CN110498835A - 一种合成etelcalcetide的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种合成Etelcalcetide的方法，其包括如下步骤：1)合成化合物3；2)以固相合成方法合成多肽树脂：H‑D‑Ala‑D‑Arg(Pbf)‑D‑Arg(Pbf)‑D‑Ala‑D‑Arg(Pbf)‑固相合成树脂；3)偶联步骤1)所得的化合物3和步骤2)所得的多肽树脂，得到；4)裂解肽树脂同时脱除保护基，即得到Etelcalcetide。本发明的方法在合成过程中不使用巯基吡啶类化合物，更环保，合成效率更高。

Description

一种合成ETELCALCETIDE的方法
技术领域
本发明涉及药物合成领域，具体涉及一种合成Etelcalcetide的方法。
背景技术
Etelcalcetide是由AMGEN INC开发的一种新颖的拟钙剂，主要用于慢性肾病成人患者做血液透析治疗的继发性甲状旁腺功能亢进的多肽药物。2017年2月07日在美国上市，商品名为Parsabiv。其用于继发性甲状旁腺机能亢进时在降低甲状旁腺素水平方面与西那卡塞一样好，并且因其可在血液透析后静脉给药，优于现有的标准拟钙剂治疗药西那卡塞。
Etelcalcetide的主链有七个D-型氨基酸组成，侧链通过一个二硫键与L-半胱氨酸相连。其肽序如下：
常规方法偶联合成Etelcalcetide的关键在于二硫键的构建，常规的肽合成中使用的构建二硫键的方法包括空气氧化法，碘/醋酸体系氧化法，双氧水氧化法，这类方法无法保证反应的专一选择性，无可避免的会产生错配杂质，产品纯度较低，增加了纯化的难度。专利CN105504012介绍了一种假稀释反应避免液相反应中存在的多肽链间二硫键错配问题，但固相成二硫键反应为非均相反应，反应转化率较低，导致产品Etelcalcetide收率低于30％。专利CN106928320和专利CN201580029560.2报道了2,2-二硫二吡啶活化法合成Etelcalcetide的方法，但产生等当量的巯基吡啶化合物，不但增加纯化难度，而且给环境造成污染，不利于环保。专利CN106928321介绍了一种全液相合成Etelcalcetide的方法，但反应后处理操作繁杂，总收率较低。
开发原子经济性反应和环保已成为绿色化学研究的核心内容，从原子经济性的角度来讲，常规的依序偶联方法由于无法避免这种线性肽的二硫键的构建的专一选择性问题，导致最后一个L-型半胱氨酸二硫键的构建时，七个D-氨基酸主链片段有效利用率较低，即原子利用率较低。在一般的固相合成操作过程中，氨基酸用量一般为3～5eqv，当主链片段有效利用率较低时将造成相应氨基酸的大量浪费，而且D-氨基酸价格较昂贵，更有必要提高原子利用率，从而降低生产成本，减少能源浪费。而采用2,2-二硫二吡啶活化法合成Etelcalcetide又会导致大量的巯基吡啶副产物生成，造成环境污染，不利于环保。
发明内容
为了解决上述问题，本发明通过Boc-L-Cys-OtBu和Ac-D-Cys-OH为原料进行氧化反应形成二硫键，从而得到(S)-3-(((R))-3-(叔丁氧基)-2-(叔丁氧羰基)氨基)-3-氧代丙基)二硫)-2-乙酰氨基丙酸(化合物3)，反应如下：
然后以化合物3与固相合成树脂偶联的多肽链进行偶联，裂解沉淀得到Etelcalcetide。如此，可以避免反应的专一选择性问题，提高主链片段利用率，提高原子利用率，从而降低生产成本，采用常规的空气氧化法避免了2,2-二硫二吡啶化合物的使用，更加环保，倡导绿色化学的理念。反应流程如下：
因此，本发明提供了一种合成Etelcalcetide的方法，其包括如下步骤：
1)合成化合物3
2)以固相合成方法合成多肽树脂：H-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-固相合成树脂；
