CN104974229A - 一种利那洛肽的固相合成方法 - Google Patents

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董守良
常民
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Abstract

本发明公开了一种利那洛肽的固相合成方法，属于生物化学技术领域，该方法包括如下步骤：(1)利那洛肽树脂的制备；(2)对步骤(1)得到的利那洛肽线性肽树脂进行切割，得到了含有Cys(Acm)和Cys(tBu)的保护基线性肽；(3)氧化形成第一对二硫键，得到单二硫环肽；(4)脱除单二硫环肽中Acm保护基，得到双二硫环肽；(5)脱除双二硫环肽中的tBu保护基，得到三二硫环肽；(6)将得到的三二硫环肽经HPLC纯化，冻干得到利那洛肽。本发明工艺具有反应操作简便、后处理容易、成本低、收率高等特点，具有可观的经济实用价值，同时在多肽药物设计合成领域具有广泛的应用前景。

Description

一种利那洛肽的固相合成方法
技术领域
本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种利那洛肽的固相合成方法。
背景技术
利那洛肽(Linaclotide)是迄今为止首个鸟苷酸环化酶激动剂(GCCA)类药物，2012年8月美国FDA批准上市，商品名为Linzess，该药为胶囊制剂，每日口服一次。该化合物由14个氨基酸组成的多肽，包括3对二硫键连接的6个半胱氨酸残基，分子式：C59H79N15O21S6，分子量为1526.8，其结构序列如下：
H-Cys-Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr-OH(三对二硫键为1-6、2-10、5-13)。
肠易激综合征(Irritable Bowel Syndrome，IBS)是一种常见的功能性肠病，以腹痛或腹部不适为主要症状，排便后可改善，常伴有排便习惯改变，缺乏町解释症状的形态学和生化学异常。便秘型肠易激综合征(IBS-C)是IBS的4种不同亚型之一。现今人们认为，1/3的IBS患者是IBS-C患者，具有慢性腹痛和便秘症状。功能性胃肠道疾病RomeIII诊断标准中包含IBS的诊断标准，即在过去3个月内具有反复发作性腹痛或腹部不适每周至少3天，症状开始于诊断前至少6个月，同时具有以下2种或2种以上表现：症状发作与排便频次改变相关；排便后症状改善；症状发作与排便性状改变相关。
目前在中国，IBS的发病率在10％-20％左右，患者以中青年为主。在欧洲人群中，IBS的估计发病率超过10％。IBS对患者的日常生活会带来负面影响，造成了巨大的社会经济压力，也导致了患者不良的心理预后，在基层医疗体系和二级医疗体系中，该疾病在胃肠道疾病工作中占有绝大部分的比例。鉴于此疾病的复杂性，IBS尚无治愈手段，现有的治疗选择也极少。
利那洛肽用于治疗便秘型肠易激综合症(IBS-C)和慢性特发性便秘(CIC)，是一种鸟苷酸环化酶C(GC-C)激动剂。它与肠道GC-C结合后，导致细胞内和细胞外环鸟甘酸(cGMP)浓度升高。细胞内cGMP升高可以刺激氯离子和碳酸氢根的分泌进入肠腔，主要是通过激活的囊性纤维化跨膜电导调节器(CFTR)离子通道，导致小肠液体增加和加速通过，加快胃肠道移行，从而增加排便频率；细胞外cGMP浓度升高会降低痛觉神经的灵敏度、降低肠道疼痛。
此外，利那洛肽最常见的不良反应是腹泻，而且该药不能用于16岁及以下年龄的患者。
