CN112321681B

CN112321681B - 一种利那洛肽的制备方法

Info

Publication number: CN112321681B
Application number: CN202011175661.XA
Authority: CN
Inventors: 俞智杰; 纪东亮; 罗瑞昌
Original assignee: Hangzhou Xinhai Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Zhejiang Tisheng biomedical Co.,Ltd.
Priority date: 2020-10-29
Filing date: 2020-10-29
Publication date: 2021-12-14
Anticipated expiration: 2040-10-29
Also published as: CN112321681A

Abstract

本发明提供了一种利那洛肽的制备方法，属于医药合成技术领域。本发明提供的方法包括以下步骤：提供利那洛肽线肽粗品；将所述利那洛肽线肽粗品溶解于氯化铵溶液中，采用碱性试剂将所得体系的pH值调节至7.5～9.5，得到利那洛肽线肽溶液；将所述利那洛肽线肽溶液与过氧化氢水溶液混合，向所得反应液中持续通入空气进行氧化反应，得到氧化产物体系；将所述氧化产物体系进行冷冻干燥，得到利那洛肽。本发明以过氧化氢水溶液和空气作为氧化剂，经一步氧化反应生成利那洛肽，操作简单，成本低，适合于放大生产；同时，本发明在氯化铵溶液中进行氧化反应，并控制合适的pH值，有利于保证氧化反应顺利进行，且产物纯度和收率高。

Description

一种利那洛肽的制备方法

技术领域

本发明涉及医药合成技术领域，尤其涉及一种利那洛肽的制备方法。

背景技术

利那洛肽(linaclotide)是迄今为止首个鸟苷酸环化酶激动剂(GCCA)类药物，2012年8月美国FDA批准了利那洛肽用于治疗成人慢性特发性便秘和便秘型肠易激综合症(IBS-C)。利那洛肽由14个氨基酸组成，包括3对二硫键连接的6个半胱氨酸残基，其结构序列如下：

H-Cys1-Cys2-Glu3-Tyr4-Cys5-Cys6-Asn7-Pro8-Ala9-Cys10-Thr11-Gly12-Cys13-Tyr14-OH(3对二硫键为：1-6、2-10以及5-13)。

专利CN 103626849A公开了一种利那洛肽的制备方法，该方法制备得到利那洛肽线肽粗品后，通过分步氧化形成3对二硫键，操作步骤繁琐；另外该方法在氧化形成3对二硫键的过程中大量使用水合肼、碘以及醋酸，增加了生产成本，明显降低了其工艺的经济效益。专利CN 102875655A采用GSH/GSSH体系作为氧化剂，该氧化剂价格偏高，不利于规模化生产；且最终所得利那洛肽产物中杂质多，纯度较低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利那洛肽的制备方法，本发明提供的方法工艺简单，成本低，且产物纯度和收率高。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种利那洛肽的制备方法，包括以下步骤：

