CN107163105B - 一种天然利那洛肽的结晶方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种天然利那洛肽的结晶方法，属于药物制备技术领域。包括：以树脂作为固相载体，依照固相多肽合成的方法依次缩合具有N‑芴甲氧羰基(Fmoc)保护的D型氨基酸；待氨基酸缩合结束后，使用切割液进行侧链保护基团的脱除以及多肽与树脂的分离，通过乙醚沉淀切割液得到镜像利那洛肽的粗肽，再通过高效液相色谱分离、冻干，得到纯化后的还原态利那洛肽；最后，通过复性折叠实现二硫键的正确配对，即可得到具有正确空间构型的镜像利那洛肽；添加等浓度的镜像利那洛肽至天然利那洛肽的中性缓冲液中，充分混匀后，通过运用蛋白结晶筛选方法，采用不同的结晶溶液、特定温度及时间，实现镜像利那洛肽辅助天然利那洛肽的结晶。

Description

一种天然利那洛肽的结晶方法
技术领域
本发明涉及一种天然利那洛肽的结晶方法，属于药物制备技术领域。
背景技术
利那洛肽(Linaclotide)由14个氨基酸组成，其氨基酸序列为CCEYCCNPACTGCY，其中的第1位与第6位半胱氨酸、第2位与第10位半胱氨酸和第5位与第13位半胱氨酸分别形成二硫键，三对二硫键发挥着稳定其空间构型的作用。利那洛肽是鸟苷酸环化酶C(以下简称GC-C)的激动剂，可以通过结合肠道上皮的GC-C受体进而促进肠道内液体分泌的增多以及肠道蠕动的增加，也有助于降低痛觉神经的灵敏度。2012年美国FDA批准了利那洛肽(商品名：Linzess；公司：Ironwood)用于治疗成人的慢性特发性便秘(CIC)及便秘型肠易激综合征(IBS-C)。
以疾病相关的蛋白/多肽三维空间结构为基础进行药物设计与筛选的方法，具有目标明确，开发周期短的优点。因此，获得蛋白/多肽晶体具有重要意义。
专利(WO 2010/059733A；WO 2014/118180A)报道了在酸性溶液或有机溶剂的条件下，获得利那洛肽晶体的方法。该方法结晶条件较为苛刻，难于操作。因此本领域中仍然需要简单高效的方法来获得利那洛肽的晶体。
发明内容
本发明的目的是提出一种天然利那洛肽的结晶方法，运用多肽固相合成方法,获得镜像利那洛肽，并以镜像利那洛肽作为辅助手段，促进天然利那洛肽的结晶。
本发明提出的天然利那洛肽的结晶方法，包括以下步骤：
(1)制备镜像利那洛肽，包括以下步骤：
(1-1)在树脂中加入N,N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷溶液10毫升，使树脂溶胀，加入溶液的体积比为：N,N-二甲基甲酰胺:二氯甲烷溶液＝1:1，溶胀时间为10分钟，利用隔膜泵作为动力源，将溶胀后的产物抽干，得到溶胀好的树脂；
(1-2)以步骤(1-1)中树脂作为1倍量，将4倍量的N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-酪氨酸溶于5毫升的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，在该溶液中加入8倍量的N,N-二异丙基乙胺，充分混匀后加入到步骤(1-1)溶胀好的树脂中，室温反应2小时后加入2毫升甲醇，反应30分钟，利用隔膜泵作为动力源，抽干反应液，得到第一反应物；分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗第一反应物各五次，在冲洗后的第一反应物中加入含有20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟，进行N-芴甲氧羰基的脱除，之后再分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗各五次，得到C端第一个氨基耦合到树脂上的第二反应物；
(1-3)将4倍量的N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸溶于5毫升的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，再加入3.6倍量的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和8倍量的N,N-二异丙基乙胺，充分混匀，得到混合液，将该混合液加入到上述步骤(1-2)的第二反应物中，室温下反应1小时，得到第三反应物，利用隔膜泵作为动力源，抽干第三反应物，分别用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺对第三反应物各冲洗五次，在第三反应物中加入含有20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟，进行N-芴甲氧羰基的脱除，之后再分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗各五次，得到C端前两个氨基耦合到树脂上的第四反应物；
(1-4)根据利那洛肽的氨基酸序列，重复步骤(1-3)，将剩余的12个氨基酸逐个耦合到第四反应物，得到侧链保护的镜像利那洛肽14肽树脂，记为第五反应物，所述的氨基酸的顺序为：N-芴甲氧羰酰基-甘氨酸、N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-苏氨酸、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸、N-芴甲氧羰酰基-D-丙氨酸、N-芴甲氧羰基-D-脯氨酸、N-芴甲氧羰基-N'-三苯甲基-D-天冬酰胺、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸、N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-酪氨酸、N-芴甲氧羰基-D-谷氨酸gamma-叔丁酯、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸和N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸；
(1-5)向步骤(1-4)中的第五反应物中加入10毫升的切割液，室温下反应2小时，然后将切割液转移至离心管中，利用氮气鼓泡进行切割液的浓缩，最后待切割液浓缩至3毫升以内后，加入冰乙醚，离心后得到固体粗肽；
(1-6)使用半制备型高效液相色谱，将上述步骤(1-5)得到的固体粗肽进行纯化，收集纯化后的溶液，并冻干，得到还原态镜像利那洛肽；
(1-7)将上述步骤(1-6)中的还原态镜像利那洛肽溶于复性缓冲液中，使还原态镜像利那洛肽的浓度为0.1毫克每毫升，25℃下复性过夜，待复性结束后，加入三氟乙酸调pH值至2.0后冻干，最后将冻干粉经高效液相色谱分离纯化，得到镜像利那洛肽；
(2)称取相同质量的天然利那洛肽和上述步骤(1)制备的镜像利那洛肽溶于pH值为7.5的摩尔浓度为50毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷的缓冲液中，使天然利那洛肽和镜像利那洛肽的总质量浓度为5-40毫克/毫升；
(3)在上述步骤(2)的溶液中加入结晶溶液，利用蛋白结晶筛选方法，在温度为4℃-18℃，结晶时间为1-14天，得到天然利那洛肽的晶体。
本发明提出的天然利那洛肽的结晶方法，其特点和优点是：
本发明方法以树脂作为固相载体，依照固相多肽合成的方法依次缩合具有N-芴甲氧羰基(Fmoc)保护的D型氨基酸；待氨基酸缩合结束后，使用切割液进行侧链保护基团的脱除以及多肽与树脂的分离，通过乙醚沉淀切割液得到镜像利那洛肽的粗肽，再通过高效液相色谱分离、冻干，得到纯化后的还原态利那洛肽；最后，通过复性折叠实现二硫键的正确配对，即可得到具有正确空间构型的镜像利那洛肽；添加等浓度的镜像利那洛肽至天然利那洛肽的中性缓冲液中，充分混匀后，通过运用蛋白结晶筛选方法，采用不同的结晶溶液、特定温度及时间，实现镜像利那洛肽辅助天然利那洛肽的结晶。本发明方法通过利用镜像利那洛肽辅助天然利那洛肽结晶，具有条件温和，易于出晶的优点。
附图说明
图1是还原态镜像利那洛肽的高效液相色谱图。
图2是镜像利那洛肽的高效液相色谱图。
图3是还原态镜像利那洛肽的质谱图。
图4是镜像利那洛肽的质谱图。
图5是天然和镜像利那洛肽的晶体结构图。
具体实施方式
本发明提出的天然利那洛肽的结晶方法，包括以下步骤：
(1)制备镜像利那洛肽，包括以下步骤：
(1-1)在树脂中加入N,N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷溶液10毫升，使树脂溶胀，加入溶液的体积比为：N,N-二甲基甲酰胺:二氯甲烷溶液＝1:1，溶胀时间为10分钟，利用隔膜泵作为动力源，将溶胀后的产物抽干，得到溶胀好的树脂；
(1-2)以步骤(1-1)中树脂作为1倍量，将4倍量的N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-酪氨酸溶于5毫升的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，在该溶液中加入8倍量的N,N-二异丙基乙胺，充分混匀后加入到步骤(1-1)溶胀好的树脂中，室温反应2小时后加入2毫升甲醇，反应30分钟，利用隔膜泵作为动力源，抽干反应液，得到第一反应物；分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗第一反应物各五次，在冲洗后的第一反应物中加入含有20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟，进行N-芴甲氧羰基的脱除，之后再分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗各五次，得到C端第一个氨基耦合到树脂上的第二反应物；
