CN104211777A - 一种皮卡那肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明采用固液结合的方法合成皮卡那肽，其中两对二硫键采用定向方法先后形成，避免了二硫键错配情况的发生，有利于后续纯化，本发明的方法具有操作简便、自动化率高、溶剂使用量少、绿色环保等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种多肽的制备方法，具体地涉及皮卡那肽的制备方法。
背景技术
皮卡那肽（Plecanatide）是一种合成的尿鸟苷素类似物（尿鸟苷素是一种促尿钠排泄激素，能够调节胃肠道中离子和液体的转运），皮卡那肽进入体内后与胃肠道黏膜内皮细胞上的鸟苷酸环化酶C结合并将其激活，活化囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)，促进氯化物和水分进入肠道，从而促进肠道蠕动，改善便秘症状。
Synergy公司于2010年l0月6日公布其在研新药皮卡那肽(代码：SP304)治疗胃肠道疾病的II a期临床实验结果。这项在慢性便秘患者中进行的研究显示，该药物能够改善患者的肠道功能，促进肠道蠕动，减少腹部不适状。在试验中，没有出现腹泻等不良反应，在试验剂量下也没有检测到皮卡那肽被系统吸收。该药物有望用于治慢性便秘(CC)、便秘型肠道易激综合征(IBS-C)以及其他胃肠道疾病。CC和IBS-C都是常见的胃肠道疾病，可能对患者的工作和生活质量造成严重影响。Synergy公司将继续进行皮卡那肽的其他临床试验。
发明内容
本发明采用固液结合的方法合成皮卡那肽，具有操作简便、自动化率高、溶剂使用量少、绿色环保等优点，同时两对二硫键采用定向方法合成，避免了二硫键错配情况的发生，有利于后续纯化。
皮卡那肽的结构为：
H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Leu-OH(二硫键4-12,7-15)
本发明提供了一种制备皮卡那肽的方法，包括以下步骤：
1）将Fmoc-Leu-OH与树脂偶联，得到Fmoc-Leu-树脂；
2）按照皮卡那肽的肽序从C端到N端依次将氨基酸原料偶联到步骤1）得到的Fmoc-Leu-树脂上，得到肽树脂片段H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(X)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(Y)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(X)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Y)-Leu-树脂，其中X和Y选自Trt、Acm、mmt或StBu，并且X不同于Y；
3）将步骤2）得到的肽树脂裂解并脱除除Cys外的氨基酸的侧链保护基，并分别脱除Cys的两种保护基X和Y，经氧化分别形成两对二硫键，得到皮卡那肽。
其中，步骤1）所述的树脂是Wang树脂或CTC树脂，所用的偶联剂为：a)所用树脂为wang树脂时所用偶联剂为HOBT/DIC/DMAP；b)所用树脂为2-CTC树脂时所用偶联剂为DIPEA。
步骤1）所述的Fmoc-Leu-树脂的替代度为0.25～0.55mmol/g。
步骤2）中所用的偶联剂为HOBT/DIC。
步骤3）中，根据反应条件不同，脱除Cys的保护基X或Y可以与裂解肽树脂并脱除除Cys外的其他氨基酸的侧链保护基同时进行；脱除Cys的保护基X或Y也可与氧化形成二硫键（4-12）或二硫键（7-15）同时进行；但是二硫键（4-12）和二硫键（7-15）的形成是分别进行的，这样可避免二硫键错配（例如（4-7）、（12-15））情况的发生，有利于后续纯化。
其中可使用含5%TFA的裂解液，优选TFA：DCM=5：95（V/V）将肽片段从CTC树脂上裂解下来或将侧链保护基mmt脱除。
可使用含95%TFA的裂解液，优选TFA：EDT：水=95：2.5：2.5（V/V）将肽片段从CTC树脂或wang树脂上裂解下来，或将侧链保护基Trt、OtBu、tBu或mmt脱除。
可使用I2溶液，优选含300mmol/l I2的乙醇溶液将侧链保护基Acm脱除。
可使用β-巯基乙醇溶液，优选含20%β-巯基乙醇和0.1M N-甲基吗啉的DMF或水溶液将侧链保护基StBu脱除。
步骤3）中形成二硫键的条件为各种可使脱去侧链保护基的Cys之间形成二硫键的氧化条件，包括但不限于空气或氧气氧化、DMSO氧化、I2氧化或H2O2氧化。
具体实施方式
本文的术语“肽树脂”是指多肽的C端连有树脂、N端的氨基连有Fmoc保护基的多肽树脂。
本文中“二硫键（4-12）”是指在皮卡那肽氨基酸序列中第4位Cys与第12位Cys之间形成的二硫键；“二硫键（7-15）”是指在皮卡那肽氨基酸序列中第7位Cys与第15位Cys之间形成的二硫键。
“裂解肽树脂”是指将肽片段从树脂上裂解下来。
本发明中所用缩写及其含义列于下表：
| 缩写及英文 | 含义 |
| CTC树脂 | 2-氯三苯甲基氯树脂 |
| mmt | 4-甲氧基三苯甲基 |
| Fmoc | 9-芴甲氧羰基 |
| DIPCDI | 二异丙基碳二亚胺 |
| HOBt | 1-羟基苯并三唑 |
| Acm | 乙酰氨甲基 |
| Trt | 三苯甲基 |
| StBu | 叔丁硫基 |
| DMF | N,N-二甲基甲酰胺 |
| DMSO | 二甲基亚砜 |
| DCM | 二氯甲烷 |
| DIC | N,N-二异丙基碳二亚胺 |
| TFA | 三氟乙酸 |
| EDT | 乙二硫醇 |
| DIPEA | N,N-二异丙基乙胺 |
| DMAP | 4-二甲胺基吡啶 |
所使用的原料氨基酸（购自吉尔生化(上海)有限公司）：
Fmoc-Asn(Trt)-OH代表：N-芴甲氧羰基-侧链三苯甲基保护天冬酰胺
Fmoc-Asp(R)-OH代表：N-芴甲氧羰基-侧链R基保护天冬氨酸
Fmoc-Glu(R)-OH代表：N-芴甲氧羰基-侧链R基保护谷氨酸
Fmoc-Thr(tBu)-OH代表：N-芴甲氧羰基-侧链叔丁基保护苏氨酸
Fmoc-Cys(R)-OH代表：N-芴甲氧羰基-侧链R基保护半胱氨酸
Fmoc-Gly-OH代表：N-芴甲氧羰基甘氨酸
Fmoc-Leu-OH代表：N-芴甲氧羰基亮氨酸
Fmoc-Ala-OH代表：N-芴甲氧羰基丙氨酸
Fmoc-Val-OH代表：N-芴甲氧羰基缬氨酸
当氨基酸为Asp（天冬氨酸）或Glu（谷氨酸）时，侧链R=OtBu（叔丁氧基）；当氨基酸为Cys（半胱氨酸）时，侧链R=Trt、Acm、mmt或StBu。
所使用的wang树脂和CTC树脂购自天津南开和成有限公司，偶联试剂购自苏州天马有限公司，其它溶剂和试剂为普通市售品。
提供以下实施例，以方便本领域技术人员更好地理解本发明，所述实施例仅出于示例性目的，并非意在限制本发明的范围。
实施例1：替代度为0.3mmol/g的Fmoc-Leu-Wang树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的Wang树脂400g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取84.84gFmoc-Leu-OH（240mmol）、38.88g HOBt（288mmol）和2.93g DMAP（24mmol）溶于800ml的DCM和DMF（体积比为1:1）混合溶液，冰水浴下加入45.02ml DIC（288mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入1395ml封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，8mol：8mol）封闭8小时。用DMF洗涤4次，DCM洗涤4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Leu-Wang树脂。检测其替代度为0.297mmol/g（本文中检测树脂替代度方法可参考《固相有机合成-原理及应用指南》王德心主编，化学工业出版社）。
实施例2：替代度为0.4mmol/g的Fmoc-Leu-Wang树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的Wang树脂400g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取113.12gFmoc-Leu-OH（320mmol）、51.84g HOBt（384mmol）和3.90g DMAP（32mmol）溶于800ml的DCM和DMF（体积比为1:1）混合溶液，冰水浴下加入60.03ml DIC（384mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入1395ml封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，8mol：8mol）封闭8小时。用DMF洗涤4次，DCM洗涤4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Leu-Wang树脂。检测替代度为0.403mmol/g。
