CN109053863A - 一种低成本制备高纯度利那洛肽的方法 - Google Patents

一种低成本制备高纯度利那洛肽的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种低成本制备高纯度利那洛肽的方法，本发明的技术方案包括以下步骤：1)使用CTC resin或Wang resin等树脂载体采用Fmoc法合成得到线性利那洛肽，或采用片段法或液相合成方法得到线性利那洛肽；2)采用一步氧化法得到正确配对的利那洛肽粗品；3)采用高效液相色谱纯化得到高纯度利那洛肽成品。本发明所述方法从氧化体系等方面着手，改进了利那洛肽二硫键正确配对的方法，其工艺简单、稳定且成本低，一步环化即可得到利那洛肽粗品，且能够保证纯化后的产品纯度大于99％，单杂可控制在0.1％以下。与现有技术相比，有更好的经济效益和应用前景。

Description

一种低成本制备高纯度利那洛肽的方法
技术领域
本发明涉及医药合成领域，具体涉及一种低成本制备高纯度利那洛肽的方法。
背景技术
利那洛肽(linaclotide)为ironwood开发的新产品，是迄今为止首个鸟苷酸环化酶激动剂(GCCA)类药物。2012年8月美国FDA批准了利那洛肽用于治疗成人慢性特发性便秘和便秘型肠易激综合症(IBS-C)。利那洛肽在血浆中的浓度基本无法测出，但与肠道GC-C结合后，能导致细胞内和细胞外环鸟苷酸(cGMP)浓度升高。细胞内cGMP升高可以刺激肠液分泌，加快胃肠道移行，从而增加排便频率。该药物为胶囊制剂，每日口服一次。该化合物由14个氨基酸组成，包括3对二硫键连接的6个半胱氨酸残基。
利那洛肽结构序列如下：
H-Cys1-Cys2-Glu3-Tyr4-Cys5-Cys6-Asn7-Pro8-Ala9-Cys10-Thr11-Gly12-Cys13-Tyr14-OH(3对二硫键为：1-6、2-10、5-13)。
中国专利CN104974229A公开了一种合成利那洛肽的方法，其以ACM、Trt、tBu分别保护3对Cys进行合成，后期采用三步法氧化得到利那洛肽成品。此方法采用特殊原料进行生产，成本高，另外采用分步氧化，工艺复杂且各种高污染试剂用量大，不适合于放大生产。
中国专利CN105017387A公开了一种合成利那洛肽的方法，其首先合成6肽片段，环化得到含一对二硫键的片段；再与另一片段肽树脂缩合得到含一对二硫键的利那洛肽肽树脂，经裂解得到含有一对二硫键的利那洛肽粗肽，经分步氧化得到环化后的利那洛肽粗品。经纯化获得利那洛肽。该方法采用片段缩合，分步氧化，由于二硫键的交换作用，其定向氧化过程中仍会形成二硫键错配的产物。分步氧化，不仅操作复杂，成本高，同时收率低，并不适合方大生产。
中国专利CN103626849A公开了一种利那洛肽的制备方法，以Trt、ACM、Hqm分别保护3对Cys进行合成，切割后在统一体系中分步进行氧化。由于多肽经过多个酸碱反应体系，多肽易降解。另外使用各种特殊保护基德氨基酸并大量使用碘、水合肼、醋酸，增加了生产成本。明显降低了其工艺的经济效益。
然而上述专利均采用特殊原料进行合成，并采用分步氧化方法进行氧化得到利那洛肽，不仅工艺复杂、成本高，而且放大生产不易。如何在现有技术基础上简化工艺，提高总收率，同时避免使用特殊原料，降低生产成本，开发出便于放大生产的工艺，是现有技术研究的难题。
发明内容
针对现有问题，本发明的目的在于提供一种低成本制备高纯度利那洛肽的方法，使得本发明所述方法能够显著简化生产工艺，提高利那洛肽的总收率，适合于放大生产。同时大大降低了生产成本，具有很好的经济效益和应用前。
为此，本发明采用以下技术方案：一种低成本制备高纯度利那洛肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步，使用CTC resin或Wang resin树脂载体采用Fmoc法合成得到多肽树脂，裂解后得到线性利那洛肽；或采用片段法或液相合成方法得到线性利那洛肽；
第二步，采用一步氧化法得到正确配对的利那洛肽粗品；
第三步，采用液相色谱纯化或离子色谱纯化得到高纯度利那洛肽成品。
作为对上述技术方案的补充和完善，本发明还包括以下技术特征。
第一步所述的Fmoc法合成得到多肽树脂具体方法为：
在活化体系存在下，将Fmoc-Tyr(tBu)-OH与树脂载体偶联后脱Fmoc保护基得到H-Tyr(tBu)-树脂载体，然后按照利那洛肽线性氨基酸序列，依次逐个将N端偶联有Fmoc保护基以及侧链连有保护基的氨基酸连接到肽树脂上，得到利那洛肽树脂：
H-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Asn(Tr t)-Pro-Ala-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-树脂固相载体，裂解后得到线性利那洛肽。
所述树脂为CTC树脂或羟基类树脂，其取代度为0.1-1.5mmol/g。
