CN108218957A - 一种固液相结合制备amg416的方法 - Google Patents

一种固液相结合制备amg416的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种固液相结合制备AMG416的方法，属于多肽合成领域。其特征在于：首先使用酸敏感氨基树脂作为固相载体制备全保护的主链肽树脂，随后向肽树脂中直接加入稀酸裂解液，同时加入Y‑Cys(X)‑OH，形成二硫键得到全保护目标肽，最后经过裂解、纯化得到AMG416。本发明采用固液相结合的方法制备AMG416，缩短了反应时间，减少了长时间反应造成副产物的增加，提高了目标肽的纯度，降低了成本，并减少了对于环境的污染，利于大规模生产。

Description

一种固液相结合制备AMG416的方法
技术领域
本发明属于多肽合成领域，具体涉及一种固液相结合制备AMG416的方法。
背景技术
AMG416，又名Velcalcetide，是一种多肽化合物，由8个氨基酸组成，C端以酰胺结尾，N端被乙酰化修饰，序列组成为：
AMG416由美国安进公司开发，目前已申报FDA且已在欧盟获批，主要用于治疗接受透析的慢性肾病患者的继发性甲状旁腺功能亢进。三期临床研究显示，AMG416对于继发性甲状旁腺功能亢进的治疗以及安全性优于目前已上市同类产品西那卡塞，业界预计，该产品上市后，其年销售额将超过10亿美元，具有广阔的市场前景。
多肽化合物的合成是氨基酸重复添加的过程，通常从C端向N端(氨基端)进行合成。合成方法包括固相合成法和液相合成法，多肽固相合成是将目的肽的第一个氨基酸C端通过共价键与固相载体连接，再以该氨基酸N端为合成起点，经过脱去氨基保护基和过量的已活化的第二个氨基酸进行反应，接长肽链，重复操作，达到理想的合成肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下来，分离纯化，获得目标多肽。多肽液相合成是采用常规有机合成的方法，用溶剂液化氨基酸，在液相环境下进行氨基酸的缩合反应，主要分为逐步合成和片段组合两种策略。基于合成速度、合成收率、合成多肽序列错接以及纯度等众多因素的影响，多肽固相合成被局限于小片段多肽的合成(30个氨基酸以内，少数为50个氨基酸以内)。大片段多肽的合成，可以应用基因工程法、液相合成法等。
目前AMG416的制备方法中，专利文献WO2011014707、WO2015154031是以RinkAmideAM树脂为固相载体，采用传统固相合成法逐步偶联得到线性肽树脂，随后裂解，再通过空气氧化形成二硫键，得到粗品，粗品经纯化、转盐得到目标产品；上述两项专利文献采用纯液相的方法形成二硫键，后处理繁琐，且需要多次纯化，溶剂使用量大，污染环境。
中国专利文献CN105504012A以Rink氨基树脂为固相载体，采用传统固相合成法逐步偶联得到线性肽树脂，然后在固相上通过空气氧化形成二硫键，随后裂解、纯化、转盐得到目标产物。但是该方法是以固相的方式形成二硫键，反应时间过长，一般需要24h以上，不利于大规模生产。
综合上述现有AMG416的制备方法主要存在以下不足：1、液相合成法氧化形成二硫键时溶剂使用量大，不仅使成本增高而且污染环境；后处理繁琐，且形成的二硫键容易断裂生成杂质，需要多次纯化且使产品纯度和收率降低。2、固相合成法氧化形成二硫键时需要反应时间长，造成成本增加，不利于大规模生产。
基于以上技术应用背景，本发明的发明人欲解决现有制备方法形成二硫键工艺繁琐、反应时间过长、溶剂使用量大污染环境等缺点，提供一种新的制备AMG416的方法。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供一种缩短反应时间，减少副产物的制备AMG416的方法。