提供利那洛肽线肽粗品；

将所述利那洛肽线肽粗品溶解于氯化铵溶液中，采用碱性试剂将所得体系的pH值调节至7.5～9.5，得到利那洛肽线肽溶液；

将所述利那洛肽线肽溶液与过氧化氢水溶液混合，向所得反应液中持续通入空气进行氧化反应，得到氧化产物体系；

将所述氧化产物体系进行冷冻干燥，得到利那洛肽。

优选地，所述利那洛肽线肽粗品的纯度为75～90％。

优选地，所述氯化铵溶液的浓度为0.05～0.2mol/L。

优选地，所述利那洛肽线肽粗品在氯化铵溶液中的质量浓度为0.1～0.5mg/mL。

优选地，所述碱性试剂包括氨水、氢氧化钾溶液或氢氧化钠溶液，所述碱性试剂的浓度为0.05～1.0wt％。

优选地，所述过氧化氢水溶液中过氧化氢与利那洛肽线肽粗品中利那洛肽线肽的摩尔比为(3～6)：1。

优选地，所述过氧化氢水溶液的浓度为5～30wt％。

优选地，以扣除大气压后计，所述空气的压力为0.005～0.01MPa。

优选地，所述氧化反应的温度为18～26℃，时间为1.5～4h。

优选地，所述冷冻干燥的时间为10～40h，真空度≤20Pa。

本发明提供了一种利那洛肽的制备方法，包括以下步骤：提供利那洛肽线肽粗品；将所述利那洛肽线肽粗品溶解于氯化铵溶液中，采用碱性试剂将所得体系的pH值调节至7.5～9.5，得到利那洛肽线肽溶液；将所述利那洛肽线肽溶液与过氧化氢水溶液混合，向所得反应液中持续通入空气进行氧化反应，得到氧化产物体系；将所述氧化产物体系进行冷冻干燥，得到利那洛肽。本发明以过氧化氢水溶液和空气作为氧化剂，经一步氧化反应生成利那洛肽，操作简单，成本低，适合于放大生产；同时，本发明在氯化铵溶液中进行氧化反应，并控制合适的pH值，有利于保证氧化反应顺利进行，且产物纯度和收率高。实施例的结果显示，采用本发明提供的方法，产物纯度可达70％以上，收率可达75％以上。

附图说明

图1为实施例1制备的利那洛肽线肽粗品的HPLC图；

图2为实施例1氧化反应后所得产物体系的HPLC图；

图3为实施例2氧化反应后所得产物体系的HPLC图；

图4为实施例3氧化反应后所得产物体系的HPLC图；

图5为实施例4氧化反应后所得产物体系的HPLC图；

图6为对比例1氧化反应后所得产物体系的HPLC图。

具体实施方式

本发明提供了一种利那洛肽的制备方法，包括以下步骤：

提供利那洛肽线肽粗品；

将所述氧化产物体系进行冷冻干燥，得到利那洛肽。

本发明提供利那洛肽线肽粗品。在本发明中，所述利那洛肽线肽粗品的纯度优选为75～90％。本发明对所述利那洛肽线肽粗品的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的方法制备得到即可。在本发明中，所述利那洛肽线肽粗品优选参照申请号为201310223243.7的中国专利公开的方法制备，包括以下步骤：1)Fmoc-Tyr(tBu)-OH和载体树脂反应，获得Fmoc-Tyr(tBu)-树脂；2)Fmoc-Tyr(tBu)-树脂采用逐一偶联的方式偶联Fmoc保护基团的其他氨基酸，获得利那洛肽树脂；3)利那洛肽树脂通过化学试剂裂解，得到利那洛肽线肽粗品。在本发明的实施例中，具体是参照上述专利(申请号为201310223243.7)中实施例5的方法制备得到利那洛肽线肽粗品；所述利那洛肽线肽粗品的HPLC纯度为84.37％。

得到利那洛肽线肽粗品后，本发明将所述利那洛肽线肽粗品溶解于氯化铵溶液中，采用碱性试剂将所得体系的pH值调节至7.5～9.5，得到利那洛肽线肽溶液。在本发明中，所述氯化铵溶液的浓度优选为0.05～0.2mol/L，更优选为0.1～0.15mol/L。在本发明中，所述利那洛肽线肽粗品在氯化铵溶液中的质量浓度优选为0.1～0.5mg/mL，更优选为0.2～0.4mg/mL。