第二步中，氧化体系由不同盐溶液通过调节pH值获得，其阳离子组成：Na+、NH4 +中的一种或两种组合而成；其阴离子组成：SO4 -、CH3COO-中的一种或两种组合而成，再使用上述阳离子的碱或上述阴离子的酸进行pH值调节。氧化体系中不加入氧化还原对，否则会有有氧化还原对加成的副产物包裹在产品中，造成纯化困难。
第二步中，氧化体系的总盐浓度为0.001M-4M，其pH值为5.0-10.0。更优选的，所述氧化体系的总盐浓度为0.05M-2M，其pH值为7.0-9.0。
第二步中，多肽浓度为0.05mg/ml-5mg/ml。更优选的，线性利那洛肽浓度为0.2-1mg/ml。
第二步中，氧化反应的温度为0-50℃，氧化时间为6-72小时。更优选的，氧化温度为15-30℃。
作为优选，利那洛肽粗品，氧化后采用0.45μm微孔有机滤膜过滤，纯化备用。
采用高效液相色谱法进行纯化。取粗品液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰并用分析液相检测纯度，合并纯度达到要求的收集液得利那洛肽样品液。采用高效液相色谱法进行换盐。取纯化后达到纯度要求的样品液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰并用分析液相检测纯度，合并纯度达到要求的主峰溶液得利那洛肽精制液，减压浓缩，得到利那洛肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得利那洛肽成品。
本发明可以达到以下有益效果：1、本发明在线性肽合成时，采用价格低廉的常规原料作为反应原料，大大降低了合成原料成本。环化时采用一步氧化法制备利那洛肽，避免了分步氧化的繁琐氧化过程。同时，本发明采用盐溶液作为氧化体系，多肽浓度可达5mg/ml，可有效降低氧化体系的体积，同时大大降低了氧化过程中所使用试剂的成本。采用此方法氧化得到的利那洛肽粗肽纯度好，降低了纯化难度并提高产品收率。2、从氧化体系方面着手，改进了利那洛肽的制备方法。采用简便、快捷的工艺提高了利那洛肽的总收率。生产中所采用的原辅料均为常规试剂，价格低廉，大大降低了生产成本。生产后的产品纯度稳定在99％以上，单杂可控制在0.1％以下。相比现有技术更加具有实用价值和应用前景。
具体实施方式
实施例1：Fmoc-Tyr(tBu)-CTC树脂的合成
取500g取代度为0.5mmol/g的CTC树脂，加入DMF溶胀树脂。取0.5mol Fmoc-Tyr(tBu)-OH,用适量DMF溶解，加入到上述树脂中，搅拌均匀后再加入0.75mol DIPEA，搅拌反应3小时，抽滤掉反应液，再用DMF洗涤3次后，再用DCM洗涤3次，得到Fmoc-Tyr(tBu)-CTC树脂。其取代值为0.4mmol/g。
实施例2：利那洛肽树脂的制备
取0.15mol实施例1的Fmoc-Tyr(tBu)-CTC树脂，用20％PIP/DMF溶液脱保护20分钟，洗涤过滤，得到去除Fmoc的H-Tyr(tBu)-CTC树脂。
取0.45mol Fmoc-Cys(Trt)-OH,用适量DMF溶解后加入到装有上述H-Tyr(tBu)-CTC树脂的反应器中，另取0.45mol HBTU和0.45mol DIPEA，分别慢慢加入到鼓氮气的上述反应器中。偶联反应30～150分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，洗涤过滤，再用20％PIP/DMF溶液去除保护20分钟，洗涤过滤，得H-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-CTC树脂。
同上法依次接入表1中剩余保护氨基酸，得到利那洛肽肽树脂：
H-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-
Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-CTC树脂。
表1
编号 氨基酸 编号 氨基酸
3 Fmoc-Gly 9 Fmoc-Cys(Trt)
4 Fmoc-Thr(tBu) 10 Fmoc-Cys(Trt)
5 Fmoc-Cys(Trt) 11 Fmoc-Tyr(tBu)
6 Fmoc-Ala 12 Fmoc-Glu(OtBu)
7 Fmoc-Pro 13 Fmoc-Cys(Trt)
8 Fmoc-Asn(Trt) 14 Fmoc-Cys(Trt)
实施例3：利那洛肽线性肽粗品的制备
取实施例2所得利那洛肽树脂，裂解后经洗涤、真空减压干燥至恒重，得到线性利那洛肽粗品201g，纯度为76％。
实施例4：利那洛肽粗品的制备
取实施例3所得利那洛肽线性肽粗品50g，用50mM(NH4)2HPO4的盐溶液溶解利那洛肽线性肽粗品，并稀释至1mg/ml，再用氨水水溶液调pH至9.0，搅拌18小时，得到利那洛肽粗品液。
实施例5：利那洛肽粗品的制备
取实施例3所得利那洛肽线性肽粗品50g，用100mM CH3COONH4的盐溶液溶解利那洛肽线性肽粗品，并稀释至1.5mg/ml，再用氨水水溶液调pH至8.0，搅拌28小时，得到利那洛肽粗品液。