(1-3)将4倍量的N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸溶于5毫升的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，再加入3.6倍量的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)和8倍量的N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，充分混匀，得到混合液，将该混合液加入到上述步骤(1-2)的第二反应物中，室温下反应1小时，得到第三反应物，利用隔膜泵作为动力源，抽干第三反应物，分别用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺对第三反应物各冲洗五次，在第三反应物中加入含有20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟，进行N-芴甲氧羰基的脱除，之后再分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗各五次，得到C端前两个氨基耦合到树脂上的第四反应物；
(1-4)根据利那洛肽的氨基酸序列，重复步骤(1-3)，将剩余的12个氨基酸逐个耦合到第四反应物，得到侧链保护的镜像利那洛肽14肽树脂，记为第五反应物，所述的氨基酸的顺序为：N-芴甲氧羰酰基-甘氨酸、N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-苏氨酸、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸、N-芴甲氧羰酰基-D-丙氨酸、N-芴甲氧羰基-D-脯氨酸、N-芴甲氧羰基-N'-三苯甲基-D-天冬酰胺、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸、N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-酪氨酸、N-芴甲氧羰基-D-谷氨酸gamma-叔丁酯、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸和N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸；
(1-5)向步骤(1-4)中的第五反应物中加入10毫升的切割液，室温下反应2小时，然后将切割液转移至离心管中，利用氮气鼓泡进行切割液的浓缩，最后待切割液浓缩至3毫升以内后，加入冰乙醚，离心后得到固体粗肽；
(1-6)使用半制备型高效液相色谱，将上述步骤(1-5)得到的固体粗肽进行纯化，收集纯化后的溶液，并冻干，得到还原态镜像利那洛肽；
(1-7)将上述步骤(1-6)中的还原态镜像利那洛肽溶于复性缓冲液中，使还原态镜像利那洛肽的浓度为0.1毫克每毫升，25℃下复性过夜，待复性结束后，加入三氟乙酸调pH值至2.0后冻干，最后将冻干粉经高效液相色谱分离纯化，得到镜像利那洛肽；
(2)称取相同质量的天然利那洛肽(可以从深圳瀚宇药业购买)和上述步骤(1)制备的镜像利那洛肽溶于pH值为7.5的摩尔浓度为50毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷的缓冲液中，使天然利那洛肽和镜像利那洛肽的总质量浓度为5-40毫克/毫升；
(3)在上述步骤(2)的溶液中加入结晶溶液，利用蛋白结晶筛选方法，在温度为4℃-18℃，结晶时间为1-14天，得到天然利那洛肽的晶体。
上述天然利那洛肽的结晶方法中，所述的树脂为2-氯-三苯甲基氯树脂(2-Cl-Trit-Cl Resin)、N-芴甲氧羰基氨基树脂(Rink Amide-AM Resin)或王树脂(Wang Resin)。
上述天然利那洛肽的结晶方法中，所述的切割液为三氟乙酸、乙二硫醇、苯酚、茴香硫醚、水和三异丙基硅烷的混合物，体积百分比为：三氟乙酸:乙二硫醇:苯酚:茴香硫醚:水:三异丙基硅烷＝(70-100％):(0-10％):(0-10％):(0-10％):(0-10％):(0-10％)。优选为：三氟乙酸:乙二硫醇:苯酚:茴香硫醚:水＝80％:5％:5％:5％:5％。
上述天然利那洛肽的结晶方法中，所述的复性缓冲液为还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、半胱氨酸和胱氨酸中的一种或多种以任何比例相混合的混合液。优选为：复性缓冲液由摩尔浓度为50毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷、摩尔浓度为100毫摩尔/升的还原型谷胱甘肽和摩尔浓度为10毫摩尔/升的氧化型谷胱甘肽组成的pH值为7.5的混合液。
上述天然利那洛肽的结晶方法中，所述的相同质量的天然利那洛肽和镜像利那洛肽溶于pH为7.5的摩尔浓度为50毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷的缓冲液中，使天然利那洛肽和镜像利那洛肽的总质量浓度为20毫克/毫升。
上述天然利那洛肽的结晶方法中，所述的结晶溶液为结晶筛选试剂盒。
上述天然利那洛肽的结晶方法中，所述的结晶筛选方法为座滴法或悬滴法。
为了便于理解本发明，下面结合具体实施范例对本发明实施过程作进一步说明，这些描述只是为进一步说明本发明的特征及优点，而不是对发明权利要求的限制。
实施例1：
(1)制备镜像利那洛肽，包括以下步骤：
(1-1)称取200毫克2-氯-三苯甲基氯树脂(取代度为0.5毫摩尔/克)于固相合成管内，加入N,N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷溶液10毫升，使树脂溶胀，加入溶液的体积比为：N,N-二甲基甲酰胺:二氯甲烷溶液＝1:1，溶胀时间为10分钟，利用隔膜泵作为动力源，将溶胀后的产物抽干，得到溶胀好的树脂；
(1-2)以步骤(1-1)中树脂作为1倍量(0.1毫摩尔)，将4倍量(0.4毫摩尔，183.8毫克)的N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-酪氨酸溶于5毫升的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，在该溶液中加入8倍量(0.8毫摩尔，132微升)的N,N-二异丙基乙胺，充分混匀后加入到步骤(1-1)溶胀好的树脂中，室温反应2小时后加入2毫升甲醇，反应30分钟，利用隔膜泵作为动力源，抽干反应液，得到第一反应物；分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗第一反应物各五次，在冲洗后的第一反应物中加入含有20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟，进行N-芴甲氧羰基的脱除，之后再分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗各五次，得到C端第一个氨基耦合到树脂上的第二反应物；
(1-3)将4倍量(0.4毫摩尔，234.2毫克)的N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸溶于5毫升的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，再加入3.6倍量(0.36毫摩尔，136.8毫克)的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)和8倍量(0.8毫摩尔，132微升)的N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，充分混匀，得到混合液，将该混合液加入到上述步骤(1-2)的第二反应物中，室温下反应1小时，得到第三反应物，利用隔膜泵作为动力源，抽干第三反应物，分别用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺对第三反应物各冲洗五次，在第三反应物中加入含有20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟，进行N-芴甲氧羰基的脱除，之后再分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗各五次，得到C端前两个氨基耦合到树脂上的第四反应物；
(1-4)根据利那洛肽的氨基酸序列，重复步骤(1-3)，将剩余12个氨基酸逐个耦合到第四反应物，得到侧链保护的镜像利那洛肽14肽树脂，记为第五反应物，所述的氨基酸的顺序为：N-芴甲氧羰酰基-甘氨酸(0.4毫摩尔，118.9毫克)、N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-苏氨酸(0.4毫摩尔，158.9毫克)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)、N-芴甲氧羰酰基-D-丙氨酸(0.4毫摩尔，124.5毫克)、N-芴甲氧羰基-D-脯氨酸(0.4毫摩尔，134.9毫克)、N-芴甲氧羰基-N'-三苯甲基-D-天冬酰胺(0.4毫摩尔，238.6毫克)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)、N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-酪氨酸(0.4毫摩尔，183.8毫克)、N-芴甲氧羰基-D-谷氨酸gamma-叔丁酯(0.4毫摩尔，170.1毫克)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)和N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)；
(1-5)向步骤(1-4)中的第五反应物中加入10毫升的切割液(体积比为三氟乙酸:乙二硫醇:苯酚:茴香硫醚:水:三异丙基硅烷＝80％:5％:5％:5％:5％:0％)，室温下反应2小时，然后将切割液转移至离心管中，利用氮气鼓泡进行切割液的浓缩，最后待切割液浓缩至3毫升以内后，加入冰乙醚，离心后得到固体粗肽；
(1-6)使用半制备型高效液相色谱，将上述步骤(1-5)得到的固体粗肽进行纯化，收集纯化后的溶液，并冻干，得到还原态镜像利那洛肽。如图1所示为还原态镜像利那洛肽的高效液相色谱图，表明合成的还原态镜像利那洛肽具有均一的性质；如图3所示为还原态镜像利那洛肽的质谱图，表明合成的还原态镜像利那洛肽具有正确的分子量。；
