CN103517712A - 神经肽类似物、组合物和治疗疼痛的方法 - Google Patents

神经肽类似物、组合物和治疗疼痛的方法 Download PDF

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Abstract

本申请描述了神经肽类似物和包括该神经肽类似物的组合物。本申请还提供了生产和使用所述神经肽类似物和包括一种或多种神经肽类似物的组合物的方法。

Description

神经肽类似物、组合物和治疗疼痛的方法
附图概述
图1显示了根据本发明所描述的MEG化神经肽类似物的类似物的结构。
图2显示了根据本发明所描述的合成神经肽类似物的一种实施方式。
图3显示了根据本发明所描述的合成神经肽类似物的另一种实施方式
图4显示了根据本发明所描述而制备的MEG化甘丙肽类似物Gal-93的结构。
图5是显示通过小鼠腹部收缩检测所示的甘丙肽类似物gal-93的镇痛活性的图。
图6是显示通过小鼠腹部收缩检测所示的神经肽Y类似物NPY-B42的镇痛活性的图。
图7是显示通过大鼠部分坐骨神经结扎检测所示的甘丙肽类似物Gal-93的镇痛活性的图。
图8是显示通过大鼠部分坐骨神经结扎检测所示的神经肽Y类似物NPY-B42的镇痛活性的图。
图9显示了使用甘丙肽类似物gal-93的小鼠角叉菜胶检测的结果。
图10显示了使用神经肽类似物NPY-B42的小鼠角叉菜胶检测的结果。
发明详述
本申请描述了神经肽类似物。在某些例子中，本申请描述了神经肽类似物如甘丙肽、神经肽Y、促生长素抑制剂和神经降压素类似物。在其它特定实施方式中，本申请所描述的类似物显示出良好的药理学特性。例如，在某些此类实施方式中，本申请所描述的神经肽类似物是代谢稳定的。在其它此类实施方式中，当全身给药时，神经肽类似物在外周神经系统显示出活性，但是在中枢神经系统未显示出显著活性。在其它实施方式中，本申请所描述的神经肽类似物未显示出心血管毒性。在进一步的此类实施方式中，本申请所描述的神经肽类似物提供了镇痛作用。在特定实施方式中，本申请所描述的神经肽类似物显示出下列特性中的一个或全部：代谢稳定性；当全身给药时，具有外周神经系统活性的同时不具有可检测的中枢神经系统活性；无心血管毒性；和镇痛作用。在特定实施方式中，本申请所描述的神经肽类似物包括至少一个与单分散低聚乙二醇单元连接的氨基酸(即，MEG化氨基酸，或MEG-AA)。
除了神经肽类似物以外，本申请还描述了包括此类类似物的组合物和方法。例如，在特定实施方式中，本申请提供了包括根据本申请所描述的一种或多种神经肽类似物的镇痛组合物，并且本申请描述了使用此类镇痛组合物的方法。在特定实施方式中，本申请提供了治疗疼痛的方法，此类方法包括给予所需对象治疗有效量的包括本申请所描述的神经肽类似物的镇痛组合物。
应理解：当这些组合物和方法的组合、亚类、相互作用、分组等公开时，尽管没有明确公开各不同个体的具体情况以及这些组合物的组合和排列，但是这些均在本申请中进行了明确地预期和描述。例如，如果公开并讨论了多肽，并且讨论了包括所述多肽的若干分子能够进行的若干修饰，则除非有明确相反的表示，否则就具体预期了多肽的每个组合和排列及其可能的修饰。所以，如果公开了一类分子A、B和C，以及一类分子D、E和F，并公开了组合分子A-D的例子，则即使没有逐一列举，也单独地和全部地预期了每一种情况。所以，在这个例子中，具体地预期了组合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F中的每一个，应认为其是由公开的A、B和C；D、E和F；以及示例性组合A-D所公开的。同样地，也具体地预期和公开了这些的任何亚类或组合。所以，例如具体地预期了A-E、B-F和C-E的亚组，应认为其是由公开的A、B和C；D、E和F；以及示例性组合A-D所公开。此概念适用于本申请的各个方面，包括但不限于制备和使用所公开组合物的方法的步骤。所以，如果有多种可以执行的附加步骤，则应理解为这些附加步骤中的每一个均可以在所公开方法的任意特定实施方式或实施方式的组合中执行，并且具体地预期了每个此类组合，而且应认为已将其公开。
应理解，因为因素是可以改变的，所以所公开的方法和组合物不限于所描述的特定方法、步骤和试剂。还应理解，本申请中使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，其并非旨在限制本发明的范围，本发明的范围将仅由所附的权利要求限定。除非另有定义，否则本申请中使用的所有技术和科学术语均具有本领域技术人员根据本说明书上下文通常所理解的含义。
必须指出的是，除非上下文另有清楚地规定，否则本申请和所附权利要求中使用的单数形式的“一”、“一个”和“该”包括复数形式。所以，例如“肽”包括多个这样的肽；“肽”指一个或多个肽以及本领域技术人员公知的其等同物等等。
“任选的”或“任选地”指随后描述的事件、情况或材料可以或可以不发生或存在，并且该描述包括所述事件、情况或材料发生或存在的情况，以及其未发生或不存在的情况。
本申请中可以将范围表示为从“约”一个特定值，和/或至“约”另一个特定值。当表示这样的范围时，另一个实施方式包括从一个特定值和/或至其它特定值。类似地，当通过在其前面使用“约”表示近似值时，应理解所述特定值形成另一个实施方式。应进一步理解，所述范围的各端点无论是相对于其它端点或者独立于其它端点均是有意义的。还应理解本申请公开了一些值，除了所述值本身以外，本申请还公开了“约”该特定值的各值。例如，如果公开了值“10”，则也公开了“约10”。还应理解，当公开了某值，则根据本领域技术人员适当的理解，还公开了“小于或等于”该值，“大于或等于该值”以及值之间可能的范围。例如，如果公开了值“10”，则也公开了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。还应理解，在整个申请中，数据以多种不同形式提供，该数据表示终点和起点，以及所述数据点任意组合的范围。例如，如果公开了特定的数据点“10”和特定的数据点15，则应理解认为也公开了大于、大于或等于、小于、小于或等于、等于10和15以及10和15之间。还应理解在两个特定数字单元之间的各数字单元也被公开了。例如，如果公开了10和15，也公开了11、12、13和14。
作为本申请所使用的术语“蛋白”和“肽”用于仅指普遍的多肽分子，不用于指具有特定尺寸、长度或分子量的多肽分子。蛋白变体和衍生物是本领域技术人员所公知的，并且其可能涉及氨基酸序列的修饰。氨基酸取代可以包括一个或多个残基，并且其可能同时出现在多个不同的位点。取代、缺失、插入或其任意组合可以在最终的构建体中组合出现。取代变体是指在其中除去至少一个残基，并且在其位置上插入不同残基。
应理解，如本申请所讨论的，使用术语“同源性”和“同一性”指相同事物的“相似性”。所以，例如，如果在两条序列之间使用同源性这个词，应理解其并不必然表明这两条序列之间的进化相关性，而是指核酸序列之间的相似性或相关性百分率。例如，某个肽可以与对照氨基酸序列具有至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％和99％的同源性。无论这些分子是否具有进化相关性，均可以使用多种用于测定两个进化相关的分子之间同源性的方法，常规地测定任意两个或多个核酸序列或氨基酸序列的同一性或相似性。
应理解，定义本申请公开的MEG化神经肽类似物的类似物、变体和衍生物的一种方法是通过定义所述类似物、变体和衍生物与特定已知的、天然的和未经修饰的肽序列或者其不含MEG-AA的类似物之间的同一性。仅用于举例目的，本申请公开的神经肽类似物与对照氨基酸序列或天然氨基酸序列，例如未经修饰的甘丙肽多肽序列(例如，SEQ ID NO：1)，具有至少百分之40、50、55、60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99的同一性，并且其中所述神经肽类似物包括至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个或者更多本申请公开的任何取代、缺失、添加或延伸。