本发明提供一种固液相结合制备AMG416的方法，包括如下步骤：首先使用酸敏感氨基树脂作为固相载体制备全保护的主链肽树脂；随后向肽树脂中加入稀酸裂解液，同时加入侧链被保护的半胱氨酸Y-Cys(X)-OH，选择性去除树脂和稀酸不稳定保护基的同时形成二硫键得到全保护目标肽，再经裂解、纯化得到AMG416精肽。
上述技术方案中，所述固相载体为酸敏感氨基树脂，选自Sieber树脂、RinkAmide-MBHA树脂、Rink Amide-AM树脂、Rink Amide树脂；优选Sieber树脂；所述固相载体的取代值0.01～2mmol/g。
进一步地，本发明AMG416的制备方法包括如下步骤：
步骤1：固相制备氮端乙酰化的全保护的主链肽树脂；所述主链肽树脂为Ac-D-Cys1(Z)-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Ala-D-Arg(pbf)-Sieber树脂；
步骤2：向主链肽树脂中加入稀酸裂解液，去除树脂和主链半胱氨酸的Z保护基，同时加入Y-Cys(X)-OH，形成二硫键得到全保护目标肽；
所述全保护目标肽为：
步骤3：全保护目标肽经裂解去除所有侧链保护基得到目标肽粗品：
步骤4：粗肽经纯化得到AMG416。
上述技术方案中，步骤1所述固相制备氮端乙酰化的全保护主链肽树脂，是按照主链肽序列组成，采用Fmoc保护策略将相应氨基酸偶联在固相载体上，得到主链肽树脂。
上述技术方案中，步骤1所述采用Fmoc保护策略，将相应氨基酸偶联在固相载体上制备肽主链树脂时，偶联所使用的缩合剂为本专业领域常规缩合剂及其混合，所述缩合剂包括如下四种组合的一种或多种：①HBTU/Cl-HoBt/DIEA，其中各组分摩尔比为0.5～1.5/0.5～1/1～2，优选0.97/1/1.1；②DIC/HoBt其中各组分摩尔比为0.5～1.5/0.5～1.5，优选1/1；③Oxyma/DIC其中各组分摩尔比为1～3/1～3，优选1.5/2；④PyBOP/Cl-HoBt/DIEA其中各组分摩尔比为0.5～1.5/0.5～1/1～2，优选0.97/1/1.1。
其中为了避免第1位Cys的消旋，第1位氨基酸缩合时优选DIC/HoBt，其他位点氨基酸的缩合采用HBTU/Cl-HoBt/DIEA、Oxyma/DIC或PyBOP/Cl-HoBt/DIEA，优选HBTU/Cl-HoBt/DIEA或Oxyma/DIC。
上述技术方案中，步骤1所述1位D-Cys侧链保护基Z为Mmt、Tmob；由于Mmt对弱酸更敏感且市售品已规模化生产，故优选Mmt。
上述技术方案中，步骤1所述将相应氨基酸偶联在固相载体制备肽主链树脂所用侧链被保护的氨基酸为本领域商业化常见侧链被保护类型的氨基酸，如Fmoc-D-Ala-OH、Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH。
上述技术方案中，步骤2所述去除树脂和主链1位半胱氨酸的保护基采用的稀酸裂解液包括TFA和TIS、TES、TFE、DCM的一种或多种；作为优选，其组分体积比为：TFA/TIS/DCM＝0～50/0～50/50～100或者TFA/TIS/TFE＝0～50/0～50/50～100或者TFA/TES/DCM＝0～50/0～50/50～100；更优选TFA/TIS/DCM＝10～50/10～50/50～100或者TFA/TES/DCM＝10～50/10～50/50～100或者TFA/TIS/TFE＝10～50/10～50/50～8；最优选TFA/TIS/DCM＝10/10/80。
所述配制试剂中TFA用量不为零；TIS、TES的加入具有更好的效果，它的作用是捕获裂解下来的Mmt，有利于二硫键形成；DCM、TFE等是作为稀释剂使用。