3)偶联步骤1)所得的化合物3和步骤2)所得的多肽树脂，得到
4)裂解肽树脂同时脱除保护基，即得到
在本发明的技术方案中，所述的步骤1)以Boc-L-Cys-OtBu和Ac-D-Cys-OH为原料通过氧化剂进行氧化反应形成二硫键；
在本发明的技术方案中，所述的步骤1)中所用的氧化剂为空气、氧气、碘/醋酸、双氧水中的一种或多种的组合物。优选为空气。
在本发明的技术方案中，所述的步骤1)中反应温度为0-50度，优选为15-35度，更优选为25度。
在本发明的技术方案中，所述的步骤1)中的溶剂选自四氢呋喃、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、二恶烷、丙酮、乙醚、乙腈、四氯化碳、二硫化碳、苯、甲苯、己烷、氯仿、二氯甲烷、水、甲醇、乙醇等溶剂，优选甲醇。
在本发明的技术方案中，所述步骤4)裂解肽树脂同时脱除保护基，以裂解液进行裂解，过滤树脂后在乙醚中沉淀，并收集沉淀。
在本发明的技术方案中，所述步骤4)的裂解液为TFA、H2O、EDT、苯甲醚、苯甲硫醚、苯酚的不同比例混合物。优选为TFA:TIS:H2O＝95:2.5:2.5(V:V)
在本发明的技术方案中，所述的步骤2)固相合成方法中使用的固相合成树脂选自氨基树脂，具体选自Rink酰胺AM树脂、Rink酰胺MBHA树脂或Rink酰胺树脂。树脂替代度为0.1-1.0mmol/g，优选0.2-0.8mmol/g，更优选0.3-0.5mmol/g。
在本发明的技术方案中，所述的步骤2)以固相合成方法合成多肽树脂的方法为以待偶联的氨基酸Fmoc-AA-OH在偶联剂的作用下偶联至固相合成树脂上，然后脱除Fmoc保护基，再依次偶联待偶联的氨基酸Fmoc-AA-OH。
在本发明的技术方案中，所述的步骤2)中偶联剂为DIPCDI和化合物A的组合物或DIPEA和化合物A和化合物B的组合物，其中化合物A为HOAt或HOBt，化合物B为PyAOP、PyBOP、HATU、HBTU或TBTU，优选为DIPCDI和化合物A的组合物。进一步地，偶联剂中各成分的比例以摩尔比计为DIPCDI:A＝1.2:1.1，DIPEA:A:B＝2.0:1.1:1.0。
在本发明的技术方案中，所述的步骤2)中20％的哌啶/DMF溶液的脱除Fmoc保护基。
在本发明的技术方案中，所述的步骤3)为所得的化合物3和步骤2)所得的多肽树脂在偶联剂的作用下进行偶联，偶联剂为DIPCDI和化合物A的组合物或DIPEA和化合物A和化合物B的组合物，其中化合物A为HOAt或HOBt，化合物B为PyAOP、PyBOP、HATU、HBTU或TBTU，优选为DIPCDI和化合物A的组合物。进一步地，偶联剂中各成分的比例以摩尔比计为DIPCDI:A＝1.2:1.1，DIPEA:A:B＝2.0:1.1:1.0。
在本发明的技术方案中，还包括用于纯化的步骤5)，具体地，所述步骤5)纯化步骤采用反相高压液相色谱法。
在本发明的技术方案中，步骤5)中所述反相高压液相色谱法包括：以反相十八烷基硅烷为固定相，以0.1％三氟乙酸水溶液/乙腈为流动相，收集目的峰馏分，浓缩冻干。
在本发明的技术方案中，在合成过程中不使用巯基吡啶类化合物。
所述的Fmoc-AA-OH中的AA为各种氨基酸。
所述固相多肽合成策略包括：i)将树脂用溶剂进行溶胀，所选溶剂包括DMF、NMP、二氯甲烷等，优选DMF；ii)用20％的哌啶/DMF溶液的脱除Fmoc保护基，用溶剂反复洗涤树脂；iii)将合适量的待偶联氨基酸和偶联剂在溶剂中溶解并活化后，一起加入到固相反应柱中，直至用茚三酮检测方法检测到反应终止为止；iv)重复ii)和iii)。
步骤2)和3)中的反应在固相反应柱中进行。
此外，每种氨基酸进行偶联反应的时间通常为1.5-4小时，优选2-3小时；温度优选为室温(即20±5℃)，也可在适当提高或降低的温度下进行。