计算一种或多种核苷酸或多肽序列的同一性百分率的方法是本领域技术人员所公知的。例如，可以在对两条序列进行比对后计算同一性百分率，以使得同一性处于其最高水平。计算序列相似性或同一性的另一种方法可以通过已公开的算法实施。用于比较的最佳序列比对可以通过Smith和Waterman Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法、Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法、Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2444(1988)的相似性方法研究、这些算法的计算机化实施(Wisconsin遗传学分析软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics ComputerGroup，575 Science Dr.，Madison，Wis.)、或检视。
可以通过，例如Zuker，M.Science 244：48-52，1989，Jaeger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：7706-7710，1989，Jaeger等，Methods Enzymol.183：281-306，1989中公开的算法获得针对核酸的相同类型的同一性和相似性，其中至少是与核酸比对相关的材料通过引用并入本申请。应理解，可以使用任何典型的方法，在某些例子中，这些不同方法的结果可能是不同的，但是本领域技术人员理解如果通过这些方法中的至少一种发现其具有同一性，则将所述序列称为具有所述的同一性，并在本申请中公开。
可以通过选择氨基酸取代来造成多肽功能或免疫学同一性的本质改变，这些氨基酸取代在不同方面起着维持作用，例如(a)在取代区多肽骨架的结构，例如为片层或螺旋结构，(b)在靶位点上分子的电荷或疏水性或者(c)侧链的大部分。可能使蛋白性质发生改变的取代可以包括(a)亲水性残基，例如丝氨酰基或苏氨酰基，被疏水性残基，例如亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、缬氨酰基或丙氨酰基取代，或取代上述疏水性残基；(b)半胱氨酸或脯氨酸被任意其它残基取代，或者取代其它残基；(c)具有正电侧链的残基，例如赖氨酰基、精氨酰基或组氨酰基，被带负电的残基，例如谷氨酰基或天冬氨酰基取代，或者取代上述带负电的残基；或者(d)具有较大侧链的残基，例如苯丙氨酸，被一个不具有侧链的残基，例如甘氨酸取代，或者取代上述不具有侧链的残基，在这种情况下，(e)通过增加硫化和/或糖基化位点的数量。
因为本说明书讨论了不同蛋白和蛋白序列，应理解也公开了能够编码那些蛋白序列的核酸。这将包括与特定蛋白序列相关的所有简并序列，即具有编码某种特定蛋白序列的序列的所有核酸，以及所有公开的编码所述蛋白序列的变体和衍生物的核酸包括简并核酸。所以，尽管在本申请中可能无法列出每个特定的核酸序列，但是应理解每个序列实际上已经通过公开的蛋白序列在本申请中公开和描述了。
应理解有多种能够并入所公开的组合物的氨基酸和肽类似物。例如，有多种D氨基酸或者具有不同功能性取代的氨基酸。公开了天然存在的肽的相反立体异构体，也公开了肽类似物的立体异构体。通过使tRNA分子带有所选的氨基酸，并且设计所使用的基因构建体，例如琥珀密码子，以便通过位点特异性途径将所述氨基酸类似物插入肽链中，可以很容易地将这些氨基酸并入多肽链(Thorson等，Methods in Molec.Biol.77：43-73(1991)，Zoller，Current Opinion in Biotechnology，3：348-354(1992)；Ibba，Biotechnology&GeneticEngineering Reviews 13：197-216(1995)，Cahill等，TIBS，14(10)：400-403(1989)；Benner，TIBTech，12：158-163(1994)；Ibba和Hennecke，Bio/technology，12：678-682(1994)，其全部内容，至少是与氨基酸类似物相关的材料，通过引用并入本申请)。
D-氨基酸可用于产生更加稳定的肽，因为D-氨基酸不被肽酶等所识别。用相同类型的D-氨基酸取代保守序列的一个或多个氨基酸(例如，使用D-赖氨酸取代L-赖氨酸)可以用于产生更加稳定的肽。半胱氨酸残基能够用于将两个或更多个肽环化或连接在一起。这可以有利地将肽限制为特定构象。(Rizo和Gierasch Ann.Rev.Biochem.61：387(1992)，通过引用并入本申请)。
本申请所使用的术语“神经肽”用于指在神经组织中发现的若干类型的多肽分子，包括在脑、脊髓和肠中发现的那些。神经肽参与多种神经功能，包括镇痛、伤害感受、睡眠和清醒调节、认知、进食、情绪调节和血液调节等。具体神经肽的例子为甘丙肽、神经肽Y、神经降压素和促生长素抑制素。甘丙肽是由GAL基因编码的30个氨基酸的神经肽，其在人和其它哺乳动物的CNS和其它组织中表达(参见，例如SEQ ID NO：1)。神经肽Y是由NPY基因编码的36个氨基酸的神经肽，其存在于机体的多种组织包括神经系统中(参见，例如SEQ ID NO：2)。神经降压素是存在于神经系统和肠中的13个氨基酸的神经肽(参见，例如SEQ ID NO：3)。促生长素抑制素是具有14个氨基酸的神经肽，其在神经系统和肠中表达(参见，例如SEQ ID NO：4)。
本申请所描述的神经肽类似物具有至少一个MEG化的氨基酸。本申请所使用的MEG化的氨基酸表示在肽的氨基酸侧链上连接至少一个单分散低聚乙二醇单元。在某些实施方式中，神经肽的对照氨基酸序列中的一个或多个氨基酸被MEG化的氨基酸取代。在某些实施方式中，神经肽的对照氨基酸序列中的至少一个氨基酸被修饰，以使得其与一个或多个单分散低聚乙二醇单元共价连接。本申请所公开的可以MEG化的神经肽及其类似物的例子可以参见美国专利申请，公开号为US 2009/0281031，其全部内容通过引用并入本申请。更特别地，本申请所公开的可以MEG化的神经肽的例子包括甘丙肽、神经肽Y、神经降压素和促生长素抑制素。
本申请所描述的MEG化的过程是将单分散低聚乙二醇与肽的氨基酸共价连接的过程。本申请所使用的MEG化还意味着包括PEG化。在一个实施方式中，本申请所公开的MEG化可以包括将一个或多个单分散聚乙二醇(MPEG)单元与肽中的一个或多个氨基酸连接。在某些实施方式中，本申请所公开的MEG化过程与PEG化过程相似，PEG化过程是本领域技术人员所公知的。
本申请所公开的神经肽类似物包括MEG化的氨基酸，用于形成所述MEG化的氨基酸的至少一个单分散低聚乙二醇单元包括2个或更多个乙二醇重复。在一个实施方式中，根据本公开的神经肽类似物可以包括一个或多个具有单分散低聚乙二醇单元的氨基酸，所述单分散低聚乙二醇单元包括至少2至48个乙二醇重复。在一个此类实施方式中，神经肽类似物可以包括一个或多个MEG化的氨基酸，其中各个MEG化的氨基酸包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47和48个或更多个乙二醇重复。在另一个实施方式中，本申请公开的神经肽类似物可以包括具有单分散低聚乙二醇单元的MEG化的氨基酸，所述单分散低聚乙二醇单元包括2至48个单分散聚乙二醇(MPEGn＝2-48)重复。在一个此类实施方式中，本申请所描述的神经肽类似物可以包括至少一个具有单分散聚乙二醇单元的MEG化的氨基酸，所述单分散低聚乙二醇单元包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47和48个MPEG重复的。
本申请所提供的神经肽类似物可以在一个或多个任意氨基酸位点MEG化。在一个实施方式中，本申请所提供的甘丙肽类似物可以在所述甘丙肽神经肽的一个或多个氨基酸位点MEG化。在特定实施方式中，甘丙肽类似物可以在氨基酸位点1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30中的任意一个MEG化，从甘丙肽类似物N-(氨基)末端到C-(羧基)末端进行编号。在某些实施方式中，本申请所提供的神经降压素类似物可以在所述神经降压素类似物的任意一个氨基酸位点MEG化。更特别地，所述神经降压素类似物可以在氨基酸位点1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13中的任意一个MEG化。在另一个实施方式中，本申请所提供的神经肽Y类似物可以在所述神经肽Y类似物的任意一个氨基酸位点MEG化。在一个此类实施方式中，所述神经肽Y类似物可以在氨基酸位点1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35和36中的任意一个MEG化。在又一个实施方式中，促生长素抑制素类似物，如天然肽或其非天然类似物，例如奥曲肽，可以在所述促生长素抑制素神经肽的一个或多个氨基酸位点MEG化。在一个特定实施方式中，所述促生长素抑制素类似物可以在氨基酸位点1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13和14中的任意一个MEG化。
