CN101463072B

CN101463072B - 一种八肽胆囊收缩素的制备方法

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Publication number: CN101463072B
Application number: CN2008100439206A
Authority: CN
Inventors: 徐红岩; 王卫国
Original assignee: Glbetter Biochemical (shanghai) Co Ltd
Current assignee: Glbetter Biochemical (shanghai) Co Ltd
Priority date: 2008-11-11
Filing date: 2008-11-11
Publication date: 2011-09-28
Anticipated expiration: 2028-11-11
Also published as: CN101463072A

Abstract

本发明涉及一种多肽的制备方法，特别涉及辛卡利特的固相制备方法。本发明解决了酶法中酶系复杂、制备周期长及化学法中制备繁琐、酸解时产物易分解的问题。制备方法包括以下步骤：(1)制备保护的辛卡利特-树脂复合物；(2)制备辛卡利特-树脂复合物；(3)切割，制备辛卡利特粗品；(4)粗品经高效液相色谱纯化得到辛卡利特精品。本发明适合简便、高效制备辛卡利特。

Description

一种八肽胆囊收缩素的制备方法

技术领域：

本发明属多肽化学领域，特别涉及一种八肽胆囊收缩素(辛卡利特)的固相制备方法。

背景技术：

胆囊收缩素(CCK)是一种具有多种分子形式且有双重分布的脑肠肽，具有激素和神经递质的作用。八肽胆囊收缩素(辛卡利特，Sincalide)具有整个胆囊收缩素的全部生物活性，且活性要强2～10倍，其序列为H-Asp-Tyr(SO₃H)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-Phe-NH₂。胰腺功能不足的病人和胃素瘤患者血浆CCK浓度增高，此外，CCK还参与中枢神经系统的发病。近年来合成的辛卡利特被广泛应用于诊断胆囊和胰腺的功能。辛卡利特的制备方法主要分为酶法和化学法两类。

(1)酶法

酶法合成是以木瓜蛋白酶，嗜热菌蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶等酶系多酶联用，采用片段缩合的方法合成辛卡利特，其中一些氨基酸原料的制备及多肽保护基的脱除仍需化学法辅助才能完成。此类方法主要参见以下文献：Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1982，79：2840；Chem.Pharm.Bull.1988，36：3915；CollectionCzechoslovak Chem.Commun.1988，53：1086等。酶法存在的主要问题是：单纯的酶法不能完成辛卡利特的合成，需要联用化学方法方可合成目标产物；酶法涉及酶制剂种类较多(如木瓜蛋白酶，嗜热菌蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶)，且酶制剂价格昂贵，不易得；酶法生产属于液相合成范畴，中间产物分离麻烦，制备周期长。因而目前辛卡利特的生产已几乎不再采用酶法，而主要以化学方法为主。

(2)化学合成法

化学合成法可采用液相缩合片段，然后磺酸化的方式，也可以固相合成多肽序列后再磺酸化，或者合成磺酸化多肽序列后再酸解脱除肽链保护基的方法。此类方法主要参见以下文献：Journal of Medicinal Chemistry，1970，13(3)：349-352；Pept.：Struct.Funct.，Proc.Am.Pept.Symp.，9^th.1985，241-244；International JournalofPeptide & Protein Research，1991，38(6)：555-561；生物化学杂志，1991，7(4)：436-440；中国药物化学杂志，1993，(1)：39-41；International Journal of Peptide &Protein Research，1994，43(2)：190-200。当前化学法中存在的主要问题是：合成后再磺酸化的方法属于液相合成范畴，操作步骤多，中间产物分离麻烦，制备周期长，且反应中容易产生副产物导致辛卡利特产率下降；使用TFA脱除侧链保护基时，多肽上的磺酸酯键容易断裂，导致辛卡利特分解，产率及纯度下降。

