CN101255187B - Atl肽的固相合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种ATL肽的固相合成方法。采用MBHA树脂作为固相载体，首先在该树脂上连接保护赖氨酰基Boc-Lys(2-CI-Z)，采用Boc保护氨基酸的程序接肽法完成ATL的合成，用乙酸酐对N端进行乙酰化修饰，得到全保护的肽树脂；用哌啶脱除Trp的甲酰基(For)侧链保护基，最后用三氟甲磺酸脱除侧链保护基团，并切割树脂，得到ATL粗肽制品；然后用反相C18填料的高效液相纯化该粗制品，甲醇-水梯度洗脱方法分离纯化，得ATL肽精制产品。本发明的方法条件具有单步缩合反应产率高，副产物少，最终粗品纯度高，杂质含量少，操作简单易行，总收率高的特点。
Description
技术领域
本发明涉及多肽类药物的制备方法，尤其涉及一种ATL肽(C85H141N27O15)的固相法合成方法。属生物技术领域。
背景技术
ATL肽化学名：乙酰-精氨酰-酪氨酰-酪氨酰-精氨酰-色氨酰-赖氨酰-赖氨酰-赖氨酰-赖氨酰-赖氨酰-赖氨酰-赖氨酰胺(Ac-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Trp-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2)，
化学结构式为：
分子式：C85H141N27O15
分子量：1781.24。
ATL肽是在Ac-RYYRWK-NH2六肽的基础上改构而来的，此六肽是从合成组合化学肽库中被NOP(Nociceptin/orphanin FQ peptide receptor)选择性筛选出来的肽。孤啡肽(nocieeptin或orphanin FQ)是阿片受体样受体(ORL1或LC 132)的内源性配体，在痛觉调节、心血管系统、离子通道、依赖和耐受、学习和记忆等方面具有广泛的生物学活性。ATL肽是利用SIP(Structure inducing probes)技术设计出NOP受体的新型配体，在原六肽的基础上增加了其代谢稳定性。
美国专利US 7,244,701中有合成本品的报道：包括化学合成法和生物重组合成法，生物合成法是近年发展起来的新合成方法，但生物表达技术目前尚不成熟。同时，产品的纯化和产率方面离产业化生产尚有较大距离。报道的化学合成法包括：1，液相合成法(solution phase peptide synthese)，2，基于Merrifield-类型树脂的固相合成，包括Boc/Bzl和Fmoc/tBu策略。3，基于TentaGel Resin(PEG-PS)类型树脂的固相合成，Fmoc/tBu策略。然而，液相合成法存在(1)反应步骤多，路线冗长。(2)中间体不易纯化分离，实际操作中溶剂蒸除难度较大。(3)目前试剂和所用氨基酸侧链保护基的来源和制备难度较大等不足。Merrifield类型树脂为载体，合成保护ATL树脂后，将肽从树脂上切下来所要求的条件比较苛刻，该方法采用HF裂解方式，必须拥有一台HF气体发生装置才能实现裂解，对于大量的肽树脂只能分两次裂解，生产规模受到限制。另外，HF是一种强腐蚀性的气体，一旦泄漏会对人造成极大的伤害。再者，此合成方法将肽从树脂上裂解下来后，抽去HF用稀乙酸抽提，抽提物经冷冻干燥后，生产周期长，成本高。TentaGel Resin(PEG-PS)类型树脂目前成本较高，不适合于大批量的制备和工业化生产。
发明内容
针对上述技术不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简便，单步缩合反应产率高，副产物少，最终粗品纯度高，杂质含量少，总收率高的ATL肽(C85H141N27O15)的固相法合成方法。
本发明所述ATL肽固相法合成方法的技术方案是：采用MBHA树脂作为固相载体，首先在该树脂上连接保护赖氨酰基Boc-Lys(2-Cl-Z)，采用Boc保护氨基酸的程序接肽法完成ATL的合成，用乙酸酐对N端进行乙酰化修饰，得到全保护的肽树脂；用哌啶脱除Trp的甲酰基(For)侧链保护基，最后用三氟甲磺酸脱除侧链保护基团，并切割树脂，得到ATL粗肽制品；然后用反相C18填料的高效液相纯化该粗制品，甲醇-水梯度洗脱方法分离纯化，得ATL肽精制产品。
本发明提供的ATL肽固相法合成方法的具体步骤是：
1)以MBHA树脂为固相载体和起始原料，在MBHA树脂上依次进行缩合反应连接保护氨基酸，制备H2N-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA树脂
其中所述MBHA树脂的化学结构为：
MBHA树脂可采用市售产品，如天津南开和成科技公司生产的规格为：subst.0.8mmol/g，DVB：1％，Mesh 100～200的MBHA树脂。
制备步骤如下：
(1)向MBHA树脂中加入5％三乙胺DCM溶液洗2～3次；再用二氯甲烷、乙醇交替洗树脂2～3次，抽干；
(2)向上述树脂中加入1～5当量Boc-保护氨基酸，1～5当量的HOBt，而后加入1～5当量的N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)，室温下搅拌1～6小时，抽干，得Boc-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA树脂；其中，所述HOBt用二氯甲烷(DCM)或二氯甲烷与N，N-二甲基甲酰胺(DMF)的混合液溶解，所述N，N-环己基碳二亚胺用二氯甲烷与N，N-二甲基甲酰胺(DMF)的混合液溶解；
(3)树脂用二氯甲烷、乙醇交替洗3次，抽干；