本发明先合成全保护内消旋胱氨酸单体化合物3偶联至肽树脂Etelcalcetide(1-6)树脂上，能够避免固相合成中二硫键的构建无法保证反应的专一选择性问题，提高片段肽树脂的利用率，提高主链片段利用率，提高原子利用率，从而降低生产成本，采用常规的空气氧化法构建二硫键合成单体化合物3，避免了原研专利中2,2-二硫二吡啶化合物的使用，更加环保，倡导了绿色化学的理念。
本发明使用的英文缩写含义
附图说明
图1为Etelcalcetide精肽HPLC谱图，出峰时间为20.125分钟，宽度为0.66分钟，峰面积为6697.99，峰高为692.48，峰面积％为99.98％。
图2为Etelcalcetide精肽质谱图。
具体实施方式
实施例1：本专利方法实施例，单体化合物3合成
称取Boc-L-Cys-OtBu(55.5g，200mmol)和Ac-D-Cys-OH(32.6g，200mmol)加入30％甲醇水溶液(1L)中搅拌溶清，加三乙胺调pH值至7～9，加入双氧水(150mL)，室温搅拌过夜。30℃减压除去浓缩大部分甲醇，加乙酸乙酯萃取，静置分层，除去水相，收集有机相。有机相浓缩后残余物加甲基叔丁基醚(450mL)，加热至50℃搅拌溶清，自然冷却至室温后冰箱冷却静置过夜。过滤得到全保护内消旋胱氨酸单体化合物3(37.2g，收率42.4％，纯度98.3％)。
实施例2：肽树脂合成
称取Rink Amide树脂(52g，替代度为0.48mmol/g)加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，再用DMF溶胀树脂30分钟，加入DBLK脱保护(5min+7min)，树脂用DMF洗涤6次。称取Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH(48.660g，75mmol)和HOBT(12.159g,90mmol)加入至DMF(250mL)中溶解，冰水浴冷却至0～5℃，加入DIPCDI(12.75mL，75mmol)活化5min，将此活化液加入到反应柱中，室温鼓氮气鼓泡2小时，以茚三酮检测反应终点(如树脂无色透明则终止反应；如树脂显色则延长反应1小时)。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取Fmoc-D-Ala-OH(23.372g，75mmol)和HOBT(12.159g，90mmol)加入至DMF(250mL)中溶解，冰水浴冷却至0～5℃，加入DIPCDI(12.75mL，75mmol)活化5min，将此活化液加入到反应柱中，室温鼓氮气鼓泡2小时，以茚三酮检测反应终点。反应结束后用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH(48.660g，75mmol)和HOBT(12.159g,90mmol)加入至DMF(250mL)中溶解，冰水浴冷却至0～5℃，加入DIPCDI(12.75mL，75mmol)活化5min，将此活化液加入到反应柱中，室温鼓氮气鼓泡2小时，以茚三酮检测反应终点。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH(48.660g，75mmol)和HOBT(12.159g,90mmol)加入至DMF(250mL)中溶解，冰水浴冷却至0～5℃，加入DIPCDI(12.75mL，75mmol)活化5min，将此活化液加入到反应柱中，室温鼓氮气鼓泡2小时，以茚三酮检测反应终点。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。称取Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH(48.660g，75mmol)和HOBT(12.159g,90mmol)加入至DMF(250mL)中溶解，冰水浴冷却至0～5℃，加入DIPCDI(12.75mL，75mmol)活化5min，将此活化液加入到反应柱中，室温鼓氮气鼓泡2小时，以茚三酮检测反应终点。