CN107722107B - 一种乙酰基四肽-2的制备方法 - Google Patents

一种乙酰基四肽-2的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种乙酰基四肽‑2的制备方法，该方法将Fmoc‑L‑m‑Tyr‑OH与叔丁基二甲基氯硅烷、N,N二异丙基乙胺进行反应合成Fmoc‑L‑m‑Tyr(TBDMS)‑OH，然后在Rink‑Amid‑AM Resin上依次连接Fmoc‑L‑m‑Tyr(TBDMS)‑OH、Fmoc‑Val‑OH、Fmoc‑Asp(OtBu)‑OH、Fmoc‑D‑Lys(Boc)‑OH，经脱保护、切割得乙酰基四肽‑2产品。本发明将固相合成与液相合成相结合，先通过液相合成方法合成Fmoc‑L‑m‑Tyr(TBDMS)‑OH，再通过经典固相合成法合成乙酰基四肽‑2，既有降低成本、易于操作的优点，又有经典固相法合成效率高、操作简单的特点，是一种相对理想的乙酰基四肽‑2合成方法。

Description

一种乙酰基四肽-2的制备方法
技术领域
本发明属于化妆品技术领域，具体涉及一种乙酰基四肽-2的制备方法。
背景技术
乙酰基四肽-2是一种四个氨基酸组成的活性多肽，其序列为Ac-D-Lys-Asp-Val-L-m-Tyr-NH2，是由胸腺生成素II的氮端(AA33～36)衍生而来的四个氨基酸肽链，其可以刺激角质细胞的生长和分化，可以有效加强皮肤免疫防御和促进表皮再生，增强皮肤系统免疫力。因此，多用于化妆品内开发抗衰老美容产品。
目前，有关乙酰基四肽-2的制备使用经典的固相合成方法，由于使用的保护氨基酸产品Fmoc-L-m-Tyr(tBu)-OH价格昂贵，所以合成成本很高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种简单易行、成本较低的乙酰基四肽-2的制备方法。
解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成：
1、合成Fmoc-L-m-Tyr(TBDMS)-OH
(1)合成Fmoc-L-m-Tyr-OH
以水和乙腈的混合液为溶剂，将L-m-Tyr-OH、芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺、三乙胺在室温下进行反应，反应完后用盐酸调节pH<5，浓缩除去乙腈，用硫酸氢钾水溶液和乙酸乙酯萃取，对乙酸乙酯相进行浓缩，浓缩液用石油醚结晶并淋洗过滤，得到Fmoc-L-m-Tyr-OH。
(2)合成Fmoc-L-m-Tyr(TBDMS)-OH
以乙腈为溶剂，将Fmoc-L-m-Tyr-OH、叔丁基二甲基氯硅烷、N,N-二异丙基乙胺在室温下进行反应，反应完成后用硫酸氢钾水溶液调节pH<5，浓缩除去乙腈，用硫酸氢钾水溶液和用乙酸乙酯萃取，对乙酸乙酯相进行浓缩，浓缩物柱层析纯化，得到Fmoc-L-m-Tyr(TBDMS)-OH。
2、合成Fmoc-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin
以N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，将Rink Amid-AM Resin、Fmoc-L-m-Tyr(TBDMS)-OH、1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基碳二亚胺在室温下进行反应，得到Fmoc-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin。
3、合成Fmoc-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin
将步骤2得到的Fmoc-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin用哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱除Fmoc保护基，得到H2N-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin；以N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，将H2N-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin、Fmoc-Val-OH、1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基碳二亚胺在室温下进行反应，得到Fmoc-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin。
4、合成Fmoc-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AMResin