实施例3：替代度为0.5mmol/g的Fmoc-Leu-Wang树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的Wang树脂400g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取141.40gFmoc-Leu-OH（400mmol）、64.85g HOBt（480mmol）和4.88g DMAP（40mmol）溶于800ml的DCM和DMF（体积比为1:1）混合溶液，冰水浴下加入75.04ml DIC（480mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入1395ml封闭液（吡啶/乙酸酐=1:1，8mol：8mol）封闭8小时。用DMF洗涤4次，DCM洗涤4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Leu-Wang树脂。检测替代度为0.511mmol/g。
实施例4：替代度为0.3mmol/g的Fmoc-Leu-CTC树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的CTC树脂400g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取50.90gFmoc-Leu-OH（144mmol）溶于800ml DMF溶液，冰水浴下加入50.07ml DIPEA（288mmol）活化3min后加入固相反应柱中，反应5min后，再次加入25.04ml DIPEA（144mmol），室温反应0.5小时。用DMF洗涤3次，加入325.05ml甲醇（8mol）封闭8小时。用DMF洗涤4次，DCM洗涤4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Leu-CTC树脂。检测替代度为0.298mmol/g。
实施例5：替代度为0.4mmol/g的Fmoc-Leu-CTC树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的CTC树脂400g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取67.87gFmoc-Leu-OH（192mmol）溶于800ml DMF溶液，冰水浴下加入66.76ml DIPEA（384mmol）活化3min后加入固相反应柱中，反应5min后，再次加入33.38ml DIPEA（192mmol），室温反应0.5小时。用DMF洗涤3次，加入325.05ml甲醇（8mol）封闭8小时。用DMF洗涤4次，DCM洗涤4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Leu-CTC树脂。检测替代度为0.403mmol/g。
实施例6：替代度为0.5mmol/g的Fmoc-Leu-CTC树脂的合成
称取替代度为1.0mmol/g的CTC树脂400g，加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。称取84.84gFmoc-Leu-OH（240mmol）溶于800ml DMF溶液，冰水浴下加入83.45ml DIPEA（480mmol）活化3min后加入固相反应柱中，反应5min后，再次加入41.73ml DIPEA（240mmol），室温反应0.5小时。用DMF洗涤3次，加入325.05ml甲醇（8mol）封闭8小时。用DMF洗涤4次，DCM洗涤4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-Leu-CTC树脂。检测替代度为0.501mmol/g。
实施例7：
H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(Acm)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Acm)-Leu-Wang树脂的制备
称取按实施例2方法制备的替代度为0.403mmol/g的Fmoc-Leu-Wang树脂248.14g（100mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。用约800ml DBLK（20%哌啶/DMF）反应15min脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗涤2次。取124.35g Fmoc-Cys(Acm)-OH（300mmol），48.64g HOBt（360mmol），溶于800ml的DCM和DMF（体积比为1:1）混合溶液，冰水浴下加入56.28ml DIC（360mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照皮卡那肽肽序，从C端到N端依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH的偶联（各原料氨基酸的量为300mmol），按上述方法脱除最后氨基酸的Fmoc保护后，将肽树脂用甲醇收缩，真空干燥过夜，得到H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(Acm)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Acm)-Leu-Wang树脂482.32g。
实施例8：
H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(mmt)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(Acm)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(mmt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Acm)-Leu-Wang树脂的制备
称取按实施例2方法制备的替代度为0.403mmol/g的Fmoc-Leu-Wang树脂248.14g（100mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。用约800ml DBLK（20%哌啶/DMF）反应15min脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗涤2次。取124.35g Fmoc-Cys(Acm)-OH（300mmol），48.64g HOBt（360mmol），溶于800ml的DCM和DMF（体积比为1:1）混合溶液，冰水浴下加入56.28ml DIC（360mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照皮卡那肽肽序，从C端到N端依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(mmt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(mmt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH的偶联（各原料氨基酸的量为300mmol），按上述方法脱除最后氨基酸的Fmoc保护后，将肽树脂用甲醇收缩，真空干燥过夜，得到H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(mmt)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(Acm)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(mmt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Acm)-Leu-Wang树脂481.56g。
实施例9：
H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(StBu)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(Acm)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(StBu)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Acm)-Leu-Wang树脂的制备
称取按实施例2方法制备的替代度为0.403mmol/g的Fmoc-Leu-Wang树脂248.14g（100mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。用约800ml DBLK（20%哌啶/DMF）反应15min脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗涤2次。取124.35g Fmoc-Cys(Acm)-OH（300mmol），48.64g HOBt（360mmol），溶于800ml的DCM和DMF（体积比为1:1）混合溶液，冰水浴下加入56.28ml DIC（360mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照皮卡那肽肽序，从C端到N端依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(StBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(StBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH的偶联（各原料氨基酸的量为300mmol），按上述方法脱除最后氨基酸的Fmoc保护后，将肽树脂用甲醇收缩，真空干燥过夜，得到H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(StBu)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(Acm)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(StBu)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Acm)-Leu-Wang树脂479.86g。