反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。Fmoc-D-Ala-OH(23.372g，75mmol)和HOBT(12.159g，90mmol)加入至DMF(250mL)中溶解，冰水浴冷却至0～5℃，加入DIPCDI(12.75mL，75mmol)活化5min，将此活化液加入到反应柱中，室温鼓氮气鼓泡2小时，以茚三酮检测反应终点。反应结束后用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。偶联结束得到Etelcalcetide(1-6)Resin。称取实施例1中所得化合物3(32.892g，75mmol)和HOBT(12.159g，90mmol)加入至DMF(250mL)中溶解，冰水浴冷却至0～5℃，加入DIPCDI(12.75mL，75mmol)活化5min，将此活化液加入到反应柱中，室温鼓氮气鼓泡2小时，以茚三酮检测反应终点。反应结束后用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。偶联结束后用甲醇收缩，真空抽干得到肽树脂92.8g，树脂增重率78.46％。
实施例3：本专利方法实施例，裂解肽树脂
将实施例2得到的肽树脂92.8g加入到2L单口瓶中，加入预冻至-15℃的l裂解液(TFA:TIS:H2O＝95:2.5:2.5(V:V)，900ml)，室温搅拌4小时，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入9L冰乙醚中沉淀。离心，冰乙醚洗涤5次，氮气吹干得到粗肽26.18克，粗肽纯度89.6％，收率99.92％。
实施例4：本专利方法实施例，反相色谱制备精肽
将实施例4得到的粗肽用高效液相纯化，得精肽16.9g，纯度99.98％(HPLC谱图如图1)，收率64.5％。，质谱信号为1048.965(质谱图如图2)。
实施例5：原研方法对比实施例，偶联结束得到Etelcalcetide(1-7)Resin
按实施例2操作依序偶联Fmoc-AA-OH得到Etelcalcetide(1-6)Resin，反应结束，用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。Fmoc-D-Cys(Trt)-OH(32.945g，75mmol)和HOBT(12.159g，90mmol)加入至DMF(250mL)中溶解，冰水浴冷却至0～5℃，加入DIPCDI(12.75mL，75mmol)活化5min，将此活化液加入到反应柱中，室温鼓氮气鼓泡2小时，以茚三酮检测反应终点。反应结束后用DMF洗涤树脂3次，加入DBLK脱保护5min+7min，DMF洗涤树脂6次，茚三酮检测树脂有颜色。偶联结束得到Etelcalcetide(1-7)Resin。偶联结束后用甲醇收缩，真空抽干得到肽树脂102.3g，树脂增重率96.73％。
实施例6：原研方法对比实施例，Etelcalcetide(1-7)Resin裂解及2,2-二硫二吡啶活化
将实施例5得到的肽树脂51.3g加入到2L单口瓶中，加入预冻至-15℃的裂解液(TFA:TIS:H2O＝95:2.5:2.5(V:V)，900ml)和2,2-二硫二吡啶(35.2g，6.4eqv)室温搅拌4小时，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入9L冰乙醚中沉淀。离心，冰乙醚洗涤5次，氮气吹干得到活化中间体粗肽10.7克，粗肽纯度84.3％，收率91.06％。
实施例7：原研方法对比实施例，氧化得到粗肽
将实施6中的活化粗肽(10.7g)加入至1.5％TFA水溶液(3.5L)中，加入L-Cys-OH(1.55g,1.1eqv)搅拌2小时。经HPLC检测，粗肽纯度40.31％。