关于利那洛肽的制备方法，国内外报道较少。2011年Miriam等人发表关于利那洛肽合成的文章(Optimized Fmoc Solid-Phase Synthesis of the Cysteine-Rich PeptideLinaclotide,Peptide Science,2011,Volume 96,Number 1,pages 69-80)。文章中采用三种不同的方法合成利那洛肽：(1)随机氧化策略即Cys的保护基全部采用Trt，固相合成线性粗肽后在液相中一步氧化得到利那洛肽；(2)半选择性策略即Cys保护基分别采用Trt和Acm，固相合成线性粗肽后分步氧化形成二硫键得到利那洛肽；(3)完全选择性策略即Cys的保护基采用[2Mmt+2Acm+2Trt]、[2Acm+2Trt+2pMeOBzl]、[2StBu+2Trt+2pMeOBzl]，固相合成线性粗肽后分步逐对形成二硫键。第一种方法的随机氧化会得到多种异构体，导致目标肽纯度低，纯化困难，不适合大规模生产。第二种方法虽然相对于方法一有一定的优势，也无法完全避免异构体的产生。第三种方法虽然尝试多种保护基，但均未得到最终目标产物。
中国专利CN 102875655 A合成利那洛肽线性肽树脂时Cys的保护基都采用Mmt，三对二硫键的形成采用GSH/GSSH的方法一步氧化；中国专利CN 104231051 A合成利那洛肽线性肽树脂时Cys的保护基5个采用Mmt和1个Trt，三对二硫键的形成用10％DMSO的方法一步氧化。这两种方法均属于随机氧化的方法，会得到多种异构体，导致目标肽纯度低，纯化困难，不适合大规模生产。
中国专利CN 104628826 A合成利那洛肽线性肽时Cys的保护基均采用Trt，三对二硫键的形成也是采用随机氧化的方法，但是选择了强氧化剂碘单质氧化，虽然加快了反应速度，却更容易产生多种二硫键之间的错配，导致多种同分异构体的产生，给后续目标肽的分离纯化带来很大的困难。
中国专利CN 103626849 A采用完全选择性形成三对二硫键合成利那洛肽的方法。合成线性肽树脂时Cys的保护基采用Hqm、Trt和Acm，采用分步脱除氧化的方法形成三对二硫键。但这个方法中的Fmoc-Cys(Hqm)-OH原料比较昂贵，合成脱除步骤也比较繁琐，不利于工业化生产。
中国专利CN 104231051 A线性肽中Cys的保护基采用都Trt，并且合成线性肽采用片段对接，五肽片段与九肽片段通过硫酯交换和S→N酰基转移才得到线性肽，然后再采用GSH/GSSH氧化体系得到利那洛肽。该方法得到的线性肽步骤繁琐、成本高、产率低，而且最后的随机氧化易造成多种异构体，给后期的纯化带来困难。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是，提供一种完全定向形成三对二硫键的利那洛肽的固相合成方法，提高形成二硫键的准确率，反应条件温和，成本低，产品的纯化简单，收率高，适用于规模化生产。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种利那洛肽的固相合成方法，该方法包括如下步骤：
(1)利那洛肽树脂的制备：Fmoc-Tyr(tBu)-OH和载体树脂反应，获得Fmoc-Tyr(tBu)-树脂；以Fmoc-Tyr(tBu)-树脂为固相载体，采用逐一偶联的方式从C端到N端依次偶联13个具有Fmoc保护基团的氨基酸，获得利那洛肽线性肽树脂，其中，形成二硫键的三组Cys分别连接Trt、Acm或tBu保护基，同组的Cys连接相同保护基，不同组的Cys连接不同的保护基；
(2)将步骤(1)得到的利那洛肽线性肽树脂进行切割，脱去除Cys(Acm)和Cys(tBu)外的所有氨基酸的侧链保护基，得到了含有Cys(Acm)和Cys(tBu)的保护基线性肽；
(3)氧化步骤(2)得到的线性肽形成第一对二硫键，得到单二硫环肽；
(4)脱除步骤(3)得到的单二硫环肽中Cys(Acm)中Acm保护基，同时形成第二对二硫键，得到双二硫环肽；
(5)脱除步骤(4)得到的双二硫环肽中Cys(tBu)中的tBu保护基，同时形成第三对二硫键，得到三二硫环肽；