按照步骤2的方法在步骤3得到的Fmoc-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AMResin上连接Fmoc-Asp(OtBu)-OH，得到Fmoc-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-RinkAmide-AM Resin；然后按照步骤3的方法在得到的Fmoc-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin上连接Fmoc-D-Lys(Boc)-OH，得到Fmoc-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin。
5、合成Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin
将步骤4得到的Fmoc-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin用哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱除Fmoc保护基，得到H2N-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin；然后将H2N-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin中加入二氯甲烷与乙酸酐、N,N-二异丙基乙胺的混合液，在室温下进行反应，得到Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-RinkAmide-AM Resin。
6、制备乙酰基四肽-2
将Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin用四丁基氟化胺的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱除TBDMS保护基，然后用切割液脱除Boc和OtBu保护基，过滤，将滤液加入冷的甲基叔丁基醚中析出乙酰基四肽-2粗品，粗品经高效液相色谱纯化、减压浓缩、冷冻干燥，得到纯度大于95％的乙酰基四肽-2产品。
上述步骤1的(1)中，优选L-m-Tyr-OH与芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1.0～1.3，其中三乙胺用来调节反应体系的pH保持在8～9。
上述步骤1的(2)中，优选Fmoc-L-m-Tyr-OH与叔丁基二甲基氯硅烷、N,N二异丙基乙胺的摩尔比为1:1.5～2.5:2.5～4。
上述步骤1中，优选盐酸和硫酸氢钾水溶液的浓度1～4mol/L。
上述步骤1的(2)中，浓缩物柱层析纯化的洗脱液为石油醚与乙酸乙酯体积比为5:1～1:1的混合液。
上述步骤2中，优选Rink Amide-AM Resin与Fmoc-L-m-Tyr(TBDMS)-OH、1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基碳二亚胺的摩尔比为1:2.0～2.5:4～6:4～6。
上述步骤3和4中，优选Fmoc-Val-OH与1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基碳二亚胺的加入量与步骤2中Rink-Amide-AM Resin用量的摩尔比为2～2.5:4～6:4～6:1；所用Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH的摩尔量与Fmoc-Val-OH相同。
上述步骤3和5中，所述哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液中哌啶的体积浓度为15％～20％。
上述步骤6中，所述四丁基氟化胺的N,N-二甲基甲酰胺溶液中四丁基氟化胺的质量浓度为10％～15％；所述切割液是三异丙基硅烷与苯甲硫醚、三氟乙酸、水体积比为6:3:86:5的混合溶液。
本发明先通过液相合成方法合成Fmoc-L-m-Tyr(TBDMS)-OH，再通过经典固相合成方法合成乙酰基四肽-2，既有降低成本、易于操作的优点，又有经典固相法合成效率高、操作简单的特点，是一种相对理想的乙酰基四肽-2合成方法。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1
1、液相法合成Fmoc-L-m-Tyr(TBDMS)-OH
(1)合成Fmoc-L-m-Tyr-OH
称取10.9g(60mmol)L-m-Tyr-OH于1L茄形瓶中，加入100mL水、18mL三乙胺，使pH在8～9，溶解至澄清；称取21.9g(65mmol)芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺于500mL锥形瓶中，加入250mL乙腈，溶解澄清后，立即加入到茄形瓶中，搅拌0.5小时后测pH值，用三乙胺调节，使其保持在8～9，持续搅拌反应3小时，TLC(展开剂为：石油醚:乙酸乙酯:甲酸体积比＝10:30:1)显示反应完全，用1mol/L盐酸调节pH<5，搅拌15分钟，在40℃下旋转蒸发至无馏分产生，加入300mL 1mol/L硫酸氢钾水溶液和600mL乙酸乙酯进行萃取，收集乙酸乙酯相，再用300mL乙酸乙酯萃取一次上述萃取中收集的水相，合并两次乙酸乙酯相；用硫酸钠干燥乙酸乙酯相>2h，过滤收集乙酸乙酯相，在40℃下旋转蒸发至无馏分产生，加500mL石油醚，有白色固体析出，抽滤，用石油醚淋洗三次，固体粉末室温晾干，得到22.0g Fmoc-L-m-Tyr-OH，纯度91.2％，收率90.9％。