实施例10：
H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(mmt)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(StBu)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(mmt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(StBu)-Leu-Wang树脂的制备
称取按实施例2方法制备的替代度为0.403mmol/g的Fmoc-Leu-Wang树脂248.14g（100mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。用约800ml DBLK（20%哌啶/DMF）反应15min脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗涤2次。取129.48g Fmoc-Cys(StBu)-OH（300mmol），48.64g HOBt（360mmol），溶于800ml的DCM和DMF（体积比为1:1）混合溶液，冰水浴下加入56.28ml DIC（360mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照皮卡那肽肽序，从C端到N端依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(mmt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(StBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(mmt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH的偶联（各原料氨基酸的量为300mmol），按上述方法脱除最后氨基酸的Fmoc保护后，将肽树脂用甲醇收缩，真空干燥过夜，得到H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(mmt)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(StBu)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(mmt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(StBu)-Leu-Wang树脂486.96g。
实施例11：
H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(StBu)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(StBu)-Leu-Wang树脂的制备
称取按实施例2方法制备的替代度为0.403mmol/g的Fmoc-Leu-Wang树脂248.14g（100mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。用约800ml DBLK（20%哌啶/DMF）反应15min脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗涤2次。取129.48g Fmoc-Cys(StBu)-OH（300mmol），48.64g HOBt（360mmol），溶于800ml的DCM和DMF（体积比为1:1）混合溶液，冰水浴下加入56.28ml DIC（360mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照皮卡那肽肽序，从C端到N端依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(StBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH的偶联（各原料氨基酸的量为300mmol），按上述方法脱除最后氨基酸的Fmoc保护后，将肽树脂用甲醇收缩，真空干燥过夜，得到H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(StBu)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(StBu)-Leu-Wang树脂480.01g。
实施例12：
H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Acm)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(Trt)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(Acm)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Leu-CTC树脂的制备
称取按实施例5方法制备的替代度为0.403mmol/g的Fmoc-Leu-CTC树脂248.14g（100mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。用约800ml DBLK（20%哌啶/DMF）反应15min脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗涤2次。取175.71g Fmoc-Cys(Trt)-OH（300mmol），48.64g HOBt（360mmol），溶于800ml的DCM和DMF（体积比为1:1）混合溶液，冰水浴下加入56.28ml DIC（360mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照皮卡那肽肽序，从C端到N端依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH的偶联（各原料氨基酸的量为300mmol），按上述方法脱除最后氨基酸的Fmoc保护后，将肽树脂用甲醇收缩，真空干燥过夜，得到H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Acm)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(Trt)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(Acm)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Leu-CTC树脂492.31g。
实施例13：
H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Acm)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(mmt)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(Acm)-Thr(tBu)-Gly-Cys(mmt)-Leu-CTC树脂的制备
称取按实施例5方法制备的替代度为0.403mmol/g的Fmoc-Leu-CTC树脂248.14g（100mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。用约800ml DBLK（20%哌啶/DMF）反应15min脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗涤2次。取184.74g Fmoc-Cys(mmt)-OH（300mmol），48.64g HOBt（360mmol），溶于800ml的DCM和DMF（体积比为1:1）混合溶液，冰水浴下加入56.28ml DIC（360mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照皮卡那肽肽序，从C端到N端依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(mmt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH的偶联（各原料氨基酸的量为300mmol），按上述方法脱除最后氨基酸的Fmoc保护后，将肽树脂用甲醇收缩，真空干燥过夜，得到H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Acm)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(mmt)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(Acm)-Thr(tBu)-Gly-Cys(mmt)-Leu-CTC树脂478.23g。
实施例14：