(1-7)称取100毫克上述步骤(1-6)中的还原态镜像利那洛肽溶于复性缓冲液中(50毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷、100毫摩尔/升的还原型谷胱甘肽和10毫摩尔/升的氧化型谷胱甘肽组成的pH值为7.5)，使还原态镜像利那洛肽的浓度为0.1毫克每毫升，25℃下复性过夜，待复性结束后，加入三氟乙酸调pH值至2.0后冻干，最后将冻干粉经高效液相色谱分离纯化，得到镜像利那洛肽。如图2所示为镜像利那洛肽的高效液相色谱图，表明合成的镜像利那洛肽具有均一的性质；如图4所示为镜像利那洛肽的质谱图，表明合成的镜像利那洛肽具有正确的分子量；
(2)称取各20毫克的天然利那洛肽(可以从深圳瀚宇药业购买)和上述步骤(1)制备的镜像利那洛肽溶于pH值为7.5的摩尔浓度为50毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷的缓冲液中，使天然利那洛肽和镜像利那洛肽的总质量浓度为20毫克/毫升；
(3)在上述步骤(2)的溶液中加入Hampton结晶溶液，利用座滴法，在温度为16℃，结晶时间为5天，得到天然利那洛肽的晶体。图5所示为天然和镜像利那洛肽的晶体结构图，表明镜像利那洛肽确实起到了辅助天然利那洛肽结晶的作用。
实施例2：
(1)制备镜像利那洛肽，包括以下步骤：
(1-1)称取250毫克王树脂(取代度为0.4毫摩尔/克)于固相合成管内，加入N,N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷溶液10毫升，使树脂溶胀，加入溶液的体积比为：N,N-二甲基甲酰胺:二氯甲烷溶液＝1:1，溶胀时间为10分钟，利用隔膜泵作为动力源，将溶胀后的产物抽干，得到溶胀好的树脂；
(1-2)以步骤(1-1)中树脂作为1倍量(0.1毫摩尔)，将4倍量(0.4毫摩尔，183.8毫克)的N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-酪氨酸溶于5毫升的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，在该溶液中加入8倍量(0.8毫摩尔，132微升)的N,N-二异丙基乙胺，0.1倍量(0.01毫摩尔，1.2毫克)4-二甲氨基吡啶,充分混匀后加入到步骤(1-1)溶胀好的树脂中，室温反应2小时后加入2毫升甲醇，反应30分钟，利用隔膜泵作为动力源，抽干反应液，得到第一反应物；分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗第一反应物各五次，在冲洗后的第一反应物中加入含有20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟，进行N-芴甲氧羰基的脱除，之后再分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗各五次，得到C端第一个氨基耦合到树脂上的第二反应物；
(1-3)将4倍量(0.4毫摩尔，234.2毫克)的N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸溶于5毫升的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，再加入3.6倍量(0.36毫摩尔，136.8毫克)的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)和8倍量(0.8毫摩尔，132微升)的N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，充分混匀，得到混合液，将该混合液加入到上述步骤(1-2)的第二反应物中，室温下反应1小时，得到第三反应物，利用隔膜泵作为动力源，抽干第三反应物，分别用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺对第三反应物各冲洗五次，在第三反应物中加入含有20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟，进行N-芴甲氧羰基的脱除，之后再分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗各五次，得到C端前两个氨基耦合到树脂上的第四反应物；
(1-4)根据利那洛肽的氨基酸序列，重复步骤(1-3)，将剩余的12个氨基酸逐个耦合到第四反应物，得到侧链保护的镜像利那洛肽14肽树脂，记为第五反应物，所述的氨基酸的顺序为：N-芴甲氧羰酰基-甘氨酸(0.4毫摩尔，118.9毫克)、N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-苏氨酸(0.4毫摩尔，158.9毫克)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)、N-芴甲氧羰酰基-D-丙氨酸(0.4毫摩尔，124.5毫克)、N-芴甲氧羰基-D-脯氨酸(0.4毫摩尔，134.9毫克)、N-芴甲氧羰基-N'-三苯甲基-D-天冬酰胺(0.4毫摩尔，238.6毫克)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)、N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-酪氨酸(0.4毫摩尔，183.8毫克)、N-芴甲氧羰基-D-谷氨酸gamma-叔丁酯(0.4毫摩尔，170.1毫克)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)和N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)；
(1-5)向步骤(1-4)中的第五反应物中加入10毫升的切割液(体积比为三氟乙酸:乙二硫醇:苯酚:茴香硫醚:水:三异丙基硅烷＝80％:5％:5％:5％:5％:0％)，室温下反应2小时，然后将切割液转移至离心管中，利用氮气鼓泡进行切割液的浓缩，最后待切割液浓缩至3毫升以内后，加入冰乙醚，离心后得到固体粗肽；
(1-6)使用半制备型高效液相色谱，将上述步骤(1-5)得到的固体粗肽进行纯化，收集纯化后的溶液，并冻干，得到还原态镜像利那洛肽；
(1-7)称取100毫克上述步骤(1-6)中的还原态镜像利那洛肽溶于复性缓冲液中(50毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷、100毫摩尔/升的还原型谷胱甘肽和10毫摩尔/升的氧化型谷胱甘肽组成的pH值为7.5)，使还原态镜像利那洛肽的浓度为0.1毫克每毫升，25℃下复性过夜，待复性结束后，加入三氟乙酸调pH值至2.0后冻干，最后将冻干粉经高效液相色谱分离纯化，得到镜像利那洛肽；
(2)称取各20毫克的天然利那洛肽(可以从深圳瀚宇药业购买)和上述步骤(1)制备的镜像利那洛肽溶于pH值为7.5的摩尔浓度为50毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷的缓冲液中，使天然利那洛肽和镜像利那洛肽的总质量浓度为20毫克/毫升；
(3)在上述步骤(2)的溶液中加入Hampton结晶溶液中，利用座滴法，在温度为16℃，结晶时间为5天，得到天然利那洛肽的晶体。
实施例3：
(1)制备镜像利那洛肽，包括以下步骤：
(1-1)称取200毫克2-氯-三苯甲基氯树脂(取代度为0.5毫摩尔/克)于固相合成管内，加入N,N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷溶液10毫升，使树脂溶胀，加入溶液的体积比为：N,N-二甲基甲酰胺:二氯甲烷溶液＝1:1，溶胀时间为10分钟，利用隔膜泵作为动力源，将溶胀后的产物抽干，得到溶胀好的树脂；
(1-2)以步骤(1-1)中树脂作为1倍量(0.1毫摩尔)，将4倍量(0.4毫摩尔，183.8毫克)的N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-酪氨酸溶于5毫升的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，在该溶液中加入8倍量(0.8毫摩尔，132微升)的N,N-二异丙基乙胺，充分混匀后加入到步骤(1-1)溶胀好的树脂中，室温反应2小时后加入2毫升甲醇，反应30分钟，利用隔膜泵作为动力源，抽干反应液，得到第一反应物；分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗第一反应物各五次，在冲洗后的第一反应物中加入含有20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟，进行N-芴甲氧羰基的脱除，之后再分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗各五次，得到C端第一个氨基耦合到树脂上的第二反应物；
(1-3)将4倍量(0.4毫摩尔，234.2毫克)的N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸溶于5毫升的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，再加入3.6倍量(0.36毫摩尔，136.8毫克)的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)和8倍量(0.8毫摩尔，132微升)的N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，充分混匀，得到混合液，将该混合液加入到上述步骤(1-2)的第二反应物中，室温下反应1小时，得到第三反应物，利用隔膜泵作为动力源，抽干第三反应物，分别用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺对第三反应物各冲洗五次，在第三反应物中加入含有20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟，进行N-芴甲氧羰基的脱除，之后再分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗各五次，得到C端前两个氨基耦合到树脂上的第四反应物；