(2)合成Fmoc-L-m-Tyr(TBDMS)-OH
将20.0g(50mmol)Fmoc-L-m-Tyr-OH加入1L茄形瓶中，依次加入100mL乙腈、25.0mL(150mmol)N,N-二异丙基乙胺，溶解至澄清；称取15.0g(100mmol)叔丁基二甲基氯硅烷于500mL锥形瓶中，加入100mL乙腈，溶解至澄清后用恒压分液漏斗滴加到茄型瓶中，室温搅拌反应3小时，TLC(展开剂为：石油醚:乙酸乙酯:甲酸＝10:30:1)显示反应完全，用1mol/L硫酸氢钾水溶液调节pH<5，搅拌15分钟，在40℃下旋转蒸发至无馏分产生，加入300mL 1mol/L硫酸氢钾水溶液和600mL乙酸乙酯进行萃取，收集乙酸乙酯相，再用300mL乙酸乙酯萃取一次上述萃取中收集的水相，合并两次乙酸乙酯相；用硫酸钠干燥乙酸乙酯相>2h，过滤收集乙酸乙酯相，在40℃下旋转蒸发至无馏分产生，所得黄色油状物用15mL二氯甲烷溶解，过硅胶柱(200～300目)纯化，流动相：石油醚:乙酸乙酯＝3:1、石油醚:乙酸乙酯＝2:1、石油醚:乙酸乙酯＝1:1、乙酸乙酯，用TLC监测(展开剂：石油醚:乙酸乙酯＝3:1)，收集得产物，在40℃下旋转蒸发至无馏分产生，得到18.1g类白色固体Fmoc-L-m-Tyr(TBDMS)-OH，纯度98.3％，收率70.5％。
2、合成Fmoc-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin
将19.5g(17.5mmol)Rink Amide-AM Resin(取代度为0.90mmol/g)加入反应器中，加入200mL N,N-二甲基甲酰胺，室温搅拌浸泡30分钟使其充分溶胀活化，然后加入250mL体积分数为20％的哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液，室温搅拌反应40分钟，除掉Rink Amide-AMResin上的Fmoc基团，用150mL异丙醇和150mL N,N-二甲基甲酰胺各进行洗涤两次，加入250mL N,N-二甲基甲酰胺，室温搅拌下加入18.1g(35mmol)Fmoc-L-m-Tyr(TBDMS)-OH、9.5g(70mmol)1-羟基苯并三唑、10.8mL(70mmol)N,N-二异丙基碳二亚胺，室温搅拌反应4小时，用150mL异丙醇和250mL N,N-二甲基甲酰胺各洗涤两次，得到Fmoc-L-m-Tyr(TBDMS)-RinkAmide-AM Resin。
3、合成Fmoc-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin
将步骤2得到的Fmoc-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin中加入250mL体积分数为20％的哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液，室温搅拌反应40分钟，抽滤除去溶剂，用150mL异丙醇和250mL N,N-二甲基甲酰胺各洗涤两次，得到H2N-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AMResin；将得到的H2N-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin中加入250mL N,N-二甲基甲酰胺，室温搅拌下加入11.9g(35mmol)Fmoc-Val-OH、9.5g(70mmol)1-羟基苯并三唑、10.8mL(70mmol)N,N-二异丙基碳二亚胺，室温搅拌反应4小时，用150mL异丙醇和250mL N,N-二甲基甲酰胺各洗涤两次，得到Fmoc-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin。
4、合成Fmoc-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AMResin
将步骤3得到的Fmoc-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-RinkAmide-AM Resin中加入14.4g(35mmol)Fmoc-Asp(OtBu)-OH、9.5g(70mmol)1-羟基苯并三唑、10.8mL(70mmol)N,N-二异丙基碳二亚胺，室温搅拌反应4小时，用150mL异丙醇和250mL N,N-二甲基甲酰胺各洗涤两次，得到Fmoc-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AMResin；将得到的Fmoc-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AMResin中加入250mL体积分数为20％的哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液，室温搅拌反应40分钟，抽滤除去溶剂，用150mL异丙醇和250mL N,N-二甲基甲酰胺各洗涤两次，得到NH2-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AMResin；将NH2-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin中加入250mL N,N-二甲基甲酰胺，室温搅拌下加入16.4g(35mmol)Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、9.5g(70mmol)1-羟基苯并三唑、10.8mL(70mmol)N,N-二异丙基碳二亚胺，室温搅拌反应4小时，用150mL异丙醇和250mL N,N-二甲基甲酰胺各洗涤两次，得到Fmoc-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin。