(4)树脂用50％三氟醋酸/二氯甲烷(DCM)洗1～2次；
(5)树脂用二氯甲烷洗2～3次，得H2N-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA树脂；
2)用乙酸酐对N端进行乙酰化修饰
将50±2当量的乙酸酐DMF溶液加入H2N-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA树脂中，室温搅拌5～6小时，抽干；树脂用二氯甲烷、乙醇交替洗2～3次，抽干，得Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA；
3)用哌啶脱除Trp的甲酰基(For)侧链保护基
向Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中加入20％哌啶/DMF溶液，室温搅拌反应20～30分钟除Trp的甲酰基(For)保护基，抽干，二氯甲烷，乙醇交替洗涤2～3次后，得到除Trp外的ATL树脂：Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(H)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA；
4)切割反应脱除侧链保护基团并切割树脂
以10ml/g树脂的量将切割试剂加入到Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(H)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中，冰水浴下搅拌反应3小时后，过滤，收集滤液，用三氟醋酸洗涤滤除的树脂，洗涤液与滤液合并后浓缩，之后加入其100～150倍体积量的冷乙醚，即析出大量的白色固体，过滤，收集白色固体，干燥，即得ATL肽的粗肽制品；
其中：所述切割试剂是体积配比为：三氟醋酸(TFA)∶三氟甲磺酸(TFMSa)∶硫代苯甲醚(thioanisole)∶乙二硫醇(1，2-ethanethiol)＝80∶8～9∶8～9∶4～5的混合溶液；
5)ATL肽粗品的纯化
ATL肽粗品用5％醋酸水溶液溶解，经0.45μm微孔滤膜过滤后，直接上样到反相C18键合硅胶装填色谱柱，采用梯度6～9％甲醇-水流动相进行梯度洗脱分离，收集目的组分，浓缩后，冷冻干燥，得到纯ATL肽。
上述ATL肽的固相合成方法中，步骤1)所述Boc-保护氨基酸在MBHA树脂上依次进行缩合反应连接的氨基酸是：Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH，Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH，Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH，Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH，Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH，Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH，Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH，Boc-Trp(For)-OH，Boc-Arg(Mts)-OH，Boc-Tyr(2-Br-Z)-OH，Boc-Tyr(2-Br-Z)-OH，Boc-Arg(Mts)-OH。
上述ATL肽的固相合成方法中，步骤1)中(2)优选的方法是向上述树脂中加入2～4当量Boc-保护氨基酸，2～4当量的HOBt，而后加入2～4当量的N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)，室温下搅拌3～5小时，抽干，得Boc-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA树脂。
上述ATL肽的固相合成方法中，步骤1)中(2)所述的二氯甲烷与N，N-二甲基甲酰胺的混合液是指二氯甲烷∶N，N-二甲基甲酰胺体积比为1∶0.1～1的混合液。优选是指二氯甲烷∶N，N-二甲基甲酰胺体积比为1∶0.6～1的混合液。
上述ATL肽的固相合成方法中，步骤3)所述室温搅拌反应优选是30分钟。
上述ATL肽的固相合成方法中，步骤4)所述切割试剂是体积配比优选：三氟醋酸(TFA)∶三氟甲磺酸(TFMSa)∶硫代苯甲醚(thioanisole)∶乙二硫醇(1，2-ethanethiol)＝80∶8∶8∶4的混合溶液。
上述ATL肽的固相合成方法中，步骤5)所述反相C18键合硅胶装填色谱柱的装载量为5～200mg/克C18键合硅胶。
本发明的方法是一种ATL全合成的新方法，为固相法，一次完成制备侧链保护的ATL肽，有以下特点：(1)采用Boc-保护氨基酸，配比为1～5摩尔；采用MBHA树脂作为固相合成载体，采用取代值为0.8mmol/克树脂，(2)采用哌啶脱除Trp侧链甲酰基保护，(3)采用三氟甲磺酸切割ATL肽树脂，同时完成对剩余侧链保护基的去除，切割试剂由三氟甲磺酸、三氟醋酸、苯甲硫醚、乙二硫醇组成，切割完毕后直接得到肽酰胺的形式，(4)采用高效液相色谱方法进行纯化分离，采用反相C18键合硅胶装填，装载量为5～200mg/克C18键合硅胶，采用甲醇-水作为洗脱流动相，梯度洗脱方法。
附图说明
图1为本发明工艺流程框图。
图2为ATL肽HPLC检测图。