(1-4)根据利那洛肽的氨基酸序列，重复步骤(1-3)，将剩余的12个氨基酸逐个耦合到第四反应物，得到侧链保护的镜像利那洛肽14肽树脂，记为第五反应物，所述的氨基酸的顺序为：N-芴甲氧羰酰基-甘氨酸(0.4毫摩尔，118.9毫克)、N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-苏氨酸(0.4毫摩尔，158.9毫克)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)、N-芴甲氧羰酰基-D-丙氨酸(0.4毫摩尔，124.5毫克)、N-芴甲氧羰基-D-脯氨酸(0.4毫摩尔，134.9毫克)、N-芴甲氧羰基-N'-三苯甲基-D-天冬酰胺(0.4毫摩尔，238.6毫克)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)、N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-酪氨酸(0.4毫摩尔，183.8毫克)、N-芴甲氧羰基-D-谷氨酸gamma-叔丁酯(0.4毫摩尔，170.1毫克)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)和N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)；
(1-5)向步骤(1-4)中的第五反应物中加入10毫升的切割液(体积比为三氟乙酸:乙二硫醇:苯酚:茴香硫醚:水:三异丙基硅烷＝80％:5％:5％:5％:5％:0％)，室温下反应2小时，然后将切割液转移至离心管中，利用氮气鼓泡进行切割液的浓缩，最后待切割液浓缩至3毫升以内后，加入冰乙醚，离心后得到固体粗肽；
(1-6)使用半制备型高效液相色谱，将上述步骤(1-5)得到的固体粗肽进行纯化，收集纯化后的溶液，并冻干，得到还原态镜像利那洛肽；
(1-7)称取100毫克上述步骤(1-6)中的还原态镜像利那洛肽溶于复性缓冲液中(50毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷、8毫摩尔/升的还原型谷胱甘肽和1毫摩尔/升的氧化型谷胱甘肽组成的pH值为7.5)，使还原态镜像利那洛肽的浓度为0.1毫克每毫升，25℃下复性过夜，待复性结束后，加入三氟乙酸调pH值至2.0后冻干，最后将冻干粉经高效液相色谱分离纯化，得到镜像利那洛肽；
(2)称取各20毫克的天然利那洛肽(可以从深圳瀚宇药业购买)和上述步骤(1)制备的镜像利那洛肽溶于pH值为7.5的摩尔浓度为50毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷的缓冲液中，使天然利那洛肽和镜像利那洛肽的总质量浓度为20毫克/毫升；
(3)在上述步骤(2)的溶液中加入Hampton结晶溶液，利用座滴法，在温度为16℃，结晶时间为5天，得到天然利那洛肽的晶体。
实施例4：
(1)制备镜像利那洛肽，包括以下步骤：
(1-1)称取250毫克王树脂(取代度为0.4毫摩尔/克)于固相合成管内，加入N,N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷溶液10毫升，使树脂溶胀，加入溶液的体积比为：N,N-二甲基甲酰胺:二氯甲烷溶液＝1:1，溶胀时间为10分钟，利用隔膜泵作为动力源，将溶胀后的产物抽干，得到溶胀好的树脂；
(1-2)以步骤(1-1)中树脂作为1倍量(0.1毫摩尔)，将4倍量(0.4毫摩尔，183.8毫克)的N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-酪氨酸溶于5毫升的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，在该溶液中加入8倍量(0.8毫摩尔，132微升)的N,N-二异丙基乙胺，0.1倍量(0.01毫摩尔，1.2毫克)4-二甲氨基吡啶,充分混匀后加入到步骤(1-1)溶胀好的树脂中，室温反应2小时后加入2毫升甲醇，反应30分钟，利用隔膜泵作为动力源，抽干反应液，得到第一反应物；分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗第一反应物各五次，在冲洗后的第一反应物中加入含有20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟，进行N-芴甲氧羰基的脱除，之后再分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗各五次，得到C端第一个氨基耦合到树脂上的第二反应物；
(1-3)将4倍量(0.4毫摩尔，234.2毫克)的N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸溶于5毫升的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，再加入3.6倍量(0.36毫摩尔，136.8毫克)的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)和8倍量(0.8毫摩尔，132微升)的N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，充分混匀，得到混合液，将该混合液加入到上述步骤(1-2)的第二反应物中，室温下反应1小时，得到第三反应物，利用隔膜泵作为动力源，抽干第三反应物，分别用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺对第三反应物各冲洗五次，在第三反应物中加入含有20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟，进行N-芴甲氧羰基的脱除，之后再分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗各五次，得到C端前两个氨基耦合到树脂上的第四反应物；
(1-4)根据利那洛肽的氨基酸序列，重复步骤(1-3)，将剩余的12个氨基酸逐个耦合到第四反应物，得到侧链保护的镜像利那洛肽14肽树脂，记为第五反应物，所述的氨基酸的顺序为：N-芴甲氧羰酰基-甘氨酸(0.4毫摩尔，118.9毫克)、N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-苏氨酸(0.4毫摩尔，158.9毫克)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)、N-芴甲氧羰酰基-D-丙氨酸(0.4毫摩尔，124.5毫克)、N-芴甲氧羰基-D-脯氨酸(0.4毫摩尔，134.9毫克)、N-芴甲氧羰基-N'-三苯甲基-D-天冬酰胺(0.4毫摩尔，238.6毫克)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)、N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-酪氨酸(0.4毫摩尔，183.8毫克)、N-芴甲氧羰基-D-谷氨酸gamma-叔丁酯(0.4毫摩尔，170.1毫克)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)和N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)；
(1-5)向步骤(1-4)中的第五反应物中加入10毫升的切割液(体积比为三氟乙酸:乙二硫醇:苯酚:茴香硫醚:水:三异丙基硅烷＝80％:5％:5％:5％:5％:0％)，室温下反应2小时，然后将切割液转移至离心管中，利用氮气鼓泡进行切割液的浓缩，最后待切割液浓缩至3毫升以内后，加入冰乙醚，离心后得到固体粗肽；
(1-6)使用半制备型高效液相色谱，将上述步骤(1-5)得到的固体粗肽进行纯化，收集纯化后的溶液，并冻干，得到还原态镜像利那洛肽；
(1-7)称取100毫克上述步骤(1-6)中的还原态镜像利那洛肽溶于复性缓冲液中(50毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷、8毫摩尔/升的还原型谷胱甘肽和1毫摩尔/升的氧化型谷胱甘肽组成的pH值为7.5)，使还原态镜像利那洛肽的浓度为0.1毫克每毫升，25℃下复性过夜，待复性结束后，加入三氟乙酸调pH值至2.0后冻干，最后将冻干粉经高效液相色谱分离纯化，得到镜像利那洛肽；
(2)称取各20毫克的天然利那洛肽(可以从深圳瀚宇药业购买)和上述步骤(1)制备的镜像利那洛肽溶于pH值为7.5的摩尔浓度为50毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷的缓冲液中，使天然利那洛肽和镜像利那洛肽的总质量浓度为20毫克/毫升；
(3)在上述步骤(2)的溶液中加入Hampton结晶溶液，利用座滴法，在温度为16℃，结晶时间为5天，得到天然利那洛肽的晶体。
实施例5：
(1)制备镜像利那洛肽，包括以下步骤：
(1-1)称取250毫克王树脂(取代度为0.4毫摩尔/克)于固相合成管内，加入N,N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷溶液10毫升，使树脂溶胀，加入溶液的体积比为：N,N-二甲基甲酰胺:二氯甲烷溶液＝1:1，溶胀时间为10分钟，利用隔膜泵作为动力源，将溶胀后的产物抽干，得到溶胀好的树脂；
(1-2)以步骤(1-1)中树脂作为1倍量(0.1毫摩尔)，将4倍量(0.4毫摩尔，183.8毫克)的N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-酪氨酸溶于5毫升的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，在该溶液中加入8倍量(0.8毫摩尔，132微升)的N,N-二异丙基乙胺，0.1倍量(0.01毫摩尔，1.2毫克)4-二甲氨基吡啶,充分混匀后加入到步骤(1-1)溶胀好的树脂中，室温反应2小时后加入2毫升甲醇，反应30分钟，利用隔膜泵作为动力源，抽干反应液，得到第一反应物；分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗第一反应物各五次，在冲洗后的第一反应物中加入含有20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟，进行N-芴甲氧羰基的脱除，之后再分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗各五次，得到C端第一个氨基耦合到树脂上的第二反应物；