在某些实施方式中，本申请所公开的神经肽类似物可以在位于所述神经肽的C-末端、N-末端或任选地在C-末端和N-末端的一个或多个氨基酸上MEG化。在特定实施方式中，MEG化的神经肽类似物可以包括全长的肽或者截短的肽，其中在所述肽中的任意一个氨基酸可以是MEG化的。
在一个实施方式中，仅用于举例，截短的甘丙肽类似物，例如SEQ ID NO：5所示的甘丙肽类似物，可以用于本申请所公开的组合物和方法中。在另一个实施方式中，截短的甘丙肽类似物可以包括Gly1残基，其被N-甲基-甘氨酸(肌氨酸，SAR)所取代。Gly1的N-甲基化可以保护肽，使其免于始于N-末端的加速蛋白水解降解，以改善所述甘丙肽类似物的代谢稳定性。在另一个实施方式中，仅用于举例，截短的甘丙肽类似物，如本申请所描述的甘丙肽类似物，例如SEQ ID NO：6所示的甘丙肽类似物，可以包括C-末端延伸或添加。
在一个实施方式中，本申请所公开的MEG化的神经肽类似物可以包括一个或多个末端赖氨酸(Lys)、均聚-Lys和/或鸟氨酸氨基酸。在某些实施方式中，本申请所描述的MEG化的神经肽类似物包括一个或多个末端Lys氨基酸。在一个此类实施方式中，神经肽类似物在所述甘丙肽类似物的C-末端可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个Lys氨基酸。在另一个本申请所描述的甘丙肽类似物的此类实施方式中，一个或多个末端lys氨基酸可以包括与一个或多个末端Lys氨基酸共价连接的单分散低聚乙二醇单元。
在某些实施方式中，本申请所公开的神经肽类似物是MEG化的甘丙肽类似物，其在所述甘丙肽类似物的C-末端包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或者更多个Lys氨基酸。在一个此类实施方式中，一个或多个末端Lys氨基酸可以包括与所述一个或多个末端Lys氨基酸共价连接的单分散低聚乙二醇单元。
在其它实施方式中，本申请所公开的神经肽类似物是MEG化的神经肽Y类似物，其在所述神经肽Y类似物的N-末端包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或者更多个Lys氨基酸。在一个此类实施方式中，一个或多个末端Lys氨基酸可以包括与所述一个或多个末端Lys氨基酸共价连接的单分散低聚乙二醇单元(参见，例如图1中的SEQ ID NO：17)。
在其它实施方式中，本申请所公开的神经肽类似物是MEG化的神经降压素，其在所述神经降压素类似物的C-末端包括至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或者更多个Lys氨基酸。在一个此类实施方式中，一个或多个末端Lys氨基酸可以包括与所述一个或多个末端Lys氨基酸共价连接的单分散低聚乙二醇单元(参见，例如图1中的SEQ ID NO：18)。
本申请还公开了包括氨基酸取代和添加的神经肽类似物，其中是用天然或非天然存在物质进行的取代或添加。例如包括但不限于肌氨酸(Sar)、二氨基丁酸(DAB)、二氨基庚二酸(DAP)、Lys-棕榈酰(Lys-Palm)、Lys-α-亚麻酸(Lys-α-Lnn)、氯代-phe、氨基己酸(AHX)、全氟己酸(PerFHX)、8-氨基-3，6-二氧杂辛酸、寡-Lys和叔亮氨酸。
在特定实施方式中，本申请所公开的神经肽类似物是代谢稳定的。本申请所使用的术语“代谢稳定性”和“代谢稳定的”指与对照序列，野生型的肽，未经改变的、未经修饰的、或天然的肽，或者对照组合物相比，对降解具有更强的耐受和具有更长的循环半衰期的神经肽类似物。例如，与对照、未经修饰的、天然的、或野生型的神经肽或者组合物相比，根据测得的血清或体外半衰期，代谢稳定性增加的比率可以是百分之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3500或4000。
在某些实施方式中，本申请所公开的MEG化的神经肽类似物在外周神经系统中表现出活性，但是没有可检测的中枢神经系统活性或不能透过血脑屏障。例如，在某些实施方式中，当全身给药时，本申请所描述的神经肽类似物表现出镇痛活性，但没有可检测的中枢神经系统活性或不能透过血脑屏障。不囿于特定理论，目前认为本申请所描述的神经肽类似物氨基酸侧链的MEG化阻止了所述神经肽类似物透过血脑屏障并作用于中枢神经系统。因此，此类神经肽类似物减少或消除了与进入CNS相关的潜在毒性或副作用。在特定实施方式中，可以使用体内癫痫模型评估肽透过血脑屏障的能力。
本申请提供了生产本申请所描述的神经肽类似物的方法。对于本申请所描述的MEG化的神经肽类似物的某些实施方式而言，可以在使用自动肽合成仪，在固相肽合成时引入本申请所公开的氨基酸修饰。在一个此类实施方式中，生产所公开的神经肽类似物的方法包括通过蛋白化学技术将两个或多个肽、或多肽连接在一起。例如，可以使用目前可以利用的实验室设备通过Fmoc(9-芴甲氧羰基)或Boc(叔丁氧羰基)化学技术(AppliedBiosystems，Inc.，Foster City，Calif.)化学合成肽或多肽。本领域技术人员能够容易地理解，可以通过，例如标准化学反应，合成与所公开的神经肽类似物对应的肽或多肽。例如，可以合成肽或多肽并且不将其从合成树脂上裂解，反之可以合成肽或蛋白的其它片段并且随后将其从树脂上裂解，从而暴露功能性阻断其它片段的末端基团。通过肽缩合反应，可以通过肽键分别在其羧基和氨基末端将这两片段共价连接，以形成蛋白或蛋白的片段。(Grant G A(1992)Synthetic Peptides：A User Guide.W.H.Freeman and Co.，N.Y.(1992)；Bodansky M和Trost B.，Ed.(1993)Principles of Peptide Synthesis.Springer-Verlag Inc.，NY，至少与肽合成相关的材料通过引用并入本申请)。任选地，所述肽或多肽可以在体内独立地合成。一旦分离，可以通过类似的肽缩合反应将这些独立的肽或多肽连接以形成肽或肽片段。
在另一个实施方式中，可以根据克隆的或合成的肽片段的酶连接合成MEG化的神经肽类似物，以使得相对较短的肽片段连接产生更长的肽片段、多肽或完整的蛋白结构域(Abrahmsen L等，Biochemistry，30：4151(1991))。任选地，可以利用合成肽的天然化学连接从较短的肽片段合成构建更大的肽或多肽。这种方法由两步化学反应组成(Dawson等，Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation.Science，266：776-779(1994))。第一步是未保护的合成肽-硫酯与另一个含有氨基末端Cys残基的未保护的肽片段的化学选择性反应，以制备作为初始共价产物的硫酯连接的中间体。在反应条件不变的情况下，该中间体经过自发的、快速的分子内反应在连接位点形成天然的肽键(Baggiolini M等，(1992)FEBS Lett.307：97-101；Clark-Lewis I等，J.Biol.Chem.，269：16075(1994)；Clark-Lewis I等，Biochemistry，30：3128(1991)；Rajarathnam K等，Biochemistry 33：6623-30(1994))。
任选地，可以根据所述方法生产MEG化的神经肽类似物，其中未保护的肽片段在肽片段之间形成键的地方进行化学连接，所述化学连接产生的键是非天然(非-肽)的键(Schnolzer，M等，Science，256：221(1992))。这种技术已用于合成蛋白结构域的类似物和大量具有完全生物活性的相对纯的蛋白(deLisle Milton R C等，Techniques in ProteinChemistry IV.Academic Press，New York，pp.257-267(1992))。