上述技术方案中，步骤2所述Y-Cys(X)-OH中的Y为Fmoc、Boc、H，X为Npys、Pys。其中，当X为Npys时，属于弱酸不敏感保护剂，对游离的半胱氨酸的巯基敏感，因此在脱除Z保护基后，1位Cys的巯基裸露，同时可与Npys保护的Cys反应，有利于二硫键的形成。选用Npys保护基既可保护Cys的巯基不易被氧化，同时又活化了巯基与另一个巯基的反应能力，避免了二硫键的错配和其他的副反应，使步骤2所得的产品易纯化，收率高。
上述技术方案中，步骤2反应时，Y-Cys(X)-OH的反应浓度为0～1mmol/ml，优选0.08～0.16mmol/ml。
上述技术方案中，步骤2反应时，去除树脂、脱除Z保护基、形成二硫键反应同时进行，即将主链从树脂上释放、将主链半胱氨酸的Z保护基脱除以及与Y-Cys(X)-OH反应形成二硫键在固液相结合的反应体系中同时进行。
上述技术方案中，步骤2反应时间为2-8小时，优选2小时。
上述技术方案中，步骤2反应后处理包括过滤除树脂，滤液加入MTBE静置后离心，收集固体，真空干燥得产品。
上述技术方案中，步骤3中全保护目标肽裂解液为下述体积比的组分：TFA/TIS/H2O/EDT＝50～100/0～5/0～5/0～5；优选TFA/TIS/H2O＝50～100/0～5/0～5；最优选TFA/TIS/H2O＝95/5/0.5。
本发明步骤3中全保护目标肽裂解前可以不需要纯化，较现有工艺简单。
上述技术方案中，步骤4中的纯化为高效液相色谱纯化。
本发明AMG416的制备方法的有益效果如下：
本发明所述AMG416的制备方法采用固液相结合的反应体系，对合成AMG416的关键步骤即二硫键的形成进行研究，创造性的将主链肽从树脂上的释放、D-Cys1侧链Z保护基的脱除以及二硫键的形成整合在一个反应体系中同时进行，大大简化了反应操作，与固相二硫键的形成方案相比，不仅缩短反应时间，而且降低了成本；固液相结合的反应体系同时也避免了分子间二硫键的错配，使产品易纯化，收率高，减少因长时间反应造成副产物增加的不良因素，提高了目标肽的纯度，降低了成本，并减少对环境的污染，有利于大规模生产。
具体为：
1、本发明制备方法采用酸敏感型氨基树脂为起始原料，首先采用标准的固相多肽(SPPS)技术合成主链片段，然后采用稀酸裂解液去除1位D-Cys的保护基和树脂的同时与Y-Cys(X)-OH反应形成二硫键，得到全保护肽，随后经裂解、纯化后得到目标肽；
2、相比液相形成二硫键过程，本发明采用固液相结合的方法，避免了液相成二硫键过程中二硫键的错配问题以及后处理繁琐、需多次纯化等问题；
3、相比固相形成二硫键过程，本发明采用固液相结合的方法，缩短了反应周期，降低了生产成本，且减少了部分杂质。
附图说明
图1本发明合成方法流程图。
图2本发明实施例1制备的AMG416HPLC图。
具体实施方式
名词解释：
取代值：指树脂能够承载连接的多肽分子的最大摩尔量，一般是以每克树脂承载连接多肽分子摩尔量来计量；如某树脂的取代值为0.7mmol/g，是指每克此树脂能承载连接0.7mmol的多肽化合物。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，说明但不限制本发明。本发明合成方法流程图见图1，以下实施例均采用上述合成方法制备。
实施例1
(1)肽主链的合成
称取Sieber树脂(5g，取代值为0.69mmol/g树脂)加入到多肽反应器中，加入50ml的DCM洗涤并溶胀树脂；使用20％哌啶/DMF溶液脱除树脂上的Fmoc保护基；DMF洗涤树脂，去除Fmoc副产物以及残余哌啶，茚三酮检测(Kaiser Test)，树脂蓝色，脱保护完全；
称取Fmco-D-Arg(pbf)-OH(3eq，6.7g)，Cl-HoBt(3eq，1.8g)，HBTU(2.9eq，3.8g)溶解于35ml DMF中，然后加入DIEA(3.3eq，1.9ml)搅拌，茚三酮检测反应完成，过滤，DMF洗涤，茚三酮检测，树脂无色透明，缩合反应完全。加入20％哌啶/DMF溶液脱除树脂上Fmoc保护基，DMF洗涤树脂，去除Fmoc副产物以及残余哌啶，茚三酮检测，树脂蓝色，脱保护完全。
