CN111100188A - 一种制备蜘蛛抗菌肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备蜘蛛抗菌肽的方法，包括如下步骤：1)按照蜘蛛抗菌肽的氨基酸序列合成肽链，所得到的肽链上第6个和第11个氨基酸带了保护基A，第2个和15个氨基酸带保护基B；2)去除保护基A和保护基B的其中任意一个；3)氧化形成第一对二硫键；4)去除保护基A和保护基B剩下的一个；5)氧化形成第二对二硫键。本发明可以避免制备蜘蛛抗菌肽时错配的问题。
Description
技术领域
本发明属于多肽合成领域，具体涉及一种制备蜘蛛抗菌肽的方法。
背景技术
抗菌肽具有广谱抗菌活性，可以快速查杀靶标，并且其中很多是纯天然的肽，使它迅速成为潜在的治疗药物；抗菌肽的治疗范围为：革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌、真菌、寄生虫、肿瘤细胞等。
蜘蛛抗菌肽(Gomesin)，从捕鸟蛛Acanthoscurria gomesiana的血细胞分离得到，由18个氨基酸组成，C端Arg以酰胺结尾，N端为焦谷氨酸Z，序列中含有四个Cys，形成两对二硫键(Cys2与Cys15，Cys6与Cys11)，具体如下：
其中Z为焦谷氨酸(L-pGlu)。
目前Gomesin的制备方法主要有两种：采用Boc固相多肽合成法合成主链，HF脱除全部保护基后再空气氧化形成两对二硫键；采用Fmoc固相多肽合成法合成主链，TFA脱除全部保护基后再空气氧化形成两对二硫键。两种方法最后都是在水溶液中空气氧化形成两对二硫键，配对时选择性不高，容易产生大量错配的副产物。
例如：《Chan，L.Y.，Zhang，V.M.，Huang，Y.-H.，Waters，N.C.，Bansal，P.S.，Craik，D.J.，and Daly，N.L.(2013)Cyclization of theantimicrobial peptide gomesin withnative chemical ligation：influenceson stability and bioactivity.ChemBioChem14，617-624》文献中就提到：按照空气氧化法形成Gomesin的两对二硫键，错配异构体杂质含量高达18％。
基于以上技术应用背景，本发明的发明人欲解决现有制备方法形成二硫键时的错配问题，以及空气氧化下溶剂使用量大的问题。
发明内容
为了解决上述问题，提供一种新的制备蜘蛛抗菌肽的方法。
本发明提供了一种制备蜘蛛抗菌肽的方法，其特征在于：
包括如下步骤：
1)按照蜘蛛抗菌肽的氨基酸序列合成肽链，所得到的肽链上第6个和第11个氨基酸带了保护基A，第2个和15个氨基酸带保护基B；所述蜘蛛抗菌肽的氨基酸的肽链为：
2)去除保护基A和保护基B的其中任意一个；
3)氧化形成第一对二硫键；
4)去除保护基A和保护基B剩下的一个；
5)氧化形成第二对二硫键。
如前述的方法，步骤1)所述肽链合成是按照蜘蛛抗菌肽的氨基酸序列，将已保护的氨基酸依次偶联在固相载体上。
如前述述的方法，步骤1)的固相载体为酰胺功能化的树脂。
进一步地，步骤1)的固相载体为Rink Amide AM Resin、Rink Amide MBHA Resin或Siber Resin中的一种。
进一步地，步骤1)的固相载体为Rink Amide MBHA Resin。
如前述的方法，步骤1)的固相载体取代度值为0.1～2.0mmol/g。
进一步地，步骤1)的固相载体取代度值为0.2～0.8mmol/g。
如前述的方法，步骤1)所述的偶联，使用缩合剂使用缩合剂HBTU/Cl-HoBt/DIEA、TBTU/Cl-HoBt/DIEA、HBTU/DIEA、TBTU/DIEA或PyBOP/Cl-HoBt/DIEA的一种或多种。
进一步地，步骤1)所述的偶联，使用缩合剂TBTU/DIEA。
