CN109456403A - 一种利拉鲁肽的合成方法 - Google Patents

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谷海涛
施国强
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Abstract

本发明是一种利拉鲁肽的合成方法，属于多肽合成领域。该方法通过固相合成利拉鲁肽主序列的第1‑31位氨基酸，第10位Val与第11位Ser采用Fmoc‑Val10‑Ser11(Psi(Me，Me)pro)‑OH；第20位Lys侧链采用Fmoc‑Lys(X)‑OH，所述的X选自：Alloc，Dde，ivdde，Mtt，Pal‑γ‑Glu‑OtBu；经裂解沉淀得到利拉鲁肽粗肽；经纯化得到利拉鲁肽。本发明方法通过引入Fmoc‑Val10‑Ser11(Psi(Me，Me)pro)‑OH来解决利拉鲁肽困难序列合成问题，使得困难序列的合成变的简单易操作，同时极大的提高了收率和粗肽的纯度，大大降低了生产成本，利于进行工业化放大生产。

Description

一种利拉鲁肽的合成方法
技术领域
本发明涉及一种多肽药物合成领域，特别涉及GLP-1受体激动素一种利拉鲁肽的合成方法。
背景技术
中文名：利拉鲁肽；英文名：Liraglutide；肽序列为：
H-His1-Ala2-Glu3-Gly4-Thr5-Phe6-Thr7-Ser8-Asp9-Val10-Ser11-Ser12-Tyr13-Leu14-Glu15-Gly16-Gln17-Ala18-Ala19-Lys20(Pal-γ-Glu)-Glu21-Phe22-Ile23-Ala24-Trp25-Leu26-Val27-Arg28-Gly29-Arg30-Gly31-OH
利拉鲁肽由丹麦诺和诺德公司开发的第一个长效GLP-1类似物，与人胰高糖素样肽-1(GLP-1)同源性达97％。利拉鲁肽具有降低血糖，促进胰岛细胞再生，轻微延长胃排空等多种作用，应用前景广泛。
中国公开专利文献CN 103304660的公开了一种利拉鲁肽的合成方法，固相合成N端保护的利拉鲁肽直链肽，然后合成十六烷基衍生物，脱保护除去末端保护，得到目标多肽。该方法采用氨基酸逐一偶联的方式，随着肽链的延长，大量的疏水性保护基团加剧了分子间的缔合作用，部分活性基团被包裹其中，会合成过程中会出现困难偶联情况，工艺过程中易产生缺失肽，增加投料量以及延长偶联反应时间无法根本上解决问题，即使更改高效缩合试剂也解决不了困难偶联问题，这样会使得产品收率低粗品纯度差；
中国公开专利文献CN 102875665的专利公开了一种合成利拉鲁肽的方法，将利拉鲁肽分成5个片段，先合成第1至第4氨基酸、第5至第10氨基酸、第11至第16氨基酸、第17至第24氨基酸以及第25至第31氨基酸，然后5个多肽片段对接合成利拉鲁肽，该方法可以部分。虽然该方法可以同时偶联5个片段，但是5个片段均需要大量的树脂，大大提高了生产成本，并且多次的裂解在产业化增加大量的操作步骤，同时也产生过多的废液。
因此，本领域迫切需要提供一种利拉鲁肽的合成方法，以解决现有利拉鲁肽合成过程中存在的杂质多，纯度和收率低，成本昂贵，操作步骤繁琐，废液过量的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有合成过程中所存在纯度和收率低，成本昂贵，操作步骤繁琐，不利于工业化生产的问题，提供一种新的利拉鲁肽的合成方法，该方法使得困难序列的合成变的简单易操作，同时极大的提高了收率和粗肽的纯度，大大降低了生产成本。
本发明是一种利拉鲁肽的合成方法，其特征是，该方法包括以下步骤：
(1)固相合成利拉鲁肽主序列的第1-31位氨基酸，第10位Val与第11位Ser采用Fmoc-Val10-Ser11(Psi(Mc，Me)pro)-OH；第20位Lys侧链采Fmoc-Lys(X)-OH，中的X包括：Alloc，Dde，ivdde，Mtt，Pal-γ-Glu-OtBu；
(2)当Lys20的侧链为Alloc、Dde、ivdde、Mtt时，需要先脱去这些保护基团(按常规方法进行)后偶联Pal-γ-Glu-OtBu；当Lys20的侧链为Pal-γ-Glu-OtBu时，直接进入下一步；
(3)经裂解沉淀得到利拉鲁肽粗肽；
(4)利拉鲁肽粗肽经纯化得到利拉鲁肽。