按照序列组成，依次称取Fmoc-保护的D-Ala、D-Arg(pbf)、D-Arg(pbf)、D-Arg(pbf)、D-Ala各3eq，活化、缩合、脱保护重复上述过程。
最后一个氨基酸缩合采用DIC/Cl-HoBt组合，称取Fmoc-D-Cys(Mmt)-OH(3eq6.3g)，Cl-HoBt(3eq，1.7g)，溶解于35mlDCM中，然后加入DIC(3eq，1.6ml)搅拌5min后加入至上述树脂中，室温反应，反应使用茚三酮监测缩合完成后，过滤，树脂使用DMF洗涤。
向树脂中加入乙酰化试剂：醋酸酐：吡啶:DCM＝5:5:90共50ml，室温反应30min，反应完成后，过滤，树脂使用DMF洗涤，茚三酮检测乙酰化反应完全。树脂依次经DCM、甲醇洗涤，过滤，真空干燥至恒重，得到11.4g树脂结合肽，HPLC纯度为63.4％，收率为96.4％。
上述过程合成的树脂结合肽的主链结构如下：
Ac-D-Cys1(Mmt)-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Ala-D-Arg(pbf)-Sieber树脂(2)二硫键的形成
称取上述步骤(1)所得肽树脂5.0g(约1.5mmol)，加入至多肽反应器中，加体积比为TFA/TIS/DCM＝10/10/80的稀酸裂解液38ml，然后加入2.3g Boc-Cys(Npys)-OH，室温反应2h，反应完成后滤除树脂，滤液加入MTBE，室温下磁力搅拌30min，静置，3000r/min离心，收集固体，真空干燥，最终获得全保护肽链固体3.1g，收率为95.4％。
上述过程形成的全保护肽链结构如下：
(3)全保护粗肽的裂解
称取上述步骤(2)得到的全保护粗肽3.0g，加入至圆底烧瓶中，加入体积比为TFA/TIS/H2O＝95/5/0.5的裂解液50ml，室温条件下搅拌2.5h。向反应液中加入冰MTBE，静置，3000r/min离心，收集固体，真空干燥所述固体，然后将所述固体溶于100ml 5％乙腈/水中，冷冻干燥，最终获得粗肽1.4g，收率为96％，粗品HPLC检测纯度为69.5％。
上述裂解过程形成的AMG416产品结构如下：
(4)AMG416的纯化
50mg AMG416粗品经HPLC纯化，最终得到纯度为99.7％的AMG416纯品25.5mg，收率为51.0％。
实施例1所得AMG416的HPLC图如图2所示。
实施例2
(1)肽主链的合成
称取Sieber树脂(5.0g，取代值为0.69mmol/g树脂)加入到多肽反应器中，加入50ml DCM洗涤并溶胀树脂，过滤后加入20％哌啶/DMF溶液脱除Fmoc保护基；然后加入DMF洗涤树脂，茚三酮检测(Kaiser Test)，树脂蓝色，脱保护完全。
称取Fmco-D-Arg(pbf)-OH(3eq，6.7g)，Oxyma(4.5eq，2.2g)，溶于35ml DMF中，然后加入DIC(6eq，3.2ml)，搅拌后加入至上述多肽反应器中，室温反应，反应过程取小样，使用茚三酮监测缩合完成后，过滤，DMF洗涤树脂，茚三酮检测，树脂无色透明，缩合反应完全。加入20％哌啶/DMF溶液脱除Fmoc保护基，DMF洗涤树脂，茚三酮检测，树脂蓝色，脱保护完全。
按照序列组成，依次称取Fmoc-保护的D-Ala、D-Arg(pbf)、D-Arg(pbf)、D-Arg(pbf)、D-Ala各3eq，活化、缩合、脱保护重复上述过程。
最后一个氨基酸缩合剂采用DIC/Cl-HoBt组合，称取Fmoc-D-Cys(Mmt)-OH(3eq6.4g)，Cl-HoBt(3eq，1.8g)，溶解于35mlDCM中，然后加入DIC(3eq，1.6ml)搅拌5min后加入至上述树脂中，室温反应，反应过程取小样，使用茚三酮监测缩合反应完成，过滤，DMF洗涤树脂，茚三酮检测，树脂无色透明，缩合反应完全。