发明内容

本发明的目的是提供一种简便、高效的辛卡利特制备方法，解决目前辛卡利特制备工艺繁琐、周期长、产物酸解时易分解的问题。一种辛卡利特的制备方法，具体技术方案如下：

(1)制备保护的辛卡利特-树脂复合物

向带有过滤装置的容器中加入树脂a。向所述容器中加入溶剂DMF，浸没树脂，静置1h，过滤。

于辛卡利特的C端氨基酸及酯化试剂中加入溶剂DMF溶解。然后将所得的溶液加入到所述的a中，20℃下反应5h。反应结束后，过滤。然后加入溶剂DMF，洗涤树脂三遍，过滤，得到b。所述的酯化试剂为DIC、HOBt和DMAP，其中各反应物物质的量之比为n(C端氨基酸)：n(DIC)：n(HOBt)：n(DMAP)：n(树脂)＝4：4：3：0.5：1。

在b中加入20％v/v PIP和DMF混合溶液，进行脱保护反应，20℃下反应0.5h。反应完毕后，过滤。然后加入DMF洗涤树脂，过滤，得到c。

向反应器中加入C端第二个氨基酸和缩合试剂HBTU、HOBt和DIEA，20℃下反应1h，进行缩合反应。反应结束后加入DMF洗涤树脂，过滤，得到d。其中所述的反应物物质的量之比为：n(氨基酸)：n(HBTU)：n(HOBt)：n(DIEA)：n(树脂)＝3：3：3：6：1。

按照辛卡利特C端到N端的顺序，更换氨基酸，循环脱保护反应和缩合反应的操作，合成保护的辛卡利特-树脂复合物e。其中所述的反应物物质的量之比为：n(氨基酸)：n(HBTU)：n(HOBt)：n(DIEA)：n(树脂)＝3：3：3：6：1。

其中所述的树脂为王氏树脂(Wang resin)、苯乙酰胺甲基树脂(Pam resin)或羟甲基树脂(Hydromethyl resin)中的一种。步骤(1)中所述的氨基酸为：Fmoc-Phe-OH，Fmoc-Asp(ODmab)-OH，Fmoc-Met-OH，Fmoc-Trp-OH，Fmoc-Gly-OH以及Fmoc-Tyr(SO₃Ba 1/2)-OH、Fmoc-Tyr(SO₃Na)-OH或Fmoc-Tyr(SO_3·NnBu4)-OH中的一种。

(2)制备辛卡利特-树脂复合物

向e中加入脱保护试剂1％～5％v/v肼和DMF混合溶液，20℃～60℃下反应5min～60min。过滤加入DMF洗涤树脂，得到f。

(3)切割，制备辛卡利特粗品

向f中加入切割试剂：体积比为20％氨水和THF混合溶液，20℃下反应24h。反应结束后，过滤，收集滤液，旋蒸后得到辛卡利特粗品g。

(4)粗品经高效液相色谱纯化得到辛卡利特精品

制备柱为C₁₈类型反相色谱柱，流动相为水、乙酸铵水溶液、乙腈或甲醇中的一种或几种。

本发明的有益效果是：(1)采用Dmab保护Asp的侧链羧基，以肼替代TFA、氢氟酸等酸性脱保护剂，在脱除Asp的侧链保护基Dmab时，Tyr上的磺酸基完全不受影响，不会导致辛卡利特的分解，提高了产率和纯度。(2)采用Fmoc固相一步法合成辛卡利特，无需经过酶法及液相法中间产物分离纯化的步骤，工艺简单，条件温和，制备周期短，试剂低毒无污染。

图1为本发明合成路线图

具体实施方式

本发明通过以下实例作进一步举例说明，这些实例不应解释为对本发明的限制。

实施例1：制备辛卡利特

(1)制备保护的辛卡利特-树脂复合物

向带有过滤装置的反应器中加入Wang resin(1.0mmol/g)1g，注入10mlDMF，静置1h，过滤。

取4mmol Fmoc-Phe-OH，4mmol DIC，3mmol HOBt及0.5mmol DMAP，溶于10ml DMF中，然后将所得溶液加入到反应器中，20℃下反应5h。反应结束后，过滤。然后加入10ml DMF，洗涤树脂三遍，过滤。