本发明所述的一种利拉鲁肽的合成方法，其进一步优选的技术方案是：所述的Fmoc-Val10-Ser11(Psi(Me，Me)pro)-OH的制备方法如下：
(1)Fmoc-Val-Ser-Obzl的制备：取Fmoc-Val-OH、HOBt溶于DCM中，加DIC，反应；取H-Ser-OBzl·HCl，溶于DCM中，滴加DIEA；记为溶液A；15℃滴加溶液A，滴加完毕后15℃反应4-5小时；过滤得固体，DCM洗涤；30～50℃真空干燥，即得；
(2)Fmoc-Val-Ser(PsiMe，MePro)-OBzl的制备：取Fmoc-Val-Ser-Obzl、对甲苯磺酸溶于DCM中，升温至30℃，加2，2-二甲氧基丙烷，升温至60℃，回流30～40min后，蒸馏；将反应液倒入饱和NaHCO3溶液中，搅拌，过滤，所得液体静置分层；加入无水乙醇，冷却至室温加晶种，继续降温至15℃，结晶；滤出固体；40℃真空干燥，即得；
(3)Fmoc-Val10-Ser11(Psi(Me，Me)pro)-OH的制备：将
Fmoc-Val-Ser(PsiMe，MePro)-OBzl溶于THF中，加入钯碳，氢气置换；加氢反应后滤除钯碳，加入乙酸乙酯，升温至回流，冷却至30℃加入晶种，降温至17℃结晶；滤出固体，35℃真空干燥，即得。
本发明所述的一种利拉鲁肽的合成方法，其进一步优选的技术方案是：20位Lys的侧链保护基团选用催化氢化脱除的Alloc、Dde、ivdde或Mtt。
本发明所述的一种利拉鲁肽的合成方法，其进一步优选的技术方案是：固相合成利拉鲁肽主序列的第1-31位氨基酸时，采用Fmoc-Gly-Wang树脂，其制备方法如下：取Wang树脂加入到固相反应器中，加入DCM溶胀树脂，抽干溶剂；加Fmoc-Gly-OH、HOBt到DMF溶液中搅拌溶解，降温到5～8℃后，加入DIC溶液搅拌，将活化后的溶液加入到树脂中搅拌反应；抽干溶剂，加入醋酸酐，吡啶，DMFL，封闭；DCM与甲醇交替洗涤；真空干燥后，得到Fmoc-Gly-Wang树脂。
本发明所述的一种利拉鲁肽的合成方法，其进一步优选的技术方案是：步骤(3)采用的裂解试剂为TFA∶Thioanisole∶Anisole∶EDT∶H2O＝90∶3∶3∶2∶2。
本发明所述的一种利拉鲁肽的合成方法，其进一步优选的技术方案是：其具体步骤如下：
(1)全保护肽的制备
取Fmoc-Gly-Wang树脂，加入到固相反应器中，加入DCM
溶胀树脂；抽干溶剂，加入哌啶/DMF溶液，反应；抽干溶剂，加入DMF洗涤4；茚检结果呈阳性；
取Fmoc-Arg(Pbf)-OH，HOBt，DIC，加入DMF溶解，冰浴活化；将活化后的溶液加入到反应器中，反应，茚检检测结果呈阴性后，抽干溶剂；加入DMF洗涤；
重复以上步骤，按照氨基酸序列，依次加入Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val10-Ser11(Psi(Me，Me)pro)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Boc-His(Trt)-OH进行偶联反应；
称取四三苯基膦钯，吗啡啉，THF加入到固相反应器中，反应，DMF洗涤，茚检结果呈阳性；
取Pal-γ-Glu，HOBt，DIC加入DMF溶解，冰浴活化；将活化后的溶液加入到反应器中，反应；茚检检测结果呈阴性后，抽干溶剂；加入DMF洗涤；DCM与甲醇交替洗涤，真空干燥；
(2)裂解
配制裂解试剂为TFA∶Thioanisole∶Anisole∶EDT∶H2O＝90∶3∶3∶2∶2，冰浴条件下加入到全保护肽中，0.4h-0.6h后恢复至室温继续反应2-3h，反应结束后，加入无水乙醚沉淀；加入乙醚离心沉淀，；粗肽进行干燥；
(3)利拉鲁肽的纯化
取利拉鲁肽粗品，溶于乙腈水溶液，完全溶解后用0.22μm滤膜过滤；收集过滤后的利拉鲁肽粗肽水溶液备用；
第一步HPLC纯化
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶填料固定相，50mm×250mm，10μm为色谱柱；以0.5％磷酸为流动相A；以乙腈为流动相B；流速为50mL每分钟；检测波长为230nm；按以下洗脱梯度进行洗脱；
收取纯度大于90％的利拉鲁肽样品的馏分；用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈；得到利拉鲁肽第一步样品溶液；
第二步HPLC纯化