图3为ATL肽经质谱MS确证图。
具体实施方式
实施例1
H2N-Lys(2-Cl-Z)-MBHA的制备
(1)将MBHA树脂50g(40mmol)放于多肽合成反应器中，用5％三乙胺DCM溶液5～7ml/g洗2次，每次8分钟；用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗2次，2分钟/次，抽干。
(2)将Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH 82.8g及HOBt 27.0g，N，N-环己基碳二亚胺41.2g用500ml二氯甲烷/DMF溶液(二氯甲烷∶N，N-二甲基甲酰胺体积比为1∶0.8)溶解后，加入树脂中，室温搅拌5小时，抽干。
(3)将(2)的产物用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗3次，每次2分钟，抽干。
(4)用50％三氟醋酸/二氯甲烷(DCM)10ml/g洗1次，20分钟；用二氯甲烷5～7ml/g洗2次，每次2分钟；得：H2N-Lys(2-Cl-Z)-MBHA。
实施例2
H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA的制备
(1)向树脂H2N-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中加入5％三乙胺DCM溶液5～7ml/g洗2次，每次8分钟；用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗2次，2分钟/次，抽干。
(2)将Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH 82.8g及HOBt 27.0g，N，N-环己基碳二亚胺41.2g用500ml二氯甲烷/DMF溶液(二氯甲烷∶N，N-二甲基甲酰胺体积比为1∶0.9)溶解后，加入树脂中，室温搅拌5小时，抽干。
(3)将(2)的产物用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗3次，每次2分钟，抽干。
(4)用50％三氟醋酸/二氯甲烷(DCM)10ml/g洗1次，20分钟；
用二氯甲烷5～7ml/g洗2次，每次2分钟；
得：H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA。
实施例3
H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA的制备
操作：(1)向树脂H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中加入5％三乙胺DCM溶液5～7ml/g洗2次，每次8分钟；用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗2次，2分钟/次，抽干。
(2)将Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH 82.8g及HOBt 27.0g，N，N-环己基碳二亚胺41.2g用500ml二氯甲烷/DMF(二氯甲烷∶N，N-二甲基甲酰胺体积比为1∶0.9)溶液溶解后，加入树脂中，室温搅拌5小时，抽干。
(3)将(2)的产物用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗3次，每次2分钟，抽干。
(4)用50％三氟醋酸/二氯甲烷(DCM)10ml/g洗1次，20分钟；
用二氯甲烷5～7ml/g洗2次，每次2分钟；
得：H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA。
实施例4
H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA的制备
操作：(1)向树脂H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中加入5％三乙胺DCM溶液5～7ml/g洗2次，每次8分钟；用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗2次，2分钟/次，抽干。
(2)将Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH 82.8g及HOBt 27.0g，N，N-环己基碳二亚胺41.2g用500ml二氯甲烷/DMF溶液(二氯甲烷∶N，N-二甲基甲酰胺体积比为1∶0.8)溶解后，加入树脂中，室温搅拌5小时，抽干。
(3)将(2)的产物用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗3次，每次2分钟，抽干。
(4)用50％三氟醋酸/二氯甲烷(DCM)10ml/g洗1次，20分钟；
用二氯甲烷5～7ml/g洗2次，每次2分钟；
得：H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA。
实施例5
H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA的制备
操作：(1)向树脂H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中加入5％三乙胺DCM溶液5～7ml/g洗2次，每次8分钟；用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗2次，2分钟/次，抽干。