H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Acm)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(StBu)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(Acm)-Thr(tBu)-Gly-Cys(StBu)-Leu-CTC树脂的制备
称取按实施例5方法制备的替代度为0.403mmol/g的Fmoc-Leu-CTC树脂248.14g（100mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。用约800ml DBLK（20%哌啶/DMF）反应15min脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗涤2次。取129.48g Fmoc-Cys(StBu)-OH（300mmol），48.64g HOBt（360mmol），溶于800ml的DCM和DMF（体积比为1:1）混合溶液，冰水浴下加入56.28ml DIC（360mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照皮卡那肽肽序，从C端到N端依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(StBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH的偶联（各原料氨基酸的量为300mmol），按上述方法脱除最后氨基酸的Fmoc保护后，将肽树脂用甲醇收缩，真空干燥过夜，得到H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Acm)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(StBu)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(Acm)-Thr(tBu)-Gly-Cys(StBu)-Leu-CTC树脂472.30g。
实施例15：
H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(StBu)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(Trt)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(StBu)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Leu-CTC树脂的制备
称取按实施例5方法制备的替代度为0.403mmol/g的Fmoc-Leu-CTC树脂248.14g（100mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。用约800ml DBLK（20%哌啶/DMF）反应15min脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗涤2次。取175.71g Fmoc-Cys(Trt)-OH（300mmol），48.64g HOBt（360mmol），溶于800ml的DCM和DMF（体积比为1:1）混合溶液，冰水浴下加入56.28ml DIC（360mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照皮卡那肽肽序，从C端到N端依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(StBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(StBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH的偶联（各原料氨基酸的量为300mmol），按上述方法脱除最后氨基酸的Fmoc保护后，将肽树脂用甲醇收缩，真空干燥过夜，得到H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(StBu)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(Trt)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(StBu)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Leu-CTC树脂485.61g。
实施例16：
H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(mmt)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(Trt)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(mmt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Leu-CTC树脂的制备
称取按实施例5方法制备的替代度为0.403mmol/g的Fmoc-Leu-CTC树脂248.14g（100mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。用约800ml DBLK（20%哌啶/DMF）反应15min脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗涤2次。取175.71g Fmoc-Cys(Trt)-OH（300mmol），48.64g HOBt（360mmol），溶于800ml的DCM和DMF（体积比为1:1）混合溶液，冰水浴下加入56.28ml DIC（360mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照皮卡那肽肽序，从C端到N端依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(mmt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(mmt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH的偶联（各原料氨基酸的量为300mmol），按上述方法脱除最后氨基酸的Fmoc保护后，将肽树脂用甲醇收缩，真空干燥过夜，得到H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(mmt)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(Trt)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(mmt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Leu-CTC树脂479.52g。
实施例17：
H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(mmt)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(mmt)-Leu-Wang树脂的制备
称取按实施例2方法制备的替代度为0.403mmol/g的Fmoc-Leu-Wang树脂248.14g（100mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。用约800ml DBLK（20%哌啶/DMF）反应15min脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗涤2次。取184.72g Fmoc-Cys(mmt)-OH（300mmol），48.64g HOBt（360mmol），溶于800ml的DCM和DMF（体积比为1:1）混合溶液，冰水浴下加入56.28ml DIC（360mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照皮卡那肽肽序，从C端到N端依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(mmt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH的偶联（各原料氨基酸的量为300mmol），按上述方法脱除最后氨基酸的Fmoc保护后，将肽树脂用甲醇收缩，真空干燥过夜，得到H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(mmt)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(mmt)-Leu-Wang树脂486.27g。
实施例18：
H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(mmt)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(StBu)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(mmt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(StBu)-Leu-CTC树脂的制备
