合成的产物的分子量及分子离子峰与六胜肽的分子量及分子离子峰一致，说明合成产物为六胜肽。采用液相色谱仪对合成的六胜肽进行纯度测定，液相色谱图见图2(a)，结合图2(b)可见，六胜肽的纯度大于95％。

Claims (18)

1.一种六胜肽的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin合成；以及
（2）氨基酸链延长：将步骤（1）得到的Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin上依次连接Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc- Glu(OtBu)-OH、Fmoc- Glu(OtBu)-OH制备得到六胜肽产品；
其中步骤（1）中所述Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin是通过片段Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH制备得到，所述片段Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH是将H-Arg(pbf)-OH与Fmoc-Arg(pbf)-OSu进行反应合成得到。
2.如权利要求1所述六胜肽的制备方法，其特征在于，所述Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH的制备方法是将H-Arg(pbf)-OH和Fmoc-Arg(pbf)-OSu溶于N，N-二甲基甲酰胺，加入N,N-二异丙基乙胺进行反应，之后加入水、有机酸调节pH 5～6，对其用乙酸乙酯进行萃取分离得到乙酸乙酯相进行浓缩后加入乙醚再次进行浓缩，得到产物Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH。
3.如权利要求2所述六胜肽的制备方法，其特征在于，所述有机酸为柠檬酸。
4.如权利要求1所述六胜肽的制备方法，其特征在于，所述H-Arg(pbf)-OH是通过如下方法合成得到：
将Fmoc-Arg(pbf)-OH、哌啶、四氢呋喃混合进行反应，反应后将溶剂蒸干，加入水，之后用盐酸调节PH为6，固液分离得到固体，干燥得到产物H-Arg(pbf)-OH。
5.如权利要求4所述六胜肽的制备方法，其特征在于，所述盐酸的浓度是1mol/L。
6.如权利要求5所述六胜肽的制备方法，其特征在于，用盐酸调节PH为6后搅拌15分钟，再进行过滤。
7.如权利要求4所述六胜肽的制备方法，其特征在于，所述Fmoc-Arg(pbf)-OH、哌啶、四氢呋喃之间的比例是每克Fmoc-Arg(pbf)-OH加入0.60ml哌啶、20ml四氢呋喃。
8.如权利要求1所述六胜肽的制备方法，其特征在于，所述Fmoc-Arg(pbf)-OSu是通过如下方法合成得到：
在Fmoc-Arg(pbf)-OH和N-羟基琥珀酰亚胺中加入四氢呋喃和二环己基碳二亚胺进行反应，固液分离得到滤液，即为产物Fmoc-Arg(pbf)-OSu。
9.如权利要求8所述六胜肽的制备方法，其特征在于，所述Fmoc-Arg(pbf)-OH与N-羟基琥珀酰亚胺、二环己基碳二亚胺摩尔比为1:1.5:1.3。
10.如权利要求1所述六胜肽的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）合成Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin包括如下步骤：
（1）将Rink-Amide-AM-Resin活化；
（2）步骤（1）活化后的树脂中加入哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液，除掉Rink-Amide-AM-Resin上的9-芴甲氧羰基基团；
（3）将步骤（2）的Rink-Amide-AM-Resin加入N，N-二甲基甲酰胺，之后与Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH、1-羟基苯并三唑、N, N-二异丙基碳二亚胺进行反应，得到产物用有机溶剂洗涤，得到保护肽树脂Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin。
11.如权利要求10所述六胜肽的制备方法，其特征在于，所述Rink-Amide-AM-Resin树脂与Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH、1-羟基苯并三唑、N, N-二异丙基碳二亚胺的摩尔比为1:2:5:5。
12.如权利要求1所述六胜肽的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述氨基酸链延长包括如下步骤：
（1）在Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽树脂中加入哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液进行反应，去除溶剂后用有机溶剂洗涤得到H2N-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin；
（2）将步骤（1）得到的H2N-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin，加入Fmoc-Gln(Trt)-OH、1-羟基苯并三唑、N, N-二异丙基碳二亚胺进行反应，之后用有机溶剂洗涤树脂，得到保护肽树脂Fmoc-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin；
（3）在Fmoc-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin上按照上述步骤（1）和（2）的方法将Fmoc-Met-OH、Fmoc- Glu(OtBu)-OH、Fmoc- Glu(OtBu)-OH依次连接得到Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin；
（4）将步骤（3）得到的Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin脱9-芴甲氧羰基得到H2N-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin；在H2N-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin加入二氯甲烷、乙酸酐、 N,N-二异丙基乙胺进行反应，经固液分离得到产物Ac-HN-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin；然后将其加入到切割液中进行切割反应，经分离、纯化得到六胜肽产品。
13.如权利要求12所述六胜肽的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述Rink-Amide-AM-Resin树脂与Fmoc-Arg(pbf)-Arg(pbf)-OH、1-羟基苯并三唑、N, N-二异丙基碳二亚胺的摩尔比为1:2:5:5。
14.如权利要求13所述六胜肽的制备方法，其特征在于，步骤(1)和步骤（2）中用有机溶剂进行洗涤是用N，N-二甲基甲酰胺进行洗涤。
15.如权利要求12所述六胜肽的制备方法，其特征在于，步骤（4）所述H2N-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg(pbf)-Arg(pbf)-NH-resin肽树脂与乙酸酐、N,N-二异丙基乙胺的质量比为2:4:3。
16.如权利要求12所述六胜肽的制备方法，其特征在于，步骤（4）所述切割液是体积比为6:3:86:5的三异丙基硅烷、苯甲硫醚、三氟乙酸、水的混合溶液。
17.如权利要求16所述六胜肽的制备方法，其特征在于，切割液的加入量是按每克树脂加入8～10mL切割液。
18.如权利要求12所述六胜肽的制备方法，步骤（4）所述分离、纯化是对切割后的反应液进行过滤，滤液倾倒到冷冻的无水乙醚中，搅拌，离心、分离出上清液，室温减压烘干，得六胜肽的粗品，经反相色谱法纯化、浓缩、冻干得纯度大于95％的六胜肽。
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