实施例8：原研方法对比实施例，反相色谱制备精肽
将实施例7得到的粗肽用高效液相纯化，得精肽4.3g，纯度98.7％，收率32.4％。
实施例9：原研方法对比实施例，肽树脂裂解
将实施例2得到的肽树脂50g加入到2L单口瓶中，加入预冻至-15℃的裂解液(TFA:TIS:H2O＝95:2.5:2.5(V:V)，900ml)室温搅拌4小时，过滤树脂，收集滤液。用少量TFA洗涤树脂，合并滤液。将滤液缓慢加入9L冰乙醚中沉淀。离心，冰乙醚洗涤5次，氮气吹干得到活化Etelcalcetide(1-7)片段肽9.5g，粗肽纯度40.2％，收率87.15％。
实施例10：常规方法氧化对比实施例，Etelcalcetide(1-7)片段肽与L-Cys-OH空气氧化法得到Etelcalcetide粗肽
将实施9中的Etelcalcetide(1-7)片段肽9.5g至1.5％TFA水溶液(6.5L)中，加入L-Cys-OH(3.1g,1.1eqv)搅拌过夜。经HPLC检测，粗肽纯度21.6％。
实施例11：常规方法氧化对比实施例，反相色谱制备精肽。
将实施例10得到的粗肽用高效液相纯化，得精肽2.8g，纯度98.7％，收率19.5％。

Claims (10)

1.一种合成Etelcalcetide的方法，其包括如下步骤：
1)合成化合物3
2)以固相合成方法合成多肽树脂：H-D-Ala-D-Arg(Pbf)-D-Arg(Pbf)-D-Ala-D-Arg(Pbf)-固相合成树脂；
3)偶联步骤1)所得的化合物3和步骤2)所得的多肽树脂，得到
4)裂解肽树脂同时脱除保护基，即得到
2.根据权利要求1所述的合成Etelcalcetide的方法，所述的步骤1)以Boc-L-Cys-OtBu和Ac-D-Cys-OH为原料通过氧化剂进行氧化反应形成二硫键。
3.根据权利要求1所述的合成Etelcalcetide的方法，所述的步骤1)中所用的氧化剂为空气、氧气、碘/醋酸、双氧水中的一种或多种的组合物；优选为空气。
4.根据权利要求1所述的合成Etelcalcetide的方法，所述的步骤1)中的溶剂选自四氢呋喃、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、二恶烷、丙酮、乙醚、乙腈、四氯化碳、二硫化碳、苯、甲苯、己烷、氯仿、二氯甲烷、水、甲醇、乙醇，优选甲醇。
5.根据权利要求1所述的合成Etelcalcetide的方法，所述步骤4)裂解肽树脂同时脱除保护基，以裂解液进行裂解，过滤树脂后在乙醚中沉淀，并收集沉淀。
6.根据权利要求1所述的合成Etelcalcetide的方法，所述步骤4)的裂解液为TFA、H2O、EDT、苯甲醚、苯甲硫醚、苯酚的不同比例混合物。
7.根据权利要求1所述的合成Etelcalcetide的方法，所述的步骤2)以固相合成方法合成多肽树脂的方法为以待偶联的氨基酸Fmoc-AA-OH在偶联剂的作用下偶联至固相合成树脂上，然后脱除Fmoc保护基，再依次偶联待偶联的氨基酸Fmoc-AA-OH。
8.根据权利要求1所述的合成Etelcalcetide的方法，所述的步骤3)为所得的化合物3和步骤2)所得的多肽树脂在偶联剂的作用下进行偶联。
9.根据权利要求7或8所述的合成Etelcalcetide的方法，偶联剂为DIPCDI和化合物A的组合物或DIPEA和化合物A和化合物B的组合物，其中化合物A为HOAt或HOBt，化合物B为PyAOP、PyBOP、HATU、HBTU或TBTU，优选为DIPCDI和化合物A的组合物。
10.根据权利要求1所述的合成Etelcalcetide的方法，还包括用于纯化的步骤5)，优选地，所述步骤5)纯化步骤采用反相高压液相色谱法。
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