如前述的方法，步骤1)的肽链除第2、6、11、15个氨基酸以外的其它氨基酸按照下列对应关系采用保护基：Arg采用Pbf保护基，Thr、Tyr采用tBu保护基，Lys采用Boc保护基，Gln采用Trt保护基。
如前述的方法，步骤1)所述的保护基A和保护基B均选自tBu、Acm、Trt、Mmt、Mtt、MeBzl、MoBzl、Dbs、Bzh、Tacm、Bam、Bzl、Npys、Pys中的一种。
进一步地，步骤1)所述的保护基A为Acm，所述保护基B为Trt；优选地，步骤2)去除的保护基是保护基B。
如前述的方法，去除Trt保护基后紧接着形成的二硫键，是在碱性条件下，使用空气、二甲亚砜、铁氰化钾或双氧水氧化形成的；优选地，是使用双氧水氧化形成的；
和/或，去除Acm保护基后紧接着形成的二硫键，是在酸性条件下，使用碘单质、三氟乙酸铊、NIS、锍盐、氯化硅-亚砜等氧化形成的；优选地，是使用碘单质氧化形成的。
如前述的方法，步骤2)去除的保护基B的同时，还去除了第2、6、11、15个氨基酸以外的其它氨基酸的保护基；
所述第2、6、11、15个氨基酸以外的其它氨基酸的保护基选自Pbf、tBu、Boc和Trt中的一种以上。
如前述的方法，步骤2)去除保护基的方法是：使用TFA、TIS和水的混合液冰水浴搅拌，0.5h后回复常温，继续反应1.5h；反应完成后过滤，滤液用0℃乙醚沉淀，洗涤，干燥，即可。
如前述的方法，合成第二对二硫键后，使用硫代硫酸钠终止反应，得到蜘蛛抗菌肽粗品，再经纯化步骤得蜘蛛抗菌肽纯品；优选地，所述纯化步骤为HPLC或者UPLC。
本发明分两步对二硫键进行合成，每一步只有一对特定的未保护的半胱氨酸形成二硫键，大大地减少了错配异构体杂质的形成。
本发明相比现有的空气氧化法形成二硫键，缩短了反应时间，提高了目标肽的纯度，降低了纯化成本，并减少了对于环境的污染，利于大规模生产。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1是本发明合成方法流程图。
图2是本发明制备的Gomesin直链中间体HPLC图。
图3是本发明制备的Gomesin直链中间体MS图。
图4是本发明制备的Gomesin一对二硫键中间体HPLC图。
图5是本发明制备的Gomesin粗品HPLC图。
图6是本发明制备的Gomesin纯品HPLC图。
图7是本发明制备的Gomesin纯品MS图。
图8是制备的空气氧化法Gomesin直链中间体HPLC图。
图9是制备的空气氧化法Gomesin直链中间体MS图。
图10是制备的空气氧化法Gomesin粗品HPLC图。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不限制本发明。
说明书中使用的英文缩写的含义如下表所示：
| 英文缩写 | 中文含义 | 英文缩写 | 中文含义 |
| DBLK | 20％哌啶/DMF溶液，去除Fmoc保护基 | CR | 偶联试剂，形成肽键 |
| Mmt | 4-甲氧基三苯甲基 | Fmoc | 9-芴甲氧羰基 |
| Boc | 叔丁氧羰基 | NIS | N-碘代琥珀酰亚胺 |
| HPLC | 高效液相色谱 | TFA | 三氟乙酸 |
| TIS | 三异丙基硅烷 | DMF | N，N-二甲基甲酰胺 |
| TES | 三乙基硅烷 | DCM | 二氯甲烷 |
| EDT | 乙二硫醇 | DTT | 二硫苏糖醇 |
| MTBE | 甲基叔丁基醚 | DIC | N，N-二甲基碳二酰亚胺 |
| TBTU | O-苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸盐 | DIEA | N，N-二异丙基乙胺 |
| HBTU | 苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐 | HOBt | 1-羟基苯并三唑 |
| PyBOP | 六氟磷酸苯并三氮唑-1-基-氧基三吡咯烷基 | C1-HOBt | 6-氯1-羟基苯并三唑 |