向树脂中加入乙酰化试剂：醋酸酐：吡啶:DCM＝5:5:90共50ml，室温反应30min，过滤树脂，DMF洗涤树脂，茚三酮检测，树脂无色透明，乙酰化反应完全。树脂依次经DCM、甲醇洗涤，过滤，真空干燥至恒重，得到11.4g树脂结合肽，HPLC纯度为62.5％，收率为96.4％。
上述过程合成的树脂结合肽的主链结构如下：
Ac-D-Cys1(Mmt)-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Ala-D-Arg(pbf)-Sieber树脂(2)二硫键的形成
称取上述步骤(1)所得肽树脂5.0g(约1.5mmol)，加入至多肽反应器中，加入体积比为TFA/TIS/DCM＝10/10/80的稀酸裂解液38ml，和2.3g Boc-Cys(Npys)-OH，室温反应2h，反应完成后滤除树脂，滤液中加入MTBE，搅拌，静置，3000r/min离心，收集固体，真空干燥，获得全保护肽链固体3.1g，收率为92.3％。
上述过程形成的全保护肽链结构如下：
(3)全保护粗肽的裂解
称取上述步骤(2)得到的全保护粗肽3.0g，加入至圆底烧瓶中，加入体积比为TFA/TISH2O＝95/5/0.5的/裂解液50ml，室温条件下搅拌，反应2.5h。反应完成后，向反应液中加入冰MTBE，搅拌，静置，3000r/min离心，收集固体，真空干燥所述固体，然后将所述固体溶于70ml 5％乙腈/水中，冷冻干燥，最终获得粗肽1.44g，收率为99.6％，粗品HPLC检测纯度为71.5％。
上述裂解过程形成的AMG416产品结构如下：
(4)AMG416的纯化
45.3mg AMG416粗品经HPLC纯化，最终得到纯度为99.5％的AMG416纯品22.9mg，收率为50.5％。
实施例3
(1)肽主链的合成
称取Sieber树脂(2.0g，取代值为0.69mmol/g树脂)加入到多肽反应器中，加入20mlDCM洗涤并溶胀树脂，过滤后加入20％哌啶/DMF溶液脱除Fmoc保护基；然后加入DMF洗涤树脂，去除Fmoc副产物以及残余哌啶，茚三酮检测(Kaiser Test)，树脂蓝色，脱保护完全；
将Fmco-D-Arg(pbf)-OH(3eq，2.7g)，Cl-HoBt(3eq，0.7g)，溶解于7ml DMF中，然后加入DIC(3eq，0.7ml)，搅拌后加入至上述多肽反应器中，室温反应，反应过程取小样，使用茚三酮监测缩合完成全，过滤树脂，DMF洗涤树脂，茚三酮检测，树脂无色透明，缩合反应完全。加入20％哌啶/DMF溶液脱除Fmoc保护基，然后使用DMF洗涤树脂，去除Fmoc副产物以及残余哌啶，茚三酮检测，树脂蓝色，脱保护完全。
按照序列组成，依次称取Fmoc-保护的D-Ala、D-Arg(pbf)、D-Arg(pbf)、D-Arg(pbf)、D-Ala、D-Cys(Mmt)各3eq，活化、缩合、脱保护重复上述过程。然后向树脂中加入乙酰化试剂：醋酸酐：吡啶:DCM＝5:5:90共20ml，室温反应30min，反应完成后，过滤洗涤树脂，茚三酮检测，树脂无色透明，乙酰化反应完全。树脂依次用DCM、甲醇再洗涤，过滤，真空干燥至恒重，得到4.3g树脂结合肽，HPLC纯度为61.3％，产率为90％。
上述过程合成的树脂结合肽的主链结构如下：
Ac-D-Cys1(Mmt)-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Ala-D-Arg(pbf)-Sieber树脂(2)二硫键的形成