向反应器中加入10ml20％v/v PIP和DMF混合溶液，20℃下反应0.5h。反应完毕后，过滤。然后加入10ml DMF洗涤树脂三遍，过滤。

取3mmol Fmoc-Asp(ODmab)-OH，3mmol HBTU，3mmol HOBt及6mmolDIEA，溶于10ml DMF中，将所得溶液加入到反应器中，20℃下反应1h。反应结束后，过滤。然后加入10ml DMF，洗涤树脂三遍，过滤。

按照辛卡利特C端到N端的顺序，更换氨基酸，分别为：Fmoc-Met-OH，Fmoc-Trp-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Met-OH，Fmoc-Tyr(SO₃Na)-OH，Fmoc-Asp(ODmab)-OH。循环脱保护反应和缩合反应的操作，合成保护的辛卡利特-树脂复合物。

(2)制备辛卡利特-树脂复合物

向上述的保护的辛卡利特-树脂复合物中加入5ml 1％v/v肼和DMF混合溶液，20℃下反应60min。反应结束后，过滤。然后加入10ml DMF，洗涤树脂三遍，过滤，得到辛卡利特-树脂复合物。

(3)切割，制备辛卡利特粗品

向辛卡利特-树脂复合物中加入10ml 20％v/v NH₃和THF混合溶液，20℃下反应24h。反应结束后，过滤，收集滤液，旋蒸后得到辛卡利特粗品。

(4)粗品经高效液相色谱纯化得到辛卡利特精品

将辛卡利特粗品溶于水，经高效液相色谱纯化得到辛卡利特精品。制备条件为：C₁₈制备柱，检测波长220nm，流速2ml/min，流动相为乙酸铵水溶液和甲醇，5％甲醇——100％甲醇，30min。

实施例2：制备辛卡利特

(1)制备保护的辛卡利特-树脂复合物

向带有过滤装置的反应器中加入Pam resin(1.0mmol/g)2g，注入15ml DMF，静置1h，过滤。

取8mmol Fmoc-Phe-OH，8mmol DIC，6mmol HOBt及1mmol DMAP，溶于10ml DMF中，然后将所得溶液加入到反应器中，20℃下反应5h。反应结束后，过滤。然后加入15ml DMF，洗涤树脂三遍，过滤。

向反应器中加入15ml 20％v/v PIP和DMF混合溶液，20℃下反应0.5h。反应完毕后，过滤。然后加入15ml DMF洗涤树脂三遍，过滤。

取6mmol Fmoc-Asp(ODmab)-OH，6mmol HBTU，6mmol HOBt及12mmolDIEA，溶于15ml DMF中，将所得溶液加入到反应器中，20℃下反应1h。反应结束后，过滤。然后加入15ml DMF，洗涤树脂三遍，过滤。

按照辛卡利特C端到N端的顺序，更换氨基酸，分别为：Fmoc-Met-OH，Fmoc-Trp-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Met-OH，Fmoc-Tyr(SO₃Ba 1/2)-OH，Fmoc-Asp(ODmab)-OH。循环脱保护反应和缩合反应的操作，合成保护的辛卡利特-树脂复合物。

(2)制备辛卡利特-树脂复合物

向上述的保护的辛卡利特-树脂复合物中加入10ml 2％v/v肼和DMF混合溶液，30℃下反应30min。反应结束后，过滤。然后加入15ml DMF，洗涤树脂三遍，过滤，得到辛卡利特-树脂复合物。

(3)切割，制备辛卡利特粗品

向辛卡利特-树脂复合物中加入15ml 20％v/v NH₃和THF混合溶液，20℃下反应24h。反应结束后，过滤，收集滤液，旋蒸后得到辛卡利特粗品。

(4)粗品经高效液相色谱纯化得到辛卡利特精品

将辛卡利特粗品溶于水，经高效液相色谱纯化得到辛卡利特精品。制备条件为：C₁₈制备柱，检测波长220nm，流速3ml/min，流动相为乙酸铵水溶液和乙腈，5％乙腈——100％乙腈，30min。