5、合成Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin
将步骤4得到Fmoc-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AMResin中加入250mL体积分数为20％的哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液，室温搅拌反应40分钟，抽滤除去溶剂，用150mL异丙醇和250mL N,N-二甲基甲酰胺各洗涤两次，得到NH2-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin；将NH2-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin中加入170mL二氯甲烷、20mL乙酸酐、10mL N,N-二异丙基乙胺，室温搅拌反应30分钟，抽滤，用150mL异丙醇和250mL N,N-二甲基甲酰胺各洗涤两次，得到Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AMResin。
6、制备乙酰基四肽-2
将步骤5得到的Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AMResin中加入300mL质量浓度为15％的四丁基氟化胺的N,N-二甲基甲酰胺溶液，室温搅拌反应6小时，抽滤，用150mL异丙醇和250mL N,N-二甲基甲酰胺各洗涤两次，用150mL无水甲醇洗涤三次，干燥后，得到Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr-Rink Amide-AM Resin；然后将Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr-Rink Amide-AM Resin中加入200mL三异丙基硅烷与苯甲硫醚、三氟乙酸、水体积比为6:3:86:5的混合溶液，室温搅拌反应2小时，过滤，滤液倾倒到冷冻的500mL甲基叔丁基醚中，搅拌，用甲基叔丁基醚淋洗两次，抽滤后，室温真空干燥2小时，得到乙酰基四肽-2粗品，乙酰基四肽-2粗品经反相色谱法纯化(反相聚合物色谱柱：GEL反相聚合物，柱子规格：5cm×45cm，流速30mL/min，波长215nm，流动相A：体积浓度为0.05％的三氟乙酸水溶液；流动相B：体积浓度为0.05％的三氟乙酸甲醇溶液，洗脱梯度：B 3％～15％60min)、减压浓缩、冷冻干燥，得到6.8g乙酰基四肽-2，其纯度98.1％，收率为68.6％。
实施例2
1、液相法合成Fmoc-L-m-Tyr(TBDMS)-OH
(1)合成Fmoc-L-m-Tyr-OH
称取7.3g(40mmol)L-m-Tyr-OH于1L茄形瓶中，加入70mL水、10mL三乙胺，使pH在8～9，溶解至澄清；称取17.5g(52mmol)芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺于500mL锥形瓶中，加入70mL乙腈，溶解澄清后，立即加入到茄形瓶中，搅拌0.5小时后测pH值，用三乙胺调节，使其保持在8～9，持续搅拌反应3小时，TLC(展开剂为：石油醚:乙酸乙酯:甲酸体积比＝10:30:1)显示反应完全，用1mol/L盐酸调节pH<5，搅拌15分钟，在40℃下旋转蒸发至无馏分产生，加入300mL 1mol/L硫酸氢钾水溶液和500mL乙酸乙酯进行萃取，收集乙酸乙酯相，再用300mL乙酸乙酯萃取一次上述萃取中收集的水相，合并两次乙酸乙酯相；用硫酸钠干燥乙酸乙酯相>2h，过滤收集乙酸乙酯相，在40℃下旋转蒸发至无馏分产生，加500mL石油醚，有白色固体析出，抽滤，用石油醚淋洗三次，固体粉末室温晾干，得到14.9g Fmoc-L-m-Tyr-OH，纯度93.8％，收率91.6％。
(2)合成Fmoc-L-m-Tyr(TBDMS)-OH
将14.5g(36mmol)Fmoc-L-m-Tyr-OH加入1L茄形瓶中，依次加入70mL乙腈、22.3mL(135mmol)N,N-二异丙基乙胺，溶解至澄清；称取13.6g(90mmol)叔丁基二甲基氯硅烷于500mL锥形瓶中，加入150mL乙腈，溶解至澄清后用恒压分液漏斗滴加到茄型瓶中，室温搅拌反应3小时，TLC(展开剂为：石油醚:乙酸乙酯:甲酸＝10:30:1)显示反应完全，用1mol/L硫酸氢钾水溶液调节pH<5，搅拌15分钟，在40℃下旋转蒸发至无馏分产生，加入300mL 1mol/L硫酸氢钾水溶液和500乙酸乙酯进行萃取，收集乙酸乙酯相，再用300mL乙酸乙酯萃取一次上述萃取中收集的水相，合并两次乙酸乙酯相；用硫酸钠干燥乙酸乙酯相>2h，过滤收集乙酸乙酯相，在40℃下旋转蒸发至无馏分产生，所得黄色油状物用10mL二氯甲烷溶解，过硅胶柱(200～300目)纯化，流动相：石油醚:乙酸乙酯＝5:1、石油醚:乙酸乙酯＝3:1、石油醚:乙酸乙酯＝1:1、乙酸乙酯，用TLC监测(展开剂：石油醚:乙酸乙酯＝3:1)，收集得产物，在40℃下旋转蒸发至无馏分产生，得到13.5g类白色固体Fmoc-L-m-Tyr(TBDMS)-OH，纯度98.6％，收率72.4％。