称取按实施例5方法制备的替代度为0.403mmol/g的Fmoc-Leu-CTC树脂248.14g（100mmol），加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。用约800ml DBLK（20%哌啶/DMF）反应15min脱除Fmoc保护，然后用DMF洗涤4次，DCM洗涤2次。取129.48g Fmoc-Cys(StBu)-OH（300mmol），48.64g HOBt（360mmol），溶于800ml的DCM和DMF（体积比为1:1）混合溶液，冰水浴下加入56.28ml DIC（360mmol）活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。以茚三酮法检测判断反应终点，如果树脂无色透明，则表示反应完全；树脂显色，则表示反应不完全，需再偶联反应1小时，此判断标准适用于后续内容中以茚三酮法检测判断反应终点。重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照皮卡那肽肽序，从C端到N端依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(mmt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(StBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(mmt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH的偶联（各原料氨基酸的量为300mmol），按上述方法脱除最后氨基酸的Fmoc保护后，将肽树脂用甲醇收缩，真空干燥过夜，得到H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(mmt)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(StBu)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(mmt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(StBu)-Leu-CTC树脂472.88g。
实施例19：
H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Leu-OH(二硫键4-12,7-15)的制备
将按实施例7方法制备的H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(Acm)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Acm)-Leu-Wang树脂（100mmol，482.32g）置于裂解反应器中，以10ml/g肽树脂的比例加入裂解试剂（TFA：EDT：水=95：2.5：2.5（V/V）），室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，再在漏斗中加入少量TFA洗涤树脂，收集滤液，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚（100ml/g肽树脂）使溶液沉淀，离心去除乙醚后将沉淀用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体约180g，即H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys(Acm)-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys(Acm)-Leu-OH。将固体用水溶解成1mg/ml溶液。加入27L15%（体积比）的DMSO水溶液，室温搅拌反应12h，制得H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys(Acm)-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys(Acm)-Leu-OH(二硫键4-12)溶液，用旋转蒸发仪干燥后将该化合物用水配制成3mg/ml的溶液约60L，加入用1L乙醇溶解的300mmol I2溶液，室温搅拌反应2h。加入适量Vc（维生素c）去除过量I2，直至反应溶液颜色透明，即得到H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Leu-OH(二硫键4-12,7-15)。
实施例20：
H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Leu-OH(二硫键4-12,7-15)的制备
将按实施例8方法制备的H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(mmt)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(Acm)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(mmt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Acm)-Leu-Wang树脂（100mmol，481.56g）置于裂解反应器中，以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂（TFA：EDT：水=95：2.5：2.5（V/V）），室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，再在漏斗中加入少量TFA洗涤树脂，收集滤液，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚（100ml/g肽树脂）使溶液沉淀，离心去除乙醚后将沉淀用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体约180g，即H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys(Acm)-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys(Acm)-Leu-OH。将固体用水溶解成1mg/ml溶液。加入1.8L1%（体积比）H2O2水溶液，室温搅拌反应30min，制得H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys(Acm)-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys(Acm)-Leu-OH(二硫键4-12)溶液，用旋转蒸发仪干燥后将该化合物用水溶解成3mg/ml的溶液约60L，加入用1L乙醇溶解的300mmol I2溶液，室温搅拌反应2h。加入适量Vc去除过量I2，直至反应溶液颜色透明，即得到H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Leu-OH(二硫键4-12,7-15)。
实施例21：
H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Leu-OH(二硫键4-12,7-15)的制备
将按实施例9方法制备的H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(StBu)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(Acm)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(StBu)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Acm)-Leu-Wang树脂（100mmol，479.86g）加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。加入500ml含20%β-巯基乙醇和0.1M N-甲基吗啉的DMF溶液，搅拌反应12h。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys-Glu(OtBu)-Leu-Cys(Acm)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys-Thr(tBu)-Gly-Cys(Acm)-Leu-Wang树脂。以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂（TFA：EDT：水=95：2.5：2.5（V/V）），室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，再在漏斗中加入少量TFA洗涤树脂，收集滤液，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚（100ml/g肽树脂）使溶液沉淀，离心去除乙醚后将沉淀用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体约180g，即H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys(Acm)-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys(Acm)-Leu-OH。将固体用水溶解成1mg/ml溶液。室温搅拌反应24h，经空气氧化制得H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys(Acm)-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys(Acm)-Leu-OH(二硫键4-12)溶液，用旋转蒸发仪干燥后将该化合物用水溶解成3mg/ml的溶液约60L，加入用1L乙醇溶解的300mmol I2溶液，室温搅拌反应2h。加入适量Vc去除过量I2，直至反应溶液颜色透明，即得到H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Leu-OH(二硫键4-12,7-15)。