称取上述步骤(1)所得肽树脂1.0g，加入至多肽反应器中，加入体积比为TFA/TIS/DCM＝10/10/80的稀酸裂解液8ml，然后加入0.5g Boc-Cys(Npys)-OH(4eq，约1.28mmol)，室温反应2h，过滤，滤液加入MTBE，室温下搅拌，静置，3000r/min离心，弃上清，收集固体，真空干燥，最终获得全保护肽链固体0.63g，收率为97.3％。
上述过程形成的全保护肽链结构如下：
(3)全保护粗肽的裂解
称取上述步骤(2)得到的全保护粗肽0.5g，加入至圆底烧瓶中，加入体积比为TFA/TIS/H2O＝95/5/0.5的裂解液0.5ml，室温下搅拌2.5h。向反应液中加入冰MTBE，有白色固体产生，静置，3000r/min离心，收集固体，真空干燥所述固体，然后将所述固体溶于10ml 5％乙腈/水中，冷冻干燥，最终获得粗肽235mg，收率为97.5％，粗品HPLC检测纯度为66.3％。
上述裂解过程形成的AMG416产品结构如下：
(4)AMG416的纯化
45mg AMG416粗品经HPLC纯化，最终得到纯度为99.5％的AMG416纯品22.6mg，收率为50.2％。
实施例4
(1)肽主链的合成
肽主链的合成过程类似实施例1，合成的树脂结合肽的主链结构如下：
Ac-D-Cys1(Mmt)-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Ala-D-Arg(pbf)-Sieber树脂(2)二硫键的形成
称取步骤(1)所得肽树脂1.0g，加入至多肽反应器中，加入体积比为TFA/TIS/DCM＝10/10/80的稀酸裂解液8ml，然后加入0.480g Boc-Cys(Npys)-OH(约1.28mmol)，反应液浓度为0.16mmol/ml，室温搅拌2h，过滤，滤液加入MTBE，室温搅拌30min，静置，3000r/min离心，弃上清，收集固体，真空干燥，最终获得全保护肽链固体0.63g，收率为97.6％。
上述过程形成的全保护肽链结构如下：
(3)全保护粗肽的裂解
称取步骤(2)得到的全保护粗肽0.5g，加入至圆底烧瓶中，加入体积比为TFA/TIS/H2O＝95/5/0.5的裂解液0.5ml，室温下搅拌2.5h。向反应液中加入冰MTBE，有白色固体产生，静置，3000r/min离心，收集固体，真空干燥所述固体，然后将所述固体溶于10ml 5％乙腈/水中，冷冻干燥，最终获得AMG416粗肽232mg，收率为96.4％，粗品HPLC检测纯度为66.3％。
上述裂解过程形成的AMG416产品结构如下：
(4)AMG416的纯化
取上述(3)所得的AMG416粗品42.5mg经HPLC纯化，最终得到纯度为99.3％的AMG416纯品21.4mg，收率为50.4％。
实施例5
(1)肽主链的合成
肽主链的合成过程类似实施例1，合成的树脂结合肽的主链结构如下：
Ac-D-Cys1(Mmt)-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Ala-D-Arg(pbf)-Sieber树脂(2)二硫键的形成
称取步骤(1)所得肽树脂1.0g，加入至多肽反应器中，加入体积比为TFA/TIS/DCM＝10/10/80的稀酸裂解液8ml，然后加入0.2g Boc-Cys(Npys)-OH(约0.64mmol)，反应液浓度为0.08mmol/ml，室温反应2h，滤除树脂，滤液加入MTBE中沉淀，室温搅拌，静置，3000r/min离心，弃上清，收集固体，真空干燥，最终获得全保护肽链固体0.60g，收率为92.3％。
上述过程形成的全保护肽链结构如下：
(3)全保护粗肽的裂解
称取步骤(2)得到的全保护粗肽0.5g，加入至圆底烧瓶中，加入体积比为TFA/TIS/H2O＝95/5/0.5的裂解液0.5ml，室温下搅拌2.5h。反应液中加入冰MTBE，有白色固体产生，室温，静置，3000r/min离心，收集固体，真空干燥所述固体，然后将所述固体溶于10ml 5％乙腈/水中，冷冻干燥，最终获得AMG416粗肽228mg，收率为94.8％，粗品HPLC检测纯度为52.4％。