(1-3)将4倍量(0.4毫摩尔，234.2毫克)的N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸溶于5毫升的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，再加入3.6倍量(0.36毫摩尔，136.8毫克)的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)和8倍量(0.8毫摩尔，132微升)的N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，充分混匀，得到混合液，将该混合液加入到上述步骤(1-2)的第二反应物中，室温下反应1小时，得到第三反应物，利用隔膜泵作为动力源，抽干第三反应物，分别用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺对第三反应物各冲洗五次，在第三反应物中加入含有20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟，进行N-芴甲氧羰基的脱除，之后再分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗各五次，得到C端前两个氨基耦合到树脂上的第四反应物；
(1-4)根据利那洛肽的氨基酸序列，重复步骤(1-3)，将剩余的12个氨基酸逐个耦合到第四反应物，得到侧链保护的镜像利那洛肽14肽树脂，记为第五反应物，所述的氨基酸的顺序为：N-芴甲氧羰酰基-甘氨酸(0.4毫摩尔，118.9毫克)、N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-苏氨酸(0.4毫摩尔，158.9毫克)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)、N-芴甲氧羰酰基-D-丙氨酸(0.4毫摩尔，124.5毫克)、N-芴甲氧羰基-D-脯氨酸(0.4毫摩尔，134.9毫克)、N-芴甲氧羰基-N'-三苯甲基-D-天冬酰胺(0.4毫摩尔，238.6毫克)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)、N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-酪氨酸(0.4毫摩尔，183.8毫克)、N-芴甲氧羰基-D-谷氨酸gamma-叔丁酯(0.4毫摩尔，170.1毫克)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)和N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)；
(1-5)向步骤(1-4)中的第五反应物中加入10毫升的切割液(体积比为三氟乙酸:乙二硫醇:苯酚:茴香硫醚:水:三异丙基硅烷＝85％:0％:5％:0％:5％:5％)，室温下反应2小时，然后将切割液转移至离心管中，利用氮气鼓泡进行切割液的浓缩，最后待切割液浓缩至3毫升以内后，加入冰乙醚，离心后得到固体粗肽；
(1-6)使用半制备型高效液相色谱，将上述步骤(1-5)得到的固体粗肽进行纯化，收集纯化后的溶液，并冻干，得到还原态镜像利那洛肽；
(1-7)称取100毫克上述步骤(1-6)中的还原态镜像利那洛肽溶于复性缓冲液中(50毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷、100毫摩尔/升的还原型谷胱甘肽和10毫摩尔/升的氧化型谷胱甘肽组成的pH值为7.5)，使还原态镜像利那洛肽的浓度为0.1毫克每毫升，25℃下复性过夜，待复性结束后，加入三氟乙酸调pH值至2.0后冻干，最后将冻干粉经高效液相色谱分离纯化，得到镜像利那洛肽；
(2)称取各20毫克的天然利那洛肽(可以从深圳瀚宇药业购买)和上述步骤(1)制备的镜像利那洛肽溶于pH值为7.5的摩尔浓度为50毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷的缓冲液中，使天然利那洛肽和镜像利那洛肽的总质量浓度为20毫克/毫升；
(3)在上述步骤(2)的溶液中加入Hampton结晶溶液，利用座滴法，在温度为16℃，结晶时间为5天，得到天然利那洛肽的晶体。
实施例6：
(1)制备镜像利那洛肽，包括以下步骤：
(1-1)称取200毫克2-氯-三苯甲基氯树脂(取代度为0.5毫摩尔/克)于固相合成管内，加入N,N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷溶液10毫升，使树脂溶胀，加入溶液的体积比为：N,N-二甲基甲酰胺:二氯甲烷溶液＝1:1，溶胀时间为10分钟，利用隔膜泵作为动力源，将溶胀后的产物抽干，得到溶胀好的树脂；
(1-2)以步骤(1-1)中树脂作为1倍量(0.1毫摩尔)，将4倍量(0.4毫摩尔，183.8毫克)的N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-酪氨酸溶于5毫升的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，在该溶液中加入8倍量(0.8毫摩尔，132微升)的N,N-二异丙基乙胺，充分混匀后加入到步骤(1-1)溶胀好的树脂中，室温反应2小时后加入2毫升甲醇，反应30分钟，利用隔膜泵作为动力源，抽干反应液，得到第一反应物；分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗第一反应物各五次，在冲洗后的第一反应物中加入含有20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟，进行N-芴甲氧羰基的脱除，之后再分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗各五次，得到C端第一个氨基耦合到树脂上的第二反应物；
(1-3)将4倍量(0.4毫摩尔，234.2毫克)的N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸溶于5毫升的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，再加入3.6倍量(0.36毫摩尔，136.8毫克)的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)和8倍量(0.8毫摩尔，132微升)的N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，充分混匀，得到混合液，将该混合液加入到上述步骤(1-2)的第二反应物中，室温下反应1小时，得到第三反应物，利用隔膜泵作为动力源，抽干第三反应物，分别用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺对第三反应物各冲洗五次，在第三反应物中加入含有20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟，进行N-芴甲氧羰基的脱除，之后再分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗各五次，得到C端前两个氨基耦合到树脂上的第四反应物；
(1-4)根据利那洛肽的氨基酸序列，重复步骤(1-3)，将剩余的12个氨基酸逐个耦合到第四反应物，得到侧链保护的镜像利那洛肽14肽树脂，记为第五反应物，所述的氨基酸的顺序为：N-芴甲氧羰酰基-甘氨酸(0.4毫摩尔，118.9毫克)、N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-苏氨酸(0.4毫摩尔，158.9毫克)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)、N-芴甲氧羰酰基-D-丙氨酸(0.4毫摩尔，124.5毫克)、N-芴甲氧羰基-D-脯氨酸(0.4毫摩尔，134.9毫克)、N-芴甲氧羰基-N'-三苯甲基-D-天冬酰胺(0.4毫摩尔，238.6毫克)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)、N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-酪氨酸(0.4毫摩尔，183.8毫克)、N-芴甲氧羰基-D-谷氨酸gamma-叔丁酯(0.4毫摩尔，170.1毫克)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)和N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)；
(1-5)向步骤(1-4)中的第五反应物中加入10毫升的切割液(体积比为三氟乙酸:乙二硫醇:苯酚:茴香硫醚:水:三异丙基硅烷＝85％:0％:5％:0％:5％:5％)，室温下反应2小时，然后将切割液转移至离心管中，利用氮气鼓泡进行切割液的浓缩，最后待切割液浓缩至3毫升以内后，加入冰乙醚，离心后得到固体粗肽；
(1-6)使用半制备型高效液相色谱，将上述步骤(1-5)得到的固体粗肽进行纯化，收集纯化后的溶液，并冻干，得到还原态镜像利那洛肽；
(1-7)称取100毫克上述步骤(1-6)中的还原态镜像利那洛肽溶于复性缓冲液中(50毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷、100毫摩尔/升的还原型谷胱甘肽和10毫摩尔/升的氧化型谷胱甘肽组成的pH值为7.5)，使还原态镜像利那洛肽的浓度为0.1毫克每毫升，25℃下复性过夜，待复性结束后，加入三氟乙酸调pH值至2.0后冻干，最后将冻干粉经高效液相色谱分离纯化，得到镜像利那洛肽；