本发明采用氯化铵溶液溶解利那洛肽线肽粗品，在氯化铵溶液中进行氧化反应，有利于保证氧化反应顺利进行，且所得氧化产物体系经冷冻干燥后，得到白色粉末状利那洛肽，产品纯度高。具体的，氯化铵属于强酸弱碱盐，在氧化过程中具有缓冲体系pH值的作用，有利于使体系pH值保持稳定，避免体系pH值在氧化过程中发生较大变化，影响氧化反应顺利进行；此外，本发明基于盐析原理，将利那洛肽线肽粗品溶解于氯化铵溶液中，有利于提高利那洛肽线肽粗品与目标产物利那洛肽(即利那洛肽环肽)在体系中的溶解性，有利于氧化反应顺利进行，使目标产物利那洛肽稳定存在于体系中；同时，氯化铵属于挥发性盐，在氧化产物体系进行冷冻干燥过程中氯化铵会被去除，最终得到白色粉末状利那洛肽，产品纯度高。而如果采用非挥发性盐(如磷酸二氢铵、磷酸二氢钠或磷酸二氢钾)的溶液溶解利那洛肽线肽粗品，经氧化反应，所得氧化产物体系在冷冻干燥过程中，非挥发性盐会吸附在目标产物利那洛肽上，无法有效去除该非挥发性盐，最终所得产品并非为白色粉末状，而是会附着有所述非挥发性盐形成的晶体状薄膜；此外，在冷冻干燥过程中所述非挥发性盐会发生一定的熔化现象，从而粘附在冷冻干燥设备上，如粘附在冻干瓶的瓶壁上，不利于产品收集。

在本发明中，所述碱性试剂优选包括氨水、氢氧化钾溶液或氢氧化钠溶液，所述碱性试剂的浓度优选为0.05～1.0wt％，进一步优选为0.1～0.5wt％。在本发明中，所述利那洛肽线肽溶液的pH值为7.5～9.5，优选为8.0～8.5。本发明在上述pH值环境中进行氧化反应，有利于提高氧化剂(即过氧化氢水溶液和空气)与利那洛肽线肽的反应活性；如果所述利那洛肽线肽溶液的pH值过高，会导致利那洛肽线肽粗品水解，降低产物收率；如果所述利那洛肽线肽溶液的pH值偏低，会降低过氧化氢的分解速率，导致氧化时间延长，副反应增多或使已经氧化成环的产物发生分解，进而导致产物纯度下降。

得到利那洛肽线肽溶液后，本发明将所述利那洛肽线肽溶液与过氧化氢水溶液混合，向所得反应液中持续通入空气进行氧化反应，得到氧化产物体系。在本发明中，所述过氧化氢水溶液的浓度优选为5～30wt％，更优选为10～15wt％；所述过氧化氢水溶液中过氧化氢与利那洛肽线肽粗品中利那洛肽线肽的摩尔比优选为(3～6)：1，更优选为(4～5)：1。在本发明中，以扣除大气压后计，向反应液中通入空气的压力优选为0.005～0.01MPa。本发明对空气的通入方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的方式即可，在本发明的实施例中，具体可以将耐腐蚀的软管的一端置于反应容器底部，通过所述耐腐蚀的软管向反应液中通入空气即可。在本发明中，所述耐腐蚀的软管的管径优选为8mm。在本发明中，所述氧化反应过程中，空气优选匀速通入反应液中。

本发明在过氧化氢水溶液和空气存在条件下，经一步氧化反应形成3对二硫键，具体的，单独采用空气作为氧化剂时，因空气中氧含量约为21％，且为分子态，故其氧化时速率偏慢，往往需要48h左右才能完成氧化反应，而单独用过氧化氢水溶液作为氧化剂时，其氧化速率较快，但是其过强的氧化性易造成过氧化的情况，使杂质增多，故本发明采用两者结合的方式经一步氧化，再经冷冻干燥即可得到利那洛肽，氧化效果好且操作简单。本发明优选将过氧化氢水溶液以及空气的用量控制在上述范围，有利于保证氧化反应顺利进行，得到高纯度产物；具体的，适量的过氧化氢水溶液氧化大部分利那洛肽线肽分子，空气中的氧气对未氧化完全的利那洛肽线肽分子进行补充氧化。

在本发明中，所述氧化反应的温度优选为18～26℃，更优选为20～25℃，具体可以在室温条件下进行所述氧化反应，即不需要额外的加热或降温；在本发明的实施例中，具体是在25℃条件下进行所述氧化反应。在本发明中，所述氧化反应的时间优选为1.5～4h，更优选为3～4h。本发明在过氧化氢水溶液和空气存在条件下，经一步氧化反应形成3对二硫键，氧化反应周期短，操作简单。