| Pbf | 2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基 | Acm | 乙酰氨甲基 |
| Mtt | 4-甲基三苯甲基 | Dbs | 二苯并环庚烯酮基 |
| Bzh | 二苯甲基 | Tacm | 三甲基乙酰胺甲基 |
| Bam | 苯甲酰胺甲基 | Bzl | 苄基 |
| Npys | 3-硝基-2-吡啶硫酰基 | Pys | 2-吡啶硫酰基 |
| Trt | 三苯甲基 | tBu | 叔丁基 |
| MoBzl | 甲氧苄基 |
实施例1
(1)直链中间体的制备
(i)肽主链的合成：
称取Rink Amide MBHA树脂(32.3g，取代值为0.31mmol/g树脂)加入到1000ml多肽反应器中，加入400mlDCM洗涤并溶胀树脂30min，排干溶剂；使用20％哌啶/DMF溶液分两次，每次350mL第一次5min，第二次15min处理树脂，脱除Fmoc保护基；然后使用DMF分五次，每次350ml洗涤树脂，去除Fmoc副产物以及残余哌啶，茚三酮检测(Kaiser Test)，树脂蓝色，脱保护完全；
称取Fmco-Arg(pbf)-OH(2eq，13.0g)，TBTU(2eq，6.4g)溶解于350ml DMF中，氮气保护条件下将该溶液冰浴至0-5℃，然后加入DIEA(2.2eq，3.3ml)，活化5min。5min后，将活化好的溶液加入至反应器中，室温反应，反应过程取小样，使用茚三酮检测缩合完成情况，1.5h反应完全，抽干树脂，使用DMF分三次，每次350ml洗涤树脂，茚三酮检测，树脂无色透明，缩合反应完全。
随后使用20％哌啶/DMF溶液分两次，每次350mL，第一次5min，第二次15min处理树脂，脱除Fmoc保护基，然后使用DMF分五次，每次350ml洗涤树脂，去除Fmoc副产物以及残余哌啶，茚三酮检测，树脂蓝色，脱保护完全；
按照序列组成，依次称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Z-OH(焦谷氨酸)各2eq，活化、缩合、脱Fmoc保护，重复上述过程。最后一个氨基酸缩合完成后，使用DMF分三次，DCM洗涤3次，抽干树脂，甲醇再洗涤3次，每次350ml，收缩树脂，真空干燥至恒重，得到87.5g树脂结合肽。
合成的肽链的氨基酸序列为：ZCRRLCYKQRCVTYCRGR(SEQ ID NO.1)，其中Z为焦谷氨酸。
(ii)保护基(Pbf、tBu、Boc和Trt)和树脂的去除：
上述过程得到的肽树脂87.5g加入至圆底烧瓶中，加入780ml预配置的冰冷的裂解液：92.5％TFA/5％TIS/2.5％H2O，冰水浴下搅拌，0.5h后回复常温，继续反应1.5h。反应完成后过滤，滤液加入到预先冷却至约0℃的7800ml冰乙醚中，有白色固体产生，冰浴下继续搅拌该沉淀物60min，3000r/min离心并用新鲜冰乙醚洗涤，收集固体并真空干燥，最终获得直链中间体23.4g，收率为96.8％，粗品HPLC检测纯度为68.31％，见图2，取样质谱检测，结果见图3。
上述过程合成的树脂结合肽的主链结构如下：
(2)第一对二硫键的形成
上述所得中间体粗肽23.4g(约19.2mmol)，加入23400ml水搅拌溶解，使用NaOH溶液调节pH＝8，加入10％的H2O2搅拌，Ellman试剂监测，30min后反应结束，取样色谱检测，纯度84.89％，结果见图4。
上述过程形成的全保护肽链结构如下：
(3)Gomesin粗品的制备
上述过程得到的中间体肽溶液，使用冰乙酸调节pH＝4.5，加入碘溶液搅拌反应，色谱监测，1h后反应结束，硫代硫酸钠终止反应，粗品HPLC纯度为76.38％，结果见图5。
上述过程形成的粗品结构如下：
(4)Gomesin纯品的制备