可以制备包括根据本发明的一个或多个神经肽类似物的镇痛组合物。在特定实施方式中，本申请所描述的镇痛组合物以药物组合物的形式提供，其可以包括，例如本申请所描述的一种或多种MEG化的神经肽类似物及药学上可接受的载体。在一个此类实施方式中，本申请所描述的镇痛组合物可以包括MEG化的甘丙肽类似物。在另一个此类实施方式中，本申请所描述的镇痛组合物可以包括MEG化的神经肽Y类似物。在又一个此类实施方式中，本申请所描述的镇痛组合物可以包括MEG化的神经降压素类似物。在又一个实施方式中，本申请所描述的镇痛组合物可以包括MEG化的促生长素抑制素类似物。
本申请所使用的术语“药学上可接受的”指不是在生物学或其它方面不能接受的材料，即所述材料可以给予对象，而不会引起任何不利的生物学作用或不会以有害方式与所述药物组合物中含有的其它任何成分发生相互作用。适于给予人或动物对象的载体的例子包括溶液，如在无菌水、盐水和在生理pH的缓冲溶液。自然会选择使一种或多种神经肽类似物的降解最少和使对象中任何的不良副作用最少的载体。适于治疗用途的药学上可接受的载体、赋形剂和稀释剂是药物领域所公知的，在例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，Maack Publishing Co.(A.R.Gennaro(Ed.)1985)中对其进行了描述。
可以通过任何有效途径，例如口服或胃肠外给药，实现本申请所描述的镇痛组合物的给药。胃肠外递送的方法包括，例如动脉内、皮下、髓内、静脉内、肌内、胸骨内、海绵体内、鞘内、耳道内、尿道内注射或输注技术，以及鼻内、舌下、口腔、直肠和阴道给药。
可以采用领域公知的药学上可接受的载体以适于口服的剂量对本申请所描述的供口服给药的镇痛组合物进行制剂。此类载体能够将所述镇痛组合物制成适于对象摄入的片剂、丸剂、糖锭剂、胶囊、液体、凝胶、糖浆剂、浆液、混悬液等。
可以通过，例如将一种或多种神经肽类似物化合物与固体赋形剂通过，例如公知的制粒工艺，提供适于压片或填入胶囊的组合物，以获得供口服给药的镇痛组合物。在其它实施方式中，可以通过将一种或多种神经肽类似物化合物与固体赋形剂进行组合，任选地研磨所得到的混合物，并处理颗粒混合物，如有需要，随后加入适宜的其它化合物，以获得片剂或糖锭剂的芯，从而获得如本申请所描述的供口服给药的镇痛组合物。适于制备供口服给药的镇痛组合物的赋形剂的例子包括糖类或蛋白填充剂。此类赋形剂包括但不限于：糖类，包括乳糖，蔗糖，甘露醇，或山梨醇，玉米、小麦、大米、马铃薯、或其它植物淀粉；纤维素，如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素钠；和树胶包括阿拉伯胶和西黄耆胶；以及蛋白如明胶和胶原。如有需要，可以加入崩解剂或增溶剂，如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或它们盐(如海藻酸钠)。在使用糖衣片的芯对本申请所描述的镇痛组合物的制药配方进行制剂时，可以为这种芯提供适宜的包衣，如浓缩的糖溶液，其还可以含有，例如阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇、和/或二氧化钛、涂膜溶液和适宜的有机溶剂或溶剂混合物。
在进一步的实施方式中，适于口服给药的镇痛组合物可以制成，例如由明胶制成的推入-适配胶囊(push-fit capsule)，以及由明胶制成并涂覆甘油或山梨醇的密封软胶囊。推入-适配胶囊可以含有一种或多种镇痛化合物与，例如填充剂或粘合剂(如乳糖或淀粉)、润滑剂(如滑石粉或硬脂酸镁)、和任选地稳定剂混合。在软胶囊中，可以将一种或多种神经肽类似物溶解或混悬于适宜液体中，如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇，其中可以加入或不加入稳定剂。
当所述镇痛组合物以用于口服给药的药物组合物或剂型提供时，此类组合物可以任选地包括一种或多种药学上可接受的甜味剂、防腐剂、着色剂、矫味剂或其任意组合。当所述组合物是固体形式的单位剂型(如片剂)时，所述组合物可以包括芯，所述芯覆盖有一层或多层本领域的所公知的保护性、功能性或装饰性的包衣。而且，在特定实施方式中，可以在口服剂型，或包括在或覆盖于此类剂型的包衣中加入染料或色素，用于产品识别或确定活性化合物的量(即，剂量)。
在特定实施方式中，用于胃肠外给药的镇痛组合物包括一种或多种MEG化的神经肽类似物化合物。用于注射时，可以将本申请所描述的镇痛组合物制成水性溶液，优选在生理相容性缓冲液中如Hank′s液、林格氏液或生理缓冲盐水。水性注射混悬液可以含有增加所述混悬液粘度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或右旋糖酐。另外，可以将混悬液制成适宜的油性注射混悬液。适宜的亲脂性溶剂或载体包括脂肪油(如芝麻油)、或合成脂肪酸酯(如油酸乙酯或甘油三酯)、或脂质体。任选地，当将镇痛组合物制成混悬剂时，所述组合物还可以含有适宜的稳定剂或增加一种或多种神经肽类似物化合物溶解度的试剂，以使得能够制备成高浓度的制剂。
可以根据本领域公知的技术(例如，通过常规混合、溶解、制粒、制备糖衣片(dragee-making)、水飞、乳化、包封、包埋或冻干工艺)生产本发明所描述的镇痛组合物。在特定实施方式中，还可以通过常规方法(例如，通过使用功能性包衣和/或提供活性剂的缓释或靶向释放的已知基质或材料)对本申请所描述的镇痛组合物进行修饰以提供适宜的释放特性，例如缓释或靶向释放。在本申请所描述的镇痛组合物制备后，可以将其放在适宜容器中并贴上标签用来使用。
本申请提供了治疗疼痛和其它神经疾病的方法。在特定实施方式中，本申请所描述的方法包括根据本说明书给予所需对象治疗有效量的根据本发明所描述的镇痛组合物。在某些实施方式中，所述方法可以进一步包括识别疼痛对象、识别处于经受疼痛或不适风险中的对象、或者鉴别罹患导致疼痛或不适的病症或疾病的对象，例如本申请所描述的那些，随后根据说明书给予其治疗有效量的镇痛组合物。
在给定方法中镇痛组合物的实际给药量将依赖于待治疗的个体、所治疗状况的性质和组合物中神经肽类似物化合物的量。施用的镇痛组合物的量可以是最佳剂量，以达到所需的治疗效果同时不会出现不可接受程度的副作用。利用本申请中提供的有利教导，本领域技术人员能够确定治疗有效剂量。当然，本领域技术人员将意识到拆分和部分剂量也在本申请所描述方法的范围内。
可以通过在细胞培养物或实验动物中进行的标准药学规程(例如，ED50，群体中有50％治疗有效的剂量；和LD50，群体中有50％死亡的剂量)确定本申请所描述镇痛组合物的治疗效果和可能的毒性。产生治疗效果和出现毒性的剂量比为治疗指数，可以将其表示为ED50/LD50的比率。可以选择表现出高治疗指数的镇痛组合物给予对象。可以使用来自细胞培养物检测和动物研究的数据用于得出在目标对象或对象类别(例如，人)中的剂量范围。在特定实施方式中，给予对象的镇痛组合物的量提供了一种或多种神经肽类似物化合物的剂量，使得循环浓度处于包括了ED50且仅表现出较小毒性或无毒性的循环浓度范围内。给定神经肽类似物化合物的剂量可以在此范围内改变，依赖于，例如所使用的剂型、对象的敏感性和所选择的给药途径。
如本申请所描述的治疗疼痛的方法包括治疗特定病症和疾病，这些疾病和病症是因不适或疼痛引起的或与其相关。例如，本申请所描述的方法可以用于治疗一种或多种病症和疾病，选自慢性背痛、脊髓损伤、外周神经损伤、创伤性脑损伤、神经退行性疾病、纤维肌痛、带状疱疹后遗神经痛、糖尿病神经病变、外伤性单神经病、复杂性局部疼痛综合征、辅助镇痛、神经根切断术/神经消融、预先镇痛/截肢、化学暴露、化疗引起的神经病变、癌症、阿片类戒断和慢性神经痛。