色谱条件：以HILIC色谱填料，50mm×250mm，10μm为色谱柱；以0.08％三氟乙酸溶液为流动相A；以乙腈为流动相B；流速为50mL每分钟；检测波长为230nm；按以下洗脱梯度进行洗脱；
收取纯度大于99.6％的利拉鲁肽样品的馏分；用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈，得利拉鲁肽。
本发明合成方法中，所用的缩合剂可以为DIC/HOBt，HBTU/HOBT/DIEA，PyBop/HOBT/DIEA其中的一种或多种；所用的反应溶剂可以为DCM、DMF、NMP、DMSO中的一种或多种组合；所使用的Fmoc脱除试剂可以为v/v25％哌啶/DMF溶液。本发明方法中，如无特殊说明，涉及的产品或者方法均可以采用本领域公开的常规产品或者方法。
与现有技术相比，本发明方法具有以下有益效果：本发明利拉鲁肽的合成方法采用二肽的形式进行偶联，破坏了直链肽的二级结构，解决了偶联困难问题，去除了工艺产生的缺失肽，减少了投料，降低成本，有利于放大生产。通过引入Fmoc-Val10-Ser11(Psi(Me，Me)pro)-OH来解决利拉鲁肽困难序列合成问题，使得困难序列的合成变的简单易操作，同时极大的提高了收率和粗肽的纯度。
附图说明
图1为实施例制得的利拉鲁肽产品的质谱图。
具体实施方式
以下进一步地对本发明方法的技术方案进行描述，以使本领域技术人员进一步地理解本发明，而不构成对本发明权利要的限制。
一、Fmoc-Gly-Wang树脂的制备
称取Wang树脂100.0g(Sub＝0.61mmol/g)加入到固相反应器中，加入350mL DCM溶胀树脂0.5h，抽干溶剂。加Fmoc-Gly-OH 45.1g、HOBt 30.5g到370mlDMF溶液中搅拌溶解，降温到5～8度后，加入DIC 30.5mL溶液搅拌，将活化后的溶液加入到树脂中搅拌反应5h。抽干溶剂，加入醋酸酐11mL，吡啶8mL，DMF160mL，封闭2h。DCM与甲醇交替洗涤3次，每次170mL。真空干燥后，得到Fmoc-Gly-Wang树脂的替代度约Sub＝0.55mmol/g左右。
二、Fmoc-Val10-Ser11(Psi(Me，Me)pro)-OH的制备
1、Fmoc-Val-Ser-Obzl的制备
取100g Fmoc-Val-OH、HOBt溶于1000ml DCM中，加DIC，10～15min反应1小时，
取70g H-Ser-OBzl·HCl，溶于300ml DCM中，滴加DIEA。记为溶液A。15℃左右，滴加溶液A，5min滴加完毕。15℃反应4.5小时。过滤得固体，DCM洗涤两次，每次200ml；30～50℃真空干燥，得固体137.1g，纯度≥90％，收率73.27％。
2、Fmoc-Val-Ser(PsiMe，MePro)-OBzl的制备
取110g Fmoc-Val-Ser-Obzl、对甲苯磺酸溶于800mlDCM中，升温至30℃，加2，2-二甲氧基丙烷，升温至60℃，回流30～40min后，蒸馏；将反应液倒入饱和NaHCO3溶液中，搅拌20min，过滤，所得液体静置分层。加入130ml无水乙醇(有固体析出)，冷却至室温加晶种，继续降温至15℃，结晶。滤出固体；40℃真空干燥，得固体100.92g。收率75.13％
3、Fmoc-Val10-Serl1(Psi(Me，Me)pro)-OH的制备
将Fmoc-Val-Ser(PsiMe，MePro)-OBzl溶于350ml THF中，加入钯碳，氢气置换3次。加氢反应约2小时，滤除钯碳，加入300ml乙酸乙酯，升温至回流(溶清)，冷却至30℃加入晶种，降温至17℃结晶。滤出固体，35℃真空干燥，得固体91g。
三、全保护肽的制备
称取Fmoc-Gly-Wang树脂20.0g，加入到固相反应器中，加入90mL DCM溶胀树脂0.5h。抽干溶剂，分别加入2次90mL v/v 20％哌啶/DMF溶液，反应5min和15min。抽干溶剂，加入DMF 90mL洗涤4次。茚检结果呈阳性。
称取Fmoc-Arg(Pbf)-OH 19.8g，HOBt 5.6g，DIC 5.6mL，加入DMF90mL溶解，冰浴活化8min。将活化后的溶液加入到反应器中，反应1h，茚检检测结果呈阴性后，抽干溶剂。加入DMF洗涤3次，每次90mL。