上述裂解过程形成的AMG416产品结构如下：
(4)AMG416的纯化
取上述(3)所得的AMG416粗品47mg经HPLC纯化，最终得到纯度为99.3％的AMG416纯品23.6mg，收率为50.2％。
实施例6
(1)主链Mmt的脱除
称取实施例1中步骤(1)所得肽树脂5.0g(约1.5mmol)，加入至圆底烧瓶中，加入体积比为TFA/TIS/DCM＝1/2.5/96.5的裂解液50ml，室温条件下搅拌2.5h。过滤收集滤液，直接加入冰MTBE沉淀，静置，3000r/min离心，收集固体，真空干燥，得到固体1.54g，收率为50.0％。
上述过程形成的肽主链结构如下：
(2)二硫键的形成
称取上述步骤(1)得到的全保护粗肽1.54g，加入至圆底烧瓶中，加入Boc-Cys(Npys)-OH1.12g，加入体积比为TFA/TIS/DCM＝10/10/80的反应液38ml，室温条件下搅拌1.5h。然后过滤，收集滤液，加入冰MTBE，静置，3000r/min离心，收集固体，真空干燥得到固体1.31g，收率为77％。
上述二硫键形成的产品结构如下：
(3)全保护粗肽的裂解
称取上述步骤(2)得到的全保护粗肽1.31g，加入至圆底烧瓶中，加入体积比为TFA/TIS/H2O＝95/5/0.5的裂解液13ml，室温下搅拌2.5h。向反应液中加入冰MTBE，有白色固体产生，静置，3000r/min离心，收集固体，真空干燥所述固体，然后将所述固体溶于30ml5％乙腈/水中，冷冻干燥，最终获得粗肽0.53g，收率为89％。
上述裂解过程形成的AMG416产品结构如下：
(4)AMG416的纯化
取上述步骤(3)所得的AMG416粗品530mg经HPLC纯化，最终得到纯度为99.5％的AMG416纯品185mg，收率为35％。
本说明书和权利要求书所使用的缩写的含义如下所示：
英文缩写 中文含义 英文缩写 中文含义
Fmoc 9-芴甲氧羰基 DIC N,N-二异丙基碳二亚胺
Boc 叔丁氧羰基 TFA 三氟乙酸
HPLC 高效液相色谱 DMF N,N-二甲基甲酰胺
TIS 三异丙基硅烷 DIEA N,N-二异丙基乙胺
TES 三乙基硅烷 DCM 二氯甲烷
TFE 三氟乙醇 Pys 2-吡啶基硫
HBTU 苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐 HOBt 1-羟基苯并三唑
PyBOP 六氟磷酸苯并三氮唑-1-基-氧基三吡咯烷基 Cl-HOBt 6-氯1-羟基苯并三唑
Oxyma 2-肟氰乙酸乙酯 EDT 1，2-乙二硫醇
Pbf 2,2,4,6,7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基 MTBE 甲基叔丁基醚
Trt 三苯甲基 Npys 3-硝基-2-吡啶基硫
Tmob 2，4，6-三甲氧苄基 Mmt 4-甲氧基三苯甲基
Sieber树脂 芴甲氧羰基-氨基-吨-3-氧代-甲基树脂

Claims (10)

1.一种固液相结合制备AMG416的方法，其特征在于，包括如下步骤：首先使用酸敏感氨基树脂作为固相载体制备全保护的主链肽树脂；随后向肽树脂中加入稀酸裂解液，同时加入Y-Cys(X)-OH，选择性去除树脂和稀酸不稳定保护基的同时形成二硫键得到全保护目标肽；最后经裂解、纯化得到AMG416精肽。
2.根据权利要求1所述的固液相结合制备AMG416的方法，其特征在于，所述固相载体选自Sieber树脂、Rink Amide-MBHA树脂、Rink Amide-AM树脂、Rink Amide树脂；优选Sieber树脂。