(2)称取各20毫克的天然利那洛肽(可以从深圳瀚宇药业购买)和上述步骤(1)制备的镜像利那洛肽溶于pH值为7.5的摩尔浓度为50毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷的缓冲液中，使天然利那洛肽和镜像利那洛肽的总质量浓度为20毫克/毫升；
(3)在上述步骤(2)的溶液中加入Hampton结晶溶液，利用座滴法，在温度为16℃，结晶时间为5天，得到天然利那洛肽的晶体。
实施例7：
(1)制备镜像利那洛肽，包括以下步骤：
(1-1)称取200毫克2-氯-三苯甲基氯树脂(取代度为0.5毫摩尔/克)于固相合成管内，加入N,N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷溶液10毫升，使树脂溶胀，加入溶液的体积比为：N,N-二甲基甲酰胺:二氯甲烷溶液＝1:1，溶胀时间为10分钟，利用隔膜泵作为动力源，将溶胀后的产物抽干，得到溶胀好的树脂；
(1-2)以步骤(1-1)中树脂作为1倍量(0.1毫摩尔)，将4倍量(0.4毫摩尔，183.8毫克)的N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-酪氨酸溶于5毫升的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，在该溶液中加入8倍量(0.8毫摩尔，132微升)的N,N-二异丙基乙胺，充分混匀后加入到步骤(1-1)溶胀好的树脂中，室温反应2小时后加入2毫升甲醇，反应30分钟，利用隔膜泵作为动力源，抽干反应液，得到第一反应物；分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗第一反应物各五次，在冲洗后的第一反应物中加入含有20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟，进行N-芴甲氧羰基的脱除，之后再分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗各五次，得到C端第一个氨基耦合到树脂上的第二反应物；
(1-3)将4倍量(0.4毫摩尔，234.2毫克)的N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸溶于5毫升的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，再加入3.6倍量(0.36毫摩尔，136.8毫克)的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)和8倍量(0.8毫摩尔，132微升)的N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，充分混匀，得到混合液，将该混合液加入到上述步骤(1-2)的第二反应物中，室温下反应1小时，得到第三反应物，利用隔膜泵作为动力源，抽干第三反应物，分别用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺对第三反应物各冲洗五次，在第三反应物中加入含有20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟，进行N-芴甲氧羰基的脱除，之后再分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗各五次，得到C端前两个氨基耦合到树脂上的第四反应物；
(1-4)根据利那洛肽的氨基酸序列，重复步骤(1-3)，将剩余的12个氨基酸逐个耦合到第四反应物，得到侧链保护的镜像利那洛肽14肽树脂，记为第五反应物，所述的氨基酸的顺序为：N-芴甲氧羰酰基-甘氨酸(0.4毫摩尔，118.9毫克)、N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-苏氨酸(0.4毫摩尔，158.9毫克)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)、N-芴甲氧羰酰基-D-丙氨酸(0.4毫摩尔，124.5毫克)、N-芴甲氧羰基-D-脯氨酸(0.4毫摩尔，134.9毫克)、N-芴甲氧羰基-N'-三苯甲基-D-天冬酰胺(0.4毫摩尔，238.6毫克)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)、N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-酪氨酸(0.4毫摩尔，183.8毫克)、N-芴甲氧羰基-D-谷氨酸gamma-叔丁酯(0.4毫摩尔，170.1毫克)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)和N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)；
(1-5)向步骤(1-4)中的第五反应物中加入10毫升的切割液(体积比为三氟乙酸:乙二硫醇:苯酚:茴香硫醚:水:三异丙基硅烷＝85％:5％:0％:5％:5％:0％)，室温下反应2小时，然后将切割液转移至离心管中，利用氮气鼓泡进行切割液的浓缩，最后待切割液浓缩至3毫升以内后，加入冰乙醚，离心后得到固体粗肽；
(1-6)使用半制备型高效液相色谱，将上述步骤(1-5)得到的固体粗肽进行纯化，收集纯化后的溶液，并冻干，得到还原态镜像利那洛肽；
(1-7)称取100毫克上述步骤(1-6)中的还原态镜像利那洛肽溶于复性缓冲液中(50毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷、100毫摩尔/升的还原型谷胱甘肽和10毫摩尔/升的氧化型谷胱甘肽组成的pH值为7.5)，使还原态镜像利那洛肽的浓度为0.1毫克每毫升，25℃下复性过夜，待复性结束后，加入三氟乙酸调pH值至2.0后冻干，最后将冻干粉经高效液相色谱分离纯化，得到镜像利那洛肽；
(2)称取各20毫克的天然利那洛肽(可以从深圳瀚宇药业购买)和上述步骤(1)制备的镜像利那洛肽溶于pH值为7.5的摩尔浓度为50毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷的缓冲液中，使天然利那洛肽和镜像利那洛肽的总质量浓度为20毫克/毫升；
(3)在上述步骤(2)的溶液中加入Hampton结晶溶液，利用座滴法，在温度为16℃，结晶时间为5天，得到天然利那洛肽的晶体。
实施例8：
(1)制备镜像利那洛肽，包括以下步骤：
(1-1)称取250毫克王树脂(取代度为0.4毫摩尔/克)于固相合成管内，加入N,N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷溶液10毫升，使树脂溶胀，加入溶液的体积比为：N,N-二甲基甲酰胺:二氯甲烷溶液＝1:1，溶胀时间为10分钟，利用隔膜泵作为动力源，将溶胀后的产物抽干，得到溶胀好的树脂；
(1-2)以步骤(1-1)中树脂作为1倍量(0.1毫摩尔)，将4倍量(0.4毫摩尔，183.8毫克)的N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-酪氨酸溶于5毫升的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，在该溶液中加入8倍量(0.8毫摩尔，132微升)的N,N-二异丙基乙胺，0.1倍量(0.01毫摩尔，1.2毫克)4-二甲氨基吡啶,充分混匀后加入到步骤(1-1)溶胀好的树脂中，室温反应2小时后加入2毫升甲醇，反应30分钟，利用隔膜泵作为动力源，抽干反应液，得到第一反应物；分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗第一反应物各五次，在冲洗后的第一反应物中加入含有20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟，进行N-芴甲氧羰基的脱除，之后再分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗各五次，得到C端第一个氨基耦合到树脂上的第二反应物；
(1-3)将4倍量(0.4毫摩尔，234.2毫克)的N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸溶于5毫升的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，再加入3.6倍量(0.36毫摩尔，136.8毫克)的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)和8倍量(0.8毫摩尔，132微升)的N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，充分混匀，得到混合液，将该混合液加入到上述步骤(1-2)的第二反应物中，室温下反应1小时，得到第三反应物，利用隔膜泵作为动力源，抽干第三反应物，分别用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺对第三反应物各冲洗五次，在第三反应物中加入含有20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟，进行N-芴甲氧羰基的脱除，之后再分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗各五次，得到C端前两个氨基耦合到树脂上的第四反应物；