实施例6：利那洛肽粗品的制备
取实施例3所得利那洛肽线性肽粗品50g，用500mM(NH4)2SO4的盐溶液溶解利那洛肽线性肽粗品，并稀释至2mg/ml，再用氨水水溶液调pH至8.5，搅拌36小时，得到利那洛肽粗品液。
实施例7：利那洛肽粗品的纯化
取实施例4所得利那洛肽粗品用0.45μm微孔滤膜过滤，纯化备用。
采用高效液相色谱法进行纯化。取粗品液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰并用分析液相检测纯度，合并纯度达到要求的收集液得利那洛肽样品液；
采用高效液相色谱法进行换盐。取纯化后达到纯度要求的样品液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰并用分析液相检测纯度，合并纯度达到要求的主峰溶液得利那洛肽精制液，减压浓缩，得到利那洛肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得利那洛肽成品。纯度：99.8％，最大单一杂质为0.06％。
实施例8：利那洛肽粗品的纯化
取实施例5所得利那洛肽粗品用0.45μm微孔滤膜过滤，纯化备用。
采用高效液相色谱法进行纯化。取粗品液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰并用分析液相检测纯度，合并纯度达到要求的收集液得利那洛肽样品液；
采用高效液相色谱法进行换盐。取纯化后达到纯度要求的样品液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰并用分析液相检测纯度，合并纯度达到要求的主峰溶液得利那洛肽精制液，减压浓缩，得到利那洛肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得利那洛肽成品。纯度：99.6％，最大单一杂质为0.08％。
实施例9：利那洛肽粗品的纯化
取实施例6所得利那洛肽粗品用0.45μm微孔滤膜过滤，纯化备用。
采用高效液相色谱法进行纯化。取粗品液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰并用分析液相检测纯度，合并纯度达到要求的收集液得利那洛肽样品液；
采用高效液相色谱法进行换盐。取纯化后达到纯度要求的样品液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰并用分析液相检测纯度，合并纯度达到要求的主峰溶液得利那洛肽精制液，减压浓缩，得到利那洛肽醋酸水溶液，冷冻干燥，得利那洛肽成品。纯度：99.5％，最大单一杂质为0.08％。
表2英文缩写释义
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (7)

1.一种低成本制备高纯度利那洛肽的方法，其特征在于，所述的低成本制备高纯度利那洛肽的方法包括以下步骤：
第一步，使用CTC resin或Wang resin树脂载体采用Fmoc法合成得到多肽树脂，裂解后得到线性利那洛肽；或采用片段法或液相合成方法得到线性利那洛肽；
第二步，采用一步氧化法得到正确配对的利那洛肽粗品；
第三步，采用液相色谱纯化或离子色谱纯化得到高纯度利那洛肽成品。
2.根据权利要求1所述一种低成本制备高纯度利那洛肽的方法，其特征在于：第一步所述的Fmoc法合成得到多肽树脂具体方法为：
在活化体系存在下，将Fmoc-Tyr（tBu）-OH与树脂载体偶联后脱Fmoc保护基得到H-Tyr(tBu）-树脂载体，然后按照利那洛肽线性氨基酸序列，依次逐个将N端偶联有Fmoc保护基以及侧链连有保护基的氨基酸连接到肽树脂上，得到利那洛肽树脂：
H-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-树脂固相载体，裂解后得到线性利那洛肽。
3.根据权利要求2所述一种低成本制备高纯度利那洛肽的方法，其特征在于，所述树脂为CTC树脂或羟基类树脂，其取代度为0.1-1.5mmol/g。
4.根据权利要求1所述一种低成本制备高纯度利那洛肽的方法，其特征在于，第二步中，氧化体系由不同盐溶液通过调节pH值获得，其阳离子组成：Na+、NH4 +中的一种或两种组合而成；其阴离子组成：SO4 -、CH3COO-中的一种或两种组合而成，再使用上述阳离子的碱或上述阴离子的酸进行pH值调节。
5.根据权利要求4所述一种低成本制备高纯度利那洛肽的方法，其特征在于，第二步中，氧化体系的总盐浓度为0.001M-4M，其pH值为5.0-10.0。
6.根据权利要求5所述一种低成本制备高纯度利那洛肽的方法，其特征在于，第二步中，多肽浓度为0.05mg/ml-5mg/ml。
7.根据权利要求6所述一种低成本制备高纯度利那洛肽的方法，其特征在于，第二步中，氧化反应的温度为0-50℃，氧化时间为6-72小时。
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