得到氧化产物体系后，本发明将所述氧化产物体系进行冷冻干燥，得到利那洛肽。在本发明中，所述冷冻干燥的时间优选为10～40h，更优选为30～40h；所述冷冻干燥的真空度优选≤20Pa。在本发明的实施例中，具体是在室温环境中，采用挂瓶式真空冷冻干燥机对所述氧化产物体系进行冷冻干燥。本发明通过冷冻干燥去除氧化产物体系中水分、氯化铵以及利那洛肽线肽粗品中含有的三氟乙酸、醚等杂质，得到粉末状利那洛肽。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

制备利那洛肽线肽粗品，包括以下步骤：

称取替代度为0.70mmol/g的Fmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin 140.12g(100mmol；其中，Fmoc为9-芴甲氧羰基，Wang Resin为4-苄氧基苄醇树脂，tBu为叔丁基)，加入固相反应柱中，用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶胀树脂60min后，真空抽滤，加入3倍树脂床层体积的哌啶和DMF的混合物(所述混合物中哌啶的体积分数为20％)，搅拌30min脱除Fmoc保护，真空抽滤后用DMF洗涤5次；

将176.3g(300mmol)Fmoc-Cys(Trt)-OH和40.5g(300mmol)1-羟基苯并三唑(HOBt)用DMF溶解后在-10℃条件下冷却20min，加入47.3mL(300mmol)N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)后继续活化30min；将活化好的反应液加入固相反应柱中，室温(25℃)条件下进行偶联反应，反应2h后茚三酮检测呈阴性；

重复上述脱除Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤，按照序列的顺序，采用偶联剂HOBt/DIC依次完成Fmoc-Cys(Trt)-OH(Trt为三苯甲基)、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Mmt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH和Fmoc-Cys(Trt)-OH；反应结束后用甲醇收缩，树脂真空干燥过夜，得到利那洛肽肽树脂，称重为478.5g。

将制备得到的478.5g利那洛肽肽树脂置于裂解反应器中，以15mL/g树脂的比例加入裂解试剂(以体积比计，裂解试剂组成为TFA：苯甲硫醚：苯酚：水：EDT：TIS＝75：5：5：5：8：2，TFA为三氟乙酸，EDT为1,2-乙二硫醇，TIS为三异丙基硅烷)，室温搅拌2.5h；所得反应产物用砂芯漏斗过滤，收集滤液，过滤得到的树脂再用TFA洗涤3次，与滤液合并后减压浓缩至3L；将所得浓度物料加入冰冻的无水乙醚(15L)进行沉淀，之后用布氏漏斗过滤，用无水乙醚洗涤沉淀3次，每次用量1.5L；将洗涤后物料进行真空干燥，得到白色粉末固体，即利那洛肽线肽粗品，称重为160.3g，利那洛肽线肽粗品重量收率为104.6％，HPLC纯度为84.37％，利那洛肽线肽粗品的HPLC图如图1所示，横坐标的单位为min，纵坐标的单位为AU；对应色谱峰的数据信息如表1所示。

表1实施例1制备的利那洛肽线肽粗品的HPLC图中各成分的数据信息

称取1g所述利那洛肽线肽粗品，超声溶解于2.5L浓度为0.1mol/L的氯化铵溶液中，采用浓度为0.1wt％的氨水调节pH值为8.5，之后加入400μL浓度为15wt％的双氧水，在磁力搅拌、室温(25℃)条件下向得到的反应液中持续通入空气进行氧化反应4h，其中，所述空气具体是通过耐腐蚀的软管通入反应液中，通入所述软管中的空气压力为0.01MPa(扣除大气压后)，所述软管的管径为8mm；氧化反应结束后，所得产物体系的纯度为75.24％(HPLC图如图2所示，横坐标的单位为min，纵坐标的单位为AU；对应色谱峰的数据信息如表2所示)，再用挂瓶式真空冷冻干燥机于室温环境中、真空度≤20Pa条件下进行冻干40h，得到1.12g利那洛肽粗品粉末，收率为89.18％。