(6)步骤(5)得到的三二硫环肽经HPLC制备纯化，冻干得到利那洛肽。
步骤(1)中，所述的载体树脂为Wang树脂或2-Chlortrityl Chloride树脂，优选2-Chlortrityl Chloride树脂。
步骤(1)中，所述的Fmoc-Tyr(tBu)-OH和载体树脂反应，按1：(1～2)：(2～4)的摩尔比分别称取溶胀后的载体树脂、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、DIPEA，室温震荡1～3小时，直接向反应液中加入甲醇，甲醇与载体树脂的比例为0.8～1ml：1g，封闭30min，然后分别用二甲基甲酰氨和二氯甲烷、甲醇洗涤，抽干树脂，得到Fmoc-Tyr(tBu)-树脂。
步骤(1)中，根据权利要求1所述的方法，其中所用的具有Fmoc保护基团的氨基酸分别为Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH，得到的14个氨基酸的线性全保护肽树脂如下：NH2-Cys(Acm)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Cys(tBu)-Cys(Acm)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(tBu)-Tyr(tBu)-树脂。其中，Fmoc为芴甲氧羰基，Acm为乙酰胺甲基，Trt为三苯甲基，OtBu为氧叔丁基，tBu为叔丁基。
步骤(1)中，所述的从C端到N端依次偶联13个具有Fmoc保护基团的氨基酸，获得利那洛肽线性肽树脂，方法为：按1∶(2～6)∶(2～6)的摩尔比分别称取溶胀后的H-Tyr(tBu)-树脂、Fmoc保护氨基酸、偶联剂，将Fmoc保护氨基酸、偶联剂溶于二甲基甲酰胺，预活化，然后加入溶胀后的树脂，室温震荡反应1～3小时连接Fmoc保护氨基酸，连接下一个氨基酸前用哌啶与DMF体积比为1:4的溶液处理2次，脱除Fmoc保护基，每次连接一个氨基酸之后和脱除Fmoc保护基之后都用二甲基甲酰氨和二氯甲烷交替洗涤2～3次，用量为5～10ml/g树脂；
其中，所述的偶联剂为：HOAt和DIC的摩尔比为1:1的混合物，HOBt和DIC的摩尔比为1:1的混合物，HOBt和DCC的摩尔比为1:1的混合物，HOBt、HBTU和DIEPA的摩尔比为1:1:2的混合物，HOBt、HBTU和DIEPA的摩尔比为1:1:2的混合物或HOBt、PyBOP和DIEPA的摩尔比为1:1:2的混合物。
步骤(1)中的具体步骤如下：
1)洗涤：用二氯甲烷将载体树脂溶胀2次，每次30min，每次用量为5～10ml/g树脂。
2)制备Fmoc-Tyr(tBu)-树脂：按1：(1～2)：(2～4)的摩尔比分别称取溶胀后的载体树脂、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、DIPEA，室温震荡1～3小时，直接向反应液中加入甲醇(0.8～1ml/g树脂)封闭30min；然后分别用二甲基甲酰氨和二氯甲烷、甲醇洗涤3次，抽干，得到Fmoc-Tyr(tBu)-树脂，测取代值。
3)脱Fmoc保护基：用哌啶与DMF的体积比为1:4的溶液室温下处理Fmoc-Tyr(tBu)-树脂2次，处理时间分别为5min、10min，脱除Fmoc保护基。
4)洗涤：用二甲基甲酰氨和二氯甲烷交替洗涤2～3次，用量为5～10ml/g树脂。
5)连接保护氨基酸：按1∶(2～6)∶(2～6)的摩尔比分别称取溶胀后的H-Tyr(tBu)-树脂、Fmoc保护氨基酸、偶联剂，将Fmoc保护氨基酸、偶联剂溶于二甲基甲酰胺，预活化，然后加入溶胀后的树脂，室温震荡反应1～3小时连接Fmoc保护氨基酸。