实施例3：制备辛卡利特

(1)制备保护的辛卡利特-树脂复合物

向带有过滤装置的反应器中加入Hydromethyl resin(1.0mmol/g)3g，注入20ml DMF，静置1h，过滤。

取12mmol Fmoc-Phe-OH，12mmol DIC，9mmol HOBt及1.5mmol DMAP，溶于20ml DMF中，然后将所得溶液加入到反应器中，20℃下反应5h。反应结束后，过滤。然后加入20ml DMF，洗涤树脂三遍，过滤。

向反应器中加入20ml 20％v/v PIP和DMF混合溶液，20℃下反应0.5h。反应完毕后，过滤。然后加入20ml DMF洗涤树脂三遍，过滤。

取9mmol Fmoc-Asp(ODmab)-OH，9mmol HBTU，9mmol HOBt及18mmolDIEA，溶于20ml DMF中，将所得溶液加入到反应器中，20℃下反应1h。反应结束后，过滤。然后加入20ml DMF，洗涤树脂三遍，过滤。

按照辛卡利特C端到N端的顺序，更换氨基酸，分别为：Fmoc-Met-OH，Fmoc-Trp-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Met-OH，Fmoc-Tyr(SO_3·NnBu4)-OH，Fmoc-Asp(ODmab)-OH。循环脱保护反应和缩合反应的操作，合成保护的辛卡利特-树脂复合物。

(2)制备辛卡利特-树脂复合物

向上述的保护的辛卡利特-树脂复合物中加入15ml 5％v/v肼和DMF混合溶液，60℃下反应5min。反应结束后，过滤。然后加入20ml DMF，洗涤树脂三遍，过滤，得到辛卡利特-树脂复合物。

(3)切割，制备辛卡利特粗品

向辛卡利特-树脂复合物中加入20ml20％v/v NH₃/THF，20℃下反应24h。反应结束后，过滤，收集滤液，旋蒸后得到辛卡利特粗品。

(4)粗品经高效液相色谱纯化得到辛卡利特精品

将辛卡利特粗品溶于水，经高效液相色谱纯化得到辛卡利特精品。制备条件为：C₁₈制备柱，检测波长220nm，流速4ml/min，流动相为乙酸铵水溶液和甲醇；5％甲醇——100％甲醇，30min。