将上述所得Gomesin粗品溶液过滤并经HPLC纯化并冻干，最终得到纯度为95.11％的Gomesin纯品3.2g，总收率14.1％，纯度见图6，质谱见图7。
对比例1
(1)直链中间体的制备
(i)肽主链的合成：
称取RinkAmide MBHA树脂(1.6g，取代值为0.31mmol/g树脂)加入到50ml多肽反应器中，加入16mlDCM洗涤并溶胀树脂30min，排干溶剂；使用20％哌啶/DMF溶液分两次，每次16mL第一次5min，第二次15min处理树脂，脱除Fmoc保护基；然后使用DMF分五次，每次16ml洗涤树脂，去除Fmoc副产物以及残余哌啶，茚三酮检测(Kaiser Test)，树脂蓝色，脱保护完全；
称取Fmco-Arg(pbf)-OH(2eq，6.5g)，TBTU(2eq，3.2g)溶解于16ml DMF中，氮气保护条件下将该溶液冰浴至0-5℃，然后加入DIEA(2.2eq，0.16ml)，活化5min。5min后，将活化好的溶液加入至反应器中，室温反应，反应过程取小样，使用茚三酮检测缩合完成情况，1.5h反应完全，抽干树脂，使用DMF分三次，每次16ml洗涤树脂，茚三酮检测，树脂无色透明，缩合反应完全。
随后使用20％哌啶/DMF溶液分两次，每次16mL，第一次5min，第二次15min处理树脂，脱除Fmoc保护基，然后使用DMF分五次，每次16ml洗涤树脂，去除Fmoc副产物以及残余哌啶，茚三酮检测，树脂蓝色，脱保护完全；
按照序列组成，依次称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Z-OH(焦谷氨酸)各2eq，活化、缩合、脱保护重复上述过程。最后一个氨基酸缩合完成后，使用DMF分三次，DCM洗涤3次，抽干树脂，甲醇再洗涤3次，每次16ml，收缩树脂，真空干燥至恒重，得到3.8g树脂结合肽。
(ii)保护基和树脂的去除：
上述过程得到的肽树脂3.8g加入至圆底烧瓶中，加入35ml预配置的冰冷的裂解液：92.5％TFA/5％TIS/2.5％H2O，冰水浴下搅拌，0.5h后回复常温，继续反应1.5h。反应完成后过滤，滤液加入到预先冷却至约0℃的350ml冰乙醚中，有白色固体产生，冰浴下继续搅拌该沉淀物60min，3000r/min离心并用新鲜冰乙醚洗涤，收集固体并真空干燥，最终获得直链中间体1.2g，收率为99.2％，粗品HPLC检测纯度为78.55％，见图8，取样质谱检测，结果见图9。
上述过程合成的树脂结合肽的主链结构如下：
Z1-Cys2-Arg3-Arg4-Leu5-Cys6-Tyr7-Lys8-Gln9-Arg10-Cys11-Val12-Thr13-Tyr14-Cys15-Arg16-Gly17-Arg18-NH2
(2)Gomesin粗品的制备
将上述所得直链中间体粗品1.2g，加入1200ml水溶解，NaOH溶液调节pH＝7.5，暴露于空气中并剧烈搅拌，Ellman试剂监测，26h后反应结束加入冰醋酸调节pH＝4.5，最终得到Gomesin粗品纯度为31.98％，结果见图10。
上述过程合成的树脂结合肽的主链结构如下：
综上，本发明的方法制备得到的蜘蛛抗菌肽粗品纯度远远高于传统的方法，应用前景良好。
SEQUENCE LISTING
<110> 成都医学院
<120> 一种制备蜘蛛抗菌肽的方法
<130> GY044-2019P018191CCZ
<150> 2018112539942
<151> 2018-10-25
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> 捕鸟蛛(Acanthoscurria gomesiana)
<400> 1
Glx Cys Arg Arg Leu Cys Tyr Lys Gln Arg Cys Val Thr Tyr Cys Arg
1 5 10 15
Gly Arg
Claims (12)
1.一种蜘蛛抗菌肽的合成方法，其特征在于：
包括如下步骤：