本申请所公开的方法和镇痛组合物可以用于与其它组合物或治疗方法联用。本申请所使用的短语“与……联用”指除了本申请所公开的镇痛组合物以外将至少一种或多种组合物给予对象的方法。因此，在某些实施方式中，涉及给予联用组合物的方法包括将本申请所描述的镇痛组合物与下述中的至少一种联合给予：阿片和阿片样肽、吗啡、羟基吗啡、芬太尼、羟考酮、可待因、辣椒素、抗癫痫药物(例如，卡马西平、扑癫酮、加巴喷丁、普瑞巴林、地西泮、非氨酯、氟乙酰胺、拉莫三嗪、拉科酰胺、左乙拉西坦、苯巴比妥、苯妥英、fos-苯妥英、托吡酯、丙戊酸、氨己烯酸、唑尼沙胺、和奥卡西平)、非甾体抗炎药(NSAID)、局部麻醉剂(例如，利多卡因)、谷氨酸受体拮抗剂、NMDA拮抗剂、α-肾上腺素能受体激动剂和拮抗剂、腺苷、大麻素、NK-1拮抗剂(例如，Cl-021)、抗抑郁药(例如，阿米替林、去甲丙咪嗪、丙咪嗪)、甘丙肽的类似物和衍生物、促生长素抑制素、神经降压素、神经肽Y、Δ-睡眠诱导肽、脑啡肽、催产素、缩胆囊素、降钙素、皮质抑素、孤啡肽和其它基于神经肽的治疗剂。在另一个实施方式中，本申请所公开的镇痛组合物可以同两种或多种其它组合物联合给予对象。
在本申请中引用了多种出版物。这些出版物所公开的全部内容通过引用并入本申请，以便更加全面的描述本发明所属技术领域的现有技术的状况。
实施例
实施例1
使用固相肽合成方案化学合成若干MEG化的甘丙肽类似物。在本实施例中，使用两种策略将MEG化的氨基酸引入截短的甘丙肽类似物。一种策略是使用MEG化的氨基酸取代脂氨基酸，见图1中的Gal-BX。另一种策略包括使用MEG化的氨基酸取代氨基酸，参见图1中的Gal-B92。表1汇总了示例性基于甘丙肽类似物的结构，其含有单分散低聚乙二醇(MPEGn)重复在4至24范围内改变的MEG化的氨基酸。如表1所示，Sar是肌氨酸，N-甲基-Trp是N-甲基-色氨酸。
表1
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使用预装的Fmoc-Lys(Boc)-Clear Rink Amide树脂合成Gal-58、Gal-93、Gal-103和Gal-104，并将Fmoc-Lys(Mmt)-OH与所述肽的第2位结合。与所有其余氨基酸连接后，使用HAc/TFE/DCM(1∶2∶7)除去Mmt-基，然后使用10％DIEA/DCM中和树脂，连接不同的NPEG-酸以制备所需产物。
如图2所示，使用相同的中间体合成Gal-75、Gal-78、Gal-B81、Gal-82和Gal-91。选择弱酸敏感TG Sieber树脂将PEG酸与C-末端或肽链结合。
Gal-100和Gal-105的合成涉及逐步去保护/结合方法，如图3所示。α-亚麻酸是光和空气敏感的不饱和脂肪酸，所以设计在最后一步进行α-亚麻酸的结合。选择Aloc/Mmt正交保护基团对肽进行PEG化和脂质化修饰。由于alloc-去保护使用醋酸作为清除剂，其将同时除去Mmt-，因而需要首先除去Mmt。这样使用Mmt-保护C-末端赖氨酸的侧链，使用Aloc-保护3位的另一个赖氨酸。在树脂上合成肽后，使用HAc/TFE/DCM (1∶2∶7)将Mmt-基团去保护，然后使用MPEG24-酸进行PEG化。使用Pd(P(Ph3))4/HAc/NMM/DCM除去Alloc，然后将α-亚麻酸与给定靶产物结合。在经不饱和脂肪酸(如α-亚麻酸)修饰的肽裂解过程中，常见的裂解试剂如无二硫乙烷的试剂K(TFA/茴香硫醚/PhOH/H2O)或TFA/TIPS/H2O，均会产生大量异构体，特别是裂解时间较长时，在强酸(TFA)条件的诱导下很可能导致双键(顺式/反式)异构体的产生。在低温下(0℃)可能会抑制该异构化，但是在该条件下肽不能完全去保护。因而，选择室温。使用无二硫乙烷的试剂K(TFA/茴香硫醚/PhOH/H2O 85/5/5/5)作为裂解配方，使用HPLC监测裂解时间。40分钟后裂解反应完成，伴有30％的异构体。
本申请所描述的甘丙肽类似物的一般合成步骤如下：TG Sieber树脂(0.19meq)购自Novabiochem。m-dPEGTM-24酸和N-Fmoc-酰胺基-dPEGTM-24酸购自Quanta biodesignLimited。Fmoc-N-甲基-Trp(Boc)-OH购自Bachem Inc。所有其它试剂购自ChemimpexInternational Inc。
除非另有说明，否则反应在N2气体环境下进行。在Symphony肽合成仪中进行自动固相肽合成(SPPS)。在配有Waters 2487双波长检测器(λ1 220nm，λ2 280nm)的Waters 600泵系统上和使用制备Vydac二苯基柱(219TP101522)进行制备HPLC。分析HPLC使用分析Vydac二苯基柱(219TP54)。HPLC的流动相为缓冲液A，100％的水(0.1％TFA)，和缓冲液B，90％的乙腈(0.1％TFA)。在犹他州立大学的中心实验室进行MALDI-TOF MS。
对于Gal-58的合成，采用PyBop法将2倍的Fmoc-Lys(Mmt)-OH按照手册与预装的Lys(Boc)-Rink Amide Clear树脂连接。与所有其余氨基酸连接后，在树脂中加入10mLHAc/TFE/DCM(1∶2∶7)，振摇6至10分钟以除去Mmt基团。通过检查溶液的颜色由黄色变为无色来监测去保护过程。在使用10％DIEA/DCM中和后，使用PyBop法将MPEG4-酸(MeO(CH2CH2O)4CH2COOH)与树脂连接。使用试剂K(TFA-苯酚-水-茴香硫醚-1，2-二硫乙烷82.5∶5∶5∶5∶2.5)裂解肽，使用MTBE沉淀，并使用制备HPLC(Vydac二苯基柱)纯化。
对于Gal-93和Gal-103，在肽合成中将2倍的Boc-Trp(Boc)-OH而不是Fmoc-Trp(Boc)-OH进行连接，随后采用与在Gal-58合成中所描述的相同方法。
对于Gal-104，将2倍的Fmoc-N-甲基-Trp(Boc)-OH按照手册连接24小时，然后使用20％的哌啶/NMP除去Fmoc，随后采用与Gal-58相同的方法。
对于Gal-91和Gal-92，将Fmoc-Lys(Mmt)-OH与Rink Amid clear树脂连接，随后采用与Gal-58相同的方法。
对于Gal-75、Gal-78、Gal-B81和Gal-82通用中间体的合成，选择TG Sieber树脂在甘丙肽类似物的N-赖氨酸上进行柔性修饰。使用上文所述的基于Fmoc的PyBop连接方案。在肽合成中使用5倍的Fmoc-氨基酸/PyBop/DIEA(1∶1∶2，摩尔比)。首先将Fmoc-Lys(Mmt)-OH与Sieber树脂连接，随后再与其余的所有Fmoc-保护的氨基酸连接。将N-末端氨基酸与加Boc帽的肌氨酸连接以促进用于Gal-82合成的赖氨酸侧链修饰，其使用Fmoc-保护的PEG24酸合成PEG48部分。按照手册连接Fmoc-Lys(棕榈酰基)-OH。在连接完成后，使用试剂HAc/CF3CH2OH/CH2Cl2(1∶2∶7)经6x 10分钟除去在C-末端的N-赖氨酸的Mmt-基团。使用含10％DIEA的CH2Cl2中和树脂5分钟，然后使用CH2Cl2洗涤，以获得用于Gal-75、Gal-78、Gal-B81和Gal-82合成的通用中间体树脂。
此外，对于Gal-81，将1.5倍的m-dPEGTM-24酸/PyBop/HOBt/DIEA(1∶0.98∶1∶2)加入Mmt-去保护的树脂，振摇24小时直到茚三酮检测为阴性。使用试剂K(TFA-苯酚-水-茴香硫醚-1，2-二硫乙烷82.5∶5∶5∶5∶2.5)处理2小时将肽从树脂上裂解。在蒸发除去TFA后，使用MTBE沉淀残留物，并使用RP-HPLC纯化以获得PEG化的甘丙肽类似物Gal-81。使用与在Gal-B81中所描述的相同方法制备Gal-75；但是连接MPEG12-酸而不是m-dPEGTM-24酸。如图2所示，合成Gal-75和Gal-81的替代方法包括使用含1％TFA的95％DCM/5％TES(三乙基硅烷)在除去Mmt的同时，将被保护的中间体从SieBer树脂上裂解；然后使用含10％DIEA的DCM中和后，使用PyBop法将所述中间体与dPEG-酸连接以获得最终的目标肽。
对于Gal-82，将1.5倍的N-Fmoc-酰胺基-dPEGTM24酸/PyBop/HOBt/DIEA(1∶0.98∶1∶2)加入Mmt-去保护的树脂作用24小时，然后除去Fmoc。将m-dPEGTM-24酸/PyBop/HOBt/DIEA(1∶0.98∶1∶2)与树脂连接，随后采用与Gal-81相同的裂解和纯化方法获得Gal-82。