实施例22：
H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Leu-OH(二硫键4-12,7-15)的制备
将按实施例10方法制备的H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(mmt)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(StBu)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(mmt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(StBu)-Leu-Wang树脂（100mmol，486.96g）置于裂解反应器中，以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂（TFA：EDT：水=95：2.5：2.5（V/V）），室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，再在漏斗中加入少量TFA洗涤树脂，收集滤液，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚（100ml/g肽树脂）使溶液沉淀，离心去除乙醚后将沉淀用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体约180g，即H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys(StBu)-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys(StBu)-Leu-OH。将固体用水溶解成1mg/ml溶液。加入1.8L1%（体积比）H2O2水溶液，室温搅拌反应30min，制得H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys(StBu)-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys(StBu)-Leu-OH(二硫键4-12)溶液，用旋转蒸发仪干燥后将该化合物用500ml含有20%β-巯基乙醇和0.1M的N-甲基吗啉水溶液溶解，搅拌反应12h后，将反应液用水稀释为3mg/ml的溶液约60L，加入用1L乙醇溶解的300mmol I2溶液，室温搅拌反应2h。加入适量Vc去除过量I2，直至反应溶液颜色透明，即得到H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Leu-OH(二硫键4-12,7-15)。
实施例23：
H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Leu-OH(二硫键4-12,7-15)的制备
将按实施例11方法制备的H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(StBu)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(StBu)-Leu-Wang树脂（100mmol，480.01g）置于裂解反应器中，以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂（TFA：EDT：水=95：2.5：2.5（V/V）），室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，再在漏斗中加入少量TFA洗涤树脂，收集滤液，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚（100ml/g肽树脂）使溶液沉淀，离心去除乙醚后将沉淀用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体约180g，即H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys(StBu)-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys(StBu)-Leu-OH。将固体用水溶解成1mg/ml溶液。加入约27L15%（体积比）DMSO水溶液，室温搅拌反应24h，制得H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys(StBu)-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys(StBu)-Leu-OH(二硫键4-12)溶液，用旋转蒸发仪干燥后将该化合物用500ml含有20%β-巯基乙醇和0.1M N-甲基吗啉的水溶液溶解，搅拌反应12h后，将反应液用水稀释成3mg/ml的溶液约60L，加入约600ml1%（体积比）H2O2水溶液，室温反应30min，即得到H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Leu-OH(二硫键4-12,7-15)。
实施例24：
H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Leu-OH(二硫键4-12,7-15)的制备
将按实施例12方法制备的H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Acm)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(Trt)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(Acm)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Leu-CTC树脂（100mmol，492.31g）置于裂解反应器中，以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂（TFA：EDT：水=95：2.5：2.5（V/V）），室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，再在漏斗中加入少量TFA洗涤树脂，收集滤液，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚（100ml/g肽树脂）使溶液沉淀，离心去除乙醚后将沉淀用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体约180g，即H-Asn-Asp-Asp-Cys(Acm)-Glu-Leu-Cys-Val-Asn-Val-Ala-Cys(Acm)-Thr-Gly-Cys-Leu-OH。将固体用水溶解成1mg/ml溶液。加入27L15%（体积比）的DMSO水溶液，室温搅拌反应12h，制得H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys(Acm)-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys(Acm)-Leu-OH(二硫键4-12)溶液，用旋转蒸发仪干燥后将该化合物用水溶解成3mg/ml的溶液约60L，加入用1L乙醇溶解的300mmol I2溶液，室温搅拌反应2h。加入适量Vc去除过量I2，直至反应溶液颜色透明，即得到H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Leu-OH(二硫键4-12,7-15)。
实施例25：
H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Leu-OH(二硫键4-12,7-15)的制备