2、合成Fmoc-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin
将11.1g(10mmol)Rink Amide-AM Resin(取代度为0.90mmol/g)加入反应器中，加入150mL N,N-二甲基甲酰胺，室温搅拌浸泡30分钟使其充分溶胀活化，然后加入150mL体积分数为20％的哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液，室温搅拌反应40分钟，除掉Rink Amide-AMResin上的Fmoc基团，用100mL异丙醇和150mL N,N-二甲基甲酰胺各洗涤两次，加入150mLN,N-二甲基甲酰胺，室温搅拌下加入13.0g(25mmol)Fmoc-L-m-Tyr(TBDMS)-OH、8.1g(60mmol)1-羟基苯并三唑、9.3mL(60mmol)N,N-二异丙基碳二亚胺，室温搅拌反应4小时，用100mL异丙醇和150mL N,N-二甲基甲酰胺各洗涤两次，得到Fmoc-L-m-Tyr(TBDMS)-RinkAmide-AM Resin。
3、合成Fmoc-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin
将步骤2得到的Fmoc-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin中加入150mL体积分数为20％的哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液，室温搅拌反应40分钟，抽滤除去溶剂，用100mL异丙醇和150mL N,N-二甲基甲酰胺各洗涤两次，得到H2N-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AMResin；将得到的H2N-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin中加入150mL N,N-二甲基甲酰胺，室温搅拌下加入8.5g(25mmol)Fmoc-Val-OH、8.1g(60mmol)1-羟基苯并三唑、9.3mL(60mmol)N,N-二异丙基碳二亚胺，室温搅拌反应4小时，用100mL异丙醇和150mL N,N-二甲基甲酰胺各洗涤两次，得到Fmoc-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin。
4、合成Fmoc-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AMResin
将步骤3得到的Fmoc-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin中加入10.3g(25mol)Fmoc-Asp(OtBu)-OH、8.1g(60mmol)1-羟基苯并三唑、9.3mL(60mmol)N,N-二异丙基碳二亚胺，室温搅拌反应4小时，用100mL异丙醇和150mL N,N-二甲基甲酰胺各洗涤两次，得到Fmoc-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin；将得到的Fmoc-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AMResin中加入150mL体积分数为20％的哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液，室温搅拌反应40分钟，抽滤除去溶剂，用100mL异丙醇和150mL N,N-二甲基甲酰胺各洗涤两次，得到NH2-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AMResin；将NH2-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AMResin中加入150mL N,N-二甲基甲酰胺，室温搅拌下加入11.7g(25mol)Fmoc-D-Lys(Boc)-OH、8.1g(60mmol)1-羟基苯并三唑、9.3mL(60mmol)N,N-二异丙基碳二亚胺，室温搅拌反应4小时，用100mL异丙醇和150mL N,N-二甲基甲酰胺各洗涤两次，得到Fmoc-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin。
5、合成Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin
将步骤4得到Fmoc-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AMResin中加入150mL体积分数为20％的哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液，室温搅拌反应40分钟，抽滤除去溶剂，用100mL异丙醇和150mL N,N-二甲基甲酰胺各洗涤两次，得到NH2-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin；将NH2-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin中加入128mL二氯甲烷、15mL乙酸酐、7.5mL N,N-二异丙基乙胺，室温搅拌反应30分钟，抽滤，用100mL异丙醇和150mL N,N-二甲基甲酰胺各洗涤两次，得到Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-RinkAmide-AM Resin。
6、制备乙酰基四肽-2
将步骤5得到的Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AMResin中加入150mL质量浓度为15％的四丁基氟化胺的N,N-二甲基甲酰胺溶液，室温搅拌反应6小时，抽滤，用100mL异丙醇和150mL N,N-二甲基甲酰胺各洗涤两次，用100mL无水甲醇洗涤三次，干燥后，得到Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr-RinkAmide-AM Resin；然后将Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr-Rink Amide-AM Resin中加入100mL三异丙基硅烷与苯甲硫醚、三氟乙酸、水体积比为6:3:86:5的混合溶液，室温搅拌反应2小时，过滤，滤液倾倒到冷冻的500mL甲基叔丁基醚中，搅拌，用甲基叔丁基醚淋洗两次，抽滤后，室温真空干燥2小时，得到乙酰基四肽-2粗品，乙酰基四肽-2粗品经反相色谱法纯化(反相聚合物色谱柱：GEL反相聚合物，柱子规格：5cm×45cm，流速30mL/min，波长215nm，流动相A：体积浓度为0.05％的三氟乙酸水溶液；流动相B：体积浓度为0.05％的三氟乙酸甲醇溶液，洗脱梯度：B 3％～15％60min)、减压浓缩、冷冻干燥，得到3.9g乙酰基四肽-2，其纯度98.5％，收率为69.0％。
上述的Boc是赖氨酸(Lys)的侧链氨基保护基，名称为叔丁氧羰基；OtBu是天冬氨酸(Asp)的侧链羧基保护基，名称为叔丁氧基；TBDMS是酪氨酸(Tyr)的侧链羟基保护基，名称为叔丁基二甲基硅基；Fmoc是RinkAmide-AM Resin的氨基保护基团，也是Lys、Asp、缬氨酸(Val)和Tyr的氨基保护基，名称为9-芴甲氧羰基。

Claims (10)

1.一种乙酰基四肽-2的制备方法，其特征在于该方法由下述步骤组成：
(1)合成Fmoc-L-m-Tyr(TBDMS)-OH
①合成Fmoc-L-m-Tyr-OH
以水和乙腈的混合液为溶剂，将L-m-Tyr-OH、芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺、三乙胺在室温下进行反应，反应完后用盐酸调节pH<5，浓缩除去乙腈，用硫酸氢钾水溶液和乙酸乙酯萃取，对乙酸乙酯相进行浓缩，浓缩液用石油醚结晶并淋洗过滤，得到Fmoc-L-m-Tyr-OH；
②合成Fmoc-L-m-Tyr(TBDMS)-OH
以乙腈为溶剂，将Fmoc-L-m-Tyr-OH、叔丁基二甲基氯硅烷、N,N-二异丙基乙胺在室温下进行反应，反应完成后用硫酸氢钾水溶液调节pH<5，浓缩除去乙腈，用硫酸氢钾水溶液和用乙酸乙酯萃取，对乙酸乙酯相进行浓缩，浓缩物柱层析纯化，得到Fmoc-L-m-Tyr(TBDMS)-OH；
(2)合成Fmoc-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin
以N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，将Rink Amid-AM Resin、Fmoc-L-m-Tyr(TBDMS)-OH、1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基碳二亚胺在室温下进行反应，得到Fmoc-L-m-Tyr(TBDMS)-RinkAmide-AM Resin；
(3)合成Fmoc-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin
将步骤(2)得到的Fmoc-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin用哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱除Fmoc保护基，得到H2N-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin；以N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，将H2N-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin、Fmoc-Val-OH、1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基碳二亚胺在室温下进行反应，得到Fmoc-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin；