(1-4)根据利那洛肽的氨基酸序列，重复步骤(1-3)，将剩余的12个氨基酸逐个耦合到第四反应物，得到侧链保护的镜像利那洛肽14肽树脂，记为第五反应物，所述的氨基酸的顺序为：N-芴甲氧羰酰基-甘氨酸(0.4毫摩尔，118.9毫克)、N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-苏氨酸(0.4毫摩尔，158.9毫克)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)、N-芴甲氧羰酰基-D-丙氨酸(0.4毫摩尔，124.5毫克)、N-芴甲氧羰基-D-脯氨酸(0.4毫摩尔，134.9毫克)、N-芴甲氧羰基-N'-三苯甲基-D-天冬酰胺(0.4毫摩尔，238.6毫克)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)、N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-酪氨酸(0.4毫摩尔，183.8毫克)、N-芴甲氧羰基-D-谷氨酸gamma-叔丁酯(0.4毫摩尔，170.1毫克)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)和N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)；
(1-5)向步骤(1-4)中的第五反应物中加入10毫升的切割液(体积比为三氟乙酸:乙二硫醇:苯酚:茴香硫醚:水:三异丙基硅烷＝85％:5％:0％:5％:5％:0％)，室温下反应2小时，然后将切割液转移至离心管中，利用氮气鼓泡进行切割液的浓缩，最后待切割液浓缩至3毫升以内后，加入冰乙醚，离心后得到固体粗肽；
(1-6)使用半制备型高效液相色谱，将上述步骤(1-5)得到的固体粗肽进行纯化，收集纯化后的溶液，并冻干，得到还原态镜像利那洛肽；
(1-7)称取100毫克上述步骤(1-6)中的还原态镜像利那洛肽溶于复性缓冲液中(50毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷、100毫摩尔/升的还原型谷胱甘肽和10毫摩尔/升的氧化型谷胱甘肽组成的pH值为7.5)，使还原态镜像利那洛肽的浓度为0.1毫克每毫升，25℃下复性过夜，待复性结束后，加入三氟乙酸调pH值至2.0后冻干，最后将冻干粉经高效液相色谱分离纯化，得到镜像利那洛肽；
(2)称取各20毫克的天然利那洛肽(可以从深圳瀚宇药业购买)和上述步骤(1)制备的镜像利那洛肽溶于pH值为7.5的摩尔浓度为50毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷的缓冲液中，使天然利那洛肽和镜像利那洛肽的总质量浓度为20毫克/毫升；
(3)在上述步骤(2)的溶液中加入Hampton结晶溶液，利用座滴法，在温度为16℃，结晶时间为5天，得到天然利那洛肽的晶体。
实施例9：
(1)制备镜像利那洛肽，包括以下步骤：
(1-1)称取200毫克2-氯-三苯甲基氯树脂(取代度为0.5毫摩尔/克)于固相合成管内，加入N,N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷溶液10毫升，使树脂溶胀，加入溶液的体积比为：N,N-二甲基甲酰胺:二氯甲烷溶液＝1:1，溶胀时间为10分钟，利用隔膜泵作为动力源，将溶胀后的产物抽干，得到溶胀好的树脂；
(1-2)以步骤(1-1)中树脂作为1倍量(0.1毫摩尔)，将4倍量(0.4毫摩尔，183.8毫克)的N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-酪氨酸溶于5毫升的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，在该溶液中加入8倍量(0.8毫摩尔，132微升)的N,N-二异丙基乙胺，充分混匀后加入到步骤(1-1)溶胀好的树脂中，室温反应2小时后加入2毫升甲醇，反应30分钟，利用隔膜泵作为动力源，抽干反应液，得到第一反应物；分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗第一反应物各五次，在冲洗后的第一反应物中加入含有20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟，进行N-芴甲氧羰基的脱除，之后再分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗各五次，得到C端第一个氨基耦合到树脂上的第二反应物；
(1-3)将4倍量(0.4毫摩尔，234.2毫克)的N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸溶于5毫升的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，再加入3.6倍量(0.36毫摩尔，136.8毫克)的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)和8倍量(0.8毫摩尔，132微升)的N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，充分混匀，得到混合液，将该混合液加入到上述步骤(1-2)的第二反应物中，室温下反应1小时，得到第三反应物，利用隔膜泵作为动力源，抽干第三反应物，分别用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺对第三反应物各冲洗五次，在第三反应物中加入含有20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟，进行N-芴甲氧羰基的脱除，之后再分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗各五次，得到C端前两个氨基耦合到树脂上的第四反应物；
(1-4)根据利那洛肽的氨基酸序列，重复步骤(1-3)，将剩余的12个氨基酸逐个耦合到第四反应物，得到侧链保护的镜像利那洛肽14肽树脂，记为第五反应物，所述的氨基酸的顺序为：N-芴甲氧羰酰基-甘氨酸(0.4毫摩尔，118.9毫克)、N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-苏氨酸(0.4毫摩尔，158.9毫克)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)、N-芴甲氧羰酰基-D-丙氨酸(0.4毫摩尔，124.5毫克)、N-芴甲氧羰基-D-脯氨酸(0.4毫摩尔，134.9毫克)、N-芴甲氧羰基-N'-三苯甲基-D-天冬酰胺(0.4毫摩尔，238.6毫克)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)、N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-酪氨酸(0.4毫摩尔，183.8毫克)、N-芴甲氧羰基-D-谷氨酸gamma-叔丁酯(0.4毫摩尔，170.1毫克)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)和N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)；
(1-5)向步骤(1-4)中的第五反应物中加入10毫升的切割液(体积比为三氟乙酸:乙二硫醇:苯酚:茴香硫醚:水:三异丙基硅烷＝80％:5％:5％:5％:5％:0％)，室温下反应2小时，然后将切割液转移至离心管中，利用氮气鼓泡进行切割液的浓缩，最后待切割液浓缩至3毫升以内后，加入冰乙醚，离心后得到固体粗肽；
(1-6)使用半制备型高效液相色谱，将上述步骤(1-5)得到的固体粗肽进行纯化，收集纯化后的溶液，并冻干，得到还原态镜像利那洛肽；
(1-7)称取100毫克上述步骤(1-6)中的还原态镜像利那洛肽溶于复性缓冲液中(50毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷、100毫摩尔/升的还原型谷胱甘肽和10毫摩尔/升的氧化型谷胱甘肽组成的pH值为7.5)，使还原态镜像利那洛肽的浓度为0.1毫克每毫升，25℃下复性过夜，待复性结束后，加入三氟乙酸调pH值至2.0后冻干，最后将冻干粉经高效液相色谱分离纯化，得到镜像利那洛肽；
(2)称取各10毫克的天然利那洛肽(可以从深圳瀚宇药业购买)和上述步骤(1)制备的镜像利那洛肽溶于pH值为7.5的摩尔浓度为50毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷的缓冲液中，使天然利那洛肽和镜像利那洛肽的总质量浓度为10毫克/毫升；
(3)在上述步骤(2)的溶液中加入Hampton结晶溶液，利用座滴法，在温度为16℃，结晶时间为5天，得到天然利那洛肽的晶体。
实施例10：
(1)制备镜像利那洛肽，包括以下步骤：
(1-1)称取250毫克王树脂(取代度为0.4毫摩尔/克)于固相合成管内，加入N,N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷溶液10毫升，使树脂溶胀，加入溶液的体积比为：N,N-二甲基甲酰胺:二氯甲烷溶液＝1:1，溶胀时间为10分钟，利用隔膜泵作为动力源，将溶胀后的产物抽干，得到溶胀好的树脂；
(1-2)以步骤(1-1)中树脂作为1倍量(0.1毫摩尔)，将4倍量(0.4毫摩尔，183.8毫克)的N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-酪氨酸溶于5毫升的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，在该溶液中加入8倍量(0.8毫摩尔，132微升)的N,N-二异丙基乙胺，0.1倍量(0.01毫摩尔，1.2毫克)4-二甲氨基吡啶,充分混匀后加入到步骤(1-1)溶胀好的树脂中，室温反应2小时后加入2毫升甲醇，反应30分钟，利用隔膜泵作为动力源，抽干反应液，得到第一反应物；分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗第一反应物各五次，在冲洗后的第一反应物中加入含有20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟，进行N-芴甲氧羰基的脱除，之后再分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗各五次，得到C端第一个氨基耦合到树脂上的第二反应物；