(2)将Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH 82.8g及HOBt 27.0g，N，N-环己基碳二亚胺41.2g用500ml二氯甲烷/DMF溶液(二氯甲烷∶N，N-二甲基甲酰胺体积比为1∶0.9)溶解后，加入树脂中，室温搅拌5小时，抽干。
(3)将(2)的产物用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗3次，每次2分钟，抽干。
(4)用50％三氟醋酸/二氯甲烷(DCM)10ml/g洗1次，20分钟；
用二氯甲烷5～7ml/g洗2次，每次2分钟；
得：H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA。
实施例6
H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBH
A的制备
操作：(1)向树脂H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中加入5％三乙胺DCM溶液5～7ml/g洗2次，每次8分钟；用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗2次，2分钟/次，抽干。
(2)将Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH 82.8g及HOBt 27.0g，N，N-环己基碳二亚胺41.2g用500ml二氯甲烷/DMF溶液(二氯甲烷∶N，N-二甲基甲酰胺体积比为1∶0.9)溶解后，加入树脂中，室温搅拌5小时，抽干。
(3)将(2)的产物用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗3次，每次2分钟，抽干。
(4)用50％三氟醋酸/二氯甲烷(DCM)10ml/g洗1次，20分钟；
用二氯甲烷5～7ml/g洗2次，每次2分钟；
得：H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA。
实施例7
H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA的制备
操作：(1)向树脂H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)--MBHA中加入5％三乙胺DCM溶液5～7ml/h洗2次，每次8分钟；用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗2次，2分钟/次，抽干。
(2)将Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH 82.8g及HOBt 27.0g，N，N-环己基碳二亚胺41.2g用500ml二氯甲烷/DMF溶液(二氯甲烷∶N，N-二甲基甲酰胺体积比为1∶1)溶解后，加入树脂中，室温搅拌5小时，抽干。
(3)将(2)的产物用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗3次，每次2分钟，抽干。
(4)用50％三氟醋酸/二氯甲烷(DCM)10ml/g洗1次，20分钟；
用二氯甲烷5～7ml/g洗2次，每次2分钟；
得：H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA。
实施例8
H2N-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA的制备
操作：(1)向树脂H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中加入5％三乙胺DCM溶液5～7ml/g洗2次，每次8分钟；用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗2次，2分钟/次，抽干。
(2)将Boc-Trp(For)-OH 66.5g及HOBt 27.0g，N，N-环己基碳二亚胺41.2g用500ml二氯甲烷/DMF溶液(二氯甲烷∶N，N-二甲基甲酰胺体积比为1∶1)溶解后，加入树脂中，室温搅拌5小时，抽干。
(3)将(2)的产物用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗3次，每次2分钟，抽干。
(4)用50％三氟醋酸/二氯甲烷(DCM)10ml/g洗1次，20分钟；
用二氯甲烷5～7ml/g洗2次，每次2分钟；
得：H2N-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA。
实施例9
H2N-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA的制备
操作：(1)向树脂H2N-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中加入5％三乙胺DCM溶液5～7ml/g洗2次，每次8分钟；用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗2次，2分钟/次，抽干。
(2)将Boc-Arg(Mts)-OH 91.3g及HOBt 27.0g，N，N-环己基碳二亚胺41.2g用500ml二氯甲烷/DMF溶液(二氯甲烷∶N，N-二甲基甲酰胺体积比为1∶1)溶解后，加入树脂中，室温搅拌5小时，抽干。