对于Gal-100，采用PyBop法将2倍的Fmoc-Lys(Mmt)-OH按照手册与Rink AmideClear树脂连接，随后将Fmoc-Lys(Boc)-OH与Fmoc-Lys(Aloc)-OH相连。在所有剩余的氨基酸连接后，将HAc/TFE/DCM(1∶2∶7)加入树脂以除去Mmt基团，然后使用10％DIEA/CH2Cl2中和树脂，使用与Gal-81相同的方法连接m-dPEGTM-24酸。在2.78mLDCM/AcOH/N-甲基吗啉(NMM)中使用四(三苯基膦)钯(0)(Pd(PPh3)4，0.23g，0.2mmol)作用2小时将Aloc去保护。然后使用CH2Cl2，0.5％DIEA/CH2Cl2洗涤树脂以除去AcOH，使用含0.02M二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液的NMP除去残留的钯，CH2Cl2。(The resinwas then washed with CH2Cl2，0.5％DIEA/CH2Cl2 to remove AcOH，0.02M sodiumdiethyldithiocarbamate solution in NMP and to remove Palladium residues，CH2Cl2)将α-亚麻酸连接20小时。在通入N2和避光条件下，向树脂中加入5ml TFA/PhOH/茴香硫醚/H2O(85/5/5/5)。40分钟后，真空蒸发除去TFA并加入MTBE以沉淀产物。使用制备RP-HPLC纯化粗肽以获得目标肽Gal-100。对于Gal-105，随后采用与Gal-100相同的合成方法，仅在N-末端氨基酸上使用Boc-Trp(Boc)-OH。
实施例2
如图4所示，在动物模型中检测甘丙肽类似物Gal-93(SEQ ID NO：10)对疼痛和癫痫的影响。如表2所示，对Gal-93的生物学检测揭示了这种类似物在6Hz癫痫模型上不具有明显的抗癫痫活性；但是其在本申请所公开的若干疼痛模型中表现出了镇痛活性。在相同的筛选条件下，含有脂氨酸的化合物Gal-B2(未列出)在30min、60min和120min时间点对4/4小鼠显示出保护性抗惊厥活性(Bulaj等，2008，J Med Chem，vol 51，p.8038-8047)。
表2
Figure BDA00003664096300181
在小鼠中采用评价急性和慢性痛觉过敏的福尔马林试验对Gal-93和其它MEG化的类似物进行检测。结果总结见表3。根据Tjolsen等描述的方法进行福尔马林试验(Tjolsen A，Berge O G，Hunskaar S，Rosland JH，Hole K.The Formalin Test：An Evaluation of the Method.Pain 53(2)，237；1992)。更具体地为，在小鼠的右后爪足底区域注射0.5％的福尔马林。其对福尔马林注射应答的明显行为性的特征在于小鼠舔舐受累足爪。该行为具有典型的两阶段。例如，在注射后小鼠立即强烈地舔舐足爪约5-10分钟。将该初始行为认为是第1阶段(急性)，并认为其主要由局部C-纤维的化学活性所介导。在急性期后为一个短暂的间隔期(通常＜5分钟)，此时很少或没有行为活动。然后接着出现持续更长时间(约20至30分钟)的舔舐期，其构成第2阶段反应(炎症)。在给予待测药物或载体之前，将各只小鼠分别放在置于镜前的若干6″高的有机玻璃笼(直径为4″)中的一个中，在其中经过15分钟的适应期。实验期间在这些管中观察小鼠的舔舐活动。适应期结束后，腹腔注射给予小鼠待测物，随后将其放回原管中。在待测物TPE中，使用连有27号不锈钢针头的汉密尔顿注射器在右后爪足底表面皮下注射体积为20μl的福尔马林。针的斜面朝向皮肤表面的下方。
在注射福尔马林后，从在5分钟时间段的前2分钟直至从给予待测药物起45分钟内对各只小鼠进行观察。每2分钟记录舔舐的累积时长。给予必要体积载体的动物与给予待测肽的各只小鼠交替放置。使用GraphPad Prism 3.03版确定药物处理动物组(n＝8)的曲线下面积(AUC)和后面的控制百分率。计算待测物组和对照组的急性期和炎症期的总AUC。还计算各只动物各期的AUC，并将其转化为总AUC的控制百分率。然后计算药物处理组和对照组百分率的平均值和S.E.M.，并检测其显著性差异。结果显示，在小鼠福尔马林试验的急性期和炎症期，Gal-93和Gal-81均显著降低舔舐持续时间，提示其具有镇痛活性。在小鼠福尔马林试验的炎症相，Gal-100、Gal104和Gal105显著降低舔舐持续时间，提示其具有镇痛活性。
表3
*P＜0.05，**P＜0.01，与载体处理的对照小鼠比较
表4汇总了静脉给予大鼠股静脉后，在大鼠福尔马林检测中Gal-93镇痛活性的剂量-应答研究结果。在给予福尔马林之前，将各只大鼠分别置于若干30.5厘米高的有机玻璃管(直径为15厘米)中的一个，经过30分钟的适应期。放入有机玻璃管以前，将一条金属带安装在动物的右后腿并使用一滴强力胶水固定，使动物适应管和金属带。随后在这些有机玻璃柱中观察大鼠在后爪注射福尔马林后伴随的退缩行为。在30分钟的适应期结束后，使用连有27号不锈钢针头的汉密尔顿注射器在右后爪足底表面皮下注射体积为50μl的2.5％的福尔马林。针的斜面朝向皮肤表面的下方。将注射福尔马林后的各只动物置于放置在检测单元上方的新有机玻璃柱中，启动自动伤害感受分析仪(Dept.of Anesthesiology，Univ.California，San Diego)。在持续60分钟的实验期间每分钟收集退缩次数。在这些研究中，i.v.给予5mg/kg Gal-93，并在给予Gal-93后10分钟、30分钟或60分钟向足爪注射福尔马林。根据小鼠福尔马林检测中的描述，将福尔马林注射后60分钟记录的退缩次数计算为曲线下面积(AUC)。这些研究显示，在大鼠福尔马林试验中，i.v.给予60分钟后Gal-93达到峰值活性。
表4
Figure BDA00003664096300201
实施例3
使用醋酸诱导的腹部收缩(扭体)试验检测神经肽类似物的镇痛作用。在这项化学伤害感受检测中，将0.6％的醋酸溶液注射至成年雄性CF-1小鼠的腹腔中，其直接刺激伤害感受器并在内脏(膈下)和皮下(肌肉壁)组织中产生炎症。其结果为在小鼠中出现特征性“扭体反应”，包括躯干纵向拉伸、背部凹拱和后肢伸长(Jensen TS，Yaksh TL.Effects ofan intrathecal dopamine agonist，apomorphine，on thermal and chemical evoked noxiousresponses in rats.Brain Res.1984 Apr 2；296(2)：285-93)。将小鼠置于6″高的有机玻璃笼(直径为4″)中观察扭体行为。
在15分钟的适应期结束后，腹腔(i.p.)给予小鼠待测神经肽类似物并将其放回原管中。在待测神经肽类似物化合物注射一小时后，使用带有26G 3/8斜角针的1ml注射器按照0.1ml/10g体重的体积i.p.注射醋酸溶液(0.6％v/v)。注射醋酸后，在30分钟的观察期内记录腹部收缩的总次数。将给予等体积载体的动物与给予待测化合物的动物并排放置观察。将出现典型的姿态至其终止重新恢复正常姿态认定为一次扭体。使用Student t-检验在组间比较腹部收缩平均次数。
如图5和6所示，与仅给予载体相比，Gal-93(SEQ ID NO：10)和NPY-B42(SEQ IDNO：17)使腹部收缩次数减少，其峰值作用分别出现在i.p.给药(4mg/kg，每组n＝3-4)后60分钟和30分钟。
实施例4
将大鼠部分坐骨神经结扎作为神经性疼痛模型。简言之，在已麻醉大鼠单侧大腿上部切开一个小口，使用连接8号尼龙线的“锥面bv 130-4”针穿过神经将约1/3至1/2的坐骨神经结扎。该结扎在坐骨神经分叉的背侧进行，仅结扎部分坐骨神经以保持部分的运动反应。在7天恢复期后，对大鼠持续性、机械性痛觉异常(对非伤害性刺激的疼痛反应)的发展情况进行检测。将各只动物分别放在置于1/4″铁丝网(不锈钢或电镀)平台上的无底有机玻璃盒中。在经过至少30分钟的适应期后，测定基线机械性敏感值。这一过程是通过使用一系列已校准的Von Frey纤维进行，该纤维垂直于足垫之间的各个后爪足表面或更靠后对着足跟。通过使用分步方法确定足缩回的50％阈值。即在出现阳性应答(足缩回)后，使用更弱的纤维。如果无缩回，则再次施加下一个最高的/更硬/更粗的纤维，以此类推。这样重复5步。