6)洗涤：用二甲基甲酰氨和二氯甲烷交替洗涤2～3次，用量为5～10ml/g树脂。
7)第一个氨基酸缩合完成后，重复步骤3)～6)，按照氨基酸顺序延长肽链至14个氨基酸偶联完毕。
步骤(2)中，将三氟乙酸、苯酚、水、三异丙基硅烷按照体积比88:5:5:2混合，或者将三氟乙酸、苯甲硫醚、乙二硫醇、苯甲醚按照体积比90:5:3:2混合，将上述两种混合物中的一种加入步骤(1)得到的利那洛肽线性肽树脂中(10ml/g)，震荡反应1～3小时后，将切割液逐滴滴入大于10倍量的冰乙醚中，沉淀，离心，倒掉上清，收集沉淀物，反复洗涤5～8次，得到含Cys(Acm)和Cys(tBu)的线性肽。
步骤(3)中，将步骤(2)得到的线性肽溶于乙腈与水的体积比为1:3的溶液中(c＝0.5～1.6mg/ml)，线性肽的浓度为0.5～1mg/ml，氨水调节PH值至8～10，加入DMSO，DMSO与乙腈水溶液的体积比为1:5，室温下搅拌反应24～30小时，反应结束后加入两倍体积的水溶液终止反应，冻干溶液，得到单二硫环肽。
步骤(4)中，将步骤(3)得到的单二硫环肽溶于乙酸与水体积比为4:1的溶液中，单二硫环肽的浓度为0.5～1mg/ml，加入10～15倍摩尔当量的碘单质，25℃反应1～2小时，反应完全后，加入浓度为0.1mol/L Vc水终止反应，冻干溶液，得到双二硫环肽。
步骤(5)中，将步骤(4)得到的双二硫环肽溶于三氟乙酸中，双二硫环肽的浓度为0.5～1mg/ml，依次加入5～10倍当量二苯基亚砜、100～150倍当量三氯甲基硅烷和100～150倍当量苯甲醚，25℃搅拌反应10～30分钟，将溶液逐滴滴入冰乙醚中，静置、离心，弃上清，收集沉淀物，用冰乙醚重复洗涤2～3次，风干，得到三二硫环肽。
步骤(6)中，所述的HPLC纯化是将步骤(5)得到的三二硫环肽粗品经C18反相高效液相柱纯化，冻干得到利那洛肽。
所述及的2-Chlorotrityl Chloride Resin的化学结构为：
所合成的利那洛肽具有如下结构：
其14个氨基酸的序列为：
Cys-Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr，肽链中二硫键的连接模式为Cys1-Cys6,Cys2-Cys10,Cys5-Cys13。分子式：C59H79N15O21S6，分子量：1526.74。
以下是本发明的固相合成法流程示意：
有益效果：本发明相对于现有技术具有如下突出的效果：
本发明针对多对二硫键多肽的特点，结合半胱氨酸侧链巯基的化学反应特性，巧妙选用了Trt、Acm、tBu三种不同保护强度的巯基保护基，实现依次脱除，依次成环，二硫键能够准确定位，提高了环化速度，反应效率，产品纯度，得到较满意的收率。所接入的其他氨基酸的保护基，也可根据尝试设计。本发明工艺具有反应操作简便、后处理容易、成本低、收率高等特点，具有可观的经济实用价值，同时在多肽药物设计合成领域具有广泛的应用前景。
相比专利CN103626849A，本发明原料比较便宜易得，二硫键的连接步骤更加简单，易于纯化。与专利CN102875655A、CN104231051A、CN 104628826 A和CN104231051A相比，本发明采用分步脱保护形成二硫键的方法，二硫键形成更有序，产品更易于制备纯化，分离得到的产品纯度更高。
附图说明
图1为本发明的合合成路线流程图。
图2为本发明得到的利那洛肽纯化后获得的利那洛肽HPLC图。
图3为本发明得到的利那洛肽纯化后获得的利那洛肽LC-MS图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
本发明的说明书或权利要求书中使用的缩写及英文的含义如表1所示：
表1说明书或权利要求书中使用的缩写及英文的含义
实施例1：利那洛肽线性全保护肽树脂的制备。