(4)合成Fmoc-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin
按照步骤(2)的方法在步骤(3)得到的Fmoc-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AMResin上连接Fmoc-Asp(OtBu)-OH，得到Fmoc-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-RinkAmide-AM Resin；然后按照步骤(3)的方法在得到的Fmoc-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin上连接Fmoc-D-Lys(Boc)-OH，得到Fmoc-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin；
(5)合成Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin
将步骤(4)得到的Fmoc-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AMResin用哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱除Fmoc保护基，得到H2N-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin；然后将H2N-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin中加入二氯甲烷与乙酸酐、N,N-二异丙基乙胺的混合液，在室温下进行反应，得到Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-RinkAmide-AM Resin；
(6)制备乙酰基四肽-2
将Ac-D-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Val-L-m-Tyr(TBDMS)-Rink Amide-AM Resin用四丁基氟化胺的N,N-二甲基甲酰胺溶液脱除TBDMS保护基，然后用切割液脱除Boc和OtBu保护基，过滤，将滤液加入冷的甲基叔丁基醚中析出乙酰基四肽-2粗品，粗品经高效液相色谱纯化、减压浓缩、冷冻干燥，得到纯度大于95％的乙酰基四肽-2产品。
2.根据权利要求1所述的乙酰基四肽-2的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述盐酸和硫酸氢钾水溶液的浓度均为1～4mol/L。
3.根据权利要求1所述的乙酰基四肽-2的制备方法，其特征在于：在步骤(1)的①中，L-m-Tyr-OH与芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺摩尔比为1:1.0～1.3，三乙胺调节反应体系的pH保持在8～9。
4.根据权利要求1所述的乙酰基四肽-2的制备方法，其特征在于：在步骤(1)的②中，Fmoc-L-m-Tyr-OH与叔丁基二甲基氯硅烷、N,N二异丙基乙胺的摩尔比为1:1.5～2.5:2.5～4。
5.根据权利要求3所述的乙酰基四肽-2的制备方法，其特征在于：在步骤(1)的②中，浓缩物柱层析纯化的洗脱液为石油醚与乙酸乙酯体积比为5:1～1:1的混合液。
6.根据权利要求1所述的乙酰基四肽-2的制备方法，其特征在于：在步骤(2)中，RinkAmide-AM Resin与Fmoc-L-m-Tyr(TBDMS)-OH、1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基碳二亚胺的摩尔比为1:2.0～2.5:4～6:4～6。
7.根据权利要求1所述的乙酰基四肽-2的制备方法，其特征在于：在步骤(3)和(4)中，所述Fmoc-Val-OH与1-羟基苯并三唑、N,N-二异丙基碳二亚胺的加入量与步骤(2)中Rink-Amide-AM Resin用量的摩尔比2～2.5:4～6:4～6:1；所用F moc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-D-Lys(Boc)-OH的摩尔量与Fmoc-Val-OH相同。
8.根据权利要求1所述的乙酰基四肽-2的制备方法，其特征在于：在步骤(3)和(5)中，所述哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液中哌啶的体积浓度为15％～20％。
9.根据权利要求1所述的乙酰基四肽-2的制备方法，其特征在于：在步骤(6)中，所述四丁基氟化胺的N,N-二甲基甲酰胺溶液中四丁基氟化胺的质量浓度为10％～15％。
10.根据权利要求1所述的乙酰基四肽-2的制备方法，其特征在于：在步骤(6)中，所述切割液是三异丙基硅烷与苯甲硫醚、三氟乙酸、水体积比为6:3:86:5的混合溶液。
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