在确定了初始基线敏感性后，i.p注射给予大鼠神经肽类似物待测化合物，并在注射后1、2、4、6和24小时评估机械性阈值，以确定待测化合物的作用持续时间及其峰值作用时间。使用“xoxox”方法计算各只动物在各时间点的缩回阈值(Chaplan SR，BachFW，PogrelJW，Chung JM，Yaksh TL.Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw.J NeurosciMethods.1994 53(1)：55-63)。计算给药前缩回阈值的平均值和S.E.M.，并与给药后各时间点各组的平均缩回阈值进行比较。计算给药组和对照组百分率的平均值和S.E.M.，并对其显著性差异进行检验。
如图7所示，当与给药前未经处理的对照组相比，给予甘丙肽类似物Gal-93的小鼠的足爪缩回阈值(PWT)升高50％，其峰值活性出现在Gal-93 i.p.给药后1小时(2mg/kg，每组n＝4)。如图8所示，与给药前未经处理的对照组相比，给予NPY-B42(SEQ ID NO：17)的小鼠的PWT升高50％，其峰活性出现在NPY-B42 i.p.给药后2小时(8mg/kg，每组n＝8)。
实施例5
使用小鼠角叉菜胶检测作为化学诱导的炎性疼痛模型。在该模型中，在体重为25-35g的雄性CF-1小鼠右后爪的趾面注射25ul角叉菜胶(在0.9％NaCl中浓度为2％，λ角叉菜胶)。在给予角叉菜胶后检测足爪缩回的间隔期3小时。简言之，将小鼠置于加热至30℃的玻璃表面上。透过玻璃板向足爪的趾面施加辐射热，直至出现足爪从玻璃表面上缩回(Dirig等，1997，Hargreaves等，1988)。从开始加热至出现完全足爪缩回测定足爪缩回的间隔期。对每只足爪(注射的和未注射的)均进行两次检测，检测间隔至少1分钟，然后取平均值。使用注射角叉菜胶足爪的平均缩回间隔期减去未注射足爪的平均缩回间隔期以获得各只动物缩回间隔期的差值。对实验条件包括动物驯化、玻璃板温度和热刺激强度进行优化，以使得注射角叉菜胶同给予载体的动物的缩回间隔期的差值约为4s。
将实验用神经肽类似物化合物溶解在1％的吐温20/0.9％NaCl中，并在缩回间隔期检测之前1小时(Gal-93)或2小时(NPY-B42)以不同剂量通过腹腔注射给药。当缩回间隔期的差值为零时，认为所述神经肽类似物化合物具有完全的镇痛作用。所有数据以平均值±标准误差表示。使用Student t-检验对两个平均值进行比较。在分别进行Newman-Keuls或Bonferroni检验之后使用单因素或双因素ANOVA对多个平均值进行比较。
如图9所示，当与角叉菜胶对照组比较时，甘丙肽类似物Gal-93使缩回间隔期差值增加。与对照组相比，检测的6mg/kg和更高剂量的Gal-93对角叉菜胶诱导的痛觉过敏显示出明显的逆转作用。如图10所示，当与角叉菜胶对照组比较时，NPY-B42类似物使缩回间隔期增加。与对照组相比，4mg/kg剂量的NPY-B42对角叉菜胶诱导的痛觉过敏显示出明显的逆转作用。
实施例6
在本实施例中，对大鼠i.v.给药后，神经肽类似物化合物的心血管作用进行了评估。对体重在250至350g之间的雄性Sprague-Dawley大鼠进行麻醉，并植入股静脉和动脉导管。次日，将动脉导管与脉冲压力传感器连接以连续监测血压(BP)和心率(HR)。将静脉导管与用于静脉(iv)输注的远程注射器连接。将甘丙肽类似物化合物Gal-93溶解在1％的吐温20/0.9％NaCl中，并给药约1分钟(0.25mg/kg iv，输注体积1ml)。在基线期、给药时以及给药后1、5、10、20、30、40、50和60分钟收集平均BP/HR样点。在给药前和给药后60分钟，通过输注去氧肾上腺素(9ug，输注体积0.05ml)评估压力感受器的反射敏感性，去氧肾上腺素引起BP增加40-60mmHg和相应的心动过缓50-150次/min(在给予载体的动物中)。此外，在基线期、给药后30分钟和60分钟从动脉导管收集血样，用于测定红细胞比容、血浆蛋白和血糖。在基线期、给药后15分钟、30分钟和60分钟收集样点时，还对体温进行检测。从此前监测时间点30-60秒的数字脉冲压力记录片段获得平均BP和HR。为确定压力感受器的反射敏感性，在去氧肾上腺素输注后，分别获得最高点和最低点的BP和HR。
Gal-93和NPY-B42心血管安全性评估的结果见表5(n＝3只大鼠)。所有数据以平均值±标准误差表示。观察所记录时间点期间(1-60分钟)的血压(BP)和心率(HR)的最大变化。使用Student t-检验对两个平均值进行比较。在分别进行Newman-Keuls或Bonferroni检验之后，使用单因素或双因素ANOVA在多个平均值之间进行比较。在这些研究中，与给予载体的大鼠相比，对于所检测的各心血管参数Gal-93或NPY-B42均未显示出具有统计学意义的差异。
表5
Figure BDA00003664096300231
实施例7
代谢稳定性检测：在大鼠血清检测中评估肽稳定性。在加入类似物之前，将1mL 25％的大鼠血清在37℃下孵育10min。通过将溶于超纯H2O中的各类似物加入含25％大鼠血清和0.1M Tris-HCl，pH 7.5的溶液中以使得肽的终浓度为20μM来制备反应物。在适当的时间间隔(范围可达8小时)，取200μL溶液并加入到100μL“淬灭溶液”(含15％三氯乙酸的40％的异丙醇)。将异丙醇(40％，水溶液)加入到淬灭混合物(该步骤提高Gal-B2和其它类似物的回收率)。在淬灭混合物沉淀后，将样品在-20℃下孵育15min并在12,000rpm下离心。通过使用YMC ODS-ATM 5μm
Figure BDA00003664096300241
柱(Waters，Cat#：AA12S052503WT)的HPLC分离对上清液进行分析。当出现类似物的峰与在“仅为血清”的对照样品中所观察到的峰重叠的情况时，通过改变流动相的组成、柱温或HPLC柱(例如使用C8柱替换联苯柱)对梯度进行优化。通过在经三氯乙酸沉淀后在“仅为血清”的对照样品中掺入已知量的类似物评估类似物的回收率。通过在8小时时间段内对类似物的消失情况进行监测评估代谢稳定性。其通过比较在各时间点完整类似物峰所对应的峰的曲线下面积来实现。使用各时间点三次独立实验的平均值计算各类似物的半衰期t1/2。使用Kaleidagraph软件将结果绘制成对数-标度曲线。根据下述公式：t1/2(h)＝(Ln(50)-b)/(m)，其中“m”表示直线的斜率和“b”表示y-截距，采用线性曲线-拟合分析对类似物降解的时程进行拟合。
在不脱离本发明基本原则的前提下，可以对上文所述实施方式的细节作出很多改变，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，本发明的范围将仅由权利要求确定。
Figure IDA00003664096900011
Figure IDA00003664096900021
Figure IDA00003664096900051
Figure IDA00003664096900071

Claims (51)

1.一种代谢稳定性增强的组合物，所述组合物包括：
神经肽类似物，其中至少一个氨基酸共价连接至单分散低聚乙二醇单元；
其中与未和所述单分散低聚乙二醇单元共价连接的神经肽的代谢稳定性相比，与所述神经肽类似物的氨基酸连接的所述单分散低聚乙二醇单元使所述组合物的代谢稳定性增强。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述神经肽类似物包括甘丙肽类似物、神经肽Y类似物、神经降压素类似物和促生长素抑制素类似物中的至少一种。
3.根据前述任意权利要求所述的组合物，其中与包括未和所述单分散低聚乙二醇单元共价连接的神经肽的组合物的半衰期相比，与所述神经肽类似物的氨基酸连接的所述单分散低聚乙二醇单元通过提高所述组合物的半衰期使所述组合物的代谢稳定性增强。
4.根据任意前述权利要求所述的组合物，其中所述单分散低聚乙二醇单元包括至少2个乙二醇重复。
5.根据任意前述权利要求所述的组合物，其中所述单分散低聚乙二醇单元包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47和48个乙二醇重复。
6.根据任意前述权利要求所述的组合物，其中所述神经肽类似物是截短的神经肽。
7.根据任意前述权利要求所述的组合物，其中所述神经肽类似物包括至少一个末端赖氨酸。
8.根据任意前述权利要求所述的组合物，其中所述单分散低聚乙二醇单元共价连接至赖氨酸氨基酸。
9.根据前述任意权利要求所述的组合物，其中所述神经肽类似物是截短的神经肽类似物，所述截短的神经肽类似物包括至少1、2、3、4或5个末端赖氨酸残基。