3.根据权利要求1或2所述的固液相结合制备AMG416的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)固相制备氮端乙酰化的全保护的主链肽树脂；所述主链肽树脂为Ac-D-Cys1(Z)-D-Ala-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Ala-D-Arg(pbf)-Sieber树脂；
(2)向主链肽树脂中加入稀酸裂解液，去除树脂和主链半胱氨酸的Z保护基，同时加入Y-Cys(X)-OH，形成二硫键得到全保护目标肽；
所述全保护目标肽为：
(3)全保护目标肽经过裂解去除所有侧链保护基得到目标肽粗品：
(4)粗肽经纯化得到AMG416。
4.根据权利要求1-3任一项所述的固液相结合制备AMG416的方法，其特征在于，步骤(1)中：固相制备氮端乙酰化的全保护主链肽树脂，按照主链肽序列组成，将相应氨基酸偶联在固相载体上，得到主链肽树脂。
5.根据权利要求1-4任一项所述的固液相结合制备AMG416的方法，其特征在于，步骤(1)中肽主链树脂偶联时所使用的缩合剂为HBTU/Cl-HoBt/DIEA、DIC/HoBt、Oxyma/DIC或PyBOP/HoBt/DIEA的一种或多种；
优选的，所述HBTU/Cl-HoBt/DIEA各组分摩尔比为0.5～1.5/0.5～1/1～2，进一步优选0.97/1/1.1；
优选的，所述DIC/HoBt各组分摩尔比为0.5～1.5/0.5～1.5，进一步优选1/1；
优选的，Oxyma/DIC各组分摩尔比为1～3/1～3，进一步优选1.5/2；
优选的，PyBOP/Cl-HoBt/DIEA各组分摩尔比为0.5～1.5/0.5～1/1～2，进一步优选0.97/1/1.1；更优选的，第1位氨基酸缩合优选DIC/HoBt；其他位点氨基酸缩合采用HBTU/Cl-HoBt/DIEA、Oxyma/DIC或PyBOP/Cl-HoBt/DIEA；其他位点氨基酸缩合优选HBTU/Cl-HoBt/DIEA或Oxyma/DIC。
6.根据权利要求1-5任一项所述的固液相结合制备AMG416的方法，其特征在于，步骤(1)第1位D-Cys的Z保护基为Mmt、Tmob；优选Mmt保护基。
7.根据权利要求1-6任一项所述的固液相结合制备AMG416的方法，其特征在于，步骤(2)中稀酸裂解液包括TFA和TIS、TES、TFE、DCM的一种或多种；
作为优选，其组成体积比为TFA/TIS/DCM＝0～50/0～50/50～100或者TFA/TIS/TFE＝0～50/0～50/50～100或者TFA/TES/DCM＝0～50/0～50/50～100；更优选TFA/TIS/DCM＝10～50/10～50/50～100或者TFA/TES/DCM＝10～50/10～50/50～100或者TFA/TIS/TFE＝10～50/10～50/50～80；最优选TFA/TIS/DCM＝10/10/80。
8.根据权利要求1-7任一项所述的固液相结合制备AMG416的方法，其特征在于，步骤(2)中Y-Cys(X)-OH中的Y为Fmoc、Boc、H，优选Boc；X为Npys、Pys，优选Npys。
9.根据权利要求1-8任一项所述的固液相结合制备AMG416的方法，其特征在于，步骤(2)中Y-Cys(X)-OH的反应浓度为0～1mmol/ml，优选0.08～0.16mmol/ml。
10.根据权利要求1-9任一项所述的固液相结合制备AMG416的方法，其特征在于，步骤(3)中全保护目标肽裂解时的裂解液组分体积比为：TFA/TIS/H2O/EDT＝50～100/0～5/0～5/0～5；优选TFA/TIS/H2O＝50～100/0～5/0～5；更优选TFA/TIS/H2O＝95/5/0.5。
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