表2实施例1中氧化反应后所得样品的HPLC图中各成分的数据信息

实施例2

称取1g利那洛肽线肽粗品(纯度为84.37％)，超声溶解于4L浓度为0.05mol/L的氯化铵溶液中，采用浓度为0.5wt％的氨水调节pH值为8.0，之后加入900μL浓度为10wt％的双氧水，在磁力搅拌、室温(25℃)条件下向得到的反应液中持续通入空气进行氧化反应4h，其中，所述空气具体是通过耐腐蚀的软管通入反应液中，通入所述软管中的空气压力为0.01MPa(扣除大气压后)，所述软管的管径为8mm；氧化反应结束后，所得产物体系的纯度为72.92％(HPLC图如图3所示，横坐标的单位为min，纵坐标的单位为AU；对应色谱峰的数据信息如表3所示)，再用挂瓶式真空冷冻干燥机于室温环境中、真空度≤20Pa条件下进行冻干40h，得到0.96g利那洛肽粗品粉末，收率为86.43％。

表3实施例2中氧化反应后所得样品的HPLC图中各成分的数据信息

实施例3

称取1g利那洛肽线肽粗品(纯度为84.37％)，超声溶解于5L浓度为0.15mol/L的氯化铵溶液中，采用浓度为0.1wt％的氨水调节pH值为8.5，之后加入600μL浓度为10wt％的双氧水，在磁力搅拌、室温(25℃)条件下向得到的反应液中持续通入空气进行氧化反应3h，其中，所述空气具体是通过耐腐蚀的软管通入反应液中，通入所述软管中的空气压力为0.01MPa(扣除大气压后)，所述软管的管径为8mm；氧化反应结束后，所得产物体系的纯度为73.98％(HPLC图如图4所示，横坐标的单位为min，纵坐标的单位为AU；对应色谱峰的数据信息如表4所示)，再用挂瓶式真空冷冻干燥机于室温环境中、真空度≤20Pa条件下进行冻干40h，得到1.31g利那洛肽粗品粉末，收率为87.68％。

表4实施例3中氧化反应后所得样品的HPLC图中各成分的数据信息

实施例4

称取1g利那洛肽线肽粗品(纯度为84.37％)，超声溶解于5L浓度为0.10mol/L的氯化铵溶液中，采用浓度为0.05wt％的氨水调节pH值为8.7，之后加入600μL浓度为10wt％的双氧水，在磁力搅拌、室温(25℃)条件下向得到的反应液中持续通入空气进行氧化反应3h，其中，所述空气具体是通过耐腐蚀的软管通入反应液中，通入所述软管中的空气压力为0.005MPa(扣除大气压后)，所述软管的管径为8mm；氧化反应结束后，所得样品纯度为72.01％(HPLC图如图5所示，横坐标的单位为min，纵坐标的单位为AU；对应色谱峰的数据信息如表5所示)，再用挂瓶式真空冷冻干燥机于室温环境中、真空度≤20Pa条件下进行冻干40h，得到1.18g利那洛肽粗品粉末，收率为79.44％。

表5实施例4中氧化反应后所得样品的HPLC图中各成分的数据信息

对比例1

按照实施例4的方法制备利那洛肽粗品粉末，不同之处在于氧化过程中不向反应液中通入空气；其中，氧化反应后所得样品纯度为65.43％(HPLC图如图6所示，横坐标的单位为min，纵坐标的单位为AU；对应色谱峰的数据信息如表6所示)，经冷冻干燥后得到1.15g利那洛肽粗品粉末，收率为72.37％。

表6对比例1中氧化反应后所得样品的HPLC图中各成分的数据信息

由实施例4和对比例1结果可知，不使用空气时产物纯度偏低(65.43％)，使用空气后产物纯度上升(72.01％)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。