10.根据权利要求8所述的组合物，其中所述神经肽类似物包括4个末端赖氨酸残基，并且其中所述单分散低聚乙二醇单元共价连接至所述4个末端赖氨酸残基中的至少一个。
11.根据权利要求9所述的组合物，其中所述神经肽类似物包括5个末端赖氨酸残基，并且其中所述单分散低聚乙二醇单元共价连接至所述5个末端赖氨酸残基中的至少一个。
12.根据权利要求8和权利要求9之一所述的组合物，其中所述单分散低聚乙二醇单元共价连接至最末端的赖氨酸残基。
13.根据权利要求8和权利要求9之一所述的组合物，其中所述单分散低聚乙二醇单元共价连接至倒数第二个末端赖氨酸残基。
14.根据权利要求1所述的组合物，其中所述神经肽类似物选自SEQ ID NO：5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和19中的至少一个。
15.根据权利要求1所述的组合物，其中所述神经肽类似物与SEQ ID NO：5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和19中的至少一个具有至少95％的同源性。
16.根据任意前述权利要求所述的组合物，其中与包括野生型神经肽的组合物相比，所述组合物的代谢稳定性增强至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
17.根据任意前述权利要求所述的组合物，其中将所述组合物给予对象用于治疗疼痛。
18.根据任意前述权利要求所述的组合物，其中所述组合物不会透过对象的血脑屏障。
19.根据任意前述权利要求所述的组合物，其中所述单分散低聚乙二醇单元是单分散聚乙二醇单元。
20.根据任意前述权利要求所述的组合物，其中所述神经肽类似物是N-甲基化的。
21.一种制备代谢稳定性增强的神经肽类似物的方法，所述方法包括：
提供神经肽；
将至少一个单分散低聚乙二醇单元共价连接至所述神经肽的至少一个氨基酸，从而制备神经肽类似物；
其中与未和所述单分散低聚乙二醇单元共价连接的神经肽相比，所述共价连接的单分散低聚乙二醇单元使所述神经肽类似物的代谢稳定性增强；以及
从而制备代谢稳定性增强的神经肽类似物。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述神经肽类似物包括甘丙肽类似物、神经肽Y类似物、神经降压素类似物和促生长素抑制素类似物中的至少一种。
23.根据权利要求21或权利要求22所述的方法，其中所述神经肽类似物包括截短的甘丙肽类似物、截短的神经肽Y类似物、截短的神经降压素类似物和截短的促生长素抑制素类似物中的至少一种。
24.根据权利要求21至23任意一项所述的方法，其中与包括未和所述单分散低聚乙二醇单元共价连接的神经肽的组合物的半衰期相比，与所述神经肽类似物的氨基酸共价连接的所述单分散低聚乙二醇单元通过提高所述组合物的半衰期使所述组合物的代谢稳定性增强。
25.根据权利要求21至24任意一项所述的方法，其中所述神经肽类似物是包括至少一个末端赖氨酸的截短的神经肽类似物。
26.根据权利要求21所述的方法，其中所述神经肽类似物选自SEQ ID NO：5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和19中的至少一个。
27.根据权利要求21至25任意一项所述的方法，其中所述单分散低聚乙二醇单元包括至少2个乙二醇重复。
28.根据权利要求21至25和27任意一项所述的方法，其中所述单分散低聚乙二醇单元共价连接至赖氨酸氨基酸。
29.根据权利要求21至28任意一项所述的方法，其中与未和单分散低聚乙二醇单元共价连接的神经肽相比，所述神经肽类似物的代谢稳定性增强至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
30.根据权利要求21至29任意一项所述的方法，其中将所述神经肽类似物给予对象用于治疗疼痛。
31.根据权利要求21至30任意一项所述的方法，其中所述神经肽类似物不会透过对象的血脑屏障。
32.根据权利要求21至25和27至31任意一项所述的方法，其中所述单分散低聚乙二醇单元是单分散聚乙二醇单元。
33.一种制备不会透过血脑屏障的神经肽类似物的方法，所述方法包括：
提供神经肽；
将至少一个单分散低聚乙二醇单元共价连接至所述神经肽的至少一个氨基酸，从而制备甘丙肽类似物；
其中所述共价连接的单分散聚乙二醇单元阻止所述甘丙肽类似物透过血脑屏障。
34.根据权利要求33所述的方法，其中将至少一个单分散低聚乙二醇单元共价连接至所述神经肽的至少一个氨基酸的过程包括使用所述单分散低聚乙二醇单元取代脂氨基酸。
35.根据权利要求33或34所述的方法，其中所述神经肽是甘丙肽、神经肽Y、神经降压素和促生长素抑制素中的至少一种。
36.一种在对象中治疗疼痛的方法，所述方法包括：给予所述对象药学有效量的包括神经肽类似物的化合物，其中所述神经肽类似物包括至少一个与单分散低聚乙二醇单元共价连接的氨基酸。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述神经肽类似物不会透过血脑屏障。
38.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述神经肽类似物选自SEQ ID NO：5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和19中的至少一个。
39.根据权利要求36或37所述的方法，其中所述神经肽类似物与SEQ ID NO：5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18和19中的至少一个具有至少95％的同源性。
40.根据权利要求36至39任意一项所述的方法，其中与未和所述单分散低聚乙二醇单元共价连接的神经肽相比，所述神经肽类似物的代谢稳定性增强至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
41.根据权利要求36、37和40任意一项所述的方法，其中所述神经肽类似物包括甘丙肽类似物、神经肽Y类似物、神经降压素类似物和促生长素抑制素类似物中的至少一种。
42.根据权利要求36至41任意一项所述的方法，其中与包括未和所述单分散低聚乙二醇单元共价连接的神经肽的组合物的半衰期相比，与所述神经肽类似物的氨基酸连接的所述单分散低聚乙二醇单元通过提高所述组合物的半衰期使所述组合物的代谢稳定性增强至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
43.根据权利要求36、37和39至42任意一项所述的方法，其中所述神经肽类似物是包括至少一个末端赖氨酸残基的截短的神经肽类似物。
44.根据权利要求36、37和39至43任意一项所述的方法，其中所述神经肽类似物是截短的神经肽类似物，所述截短的神经肽类似物包括至少1、2、3、4或5个末端赖氨酸残基。
45.根据权利要求36、37和39至44任意一项所述的方法，其中所述神经肽类似物包括4个末端赖氨酸残基，而且其中所述单分散低聚乙二醇单元共价连接至所述4个末端赖氨酸残基中的至少一个。
46.根据权利要求36、37、和39至44任意一项所述的方法，其中所述神经肽类似物包括5个末端赖氨酸残基，而且其中所述单分散低聚乙二醇单元共价连接至所述5个末端赖氨酸残基中的至少一个。
47.根据权利要求36、37、和39至46任意一项所述的方法，其中所述单分散低聚乙二醇单元共价连接至最末端的赖氨酸残基。
48.根据权利要求36、37、和39至46任意一项所述的方法，其中所述单分散低聚乙二醇单元共价连接至倒数第二个末端赖氨酸残基。
49.根据权利要求36、37、和39至48任意一项所述的方法，其中所述单分散低聚乙二醇单元包括至少2个乙二醇重复。
50.根据权利要求36、37、和39至49任意一项所述的方法，其中所述单分散低聚乙二醇单元包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47和48个乙二醇重复。
51.根据权利要求36、37、和39至50任意一项所述的方法，其中所述单分散低聚乙二醇单元是单分散聚乙二醇单元。
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