(1)树脂溶胀：称取2-Chlorotrityl Chloride Resin 5g(SD＝0.84mmol/g)，加入到有筛板的反应器中，用两倍树脂体积的二氯甲烷溶胀2次，每次30min，每次用量为5～10ml/g树脂，抽滤除去二氯甲烷。
(2)制备Fmoc-Tyr(tBu)-树脂：按1：(1～2)：(2～4)的摩尔比分别称取溶胀后的树脂、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、DIPEA，室温震荡1～3小时，直接相反应液中加入甲醇(0.8～1ml/g树脂)封闭30min。然后分别用二甲基甲酰氨和二氯甲烷、甲醇洗涤3次，抽干树脂，检测替代度为0.5mmol/g。
(3)脱除Fmoc保护基：向反应器中加入20％哌啶/DMF(v/v)溶液50～80ml，室温搅拌反应5分钟，抽干。重复1次10分钟。然后用二甲基甲酰氨洗涤4次，50～80ml/次，2分钟/次，抽干，茚三酮法检测Fmoc脱除结果。。
(4)氨基酸预活化：在圆底烧瓶(50ml)中加入将7.5mmol的Fmoc保护基氨基酸、11.25mmol HOBT、11.25mmol DIC，用最少量的DMF超声溶解，冰浴下预活化5分钟。
(5)氨基酸连接：将已活化的保护氨基酸溶液倒入反应器中，补加适量的二甲基甲酰氨溶液，以保证树脂在反应器中充分悬浮。室温下搅拌反应1～3小时，抽干。每一种氨基酸、缩合剂的用量及具体反应时间见表1。树脂用二甲基甲酰氨洗涤3次，50～80ml/次，3min/次，抽干，茚三酮法检测氨基酸连接是否完全。
(6)第一个氨基酸缩合完成后，重复步骤(3)～(5)，按照氨基酸顺序延长肽链至14个氨基酸偶联完毕。
(6)树脂肽用二氯甲烷和甲醇交替洗涤各3次，50～80ml/次，3min/次，抽干。干燥后得利那洛肽线性全保护肽树脂3.98g，粗产率99％。
表1氨基酸、缩合剂的用量及反应时间
实施例2：利那洛肽线性全保护肽树脂的切割。
(1)将实施例1得到的线性全保护肽树脂加入到500ml圆底烧瓶中，配置切割剂1(三氟乙酸、苯酚、水、三异丙基硅烷按照体积比88:5:5:2混合)或切割剂2(将三氟乙酸、苯甲硫醚、乙二硫醇、苯甲醚按照体积比90:5:3:2混合)，将120ml(10ml/g)切割剂加入到圆底烧瓶中，720r/min震荡反应3小时。
(2)切割反应完成以后，将切割液1或切割剂2滴入10倍体积的冰乙醚(-20℃)中，再向圆底烧瓶中补加20～30ml切割剂清洗，取上清滴入冰乙醚中，静置沉降半小时。4℃3500r/min离心10min。弃上清，重新加入冰乙醚超声洗涤，低温离心，重复以上操作三次。最终将所得粗肽产品置于通风橱中，使溶剂挥发至粗肽为粉末状。得到Cys侧链含有Acm和tBu的线性粗肽3.98g，粗产率99％。
实施例3：利那洛肽单二硫环粗肽的制备。
(1)将实施例2得到的线性肽300mg加入到500ml圆底烧瓶中，加入300ml乙腈：水体积比为1:3溶液中溶解至浓度1mg/ml，用氨水调节PH至8，加入60ml DMSO，640r/min室温震荡反应24小时。
(2)反应结束，加入600ml水溶液终止反应。冻干溶液，得到利那洛肽单二硫环粗肽296mg，粗产率98.6％。
实施例4：利那洛肽双二硫环粗肽的制备。
(1)将实施例3得到的单二硫环肽290mg加入到500ml圆底烧瓶中，加入290ml醋酸：水体积比为4:1的溶液溶解至浓度1mg/ml，加入10倍摩尔当量的碘单(410mg，先用醋酸溶液溶解)，640r/min室温震荡反应1小时。
(2)反应结束，加入290ml(0.1mol/L)Vc水终止反应，冻干得到利那洛肽双二硫环粗肽281mg，粗产率96.8％。
实施例5：利那洛肽三二硫环粗肽的制备。