将按实施例13方法制备的H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Acm)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(mmt)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(Acm)-Thr(tBu)-Gly-Cys(mmt)-Leu-CTC树脂（100mmol，478.23g）置于裂解反应器中，以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂（TFA：EDT：水=95：2.5：2.5（V/V）），室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，再在漏斗中加入少量TFA洗涤树脂，收集滤液，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚（100ml/g肽树脂）使溶液沉淀，离心去除乙醚后将沉淀用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体约180g，即H-Asn-Asp-Asp-Cys(Acm)-Glu-Leu-Cys-Val-Asn-Val-Ala-Cys(Acm)-Thr-Gly-Cys-Leu-OH。将固体用水溶解成1mg/ml溶液。加入27L15%（体积比）的DMSO水溶液，室温搅拌反应12h，制得H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys(Acm)-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys(Acm)-Leu-OH(二硫键4-12)溶液，用旋转蒸发仪干燥后将该化合物用水溶解成3mg/ml的溶液约60L，加入用1L乙醇溶解的300mmol I2溶液，室温搅拌反应2h。加入适量Vc去除过量I2，直至反应溶液颜色透明，即得到H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Leu-OH(二硫键4-12,7-15)。
实施例26：
H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Leu-OH(二硫键4-12,7-15)的制备
将按实施例14方法制备的H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Acm)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(StBu)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(Acm)-Thr(tBu)-Gly-Cys(StBu)-Leu-CTC树脂（100mmol，472.30g）加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。加入500ml含有20%β-巯基乙醇和0.1M的N-甲基吗啉的DMF溶液，搅拌反应12h。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys-Glu(OtBu)-Leu-Cys(Acm)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys-Thr(tBu)-Gly-Cys(Acm)-Leu-CTC树脂。以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂（TFA：EDT：水=95：2.5：2.5（V/V）），室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，再在漏斗中加入少量TFA洗涤树脂，收集滤液，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚（100ml/g肽树脂）使溶液沉淀，离心去除乙醚后将沉淀用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体约180g，即H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys(Acm)-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys(Acm)-Leu-OH。将固体用水溶解成1mg/ml溶液。室温搅拌反应24h，经空气氧化制得H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys(Acm)-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys(Acm)-Leu-OH(二硫键4-12)溶液，用旋转蒸发仪干燥后将该化合物用水溶解成3mg/ml的溶液约60L，加入用1L乙醇溶解的300mmol I2溶液，室温搅拌反应2h。加入适量Vc去除过量I2，直至反应溶液颜色透明，即得到H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Leu-OH(二硫键4-12,7-15)。
实施例27：
H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Leu-OH(二硫键4-12,7-15)的制备
将按实施例15方法制备的H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(StBu)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(Trt)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(StBu)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Leu-CTC树脂（100mmol，485.61g）加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。加入500ml含有20%β-巯基乙醇和0.1M N-甲基吗啉的DMF溶液，搅拌反应12h。反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys-Glu(OtBu)-Leu-Cys(Trt)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Leu-CTC树脂。以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂（TFA：DCM=5：95（V/V）），室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，再在漏斗中加入少量TFA洗涤树脂，收集滤液，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚（100ml/g肽树脂）使溶液沉淀，离心去除乙醚后将沉淀用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体约290g，即H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys-Glu(OtBu)-Leu-Cys(Trt)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Leu-OH。将固体用水溶解成1mg/ml溶液。加入约2.9L1%（体积比）H2O2水溶液，室温搅拌反应1h，制得H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys-Glu(OtBu)-Leu-Cys(Trt)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Leu-OH(二硫键4-12)溶液，用旋转蒸发仪干燥后，按照5ml/g的浓度加入裂解试剂（TFA：EDT：水=95：2.5：2.5（V/V）），室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，再在漏斗中加入少量TFA洗涤，收集滤液，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚（50ml/g肽）使溶液沉淀，离心去除乙醚后将沉淀用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体约170g，即H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Leu-OH(二硫键4-12)。将固体用水溶解成3mg/ml溶液，室温搅拌反应24h，经空气氧化制得H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Leu-OH(二硫键4-12,7-15)。
实施例28：
H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Leu-OH(二硫键4-12,7-15)的制备