1)按照蜘蛛抗菌肽的氨基酸序列合成肽链，所得到的肽链上第6个和第11个氨基酸带了保护基A，第2个和15个氨基酸带保护基B；所述蜘蛛抗菌肽的氨基酸的肽链为：
2)去除保护基A和保护基B的其中任意一个；
3)氧化形成第一对二硫键；
4)去除保护基A和保护基B剩下的一个；
5)氧化形成第二对二硫键。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)所述肽链合成是按照蜘蛛抗菌肽的氨基酸序列，将已保护的氨基酸依次偶联在固相载体上。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)的固相载体为酰胺功能化的树脂；优选地，固相载体为Rink Amide AM Resin、Rink Amide MBHA Resin或Siber Resin中的一种；
进一步优选地，固相载体为Rink Amide MBHA Resin。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)的固相载体取代度值为0.1～2.0mmol/g；
优选地，步骤1)的固相载体取代度值为0.2～0.8mmol/g。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)所述的偶联，使用缩合剂HBTU/C1-HoBt/DIEA、TBTU/C1-HoBt/DIEA、HBTU/DIEA、TBTU/DIEA或PyBOP/C1-HoBt/DIEA的一种或多种；优选地，使用缩合剂TBTU/DIEA。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)所述肽链除第2、6、11、15个氨基酸以外的其它氨基酸按照下列对应关系采用保护基：Arg采用Pbf保护基，Thr、Tyr采用tBu保护基，Lys采用Boc保护基，Gln采用Trt保护基。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)所述的保护基A和保护基B均选自tBu、Acm、Trt、Mmt、Mtt、MeBzl、MoBzl、Dbs、Bzh、Tacm、Bam、Bzl、Npys、Pys中的一种。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤1)所述的保护基A为Acm，所述保护基B为Trt；优选地，步骤2)去除的保护基是保护基B。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：去除Trt保护基后紧接着形成的二硫键，是在碱性条件下，使用空气、二甲亚砜、铁氰化钾或双氧水氧化形成的；优选地，是使用双氧水氧化形成的；
和/或，去除Acm保护基后紧接着形成的二硫键，是在酸性条件下，使用碘单质、三氟乙酸铊、NIS、锍盐、氯化硅-亚砜等氧化形成的；优选地，是使用碘单质氧化形成的。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：步骤2)去除的保护基B的同时，还去除了第2、6、11、15个氨基酸以外的其它氨基酸的保护基；
所述第2、6、11、15个氨基酸以外的其它氨基酸的保护基选自Pbf、tBu、Boc和Trt中的一种以上。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：步骤2)去除保护基的方法是：使用TFA、TIS和水的混合液冰水浴搅拌，0.5h后回复常温，继续反应1.5h；反应完成后过滤，滤液用0℃乙醚沉淀，洗涤，干燥，即可。
12.根据权利要求1-11中任意一项所述方法，其特征在于：合成第二对二硫键后，使用硫代硫酸钠终止反应，得到蜘蛛抗菌肽粗品，再经纯化步骤得蜘蛛抗菌肽纯品；优选地，所述纯化步骤为HPLC或者UPLC。
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