(1)将实施例4得到的双二硫环肽281mg加入到500ml圆底烧瓶中，加入281mlTFA溶解至浓度1mg/ml，依次加入10倍摩尔当量的二苯基亚砜(346.6mg)、100倍摩尔当量的三氯甲基硅烷(2.00ml)、100倍摩尔当量的苯甲醚(1.86ml)，640r/min室温震荡反应30min。
(2)反应结束，将反应滴入10倍体积的冰乙醚(-20℃)中，静置沉降半小时，配平，4℃3500r/min离心15min。弃上清，重新加入冰乙醚，震荡超声洗涤，低温离心，重复以上操作三次。最终将所得粗肽产品置于通风橱中，使溶剂挥发至粗肽为粉末状。得到利那洛肽三二硫环粗肽275mg，粗产率97.8％。
本发明的合合成路线流程图如图1所示。
实施例6：利那洛肽粗制品的HPLC制备纯化。
装置：C18高效液相色谱制备柱，20×250mm；
洗脱液A：0.1％(v/v)TFA/H2O；
洗脱液B：0.1％(v/v)TFA/乙腈；
流速：10ml/min；
紫外检测波长：220nm；
洗脱梯度：
时间 洗脱液A/％ 洗脱液B/％
0 15 85
5 15 85
7 20 80
37 30 70
55 95 5
操作步骤如下：
(1)利那洛肽三二硫环粗肽的水溶液超声溶解，离心，取上清。
(2)上清液直接上样。
(3)乙腈-水流动相梯度洗脱。
(4)收集目的肽洗脱液。
(5)冷冻干燥。
本发明得到的利那洛肽纯化后获得的利那洛肽HPLC图如图2所示，本发明得到的利那洛肽纯化后获得的利那洛肽LC-MS图如图3所示。
收集到纯度大于等于99.3％的利那洛肽白色固体纯肽182.64mg，收率71.2％。

Claims (10)

1.一种利那洛肽的固相合成方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)利那洛肽树脂的制备：Fmoc-Tyr(tBu)-OH和载体树脂反应，获得Fmoc-Tyr(tBu)-树脂；以Fmoc-Tyr(tBu)-树脂为固相载体，采用逐一偶联的方式从C端到N端依次偶联13个具有Fmoc保护基团的氨基酸，获得利那洛肽线性肽树脂，其中，形成二硫键的三组Cys分别连接Trt、Acm或tBu保护基，同组的Cys连接相同保护基，不同组的Cys连接不同的保护基；
(2)将步骤(1)得到的利那洛肽线性肽树脂进行切割，脱去除Cys(Acm)和Cys(tBu)外的所有氨基酸的侧链保护基，得到了含有Cys(Acm)和Cys(tBu)的保护基线性肽；
(3)氧化步骤(2)得到的线性肽形成第一对二硫键，得到单二硫环肽；
(4)脱除步骤(3)得到的单二硫环肽中Cys(Acm)中Acm保护基，同时形成第二对二硫键，得到双二硫环肽；
(5)脱除步骤(4)得到的双二硫环肽中Cys(tBu)中的tBu保护基，同时形成第三对二硫键，得到三二硫环肽；
(6)步骤(5)得到的三二硫环肽经HPLC纯化，冻干得到利那洛肽。
2.根据权利要求1所述的利那洛肽的固相合成方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的载体树脂为Wang树脂或2-Chlortrityl Chloride树脂。
3.根据权利要求1所述的利那洛肽的固相合成方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的Fmoc-Tyr(tBu)-OH和载体树脂反应，按1：(1～2)：(2～4)的摩尔比分别称取溶胀后的载体树脂、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、DIPEA，室温震荡1～3小时，直接向反应液中加入甲醇，甲醇与载体树脂的比例为0.8～1ml：1g，封闭30min，然后分别用二甲基甲酰氨和二氯甲烷、甲醇洗涤，抽干树脂，得到Fmoc-Tyr(tBu)-树脂。