重复以上步骤，按照氨基酸序列，依次加入Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val10-Ser11(Psi(Me，Me)pro)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Boc-His(Trt)-OH进行偶联反应。
称取四三苯基膦钯12.2g，吗啡啉1mL，100ml THF加入到固相反应器中，反应3h，DMF洗涤3次，每次加入100mL，茚检结果呈阳性。
称取Pal-γ-Glu 17.3g，HOBt5.6g，DIC5.6mL加入DMF 90mL溶解，冰浴活化8min。将活化后的溶液加入到反应器中，反应3h，茚检检测结果呈阴性后，抽干溶剂。加入DMF洗涤3次，每次90mL。DCM与甲醇交替洗涤3次，每次90mL，真空干燥。
四、裂解
配制500mL裂解试剂为TFA∶Thioanisole∶Anisole∶EDT∶H2O＝90∶3∶3∶2∶2，冰浴条件下加入到全保护肽中，0.5h后恢复至室温继续反应2.5h，反应结束后，加入无水乙醚沉淀。离心沉淀3次，每次加入乙醚3L。粗肽进行干燥。所得粗肽54.3g。
五、利拉鲁肽的纯化
溶液经对照品定量含利拉鲁肽33.6g，合成总收率91.2％，粗品纯度76.52％。
取利拉鲁肽粗品
样品处理：将含33.6g利拉鲁肽粗品(粗品重量：54.3g)样品溶于乙腈水溶液，完全溶解后用0.22μm滤膜过滤。收集过滤后的利拉鲁肽粗肽水溶液备用。
第一步HPLC纯化
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶填料固定相(50mm×250mm，10μm)为色谱柱；以0.5％磷酸(取1000ml水，加5ml磷酸，混合均匀，用三乙胺调节pH值至7.0)为流动相A；以乙腈为流动相B；流速为50mL每分钟；检测波长为230nm；单针上样量为4.0g。
以下表洗脱梯度进行洗脱。
收取纯度大于90％的利拉鲁肽样品的馏分。用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈。得到利拉鲁肽第一步样品溶液。
第二步HPLC纯化
色谱条件：以HILIC色谱填料(50mm×250mm，10μm)为色谱柱；以0.08％三氟乙酸溶液(取1000ml水加三氟乙酸0.8m1)∶乙腈＝70∶30(V∶V)为流动相A；以乙腈为流动相B；流速为50mL每分钟；检测波长为230nm；上样量为3.0g。
以下表洗脱梯度进行洗脱。
收取纯度大于99.6％的利拉鲁肽样品的馏分。用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈，溶液经对照品定量含利拉鲁肽26.2g，收率达77.9％。产品质谱图图参照图1。

Claims (6)

1.一种利拉鲁肽的合成方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)固相合成利拉鲁肽主序列的第1-31位氨基酸，第10位Val与第11位Ser采用Fmoc-Val10-Ser11(Psi(Me，Me)pro)-OH；第20位Lys侧链采用Fmoc-Lys(X)-OH，所述的X选自：Alloc，Dde，ivdde，Mtt，Pal-γ-Glu-OtBu；
(2)当Lys20的侧链为Alloc、Dde、ivdde、Mtt时，需要先脱去这些保护基团后偶联Pal-γ-Glu-OtBu；当Lys20的侧链为Pal-γ-Glu-OtBu时，直接进入下一步；
(3)经裂解沉淀得到利拉鲁肽粗肽；
(4)利拉鲁肽粗肽经纯化得到利拉鲁肽。
2.根据权利要求1所述的一种利拉鲁肽的合成方法，其特征在于：所述的Fmoc-Val10-Ser11(Psi(Me，Me)pro)-OH的制备方法如下：
(1)Fmoc-Val-Ser-Obzl的制备：取Fmoc-Val-OH、HOBt溶于DCM中，加DIC，反应；取H-Ser-OBzl·HCl，溶于DCM中，滴加DIEA；记为溶液A；15℃滴加溶液A，滴加完毕后15℃反应4-5小时；过滤得固体，DCM洗涤；30～50℃真空干燥，即得；
(2)Fmoc-Val-Ser(PsiMe，MePro)-OBzl的制备：取Fmoc-Val-Ser-Obzl、对甲苯磺酸溶于DCM中，升温至30℃，加2，2-二甲氧基丙烷，升温至60℃，回流30～40min后，蒸馏；将反应液倒入饱和NaHCO3溶液中，搅拌，过滤，所得液体静置分层；加入无水乙醇，冷却至室温加晶种，继续降温至15℃，结晶；滤出固体；40℃真空干燥，即得；