本发明部分简写解释如下：

DMF：二甲基甲酰胺

THF：四氢呋喃

PIP：哌啶

TFA：三氟乙酸

HBTU：O-苯并三氮唑-N，N，N，N，-四甲脲六氟磷酸酯

HOBt：1-羟基苯并三氮唑

DIEA：二异丙基乙胺

DIC：N，N′-二异丙基碳二亚胺

DMAP：二甲氨基吡啶

Dmab：4-{N-[1-(4，4-二甲基-2，6-二氧环己基乙烯基)-3-甲基丁基]氨}苄酯

Wang resin：王氏树脂

Pam resin：苯乙酰胺甲基树脂

Hydromethyl resin：羟甲基树脂

Fmoc-Phe-OH：N-(9-芴甲氧羰酰基)-苯丙氨酸

Fmoc-Asp(ODmab)-OH：N-(9-芴甲氧羰酰基)-4-{N-[1-(4，4-二甲基-2，6-二氧环己基乙烯基)-3-甲基丁基]氨}苄酯-天冬氨酸

Fmoc-Met-OH：N-(9-芴甲氧羰酰基)-蛋氨酸

Fmoc-Trp-OH：N-(9-芴甲氧羰酰基)-色氨酸

Fmoc-Gly-OH：N-(9-芴甲氧羰酰基)-甘氨酸

Fmoc-Tyr(SO3Ba 1/2)-OH：N-(9-芴甲氧羰酰基)-磺酸钡基-酪氨酸

Fmoc-Tyr(SO3Na)-OH：N-(9-芴甲氧羰酰基)-磺酸钠基-酪氨酸

Fmoc-Tyr(SO3.NnBu4)-OH：N-(9-芴甲氧羰酰基)-磺酸四丁基胺基-酪氨酸

Claims

1.一种八肽胆囊收缩素的制备方法，其特征是包括以下步骤：

(1)制备保护的八肽胆囊收缩素-树脂复合物：向装有树脂的砂芯反应器中加入二甲基甲酰胺，静置，过滤，向反应器中加入八肽胆囊收缩素的C端氨基酸及酯化试剂进行反应，所述的氨基酸依次添加顺序为N-(9-芴甲氧羰酰基)-苯丙氨酸、N-(9-芴甲氧羰酰基)-4-{N-[1-(4，4-二甲基-2，6-二氧环己基乙烯基)-3-甲基丁基]氨}苄酯-天冬氨酸、N-(9-芴甲氧羰酰基)-蛋氨酸、N-(9-芴甲氧羰酰基)-色氨酸、N-(9-芴甲氧羰酰基)-甘氨酸、N-(9-芴甲氧羰酰基)-蛋氨酸、N-(9-芴甲氧羰酰基)-磺酸钠基-酪氨酸、N-(9-芴甲氧羰酰基)-4-{N-[1-(4，4-二甲基-2，6-二氧环己基乙烯基)-3-甲基丁基]氨}苄酯-天冬氨酸，反应结束后，加入二甲基甲酰胺洗涤树脂，并过滤，向反应器中加入哌啶和二甲基甲酰胺混合溶液进行脱保护反应，反应结束后加入二甲基甲酰胺洗涤树脂，向反应器中加入C端第二个氨基酸和缩合试剂缩合，缩合反应结束后加入二甲基甲酰胺洗涤树脂，过滤，按照多肽从C端到N端的顺序，更换氨基酸，重复脱保护和缩合反应，得到保护的八肽胆囊收缩素-树脂复合物；

(2)制备八肽胆囊收缩素-树脂复合物：向装有保护的八肽胆囊收缩素-树脂复合物的反应器中加入脱保护试剂进行脱保护反应，反应结束后过滤，并加入二甲基甲酰胺洗涤树脂，过滤，得到八肽胆囊收缩素-树脂复合物；

(3)切割，制备八肽胆囊收缩素粗品：向装有八肽胆囊收缩素-树脂复合物的反应器中加入切割试剂进行切割反应，反应结束后，过滤，收集滤液，旋蒸后得到八肽胆囊收缩素粗品；

(4)粗品经高效液相色谱纯化得到八肽胆囊收缩素精品：采用C₁₈类型的反相色谱柱分离纯化八肽胆囊收缩素粗品，得到八肽胆囊收缩素精品。

2.根据权利要求1所述的一种八肽胆囊收缩素的制备方法，其特征是步骤

(1)中所述的树脂为王氏树脂、苯乙酰胺甲基树脂或羟甲基树脂中的一种。

3.根据权利要求1所述的一种八肽胆囊收缩素的制备方法，其特征是步骤

(1)中所述的酯化试剂为N，N′-二异丙基碳二亚胺、1-羟基苯并三氮唑和二甲氨基吡啶，酯化试剂物质的量之比n(C端氨基酸)∶n(二异丙基碳二亚胺)∶n(1-羟基苯并三氮唑)∶n(二甲氨基吡啶)∶n(树脂)＝4∶4∶3∶0.5∶1；所述的缩合试剂为O-苯并三氮唑-N，N，N，N，-四甲脲六氟磷酸酯、1-羟基苯并三氮唑和二异丙基乙胺，缩合试剂物质的量之比n(氨基酸)∶n(O-苯并三氮唑-N，N，N，N，-四甲脲六氟磷酸酯)∶n(1-羟基苯并三氮唑)∶n(二异丙基乙胺)∶n(树脂)＝3∶3∶3∶6∶1。

4.根据权利1要求的一种八肽胆囊收缩素的制备方法，其特征是步骤(2)中所述的脱保护试剂为：体积比为1％～5％肼和二甲基甲酰胺混合溶液，反应条件为：20℃～60℃下反应5min～60min。

5.根据权利1要求的一种八肽胆囊收缩素的制备方法，其特征是步骤(3)中所述的切割试剂为：体积比为20％氨水和四氢呋喃混合溶液，切割反应条件为：20℃下反应24h。

6.根据权利1要求的一种八肽胆囊收缩素的制备方法，其特征是步骤(4)中所述的分离条件为：制备柱为C₁₈类型，流动相为水、乙酸铵水溶液、乙腈、甲醇中的一种或几种。