4.根据权利要求1所述的利那洛肽的固相合成方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的具有Fmoc保护基团的氨基酸分别为Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH；
得到的线性全保护肽树脂如下：
NH2-Cys(Acm)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Cys(tBu)-Cys(Acm)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(tBu)-Tyr-树脂。
5.根据权利要求1所述的利那洛肽的固相合成方法，其特征在于，步骤（1）中，所述的从C端到N端依次偶联13个具有Fmoc保护基团的氨基酸，获得利那洛肽线性肽树脂，方法为：按1:(2～6):(2～6)的摩尔比分别称取溶胀后的H-Tyr(tBu)-树脂、Fmoc保护氨基酸、偶联剂，将Fmoc保护氨基酸、偶联剂溶于二甲基甲酰胺，预活化，然后加入溶胀后的树脂，室温震荡反应1～3小时连接Fmoc保护氨基酸，连接下一个氨基酸前用哌啶与DMF体积比为1:4的溶液处理2次，脱除Fmoc保护基，每次连接一个氨基酸之后和脱除Fmoc保护基之后都用二甲基甲酰氨和二氯甲烷交替洗涤2～3次，用量为5～10ml/g树脂；
其中，所述的偶联剂为：HOAt和DIC的摩尔比为1:1的混合物，HOBt和DIC的摩尔比为1:1的混合物，HOBt和DCC的摩尔比为1:1的混合物，HOBt、HBTU和DIEPA的摩尔比为1:1:2的混合物，HOBt、HBTU和DIEPA的摩尔比为1:1:2的混合物或HOBt、PyBOP和DIEPA的摩尔比为1:1:2的混合物。
6.根据权利要求1所述的利那洛肽的固相合成方法，其特征在于，步骤（2）中，将三氟乙酸、苯酚、水、三异丙基硅烷按照体积比88:5:5:2混合，或者将三氟乙酸、苯甲硫醚、乙二硫醇、苯甲醚按照体积比90:5:3:2混合，将上述两种混合物中的一种加入步骤(1)得到的利那洛肽线性肽树脂中，震荡反应1～3小时后，将切割液逐滴滴入冰乙醚中，沉淀，离心，倒掉上清，收集沉淀物，反复洗涤5～8次，得到含Cys(Acm)和Cys(tBu)的线性肽。
7.根据权利要求1所述的利那洛肽的固相合成方法，其特征在于，步骤（3）中，将步骤（2）得到的线性肽溶于乙腈与水的体积比为1:3的溶液中，线性肽的浓度为0.5～1mg/ml，氨水调节PH值至8～10，加入DMSO，DMSO与乙腈水溶液的体积比为1:5，室温下搅拌反应24～30小时，反应结束后加入两倍体积的水溶液终止反应，冻干溶液，得到单二硫环肽。
8.根据权利要求1所述的利那洛肽的固相合成方法，其特征在于，步骤（4）中，将步骤（3）得到的单二硫环肽溶于乙酸与水体积比为4:1的溶液中，单二硫环肽的浓度为0.5～1mg/ml，加入10～15倍摩尔当量的碘单质，25℃反应1～2小时，反应完全后，加入浓度为0.1mol/L Vc水终止反应，冻干溶液，得到双二硫环肽。
9.根据权利要求1所述的利那洛肽的固相合成方法，其特征在于，步骤（5）中，将步骤（4）得到的双二硫环肽溶于三氟乙酸中，双二硫环肽的浓度为0.5～1mg/ml，依次加入10倍摩尔当量二苯基亚砜、100倍摩尔当量三氯甲基硅烷和100倍摩尔当量苯甲醚，25℃搅拌反应10～30分钟，将溶液逐滴滴入冰乙醚中，静置、离心，弃上清，收集沉淀物，用冰乙醚重复洗涤2～3次，风干，得到三二硫环肽。
10.根据权利要求1所述的利那洛肽的固相合成方法，其特征在于，步骤（6）中，所述的HPLC纯化是将步骤（5）得到的三二硫环肽经C18反相高效液相柱纯化。
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