将按实施例16方法制备的H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(mmt)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(Trt)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(mmt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Leu-CTC树脂（100mmol，479.52g）加入裂解反应器中，以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂（TFA：DCM=5：95（V/V）），室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，再在漏斗中加入少量TFA洗涤树脂，收集滤液，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚（100ml/g肽树脂）使溶液沉淀，离心去除乙醚后将沉淀用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体约290g，即H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys-Glu(OtBu)-Leu-Cys(Trt)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Leu-OH。将固体用水溶解成1mg/ml溶液。加入约2.9L1%（体积比）H2O2水溶液，室温搅拌反应1h，制得H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys-Glu(OtBu)-Leu-Cys(Trt)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Leu-OH(二硫键4-12)溶液，用旋转蒸发仪干燥后，按照5ml/g的浓度加入裂解试剂（TFA：EDT：水=95：2.5：2.5（V/V）），室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，再在漏斗中加入少量TFA洗涤，收集滤液，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀（50ml/g肽）使溶液沉淀，离心去除乙醚后将沉淀用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体约170g，即H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Leu-OH(二硫键4-12)。将固体用水溶解成3mg/ml溶液，室温搅拌反应24h，经空气氧化制得H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Leu-OH(二硫键4-12,7-15)。
实施例29：
H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Leu-OH(二硫键4-12,7-15)的制备
将按实施例17方法制备的H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(mmt)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(mmt)-Leu-Wang树脂（100mmol，486.27g）加入到固相反应柱中，用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟，然后以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂（TFA：DCM=5：95（V/V）），室温搅拌2h。反应结束后，将肽树脂用DMF洗涤6次，然后加入DMF1500ml，再加入15ml H2O2，室温搅拌反应1h，反应结束后将树脂用甲醇收缩，然后在真空干燥过夜，制得H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-Cys-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Cys-Leu-Wang树脂(二硫键7-15)，然后将树脂加入裂解反应器中，以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂（TFA：EDT：水=95：2.5：2.5（V/V）），室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，再在漏斗中加入少量TFA洗涤，收集滤液，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚沉淀（100ml/g肽）使溶液沉淀，离心去除乙醚后将沉淀用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体约180g，即H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Leu-OH(二硫键7-15)。将该固体用水溶解成3mg/ml溶液，室温搅拌反应24h，经空气氧化制得H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Leu-OH(二硫键4-12,7-15)。
实施例30：
H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Leu-OH(二硫键4-12,7-15)的制备
将按实施例18方法制备的H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(mmt)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(StBu)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(mmt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(StBu)-Leu-CTC树脂（100mmol，472.88g）置于裂解反应器中，以10ml/g树脂的比例加入裂解试剂（TFA：EDT：水=95：2.5：2.5（V/V）），室温搅拌2h。反应物用砂芯漏斗过滤，再在漏斗中加入少量TFA洗涤树脂，收集滤液，合并滤液后减压浓缩。加入冰冻的无水乙醚（100ml/g肽树脂）使溶液沉淀，离心去除乙醚后将沉淀用无水乙醚洗涤3次，真空干燥得到白色粉末固体约180g，即H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys(StBu)-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys(StBu)-Leu-OH。将固体用水溶解成1mg/ml溶液。加入1%体积的H2O2水溶液，室温搅拌反应30min，制得H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys(StBu)-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys(StBu)-Leu-OH(二硫键4-12)溶液，用旋转蒸发仪干燥后将该化合物用500ml含有20%β-巯基乙醇和0.1M N-甲基吗啉的水溶液溶解，搅拌反应12h后，将反应液用水稀释成3mg/ml的溶液约60L，加入用1L乙醇溶解的300mmol I2溶液，室温搅拌反应2h。加入适量Vc去除过量I2，直至反应溶液颜色透明，即得到H-Asn-Asp-Asp-Cys-Glu-Leu-Cys-Val-Asn-Val-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Leu-OH(二硫键4-12,7-15)。
Claims (10)
1.一种制备皮卡那肽的方法，包括以下步骤：
1）将Fmoc-Leu-OH与树脂偶联，得到Fmoc-Leu-树脂，
2）按照皮卡那肽的肽序从C端到N端依次将氨基酸原料偶联到步骤1）得到的Fmoc-Leu-树脂上，得到肽树脂片段H-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(X)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(Y)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(X)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Y)-Leu-树脂，其中X和Y选自Trt、Acm、mmt或StBu，并且X不同于Y，
3）将步骤2）得到的肽树脂裂解并脱除除Cys外的氨基酸的侧链保护基，并分别脱除Cys的两种保护基X和Y，经氧化分别形成二硫键（4-12）与二硫键（7-15），得到皮卡那肽。
2.权利要求1的方法，其中步骤1）所述的树脂是Wang树脂或CTC树脂。
3.权利要求1的方法，其中步骤3）中，脱除Cys的保护基X或Y可以与裂解肽树脂并脱除除Cys外的其他氨基酸的侧链保护基同时进行；脱除Cys的保护基X或Y也可与氧化形成二硫键（4-12）或二硫键（7-15）同时进行；二硫键（4-12）和二硫键（7-15）的形成是分别进行的。
4.权利要求1的方法，其中步骤3）中可使用含5%TFA的裂解液，优选TFA：DCM=5：95（V/V）将肽片段从CTC树脂上裂解下来或将侧链保护基mmt脱除；可使用含95%TFA的裂解液，优选TFA：EDT：水=95：2.5：2.5（V/V）将肽片段从CTC树脂或wang树脂上裂解下来，或将侧链保护基Trt、OtBu、tBu或mmt脱除。
5.权利要求1的方法，其中步骤3）中可使用I2溶液，优选含300mmol/lI2的乙醇溶液将侧链保护基Acm脱除。
6.权利要求1的方法，其中步骤3）中可使用β-巯基乙醇溶液，优选含20%β-巯基乙醇和0.1M N-甲基吗啉的DMF溶液或水溶液将侧链保护基StBu脱除。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中步骤3）中氧化形成二硫键是采用空气或氧气氧化、DMSO氧化、I2氧化或H2O2氧化的方法。
8.权利要求7的方法，其中步骤1）中所用的偶联剂为：a)所用树脂为wang树脂时所用偶联剂为HOBT/DIC/DMAP；b)所用树脂为2-CTC树脂时所用偶联剂为DIPEA。
9.权利要求7的方法，其中步骤2）中所用的偶联剂为HOBT/DIC。
10.权利要求1的方法，其中步骤1）中Fmoc-Leu-树脂的替代度为0.25～0.55mmol/g。
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