(3)将(2)的产物用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗3次，每次2分钟，抽干。
(4)用50％三氟醋酸/二氯甲烷(DCM)10ml/g洗1次，20分钟；
用二氯甲烷5～7ml/g洗2次，每次2分钟；
得：H2N-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA。
实施例10
H2N-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA的制备
操作：(1)向树脂H2N-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中加入5％三乙胺DCM溶液5～7ml/g洗2次，每次8分钟；用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗2次，2分钟/次，抽干。
(2)将Boc-Tyr(2-Br-Z)-OH 98.9g及HOBt 27.0g，N，N-环己基碳二亚胺41.2g用500ml二氯甲烷/DMF溶液(二氯甲烷∶N，N-二甲基甲酰胺体积比为1∶0.9)溶解后，加入树脂中，室温搅拌5小时，抽干。
(3)将(2)的产物用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗3次，每次2分钟，抽干。
(4)用50％三氟醋酸/二氯甲烷(DCM)10ml/g洗1次，20分钟；
用二氯甲烷5～7ml/g洗2次，每次2分钟；
得：H2N-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA。
实施例11
H2N-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA的制备
操作：(1)向树脂H2N-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中加入5％三乙胺DCM溶液5～7ml/g洗2次，每次8分钟；用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗2次，2分钟/次，抽干。
(2)将Boc-Tyr(2-Br-Z)-OH 98.9g及HOBt 27.0g，N，N-环己基碳二亚胺41.2g用500ml二氯甲烷/DMF溶液(二氯甲烷∶N，N-二甲基甲酰胺体积比为1∶0.9)溶解后，加入树脂中，室温搅拌5小时，抽干。
(3)将(2)的产物用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗3次，每次2分钟，抽干。
(4)用50％三氟醋酸/二氯甲烷(DCM)10ml/g洗1次，20分钟；
用二氯甲烷5～7ml/g洗2次，每次2分钟；
得：H2N-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA。
实施例12
H2N-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA的制备
操作：(1)向树脂H2N-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中加入5％三乙胺DCM溶液5～7ml/g洗2次，每次8分钟；用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗2次，2分钟/次，抽干。
(2)将Boc-Arg(Mts)-OH 91.3g及HOBt27.0g，N，N-环己基碳二亚胺41.2g用500ml二氯甲烷/DMF溶液(二氯甲烷∶N，N-二甲基甲酰胺体积比为1∶1)溶解后，加入树脂中，室温搅拌5小时，抽干。
(3)将(2)的产物用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗3次，每次2分钟，抽干。
(4)用50％三氟醋酸/二氯甲烷(DCM)10ml/g洗1次，20分钟；
用二氯甲烷5～7ml/g洗2次，每次2分钟；
得：H2N-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA。
实施例13
Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA的制备
操作：(1)向树脂H2N-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中加入5％三乙胺DCM溶液5～7ml/g洗2次，每次8分钟；用二氯甲烷、乙醇各300ml交替洗2次，2分钟/次，抽干。
(2)将乙酸酐142ml和400ml DMF加入树脂(H2N-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA)中，室温搅拌5小时。
(3)抽干。树脂用二氯甲烷、乙醇各600ml交替洗3次，每次2分钟，抽干。得Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA。
实施例14
Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(H)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA的制备