(3)Fmoc-Val10-Ser11(Psi(Me，Me)pro)-OH的制备：将Fmoc-Val-Ser(PsiMe，MePro)-OBzl溶于THF中，加入钯碳，氢气置换；加氢反应后滤除钯碳，加入乙酸乙酯，升温至回流，冷却至30℃加入晶种，降温至17℃结晶；滤出固体，35℃真空干燥，即得。
3.根据权利要求1所述的一种利拉鲁肽的合成方法，其特征在于：20位Lys的侧链保护基团选用催化氢化脱除的Alloc、Dde、ivdde或Mtt。
4.根据权利要求1所述的一种利拉鲁肽的合成方法，其特征在于：固相合成利拉鲁肽主序列的第1-31位氨基酸时，采用Fmoc-Gly-Wang树脂，其制备方法如下：取Wang树脂加入到固相反应器中，加入DCM溶胀树脂，抽干溶剂；加Fmoc-Gly-OH、HOBt到DMF溶液中搅拌溶解，降温到5～8℃后，加入DIC溶液搅拌，将活化后的溶液加入到树脂中搅拌反应；抽干溶剂，加入醋酸酐，吡啶，DMFL，封闭；DCM与甲醇交替洗涤；真空干燥后，得到Fmoc-Gly-Wang树脂。
5.根据权利要求1所述的一种利拉鲁肽的合成方法，其特征在于：步骤(3)采用的裂解试剂为TFA∶Thioanisole∶Anisole∶EDT∶H2O＝90∶3∶3∶2∶2。
6.根据权利要求1-4任何一项所述的一种利拉鲁肽的合成方法，其特征在于：其具体步骤如下：
(1)全保护肽的制备
取Fmoc-Gly-Wang树脂，加入到固相反应器中，加入DCM溶胀树脂；抽干溶剂，加入哌啶/DMF溶液，反应；抽干溶剂，加入DMF洗涤4；茚检结果呈阳性；
取Fmoc-Arg(Pbf)-OH，HOBt，DIC，加入DMF溶解，冰浴活化；将活化后的溶液加入到反应器中，反应，茚检检测结果呈阴性后，抽干溶剂；加入DMF洗涤；
重复以上步骤，按照氨基酸序列，依次加入Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Lys(Alloc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val10-Ser11(Psi(Me，Me)pro)-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(otBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Boc-His(Trt)-OH进行偶联反应；
称取四三苯基膦钯，吗啡啉，THF加入到固相反应器中，反应，DMF洗涤，茚检结果呈阳性；
取Pal-γ-Glu，HOBt，DIC加入DMF溶解，冰浴活化；将活化后的溶液加入到反应器中，反应；茚检检测结果呈阴性后，抽干溶剂；加入DMF洗涤；DCM与甲醇交替洗涤，真空干燥；
(2)裂解
配制裂解试剂为TFA∶Thioanisole∶Anisole∶EDT∶H2O＝90∶3∶3∶2∶2，冰浴条件下加入到全保护肽中，0.4h-0.6h后恢复至室温继续反应2-3h，反应结束后，加入无水乙醚沉淀；加入乙醚离心沉淀，；粗肽进行干燥；
(3)利拉鲁肽的纯化
取利拉鲁肽粗品，溶于乙腈水溶液，完全溶解后用0.22μm滤膜过滤；收集过滤后的利拉鲁肽粗肽水溶液备用；
第一步HPLC纯化
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶填料固定相，50mm×250mm，10μm为色谱柱；以0.5％磷酸为流动相A；以乙腈为流动相B；流速为50mL每分钟；检测波长为230nm；按以下洗脱梯度进行洗脱；
收取纯度大于90％的利拉鲁肽样品的馏分；用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈；得到利拉鲁肽第一步样品溶液；
第二步HPLC纯化
色谱条件：以HILIC色谱填料，50mm×250mm，10μm为色谱柱；以0.08％三氟乙酸溶液为流动相A；以乙腈为流动相B；流速为50mL每分钟；检测波长为230nm；按以下洗脱梯度进行洗脱；
收取纯度大于99.6％的利拉鲁肽样品的馏分；用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈，得利拉鲁肽。
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