(1-3)将4倍量(0.4毫摩尔，234.2毫克)的N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸溶于5毫升的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，再加入3.6倍量(0.36毫摩尔，136.8毫克)的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)和8倍量(0.8毫摩尔，132微升)的N,N-二异丙基乙胺(DIEA)，充分混匀，得到混合液，将该混合液加入到上述步骤(1-2)的第二反应物中，室温下反应1小时，得到第三反应物，利用隔膜泵作为动力源，抽干第三反应物，分别用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺对第三反应物各冲洗五次，在第三反应物中加入含有20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟，进行N-芴甲氧羰基的脱除，之后再分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗各五次，得到C端前两个氨基耦合到树脂上的第四反应物；
(1-4)根据利那洛肽的氨基酸序列，重复步骤(1-3)，将剩余的12个氨基酸逐个耦合到第四反应物，得到侧链保护的镜像利那洛肽14肽树脂，记为第五反应物，所述的氨基酸的顺序为：N-芴甲氧羰酰基-甘氨酸(0.4毫摩尔，118.9毫克)、N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-苏氨酸(0.4毫摩尔，158.9毫克)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)、N-芴甲氧羰酰基-D-丙氨酸(0.4毫摩尔，124.5毫克)、N-芴甲氧羰基-D-脯氨酸(0.4毫摩尔，134.9毫克)、N-芴甲氧羰基-N'-三苯甲基-D-天冬酰胺(0.4毫摩尔，238.6毫克)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)、N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-酪氨酸(0.4毫摩尔，183.8毫克)、N-芴甲氧羰基-D-谷氨酸gamma-叔丁酯(0.4毫摩尔，170.1毫克)、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)和N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸(0.4毫摩尔，234.2毫克)；
(1-5)向步骤(1-4)中的第五反应物中加入10毫升的切割液(体积比为三氟乙酸:乙二硫醇:苯酚:茴香硫醚:水:三异丙基硅烷＝80％:5％:5％:5％:5％:0％)，室温下反应2小时，然后将切割液转移至离心管中，利用氮气鼓泡进行切割液的浓缩，最后待切割液浓缩至3毫升以内后，加入冰乙醚，离心后得到固体粗肽；
(1-6)使用半制备型高效液相色谱，将上述步骤(1-5)得到的固体粗肽进行纯化，收集纯化后的溶液，并冻干，得到还原态镜像利那洛肽；
(1-7)称取100毫克上述步骤(1-6)中的还原态镜像利那洛肽溶于复性缓冲液中(50毫摩尔/升三羟甲基氨基甲烷、100毫摩尔/升的还原型谷胱甘肽和10毫摩尔/升的氧化型谷胱甘肽组成的pH值为7.5)，使还原态镜像利那洛肽的浓度为0.1毫克每毫升，25℃下复性过夜，待复性结束后，加入三氟乙酸调pH值至2.0后冻干，最后将冻干粉经高效液相色谱分离纯化，得到镜像利那洛肽；
(2)称取各10毫克的天然利那洛肽(可以从深圳瀚宇药业购买)和上述步骤(1)制备的镜像利那洛肽溶于pH值为7.5的摩尔浓度为50毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷的缓冲液中，使天然利那洛肽和镜像利那洛肽的总质量浓度为10毫克/毫升；
(3)在上述步骤(2)的溶液中加入Hampton结晶溶液，利用座滴法，在温度为16℃，结晶时间为5天，得到天然利那洛肽的晶体。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，也不因各实施例之间的前后次序对本发明造成任何限制，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭示的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种天然利那洛肽的结晶方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
(1)制备镜像利那洛肽，包括以下步骤：
(1-1)在树脂中加入N,N-二甲基甲酰胺/二氯甲烷溶液10毫升，使树脂溶胀，加入溶液的体积比为：N,N-二甲基甲酰胺:二氯甲烷溶液＝1:1，溶胀时间为10分钟，利用隔膜泵作为动力源，将溶胀后的产物抽干，得到溶胀好的树脂；
(1-2)以步骤(1-1)中树脂作为1倍量，将4倍量的N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-酪氨酸溶于5毫升的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，在该溶液中加入8倍量的N,N-二异丙基乙胺，充分混匀后加入到步骤(1-1)溶胀好的树脂中，室温反应2小时后加入2毫升甲醇，反应30分钟，利用隔膜泵作为动力源，抽干反应液，得到第一反应物；分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗第一反应物各五次，在冲洗后的第一反应物中加入含有20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟，进行N-芴甲氧羰基的脱除，之后再分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗各五次，得到C端第一个氨基耦合到树脂上的第二反应物；
(1-3)将4倍量的N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸溶于5毫升的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，再加入3.6倍量的2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和8倍量的N,N-二异丙基乙胺，充分混匀，得到混合液，将该混合液加入到上述步骤(1-2)的第二反应物中，室温下反应1小时，得到第三反应物，利用隔膜泵作为动力源，抽干第三反应物，分别用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺对第三反应物各冲洗五次，在第三反应物中加入含有20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液反应10分钟，进行N-芴甲氧羰基的脱除，之后再分别先后用N,N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺冲洗各五次，得到C端前两个氨基耦合到树脂上的第四反应物；
(1-4)根据利那洛肽的氨基酸序列，重复步骤(1-3)，将剩余的12个氨基酸逐个耦合到第四反应物，得到侧链保护的镜像利那洛肽14肽树脂，记为第五反应物，所述的氨基酸的顺序为：N-芴甲氧羰酰基-甘氨酸、N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-苏氨酸、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸、N-芴甲氧羰酰基-D-丙氨酸、N-芴甲氧羰基-D-脯氨酸、N-芴甲氧羰基-N'-三苯甲基-D-天冬酰胺、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸、N-芴甲氧羰基-O-叔丁基-D-酪氨酸、N-芴甲氧羰基-D-谷氨酸gamma-叔丁酯、N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸和N-芴甲氧羰基-S-三苯甲基-D-半胱氨酸；
(1-5)向步骤(1-4)中的第五反应物中加入10毫升的切割液，室温下反应2小时，然后将切割液转移至离心管中，利用氮气鼓泡进行切割液的浓缩，最后待切割液浓缩至3毫升以内后，加入冰乙醚，离心后得到固体粗肽，所述的切割液为：三氟乙酸:乙二硫醇:苯酚:茴香硫醚:水:三异丙基硅烷＝80％:5％:5％:5％:5％:0％；
(1-6)使用半制备型高效液相色谱，将上述步骤(1-5)得到的固体粗肽进行纯化，收集纯化后的溶液，并冻干，得到还原态镜像利那洛肽；
(1-7)将上述步骤(1-6)中的还原态镜像利那洛肽溶于复性缓冲液中，使还原态镜像利那洛肽的浓度为0.1毫克每毫升，25℃下复性过夜，待复性结束后，加入三氟乙酸调pH值至2.0后冻干，最后将冻干粉经高效液相色谱分离纯化，得到镜像利那洛肽，所述的复性缓冲液由摩尔浓度为50毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷、摩尔浓度为100毫摩尔/升的还原型谷胱甘肽和摩尔浓度为10毫摩尔/升的氧化型谷胱甘肽组成的pH值为7.5的混合液；
(2)称取相同质量的天然利那洛肽和上述步骤(1)制备的镜像利那洛肽溶于pH值为7.5的摩尔浓度为50毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷的缓冲液中，使天然利那洛肽和镜像利那洛肽的总质量浓度为20毫克/毫升；
(3)在上述步骤(2)的溶液中加入结晶溶液，利用蛋白结晶筛选方法，在温度为16℃-18℃，结晶时间为5天，得到天然利那洛肽的晶体。
2.如权利要求1所述的天然利那洛肽的结晶方法，其特征在于其中所述的树脂为2-氯-三苯甲基氯树脂或王树脂。
3.如权利要求1所述的天然利那洛肽的结晶方法，其特征在于其中所述的结晶溶液为结晶筛选试剂盒。
4.如权利要求1所述的天然利那洛肽的结晶方法，其特征在于其中所述的结晶筛选方法为座滴法或悬滴法。
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