操作：向树脂Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中加入20％哌啶/DMF溶液500ml，室温搅拌反应20分钟，抽干。树脂用二氯甲烷、乙醇300ml交替洗3次，2分钟/次，抽干。
得Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(H)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA。
实施例15
Ac-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Trp-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH2的制备
操作：(1)将树脂Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(H)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA真空干燥，称重得194.4g淡黄色树脂。肽树脂收率95％。
(2)量取苯甲硫醚160ml、乙二硫醇80ml，加入树脂中，冰水浴搅拌下加入三氟醋酸1600ml，反应10分钟后，缓慢滴加160ml三氟甲磺酸，滴加完毕后室温反应3小时，过滤，滤除树脂，用150ml三氟醋酸洗涤树脂，洗涤液与滤液合并后浓缩，之后加入15L冷乙醚，即析出大量的白色固体，过滤，收集白色固体，干燥，得ATL肽的粗肽制品57.02g。粗品收率79％。
粗品纯度经HPLC检测为83％，见图2。
实施例16
分离纯化
装置：C18制备柱(150×1000mm)
装载量：5～200mg/克C18键合硅胶
洗脱液A：0.1％TFA/H2O
洗脱液B：甲醇
流速：400ml/min
紫外检测波长：220nm
操作：(1)ATL肽粗品30g用500ml 5％醋酸水溶液溶解，
(2)0.45μm微孔滤膜过滤，
(3)滤液直接上样，
(4)6～9％甲醇-水流动相进行梯度洗脱，收集保留时间为10.340分钟组分峰的洗脱液(见图2)，
(5)浓缩，冷冻干燥；得ATL白色疏松粉末20.3g。
(6)其他低于98％洗脱液合并，浓缩后，回收。
(7)依此方法处理完毕所有肽粗品后，合并得ATL肽共计21.2g，分离纯化收率70.6％。
产品经质谱MS确证(谱图见图3)，总收率为56.5％。
Claims (5)
1.一种ATL肽的固相合成方法，包括下列步骤：
1)以MBHA树脂为固相载体和起始原料，在MBHA树脂上依次进行缩合反应连接保护氨基酸，制备H2N-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA树脂
(1)向MBHA树脂中加入5％三乙胺DCM溶液洗2～3次；再用二氯甲烷、乙醇交替洗树脂2～3次，抽干；
(2)向上述树脂中加入1～5当量Boc-保护氨基酸，1～5当量的HOBt，而后加入1～5当量的N，N-二环己基碳二亚胺，室温下搅拌1～6小时，抽干；其中，所述HOBt或N，N-环己基碳二亚胺用二氯甲烷与N，N-二甲基甲酰胺的混合液溶解，且混合液中二氯甲烷∶N，N-二甲基甲酰胺的体积比为1∶0.8、1∶0.9或1∶1；
(3)将(2)中反应后的树脂用二氯甲烷、乙醇交替洗3次，抽干；
(4)树脂用50％三氟醋酸/二氯甲烷洗1～2次；
(5)树脂用二氯甲烷洗2～3次；
得树脂H2N-Lys(2-Cl-Z)-MBHA；
再以H2N-Lys(2-Cl-Z)-MBHA为MBHA树脂重复(1)至(5)的制备步骤得H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA；
再以H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA为MBHA树脂重复(1)至(5)的制备步骤得H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA；
再以H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA为MBHA树脂重复(1)至(5)的制备步骤得H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA；
再以H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA为MBHA树脂重复(1)至(5)的制备步骤得H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA；
再以H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA为MBHA树脂重复(1)至(5)的制备步骤得H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA；
再以H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA为MBHA树脂重复(1)至(5)的制备步骤得H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA；
再以H2N-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA为MBHA树脂重复(1)至(5)的制备步骤得H2N-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA；
再以H2N-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA为MBHA树脂重复(1)至(5)的制备步骤得 H2N-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA；
再以H2N-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA为MBHA树脂重复(1)至(5)的制备步骤得H2N-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA；
再以H2N-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA为MBHA树脂重复(1)至(5)的制备步骤得H2N-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA；
再以H2N-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA为MBHA树脂重复(1)至(5)的制备步骤得H2N-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA树脂；
其中：步骤(2)所述Boc-保护氨基酸在MBHA树脂上依次进行缩合反应连接的氨基酸是：Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH，Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH，Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH，Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH，Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH，Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH，Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH，Boc-Trp(For)-OH，Boc-Arg(Mts)-OH，Boc-Tyr(2-Br-Z)-OH，Boc-Tyr(2-Br-Z)-OH，Boc-Arg(Mts)-OH；
2)用乙酸酐对N端进行乙酰化修饰
将50±2当量的乙酸酐DMF溶液加入H2N-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA树脂中，室温搅拌5～6小时，抽干；树脂用二氯甲烷、乙醇交替洗2～3次，抽干，得Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA；
3)用哌啶脱除Trp的甲酰基侧链保护基
向Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中加入20％哌啶/DMF溶液，室温搅拌反应20～30分钟除Trp的甲酰基保护基，抽干，二氯甲烷，乙醇交替洗涤2～3次后，得到脱除Trp的甲酰基侧链保护基的ATL树脂：Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(H)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA；
4)切割反应脱除侧链保护基团并切割树脂
以10ml/g树脂的量将切割试剂加入到Ac-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(H)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA中，室温反应3小时后，过滤，收集滤液，用三氟醋酸洗涤滤除的树脂，洗涤液与滤液合并后浓缩，之后加入其100～150倍体积量的冷乙醚，即析出 大量的白色固体，过滤，收集白色固体，干燥，即得ATL肽的粗肽制品；
其中：所述切割试剂是体积配比为：三氟醋酸∶三氟甲磺酸∶硫代苯甲醚∶乙二硫醇＝80∶8～9∶8～9∶4～5的混合溶液；
5)ATL肽粗品的纯化
ATL肽粗品用5％醋酸水溶液溶解，经0.45μm微孔滤膜过滤后，直接上样到反相C18键合硅胶装填色谱柱，采用梯度6～9％甲醇-水流动相进行梯度洗脱分离，收集目的组分，浓缩后，冷冻干燥，得到纯ATL肽。
2.如权利要求1所述ATL肽的固相合成方法，其特征在于，步骤1)中(2)是向上述树脂中加入2～4当量Boc-保护氨基酸，2～4当量的HOBt，而后加入2～4当量的N，N-二环己基碳二亚胺，室温下搅拌3～5小时，抽干。
3.如权利要求1所述ATL肽的固相合成方法，其特征在于，步骤3)所述室温搅拌反应是30分钟。
4.如权利要求1所述ATL肽的固相合成方法，其特征在于，步骤4)所述切割试剂是体积配比为：三氟醋酸∶三氟甲磺酸∶硫代苯甲醚∶乙二硫醇＝80∶8∶8∶4的混合溶液。
5.如权利要求1所述ATL肽的固相合成方法，其特征在于，步骤5)所述反相C18键合硅胶装填色谱柱的装载量为5～200mg/克C18键合硅胶。
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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